专利名称：用于保存感染性重组腺病毒的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及保存呈稳定形式的可储存腺病毒，以及用于这种保存的液体或冻凝组合物。
背景技术：
保存稳定组合物中的腺病毒是一个已知的问题，该问题已成为许多研究工作的课题，直到现在还未得到真正令人满意的结果。事实上，这些重组病毒只是在达到在未发生降解以及没有失去其感染能力之时将它们储存的条件下才是可使用的。
溶液中腺病毒颗粒的物理状态随时间流逝同时而快速地发生两种变化一方面病毒颗粒聚集(冻凝)呈团或丝状，因为这种现象是不可逆的，所以是极严重的，而另一方面，衣壳本身的二十面体结构分裂(通过衣壳溶胞作用，衣壳体释放到介质中)。
在国际申请WO 98/02522中，曾描述一种在含有蔗糖的水溶液中保存呈悬浮液形式的感染重组病毒的方法。推荐的组合物不含有甘油，按照优选实施方式含有至少一种二价阳离子盐或一价碱金属阳离子盐。
但是，可能表明蔗糖没有系统地带来在+4℃的稳定作用，根据这种情况，在这个温度下的稳定作用从未超过2星期，或至多也短于2个月。
在《病毒学杂志》(J.Virology)，70(11)，7498-7509(1996)中，曾描述以三羟甲基氨基甲烷缓冲液和甘油为主要成分的缓冲液形式保存腺病毒，但该缓冲液系统地含有氯化镁。这些制剂必需保存在非常低的温度下，约-70℃，以免其感染能力降低。
在《人体基因治疗》(Human Gene Therapy)，7，1693-99(1996)中，还使用一种以三羟甲基氨基甲烷缓冲液和甘油为主要成分的含有氯化镁的储存制剂。这个制剂保存在-80℃。
更一般地，直到今天在该文献中描述的以三羟甲基氨基甲烷为主要成分的制剂系统地含有氯化镁(一般1毫摩尔)或/和具有生理浓度的盐(一般，150毫摩尔NaCl)。作为示例，例如可以列举[《细胞》(Cell)，68，143-155(1992)；《自然遗传学》(Nature Genetics)，3，229-234(1993)；《人体基因治疗》，6，5-11(1955)；《人体基因治疗》，6，145-153(1995)；《人体基因治疗》，6，277-287(1995)；《人体基因治疗》，6，643-666(1995)；《人体基因治疗》，6，1039-1044(1995)；《人体基因治疗》，6，1317-1322(1995)；《人体基因治疗》，6，1587-1593(1995)；《人体基因治疗》，7，2177-2184(1996)；《病毒学杂志》，73，1601-1608(1999)]。这些作者明确指出，病毒保存系统地在-70℃/-80℃下完成。
自此曾表明，病毒结构的演变(聚积和溶解)是一个非常依赖于如某些添加到溶液中反阳离子浓度因素，也非常依赖于如腺病毒浓度因素的现象。在约1E12pv/毫升浓度以上，根据使用的药物组合物，在几小时至几天内可观察到衣壳聚积和分裂作用(因此丧失感染能力)，而在低浓度下，这些现象变得比较缓慢。因此，长时间保存高度浓缩的病毒颗粒组合物是特别困难的。
于是，人们发现并且构成本发明目的的是，在温度+4至+20℃之间，能够在缓冲溶液中呈悬浮液状保存在含水介质中的感染重组病毒，所述缓冲液能够将介质的pH固定在弱碱性值，而缓冲液中被加入了甘油，但是未添加二价金属阳离子或碱金属阳离子。
更确切地，介质的pH固定在8.0-9.6。
在添加甘油的缓冲液中含有腺病毒颗粒的液体或冻凝组合物属于本发明的范围。这些组合物具有的突出优点是良好的稳定性，同时特别适合长期保存高浓度病毒颗粒。
