含有三肽的药用组合物的制作方法

专利名称：含有三肽的药用组合物的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及发现了调节蛋白质聚合和超分子蛋白质复合物装配所需的蛋白质-蛋白质相互作用的肽。更具体地说，公开了包含具有修饰的羧基末端的各种小肽的生物技术工具和药物，用于人类疾病的研究和治疗或预防。
本发明背景诸如转录复合物，细菌毒素，蛋白丝和束，和病毒蛋白外壳的超分子结构由称为“亚基”的许多分子经非共价装配形成。亚基之间的蛋白质-蛋白质相互作用稳定这些复合物且提供结构完整性。这一过程在进化上具有优势，因为从较小亚基构建大型结构允许从最少量的遗传信息获得高度多样的复合物群体，该结构的装配和解装配易于控制(因为亚基通过极低能量的多键相连)，可更容易地避免该结构合成中的错误，因为在装配过程中可运行校正机制以排除错误形成的亚基。(参见，Alberts等，细胞分子生物学(Molecular Biology of the Cell)，第三版，纽约和伦敦的Garland出版公司，第123页(1994))。
调节基因表达的许多蛋白质和蛋白质复合物(例如转录激活物和抑制剂)通过蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质聚合实现与核酸的强相互作用。在简单的情况下，一个亚基与另一亚基相连形成二聚体。两个单体之间的蛋白质-蛋白质相互作用可稳定该二聚体。例如，螺旋-转角-螺旋蛋白质是包含几百个DNA-结合蛋白的一个蛋白质家族，该蛋白质作为对称二聚体与由也对称排列的两个非常相似的“半位点”组成的DNA序列结合。该排列允许各蛋白质单体形成几乎相同的接触对且极大地增加结合亲和力。第二组重要的DNA-结合基序利用一个或多个分子的锌作为结构成份。这种锌协同的DNA-结合基序称为锌指，它也形成二聚体，允许各亚基的两个α螺旋中的一个与该DNA的大沟相互作用。另外，第三种蛋白质基序称为亮氨酸拉链基序，它以二聚体的形式识别DNA。在亮氨酸拉链结构域中，分别来自各单体的两个α螺旋结合起来形成一个短的卷曲螺旋。含有亮氨酸拉链基序的基因调节蛋白可形成同型二聚体，其中两个单体是相同的，或者可形成杂二聚体，其中的单体不相同。作为二聚体与DNA结合的第四组调节蛋白含有螺旋-环-螺旋基序。与亮氨酸拉链蛋白一样，螺旋-环-螺旋蛋白质可形成同型二聚体或杂二聚体。(参见，Alberts等，细胞分子生物学，第三版，纽约和伦敦的Garland出版公司，第124页(1994))。许多基因调节蛋白，特别是转录因子，依赖于蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白聚合发挥适当的功能。
同样，一些细菌毒素的功能依赖于蛋白质-蛋白质相互作用和亚基的聚合。例如，百日咳毒素，白喉毒素，霍乱毒素，假单胞菌外毒素A，大肠杆菌的热不稳定性毒素，Vero细胞毒素，和志贺菌毒素具有相似的结构，其特征在于具有一个酶活性A亚基，它与形成全毒素所需的B亚基的寡聚体聚合。(Stein等，自然(Nature)，355748(1992)；Read等，美国专利号5856122；Lingwood，微生物学动态(Trends inMicrobiology)，4147(1996))。许多人相信B亚基从共同的祖先蛋白质(例如，识别细胞表面糖类的五聚体蛋白质)趋异产生且变成与不同酶成份相联系。(Stein等，自然，355748(1992))。
除了小的超分子结构外，自然界中也存在由多个亚基组成的大型超分子复合物。当机械强度在细胞中最重要时，分子装配通常由丝状而不是球状亚基组成。鉴于在一些基因调节蛋白家族中短的卷曲螺旋用作二聚体化结构域，更常见的是卷曲螺旋延长到超过100nm且用作大型纤维状结构，例如肌动蛋白粗丝或微管蛋白束的构件。(Alberts等，细胞分子生物学，第三版，纽约和伦敦的Garland出版公司，第124-125页(1994))。然而，大型丝状结构的累积在有些情况下是有害的，且聚合蛋白质的无节制沉积与各种形式的癌症和淀粉样变性相关的神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病和瘙痒症(朊病毒相关疾病)相关。