根据本发明，能够将介质的pH固定在8.0-9.6的缓冲溶液，或者由含有Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]或赖氨酸与选自强酸(例如盐酸)或弱酸(例如马来酸、苹果酸或乙酸)的酸的酸/碱体系组成，或者由含有Hepes[2-(4-(2-羟基乙基哌嗪)-1-基)乙烷磺酸]和强碱(例如氢氧化钠)的酸/碱体系组成。
优选地，pH固定在8.4-8.8，更优选地固定在8.4(在25℃测量值)。
以在对pH值不会产生不利影响的范围或体积内施加缓冲作用的方式确定缓冲液的浓度。酸+碱的摩尔浓度可以是10-500毫摩尔，优选地是20-100毫摩尔，更优选地是固定在20毫摩尔。在本发明的缓冲体系中，Tris/HCl缓冲溶液在浓度20毫摩尔可得到特别令人满意的结果。
根据本发明，该组合物含有10-50％甘油，优选地是20-25％(体积/体积)。
本发明的组合物还可以任选地含有其他添加剂。这些添加剂可以选自聚合物(聚乙二醇，例如PEG 400，PEG 8000)、特别是其量为约1-20％(重量)聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共混物(例如Pluronic F68)，聚山梨酸酯(特别是吐温20，例如0.01-1％(重量))，或选自糖，例如像蔗糖、甘露糖醇或葡萄糖(特别是约5-10％)，或选自1-10％(体积)醇(特别是乙醇)。
发明概述本发明的组合物特别适合于保存高浓度腺病毒制剂。事实上，如此稳定化处理的组合物能够使病毒颗粒保持呈含水液体悬浮液状(特别是+4至+20℃)，同时保持其病毒感染能力，甚至在非常高的病毒浓度(从1E8pv/毫升值直到1E12pv/毫升或直到1E13pv/毫升，甚至可以直到5E13pv/毫升)也是如此。
根据本发明的另一种可供选择方案，该病毒也可以在-20℃下冻凝，于是可保存几个月或更长的时间，然后该配方解冻，而不损害其结构与感染能力。
根据本发明，通过将开始在水溶液中得到的然后纯化的腺病毒颗粒悬浮于缓冲溶液中、接着加入甘油以及任选地加入如前述添加剂，可以制备这些组合物。
根据衣壳体包裹作用的反式互补(transcomplementante)细胞系，例如293细胞系或PER-C6细胞系通常的产生方法，可以得到感染性重组腺病毒。然后，这些病毒颗粒可以采用例如在《普通病毒学杂志》(Journal of GeneralVirology)，34，19-35(1977))中描述的氯化铯梯度离心法进行纯化。更优选地，采用阴离子交换与凝胶过滤方式、疏水方式的液相色谱法，或采用金属螯合作用纯化病毒颗粒。采用阴离子交换纯化是特别有利的，因为这种纯化通过仅一步色谱就能够得到纯的病毒制剂，脱去了蛋白，核酸和其他来自生产细胞的杂质和代谢物，脱去了由培养基带来的化合物。在国际申请WO 98/00524或如下面实施例中描述了优选的色谱纯化方式。然后，特别地使用渗析法、透滤法或凝胶过滤色谱法在选择的保存缓冲液中配制腺病毒颗粒。
如此得到的组合物可以任选地冻凝并保存在所希望的储存温度下(例如-20℃)，但这种操作对于长期保存不是必需的，这些组合物在液态下在+4℃至+20℃是稳定的。
本发明的组合物是稳定的，在+4℃在至少12个月的时间内，或在+20℃至少5个月的时间内没有显著退化[物理和生物的稳定性(感染能力)]。物理上稳定的溶液，更特别地应当理解为在所考虑的保存期之后未出现颗粒凝结、沉积或沉淀物(通过目视估计，测量光密度、电子显微镜分析或颗粒大小分布分析)的溶液。
本发明更特别地涉及保存呈稳定形式的感染性腺病毒，还涉及用于这种保存的液体或冻凝组合物。
本发明配方的优点在于所制备的第一个组合物使得有可能在温度+4℃至+20℃下保存呈液体形式的腺病毒，同时还具有达到高病毒浓度的可能性。本发明在其应用于重组腺病毒方面是特别有意义的，而它可以一般地应用于任何腺病毒(野生的或重组的)。
作为实例，特别可以列举有利地在本发明组合物中保存的下述腺病毒所有人的野生腺病毒，它们属于六个已知的被称为A、B、C、D、E和F的亚组，更特别地组成这六个亚组的所有人的腺病毒的49种不同血清型。同样地，本发明能够应用于猴、牛、马、猪、羊或狗的野生病毒，它们属于腺病毒科。此外，本发明能够应用来自属于腺病毒科的野生病毒的突变病毒。
在本发明适用的重组腺病毒载体中，可以列举在被称作E1的基因组区域内，或在E2区域内，或在E3区域内或在E4区域内，所有具有一个或多个缺失的修饰的腺病毒，以及在上述区域中有多个组合缺失的重组病毒，以及本发明可以应用于完全缺失的重组病毒(称之gutless)[FASEB，11，615(1997)]。
同样地，本发明也应用于还含有所感兴趣的核酸的重组腺病毒载体。所感兴趣的核酸可以插入腺病毒基因组中的不同部位。有利地，它插入E1、E3和E4区域处。但是，很清楚的是可以使用其他位点。特别地，进入基因组核苷酸序列能够使本领域技术人员确定可插入所感兴趣的核酸的区域。所感兴趣的核酸可以是任何导入的DNA序列，特别是寻求在靶细胞中转移和/或表达的任何序列。
特别地，它可以含有一个或多个治疗基因和/或一个或多个编码抗原蛋白的基因。可以如此转移的治疗基因是其在靶细胞中转录和任选的翻译产生具有治疗作用产物的任何基因。在治疗产物中，更具体地可以列举酶、血衍生物、荷尔蒙、淋巴因子白细胞介素、干扰素、TNF等(WO 93/19191)，生长因子、神经递质或它们的前体或合成酶、营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等，载脂蛋白ApoAl、ApoIV、ApoE等(WO 94/25073)、肌营养不良蛋白或微肌营养不良蛋白(minidystrophine)(WO 93/06223)、能够控制restenose的基因GAX、NOS等，肿瘤抑制基因p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等(WO94/24297)、凝结作用中所涉及因子的编码基因因子VII、VIII、IX，自杀基因TK等，天然或人工免疫球蛋白Fab、ScFv(WO 94/29446)，抗编程性细胞死亡基因AKT等。
治疗基因还可以是一种基因或一种反义(antisen)序列，它们在靶细胞中表达能够控制基因表达或细胞信使RNA转录。根据在专利申请EP 140 308中描述的技术，这样一些序列例如可以在靶细胞中转录成细胞信使RNA的互补RNA，于是阻断它们翻译成蛋白。
同样地，本发明应用于能够产生逆转录病毒的重组腺病毒载体[TumorTargetting，3，59(1998)]，还应用于在一个或多个病毒衣壳的结构蛋白中含有一个或多个修饰的腺病毒，特别是纤维(蛋白IV)和六邻体腺病毒蛋白(蛋白II)，或应用于无纤维的腺病毒[《病毒学杂志》，73，1601(1999)]，加入每个修饰的目的在于改变腺病毒的自然向性[Current Opinion in Biotechnology，8，583(1997)]。
另外，由于本发明的组合物可以用于制备用来通过基因疗法进行治疗或预防治疗的药物，所以它们是特别有意义的。