一些蛋白质亚基也装配成扁平片状，其中该亚基以六角形阵列进行排列。特化的膜蛋白通常在脂双层中以这种方式排列。单个亚基几何学轻微改变时，六角形片状可转变成管状，或改变更大时转变成空心球。这些原则在许多病毒蛋白衣壳的装配中可明显得到证明。这些外壳通常由几百个相同的蛋白亚基组成，它们包围并保护病毒核酸。这种衣壳的蛋白质具有适应性特别强的结构，因为它形成几种不同类型的接触且一旦病毒进入细胞也可改变其排列释放出核酸以启动病毒复制。用于形成大分子和细胞的许多复杂装配的信息包含在亚基本身中，因为在合适条件下，分离的亚基可自发装配成最终结构。
自然界中存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用对于介导蛋白质功能，蛋白质聚合和超分子复合物装配是必需的。转录因子，转录复合物，细菌毒素，纤维装配和病毒衣壳的缔合依赖于蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质聚合。发现选择性抑制这些蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质聚合事件的物质使得用于研究，治疗和预防许多疾病的新型生物技术工具，治疗剂和预防剂的开发成为可能。
本发明概述本发明的实施方案包括抑制蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和超分子复合物装配的修饰的小肽(二到十个氨基酸长)。称为蛋白质聚合抑制剂的该肽试剂(peptide agent)的选择，设计，生产，表征和应用统称为“PPI技术”。PPI技术的应用可延伸到许多领域，包括但不限于生物技术研究和开发，以及治疗性和预防性药物。
许多生化事件(例如，转录因子二聚体，转录复合物，细菌毒素，和丝状或束状结构的形成，和病毒衣壳的装配)依赖于将蛋白质亚基装配成蛋白质聚合物和复合物的蛋白质-蛋白质相互作用。对于其特定功能依赖于二，三，四或多聚的超分子结构，破坏其装配的一种方法是构建影响该蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合，和复合物装配的小分子。发现在羧基末端用酰胺基取代羟基的小肽具有这种抑制效应。因此，本发明的实施方案包括影响蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和蛋白质复合物装配的修饰的小肽。
在期望的实施方案中，修饰的短肽与蛋白质在涉及蛋白质-蛋白质相互作用和/或亚基装配的区域结合，从而抑制或防止蛋白质聚合或蛋白复合物形成。在一些实施方案中，具有序列相应于转录因子序列的小肽与转录因子的单体相互作用并防止二聚体化。在其它实施方案中，具有相应于转录激活物或抑制剂的序列的小肽与该蛋白质相互作用并调节转录激活物或抑制剂复合物的装配。例如，NF-κB/IκB复合物不能激活转录，然而与NF-κB或IκB在涉及能稳定复合物的蛋白质-蛋白质相互作用的区域相互作用的小肽可调节复合物形成(例如，抑制或防止或增强)，以便增强基因表达或防止或延迟基因表达。通过施用具有相应于涉及复合物装配或稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的区域的序列的小肽可提供调节NF-κB和IκB复合物装配的方法。另外，提供了鉴定调节NF-κB和IκB复合物装配的小肽的方法。鉴定其具有调节NF-κB和IκB复合物装配的能力的小肽可用作生物技术工具或可给药以治疗或防止与NF-κB和IκB复合物异常调节相关的疾病。
在其它实施方案中，使用相应于诸如百日咳毒素，白喉毒素，霍乱毒素，假单胞菌外毒素A，大肠杆菌的热不稳定性毒素，和Vero细胞毒素等细菌毒素的亚基中的序列的修饰小肽来防止或抑制细菌全毒素的装配。例如，提供了通过施用具有相应于涉及形成全毒素的亚基装配或稳定的蛋白质-蛋白质相互作用区域的序列的小肽抑制或防止百日咳毒素装配和发挥功能的方法。另外，提供了鉴定抑制或防止细菌全毒素装配的其它小肽的方法。鉴定其具有抑制细菌全毒素形成的能力的小肽可用作生物技术工具或可给药以治疗或防止细菌全毒素的毒性影响。
其它实施方案包括生产和鉴定抑制诸如肌动蛋白，β-淀粉样肽和朊病毒相关蛋白等丝状蛋白聚合的小肽。提供了通过施用具有相应于涉及蛋白质聚合的蛋白质-蛋白质相互作用的区域的序列的修饰小肽抑制或防止肌动蛋白，β-淀粉样肽和朊病毒相关蛋白的聚合的方法。另外，提供了鉴定抑制或防止蛋白质聚合的小肽的方法。鉴定其具有抑制肌动蛋白，β-淀粉样肽和朊病毒相关蛋白聚合的能力的小肽可用作生物技术工具或可给药以治疗或防止与肌动蛋白，β-淀粉样肽和朊病毒相关蛋白异常聚合相关的疾病，包括神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病和瘙痒症。