感染性病毒有许多应用，其中可以列举它们在般种疫苗方面和基因治疗方面的应用。在这些应用中，在将它们的基因物质(RNA或DNA)转移到宿主细胞之后，这些病毒利用感染细胞的细胞器实现其固有的基因组编码的蛋白的合成，因此诱导出所要求的特异生物效应。在基因治疗的应用中，带有治疗意义基因的感染重组病毒被用来将这种基因转移到待治疗病人器官的特定细胞中。多种治疗方案得到描述并且目前处于用于借助病毒载体转移和表达治疗基因的临床评价过程中。在这些载体中，近年来为转移治疗蛋白的编码基因，曾广泛地研制非复制腺病毒载体。在这些基因中，可以列举在控制细胞繁殖时涉及的肿瘤抑制基因p53。在抗肿瘤适应症方面，目前已研制各种在人体中使用腺病毒转移p53基因的临床试验方案。在其他研制应用中，可以列举治疗粘液粘稠症。
使用腺病毒载体作为治疗剂只是在掌握了能够在足够长的时间内保存和储存这些制剂而又不严重丧失上述病毒的感染能力的方法的条件下才能够实现。因此，本发明是特别有意义的。
非限制性地给出的下述实施例表明本发明的实施方法以及组合物的稳定性和如此配制的颗粒的感染能力。
实施例1本发明组合物的制备按照下述方式制备病毒悬浮液在CellCube(Costar)中，在补充10％胎牛血清的DMEM介质中培养细胞293。它们汇合时，用一等份表达p53基因的腺病毒工作库试样以感染复数2感染这些细胞。感染五天之后，采用排水法收集产生的上清液，再通过流经一组孔隙度逐渐降低(10/1/0.8-0.2微米)的过滤器澄清。这种上清液然后采用在截留阈为300kDa的Millipore膜上的切向超滤浓缩达20倍体积。然后用平衡的Source 15Q柱色谱纯化病毒，用在20毫摩尔Tris/HCl，pH8.0缓冲液中氯化钠溶液梯度洗脱。收集病毒峰，并采用在截留阈为300kDa的Millipore膜上的切向超滤浓缩该病毒。如此得到病毒制剂的纯度非常高，含有＜50纳克牛血清白蛋白和＜10纳克1E12病毒颗粒的宿主细胞的DNA。该病毒再配制在各种选择的缓冲液中。为了进行这种操作，对装有按照供应商说明书选择的缓冲液洗脱和平衡的Sephadex G-25的PD-10(Amersham-Pharmacia Biotech)柱通过色谱法进行缓冲液更换。在用色谱测定之后，如果必要，可通过稀释在选择的制剂缓冲液中，将病毒浓度调节到目标值。对于每种选择的配方，在研究的温度(-20℃，+4℃或+20℃)下，在聚丙烯管中放入2毫升病毒悬浮液，研究在各种配方中的病毒稳定性。然后，在这个温度下，在确定的时间内保存上述每个试验的样品(参见下面实施例)。
通过将待分析溶液放在碳化格栅上，然后用1.5％醋酸铀酰进行负染色处理，进行电子显微镜分析。这些分析使用的设备是Jeol 1010电子显微镜，操作电压为50-100千伏。
借助Coulter N4+装置(Coultronic)，采用光子相关光谱法(PCS)进行病毒颗粒的大小分布分析。
能够定量病毒颗粒的HPLC(高效液相色谱)分析按照如下所述进行在HR5/5型柱(Amersham-Pharmacia Biotech)中制备装填约1毫升QSepharoseXL(45-165微米；Amersham-Pharmacia Biotech)的色谱柱。这种柱子安装在配置UV/可见光探测系统的HPLC体系上，该探测系统在吸收范围为200-300nm下操作，该柱用来分离与定量测定病毒颗粒。在每次分析之前，该柱于30℃以流速1.5毫升/分钟用20毫摩尔Tris/HCl，pH7.5缓冲液进行平衡。含病毒颗粒的待分析样品注入柱上。在注入之后，该柱用5个体积的同样缓冲液进行冲洗，再用30个柱体积线性梯度为0-1M的氯化钠在20毫摩尔Tris/HCl，pH7.5缓冲液中的溶液洗脱固定的物种。在梯度变化结尾，在进行再平衡之前，用2个柱体积的0.5N氢氧化钠溶液洗涤柱子，以便下面的分析。
用色谱纯化的腺病毒颗粒制剂在260nm构建标准曲线。通过使用在260nm每单位吸收率为1×1010颗粒的转化系数，借助在0.1％SDS溶液中于260nm处的吸收率预先测定这种标准制剂，结果以颗粒数表示。这些样品在用色谱分析之前经过滤器(0.22微米)过滤。
F.L.Graham等人在《分子生物技术》(Molecular Biotechnology)，3，207(1995)中描述了腺病毒滴定技术。在Boyle等人在《第五次病毒载体和疫苗年会(1998)》上发表的“使用免疫滴定法测量腺病毒载体活性”中描述了采用免疫滴定测量五邻体腺病毒蛋白表达，接着采用流式细胞计量术定量测量的技术。
实施例2在+4℃下保存本发明的组合物；病毒颗粒的物理稳定性下面的表表明随缓冲溶液性质变化所得到的结果，以及采用色谱分析这些制剂所测定的病毒颗粒的物理稳定性
*Tris/HCl20毫摩尔；pH＝8.4，％甘油体积/体积，％蔗糖体积/体积实施例3在+4℃保存本发明的组合物；甘油浓度的影响下面表表明随配方中甘油浓度变化所得到的结果，以及通过制剂的色谱分析所测定的病毒颗粒的物理稳定性
*Tris/HCl20mM，pH＝8.4上表中列出的结果清楚地证实，10％(体积/体积)含量对于长达6个月期间内病毒颗粒的物理稳定化是有效的。对于包括10％以上甘油的配方，这一有效性在至少1年期间内得到证实。任何已知配方在如此长的期间内都没有带来稳定作用特别是含有10mM Tris/HCl+1mM MgCl2+1M蔗糖的配方被证实不适合于稳定高浓度(6.9×1012pv/ml)腺病毒颗粒，病毒浓度从第2个月开始快速降低。
实施例4在+4℃或+20℃，根据本发明保存的腺病毒的感染能力通过用于表达病毒颗粒含有的转基因以及导致相应蛋白表达的病毒颗粒的容量测量了病毒颗粒的感染能力。这里所述蛋白是通过使用抗体(抗五邻体)标记法完成的免疫滴定法、接着通过流式细胞计量术分析检测的五邻体腺病毒蛋白(蛋白III)。得到的结果用每毫升溶液感染单位(UI/ml)表示。计算pv/IU比是表达感染效价随时间推移而变化的第二种方式。在使用的试验条件下，对于在保存之前新得到的病毒制剂，这个比值是约20±10。
下表表明，在+4℃保存6个月或12个月后，或在+4℃保存1个月、然后在+20℃保存3.5个月之后，用甘油或蔗糖配制的病毒颗粒的感染能力。
*Tris/HCl20mM，pH＝8.4
该研究表明，对于所有甘油浓度等于或高于10％，更特别地对于所有甘油浓度等于或高于15％，在+4℃特别好地保存病毒活性。同样地，在+4℃保存1个月、然后在+20℃保存3.5个月的含有至少10％甘油的制剂保存其感染能力。首次证明了在室温下长期保存非常浓的腺病毒制剂的可能性。含有蔗糖和氯化镁的对比配方无论在+4℃还是在+20℃都不能保存浓病毒(6.9×1012v/ml)。低浓度(0.36×1012pv/ml)配方在+4℃保存一个月、然后在+20℃保存3.5个月之后其效价降低。含有蔗糖的配方在增加其浓度时是完全不适合的。