本发明的其它方面包括生产和鉴定抑制微管蛋白聚合的小肽。几年来已施用微管蛋白聚合抑制剂用于治疗各种形式的癌症，但仍然需要毒性较小的微管蛋白聚合抑制剂。口服施用相应于与微管蛋白聚合有关的微管蛋白序列的小肽具有较小的或没有副作用。提供了通过施用具有相应于涉及微管蛋白聚合的蛋白质-蛋白质相互作用的区域的序列的小肽抑制或防止微管蛋白聚合的方法。另外，提供了鉴定调节(例如，抑制，防止或增强)微管蛋白聚合的小肽的方法。鉴定其具有影响微管蛋白聚合的能力的小肽可用作生物技术工具或可给药以治疗或防止与微管蛋白异常聚合相关的疾病。
在优选的实施方案中，使用相应于与病毒衣壳装配相关的序列的修饰小肽以破坏蛋白质-蛋白质相互作用，从而抑制或防止病毒衣壳装配。例如，小肽Gly-Pro-Gly-NH2(GPG-NH2)，Gly-Lys-Gly-NH2(GKG-NH2)，Cys-Gln-Gly-NH2(CQG-NH2)，Arg-Gln-Gly-NH2(RQG-NH2)，Lys-Gln-Gly-NH2(KQG-NH2)，Ala-Leu-Gly-NH2(ALG-NH2)，Gly-Val-Gly-NH2(GVG-NH2)，Val-Gly-Gly-NH2(VGG-NH2)，Ala-Ser-Gly-NH2(ASG-NH2)，Ser-Leu-Gly-NH2(SLG-NH2)和Ser-Pro-Thr-NH2(SPT-NH2)是优选的种类。提供了通过施用具有相应于涉及病毒衣壳装配或稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的区域的序列的小肽抑制或防止病毒衣壳装配的方法。另外，提供了鉴定抑制或防止病毒衣壳装配的小肽的方法。鉴定其具有抑制或防止病毒衣壳装配的能力的小肽可用作生物技术工具或可给药以治疗或防止病毒感染，例如HIV感染。公开了含有本发明的修饰小肽的药物并提供了制备用于治疗和预防与蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和超分子复合物装配相关的疾病的这类药物，预防剂和治疗剂的方法。
附图的简要描述

图1是未处理的HIV颗粒的电子显微照片的组合。
图2是与蛋白酶抑制剂Ritonavir接触过的HIV颗粒的电子显微照片的组合。
图3是与GPG-NH2接触过的HIV颗粒的电子显微照片的组合。
图4是表示在HUT78细胞中进行的HIV感染试验的结果的图示。
图5显示了相应于HIV-1p24蛋白质羧基末端的蛋白质序列(残基146-231)和HIV-2，SIV，劳斯肉瘤病毒(RSV)，人T细胞白血病病毒-1型(HTLV-1)，小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)，Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)，和莫洛尼鼠类白血病毒(MMLV)的蛋白质序列的序列对比。线段代表主要同源性区域(MHR)。
优选实施方案的详细描述已经公开了具有相应于蛋白质-蛋白质相互作用区域的序列的修饰小肽可防止和/或抑制蛋白质聚合和超分子复合物装配。在许多超分子结构中，蛋白质亚基(例如，蛋白质单体)经历涉及非共价蛋白质-蛋白质相互作用的装配或聚合过程以产生蛋白质分子的聚合物。在羧基末端酰胺代替了羟基的小肽通过抑制产生聚合物所需的蛋白质-蛋白质相互作用破坏了这一聚合过程。这种称为蛋白质聚合抑制剂的小肽在生产用于研究，预防和治疗人类疾病的生物技术工具和药物中有用。而且，下面提供了含有相应于转录因子，细菌毒素，纤维状或束状蛋白质，病毒衣壳蛋白和涉及蛋白质聚合和超分子装配的其它蛋白质的序列的修饰小肽和/或类似于这些小肽的肽模拟物(peptidomimetics)(统称为“肽试剂(peptide agents)”)的生物技术工具和药用组合物的制备方案。
在一些实施方案中，具有相应于转录激活物序列的序列的小肽与转录因子的单体相互作用并防止二聚体化。经过抑制转录激活物(例如，NF-κB)的二聚体化，可有效降低或抑制转录因子激活的基因表达。NF-κB由具有50和65kD分子量的两个蛋白质组成。据认为NF-κB是各种细胞因子基因的基因表达的转录调节剂。(Haskill等，美国专利号5846714)。相应于NF-κB中与稳定激活剂的蛋白质-蛋白质相互作用有关的序列的小肽可破坏该复合物，从而抑制细胞因子基因的表达。该抑制剂可用作生物技术工具和药物(例如，用于治疗其特征为细胞因子基因过度表达的炎症性疾病)。
在其它实施方案中，具有相应于转录激活物或抑制剂的序列的小肽与转录因子相互作用，调节转录抑制剂复合物的装配，从而调节基因表达。如上所述，NFκB是与某些细胞因子基因的DNA调控区结合的转录激活物。(Haskill等，美国专利号5846714)。NF-κB由其与称为IκB的36kD抑制剂蛋白质的缔合来调节。NF-κB和IκB的复合物(“NFκB/IκB”)不能激活转录，然而，当NFκB磷酸化时，IκB解离并发生转录激活。与NF-κB或IκB，优选在涉及稳定NF-κB/IκB复合物的蛋白质-蛋白质相互作用的区域进行相互作用的小肽可抑制或防止复合物形成以便增强基因表达，或者，作为替换，可稳定该复合物，从而防止或妨碍基因表达。经过使用下述方法可鉴定调节NFκB与IκB缔合的许多小肽。如上所述，鉴定其具有调节NF-κB/IκB复合物装配的能力的小肽可用作生物技术工具或可给药以治疗或防止与NF-κB/IκB复合物异常调节相关的疾病。
在其它实施方案中，提供了用于抑制细菌毒素装配所需的蛋白质聚合的小肽的生产，鉴定和使用方法。为了有效，细菌毒素必须将全毒素的催化亚基传递到合适的作用位点。一些细菌毒素通过形成含有两个功能组分，一个催化组分和一个细胞识别或结合组分的超分子结构来适应该问题。例如，在百日咳毒素和Vero细胞毒素中，催化亚基“A”与由涉及毒素结合的5个“B”亚基组成的五聚体集群连接。可使用相应于在诸如百日咳毒素，白喉毒素，假单胞菌外毒素A，大肠杆菌热不稳定毒素和Vero细胞毒素等细菌毒素的亚基中的序列的修饰小肽来防止或抑制细菌全毒素的装配，从而降低或抑制细菌毒素的毒性。下面还提供了抑制细菌全毒素装配的其它小肽的鉴定方法。鉴定其具有抑制细菌全毒素形成的能力的小肽可用作生物技术工具或可给药以治疗或防止细菌全毒素的毒性效应。
另外，抑制肌动蛋白和β-淀粉样肽聚合的小肽的生产和鉴定方法也在本发明的范围内。已表明在细胞膜上β-淀粉样蛋白沉积和聚集或聚合可引起钙流入，后者引起神经细胞损伤。这种神经元损伤已经与一些神经变性疾病相联系，包括但不限于阿尔茨海默氏病，中风和亨廷顿氏病。引起肌动蛋白解聚合的化合物，例如松胞菌素，对于维持钙体内稳态有用而不管是否存在聚合的β-淀粉样肽。下面描述了抑制或防止肌动蛋白聚合和β-淀粉样肽聚集的小肽的鉴定方法。抑制或防止肌动蛋白聚合的小肽可与抑制或防止β-淀粉样肽聚集的小肽结合给药以便为患有某些神经变性疾病的个体恢复钙体内稳态并提供在治疗学上有益的治疗。
本发明的其它实施方案包括生产和鉴定抑制微管蛋白聚合的小肽。几年来已施用诸如长春花碱和长春花新碱等微管蛋白聚合抑制剂来治疗各种形式的癌症，但现在的微管蛋白聚合抑制剂伴随着许多副作用且身体不好接受。相反，口服施用相应于微管蛋白与聚合相关的序列的小肽具有较小或者没有副作用且机体耐受性较好。在下面的说明书中提供了抑制微管蛋白聚合的小肽的鉴定方法。鉴定了其抑制微管蛋白聚合的能力的小肽可用作生物技术工具或可进行给药以治疗或预防癌症。
在一些实施方案中，提供了用于治疗和预防病毒性疾病的相应于病毒衣壳蛋白序列的修饰小肽的生产，鉴定和应用方法。这些小肽与病毒衣壳蛋白结合，抑制病毒衣壳蛋白聚合，从而抑制病毒感染。例如，可使用体外结合试验来证实具有相应于病毒衣壳蛋白p24的序列的小肽与HIV-1的主要衣壳蛋白(p24)结合。而且，经过使用电子显微镜术，显示了该小肽有效破坏衣壳蛋白聚合和衣壳蛋白装配。还提供了诸如GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2等小肽抑制HIV-1，HIV-2和SIV复制的证据。