在保存三个月之后，采用电子显微镜分析了不同的制剂，这些分析表明在20％甘油浓度下，这些颗粒呈现为天然的、实心的、完整的和对称的颗粒。实际上在介质中未检测到任何自由的亚单位。与此相反，在高病毒浓度的对比配方中，这些病毒颗粒大部分聚结成含有约50个颗粒的块状，或者聚结成丝结构状。某些颗粒失去一部分其衣壳体，具有比较圆的或椭圆形结构。这些衣壳体和游离纤维在介质中仍完全分散，因此是非常易于观察的。在+4℃与+20℃同样好地观察它们。
在+4℃12个月之后，在20％甘油中保存的病毒颗粒未出现变化(实心的、完整的和对称的)。
实施例5于-20℃保存的在Tris/HCl+甘油中配制的腺病毒制剂的感染能力在这个实施例中，采用以pfu/ml表示的滴定法测定了病毒颗粒感染能力。pfu(“蚀斑形成单位”)这一表达方式相应于腺病毒溶液感染能力的量度。通过感染适当的细胞培养液，并一般地在培养15天后测量感染细胞斑点数进行这种测定。这些剂量基于生物学方法，并且得到的值在某种测量中是采用的操作条件的函数[J.Virol.，70，7498(1996)]。
下表表明在pfu试验中测量的在-20℃保存2个月病毒制剂的感染效价。
感染效价的测量值，更特别地pv/pfu比表明，无论是通过冻凝/解冻凝步骤还是通过在-20℃保存2个月都不会改变病毒颗粒。(初始病毒制剂的这个比值是20-30左右)。
实施例6在+4℃保存本发明的组合物；病毒颗粒的物理稳定性下表表明随缓冲液性质而变化所得到的结果以及采用色谱分析制剂测定的病毒颗粒的物理稳定性
实施例7在+4℃保存本发明的组合物；缓冲液pH的影响下表表明缓冲液的pH/值对在20mM Tris与10％甘油中配制的病毒颗粒在保存3个月后感染能力的影响
该研究表明，在含有10％甘油的20mM Tris/HCl配方中在pH为8.0-9.5的条件下在+4℃下病毒活性保存得特别好。
在pH小于8.0时，在+4℃其稳定性无法继续得到保证。
权利要求
1.含有腺病毒颗粒的液体或冻凝组合物，其特征在于它含有能够将介质的pH固定在8.0-9.6的缓冲液，该缓冲液中添加了甘油，但是未添加二价金属阳离子或碱金属阳离子。
2.根据权利要求1的液体或冻凝组合物，其特征在于该缓冲液是能够将介质的pH固定在8.4-8.8的溶液。
3.根据权利要求2的液体或冻凝组合物，其特征在于该缓冲液是能够将介质的pH固定在8.4的溶液。
4.根据权利要求1的液体或冻凝组合物，其特征在于所述缓冲液是由含有Tris或赖氨酸和选自强酸或弱酸的酸的酸/碱体系组成或由含有Hepes和强碱的酸/碱体系组成。
5.根据权利要求4的液体或冻凝组合物，其特征在于所述缓冲液由选自体系Tris/HCl、赖氨酸/HCl、Tris/马来酸、Tris/苹果酸、Tris/乙酸和Hepes/氢氧化钠的酸/碱体系组成。
6.根据权利要求1-5中任一项的液体或冻凝组合物，其特征在于它还含有选自聚合物、糖或醇的添加剂。
7.根据权利要求6的液体或冻凝组合物，其特征在于所述聚合物选自聚乙二醇、聚环氧乙烷聚环氧丙烷共混物或聚山梨酸酯，所述糖选自蔗糖、葡萄糖或甘露糖醇，所述醇是乙醇。
8.权利要求1-7中任一项的组合物在腺病毒保存中的应用。
9.权利要求1-7中任一项的腺病毒颗粒组合物在制备用于基因治疗的药物中的治疗或预防性应用。
全文摘要
含有腺病毒颗粒的液体或冻凝组合物,它含有能够将介质的pH固定在弱碱性值的缓冲液,该缓冲液中添加了甘油,但是未添加二价金属阳离子或碱金属阳离子。
文档编号A61K35/76GK1347450SQ00806090
公开日2002年5月1日 申请日期2000年4月7日 优先权日1999年4月9日
发明者F·布兰奇, 施香君 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司