由于一些蛋白质涉及介导蛋白质聚合和超分子装配的蛋白质-蛋白质相互作用的区域的序列是已知的，因此可使用本文所述的技术，或者在本说明书的教导下对本领域的技术人员而言显而易见的这些试验的变型选择，设计，生产和迅速筛选相应于这些序列的一些修饰的小肽，以鉴定有效抑制和/或防止蛋白质结合或蛋白质聚合的那些小肽。尽管优选的肽试剂是在其羧基末端具有酰胺基的三肽，例如，GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2，但提供这样的抑制蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质聚合的组合物和方法，其包含具有式X1，X2，X3-NH2或式X4，X5，X1，X2，X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，X3，X4和X5是任意氨基酸且其中可缺少任意一个或两个氨基酸。在合适的实施方案中X3是甘氨酸残基。
在一些实施方案中，肽试剂以单体的形式提供；在其它实施方案中，肽试剂以多聚体的形式(Multimeric form)或多聚化形式(multimerized form)提供。在一些实施方案中也使用与支持物结合的肽试剂。含有肽试剂的药用组合物可作为治疗剂或预防剂或两者进行给药用于治疗和/或预防疾病。在一些实施方案中，含有肽试剂的药用组合物可与其它用于特定疾病的常规治疗结合给药。
首先用合理的方法选择并设计肽试剂。即，基于肽试剂的序列与调节蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的蛋白质-蛋白质相互作用有关这一理解选择和设计肽试剂。在选择过程中可借助一些信息，包括但不限于突变分析，蛋白质同源性分析(例如，具有相关结构域的其它序列的分析)，蛋白质模拟和在推理性药物设计中的其它方法。当然，也可随机选择肽试剂。
然后使用常规肽或化学合成方法生产肽试剂。许多肽试剂也可以从商业途径获得。接着，进行试验评估肽试剂结合感兴趣的蛋白质，干扰使得蛋白质聚合和/或超分子复合物装配成为可能的蛋白质-蛋白质相互作用，和预防疾病的能力。本文所述的评估肽试剂结合感兴趣的蛋白质，调节蛋白质聚合或蛋白质复合物装配，和预防疾病的能力的试验统称为“肽试剂表征试验”。应理解，任意数量，顺序，或改良的本文所述肽试剂表征试验均可用于鉴定调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的肽试剂。
在下文中，提供了本发明的一些软件和硬件实施方案，以及可用于辅助本发明肽试剂的选择和设计的计算方法。
软件和硬件实施方案感兴趣的多肽或其片断(例如，涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的蛋白质)的核酸序列和/或蛋白质序列可输入计算机可读介质用于记录和操作。本领域的技术人员可预料到具有感兴趣的蛋白质或其片断的核酸序列和蛋白质序列的计算机可读介质可用于同源性序列、结构和功能域的测定，以及蛋白模型的构建。具有感兴趣的蛋白质或其片断的核酸序列和/或蛋白质序列的计算机可读介质的用途包括能够使用本领域已知的计算机程序比较序列以便进行同源性研究，确定结构和功能域以及开发蛋白质模型以便选择调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合，和蛋白质复合物装配的肽试剂。
可在能被计算机阅读和访问的任何介质上存储，记录和操作涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合，或蛋白质复合物装配的蛋白质的核酸序列和/或蛋白质序列或其片断。本文使用的词语“记录”和“存储”是指在计算机可读介质上存储信息的过程。技术人员容易采纳任何目前已知的在计算机可读介质上记录信息的方法以产生含有本实施方案的核苷酸或多肽序列信息的产品。
技术人员可获得各种数据存储结构以制备其上记录有核苷酸或多肽序列的计算机可读介质。数据存储结构的选择一般以选择访问存储信息的元件为基础。计算机可读介质包括磁可读介质，光可读介质，或电可读介质。例如，计算机可读介质可以是硬盘，软盘，磁带，zip盘，CD-ROM，DVD-ROM，RAM或ROM以及本领域的技术人员已知的其它类型的其它介质。存储了序列信息的计算机可读介质可存在于个人电脑，网络，服务器或本领域的技术人员已知的其它计算机系统中。
本发明的实施方案包括使用本文所述的序列和蛋白质模型信息设计并选择调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合事件，或蛋白质复合物装配的肽试剂的系统，特别是基于计算机的系统。术语“基于计算机的系统”是指用于为该目的分析多肽或其序列的硬件，软件，和任何数据库。基于计算机的系统优选包括上述存储介质，和用于访问和操作序列数据的处理器。本实施方案的基于计算机的系统的硬件包括中央处理器(CPU)和数据库。技术人员容易理解，任一常规可得的基于计算机的系统都是合适的。
在一个具体实施方案中，计算机系统包括与连接主存储器(优选为RAM)和各种辅助存储设备例如硬盘驱动器和可移动介质存储设备的总线相连的处理器。例如，可移动介质存储设备可以是软盘驱动器，光盘驱动器，磁带驱动器等。含有控制逻辑和/或其上记录的数据(例如，涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的蛋白质的核酸序列和/或蛋白质序列或其片断)的可移动存储介质，例如软盘，光盘，磁带等，可插入可移动存储设备中。计算机系统包括一旦插入可移动介质存储设备后用于从可移动介质存储设备读取控制逻辑和/或数据的合适软件。
感兴趣的蛋白质的核酸序列和/或蛋白质序列或其片断可以熟知的方式存储在主存储器，任意辅助存储设备，和/或可移动存储介质中。用于存取和处理核酸序列和/或蛋白质序列或其片断的软件(例如搜索工具，比较工具和模拟工具等)在执行期间存在于主存储器中。
本文使用的“数据库”是指可存储核苷酸或多肽序列信息，蛋白质模型信息和调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的其它肽，化学试剂，肽模拟物和其它试剂的信息的存储器。另外，“数据库”也指可存取其上记录了核苷酸或多肽序列信息，蛋白质模型信息和从本文提供的各种肽表征试验获得的信息的产品的存储器存取元件。在一些实施方案中，数据库存储大量肽试剂和产品的上述信息以便可进行数据比较。即，数据库可存储该信息作为所试验的各肽试剂的“特性描述(profile)”，可比较不同肽试剂的特性描述以便鉴定在衍生肽试剂中产生所需反应需要的功能和结构特征。然后经过分子生物学和蛋白质工程中的常规技术制备这些衍生物分子并在进一步的功能试验中进行检验。另外，当建立采用多个肽试剂的策略时大量肽试剂的特性描述是有用的。多个肽试剂的使用(例如，在治疗或预防疾病的药物中)比施用在一个位点调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合，或蛋白质复合物形成的肽试剂能更有效地调节感兴趣的蛋白质与另一蛋白质的缔合或蛋白质的装配。
感兴趣的蛋白质或肽试剂或两者的序列数据可以各种格式在各种数据处理程序中存储和操作。例如，序列数据可在诸如DB2，SYBASE或ORACLE等本领域技术人员熟悉的各种数据库程序中以诸如MicrosoftWORD或WORDPERFECT等字处理文件，ASCII文件，html文件，或pdf文件作为文本存储。“搜索程序(search program)”是指在基于计算机的系统上执行以对感兴趣的蛋白质的核苷酸或多肽序列与其它核苷酸或多肽序列和上述产生的分子特性描述进行比较的一个或多个程序。搜索程序也指比较一个或多个蛋白质模型与存在于数据库中的一些蛋白质模型和比较一个或多个蛋白质模型与存在于数据库中的一些肽试剂的一个或多个程序。例如，使用搜索程序比较感兴趣的蛋白质或其片断的蛋白质序列中与含肽试剂序列数据库中的序列匹配的区域以鉴定相应的或同源的序列。
“检出程序(retrieval program)”是指在基于计算机的系统中执行以鉴定同源核酸序列，同源蛋白质序列，同源蛋白质模型或同源肽试剂序列的一个或多个程序。检出程序也用于鉴定与数据库中存储的蛋白质序列或蛋白质模型相互作用的肽，肽模拟物和化学试剂。检出程序还用于鉴定数据库中与感兴趣的蛋白质复合物中所需的蛋白质-蛋白质相互作用匹配的特性描述。
在下面的讨论中，描述了一些分子模拟，组合化学，和推理性药物设计的方法用于设计和选择与据信涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的感兴趣的蛋白质相互作用的肽试剂。
推理性药物设计方法在一些实施方案中，使用搜索程序比较感兴趣的蛋白质区域与其它蛋白质以便可更有效地选择和设计调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合，或蛋白质复合物装配的肽试剂。在其它实施方案中，使用搜索程序比较感兴趣的蛋白质区域与肽试剂和肽试剂的特性描述以便可预测肽试剂与感兴趣的蛋白质的相互作用(例如，调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和蛋白质复合物的装配)。这一过程称为“推理性药物设计”。已使用推理性药物设计开发了HIV蛋白酶抑制剂和激动剂用于五种不同的促生长素抑制素受体亚型。(Erickson等，科学(Science)，249527-533(1990)和Berk等，科学282737(1998))。
例如，在一种情况下，感兴趣的蛋白质的蛋白质聚合或蛋白质复合物装配所必须的蛋白质-蛋白质相互作用区域是未知的，但相关蛋白质的该区域是已知的。从感兴趣的蛋白质或其片断的序列或蛋白质模型开始，可迅速鉴定出蛋白质聚合或亚基装配所必须的蛋白质-蛋白质相互作用区域已知的相关或同源多肽。通过比较新发现的同源蛋白质中已知的蛋白质-蛋白质相互作用区域与感兴趣的蛋白质，可鉴定感兴趣的蛋白质中很可能与蛋白质-蛋白质相互作用有关的域且可选择和设计相应于这些区域的肽试剂。
因此，通过两维途径，使用常用于比较两个多肽氨基酸相似性和位置的标准方法可测定序列一致性百分数。使用诸如BLAST或FASTA等计算机程序，对比两个多肽以实现其各自氨基酸的最佳匹配(沿一个或两个序列的全长，或沿一个或两个序列的预定部分)。该程序提供“默认”空缺(opening)扣分和“默认”缺口(gap)扣分，且将诸如PAM250等评分矩阵(标准评分矩阵；参见Dayhoff等，在蛋白质序列和结构图表集(Atlas of Protein Sequence and Structure)，第5卷，Supp.3(1978)中)与计算机程序结合使用。然后按如下计算一致性百分数 在蛋白质基础上比较感兴趣的蛋白质的蛋白质序列与已知序列。例如，使用参数W＝8的BLASTP和允许10个匹配的最大值比较感兴趣的蛋白质的蛋白质序列与在Swissprot release 35，PIR release 53和Genpept release 108公共数据库中发现的已知氨基酸序列。另外，使用参数E＝0.001的BLASTX比较编码感兴趣的蛋白质的蛋白质序列与Swissprot中公众已知的氨基酸序列。一旦鉴定了一组相关的多肽，可查阅关于相关蛋白质序列的可获得的文献以便鉴定一个或多个相关蛋白质，其中已测定了允许蛋白质聚合和蛋白质复合物装配的蛋白质-蛋白质相互作用。由于相关蛋白质的涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合，或蛋白质复合物装配的区域是已知的，可比较这些序列与感兴趣的蛋白质的同源性，记住保守氨基酸取代。以这种方式，可测定以前未知的感兴趣的蛋白质涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和蛋白质复合物装配的区域且该信息可用于选择和设计肽试剂。
另外，当蛋白质聚合和蛋白质复合物装配所必须的蛋白质-蛋白质相互作用的区域未知时，可采用突变分析中的各种技术测定亚基缔合所必须的蛋白质的域。一个技术是丙氨酸扫描(Wells，酶学方法(Methodsin Enzymol.)，202390-411(1991))。用这种方法，可用丙氨酸替代感兴趣的蛋白质中的每个氨基酸残基，一次产生一个突变体，并测量各突变对蛋白质保持蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合事件或参与蛋白质复合物装配的能力的影响。以这种方式分析感兴趣的蛋白质的各氨基酸残基并鉴定具有对亚基缔合或聚合所必须的残基的区域。
也可分离以其调节蛋白质聚合或蛋白质复合物装配所必需的蛋白质-蛋白质相互作用的能力选择的靶特异性抗体，并分析其晶体结构以鉴定可接受肽试剂调节的感兴趣的蛋白质区域。原则上，该方法产生可根据其进行随后设计的药物核心(pharmacore)。以这种方法，经过产生抗功能性的，药物学上有活性的抗体的抗独特型抗体(anti-ids)，一起绕过感兴趣的蛋白质的蛋白质晶体学。作为镜像的镜像，抗独特型抗体的结合位点预期是感兴趣的蛋白质区域的类似物。随后，抗独特型抗体可用于设计和选择肽试剂。
另外，可使用感兴趣的蛋白质的三维结构鉴定涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的蛋白质区域。过去，有许多方式测定蛋白质的三维结构。也许最好的测定蛋白质结构的已知方式涉及使用X射线晶体学。该技术的综述参见Van Holde，K.E.，物理生物化学(Physical Biochemistry)，Prentice-Hall，N.J.第221-239页(1971)。使用该技术，可以较好的精确度查明三维结构。另外，可通过使用中子衍射技术，或使用核磁共振(NMR)测定蛋白质结构。(参见，例如，Moore，W.J.，物理化学(Physical Chemistry)，第4版，Prentice-Hall，N.J.(1972))。
作为替代，可使用基于计算机的蛋白质模拟技术构建蛋白质模型。使用一种方法，通过寻找在已知三维蛋白质结构中与代表残基结构环境的特性描述最匹配的靶序列来解决蛋白质的折叠问题。(参见，例如，Eisenberg等，1995年7月25日授权的美国专利号5436850)。在另一技术中，重叠给定家族中蛋白质的已知三维结构以限定在该家族中结构上保守的区域。这种蛋白质模拟技术也使用同源蛋白质的已知三维结构以接近感兴趣的多肽的结构。(参见1996年9月17日授权的Srinivasan等的美国专利号5557535)。通常使用常规同源性模拟技术来构建蛋白酶和抗体的模型。(Sowdhamini等，蛋白质工程(ProteinEngineering)，10207，215(1997))。当感兴趣的蛋白质与模板蛋白质具有较低的序列相同性时，也可使用比较方法建立三维蛋白质模型。在一些情况下，尽管具有极弱的序列相同性，蛋白质也折叠成相似的三维结构。例如，尽管序列同源性较弱，但许多螺旋形细胞因子的三维结构按相似的三维拓扑学折叠。
当在序列水平上不能检测靶和模板之间的结构相关性时，最近形成的线型化(threading)方法和“模糊”(fuzzy)方法在许多情况下现在使得可能的折叠方式和功能蛋白域的鉴定成为可能。一种方法是，使用多序列线型化(Multiple Sequence Threading，MST)进行折叠识别并使用构建低分辨模型的距离几何学程序DRAGON从线型化输出推断结构等价性。然后使用诸如QUANTA等分子模拟包构建全部原子示意图。
根据该3步法，首先使用新型折叠识别算法MST鉴定候选模板，该算法能同时将多个对比序列线型化到一个或多个3-D结构上。在第二步中，从MST输出获得的结构等价性可转变成残基间距离限制并与从二级结构预测获得的辅助信息一起输入距离几何学程序DRAGON中。该程序以无偏方式组合这些限制并迅速产生大量低分辨模型构象(confirmations)。在第三步中，使用分子模型包QUANTA将这些低分辨模型构象转变成全部原子模型并进行能量最小化。(参见，例如，Aszodi等，蛋白质结构，功能和遗传(ProteinsStructure，Function，and Genetics)，增刊，138-42(1997))。
在一个方法中，通过上述x-射线晶体学，NMR，或中子衍射和计算机模拟测定感兴趣的蛋白质或蛋白质复合物的三维结构。有用的蛋白质或蛋白质复合物模型也可仅通过计算机模拟获得。鉴定涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和蛋白质复合物装配的蛋白质区域并选择和设计相应于这些区域的肽试剂。然后生产候选肽试剂并在本文所述的肽试剂表征试验中检测。可合成相关肽试剂文库，然后在肽试剂表征试验中筛选这些分子。鉴定产生所需反应的化合物，记录在计算机可读介质上，(例如，生成特性描述)并重复该方法以选择最佳肽试剂。各新鉴定的肽试剂和其在肽试剂表征试验中的性能记录在计算机可读介质上并产生关于各种肽试剂特性描述的数据库或文库。研究者使用这些特性描述来鉴定活性和无活性分子之间的重要特征区别以便丰富肽试剂文库(例如，用于采用多个肽试剂的方法)中具有有利特征的分子。
另外，感兴趣的蛋白质或蛋白质复合物的三维模型可保存在第一数据库中，相应于蛋白质或蛋白质复合物的肽试剂及其特性描述的文库可保存在第二数据库中，可在给定用肽试剂的特性描述限定的参数时使用搜索程序比较第一数据库的模型与第二数据库的肽试剂。然后可使用检出程序获得推断为调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合或蛋白质复合物装配的一个肽试剂或者多个肽试剂。随后，可在肽试剂表征试验中筛选这些肽试剂。这一技术对于迅速筛选和设计肽试剂极其有用且可用于涉及人类疾病的治疗方案。
许多计算机程序和数据库可用于本发明的实施方案以选择和设计肽试剂。下面所列的并不是对本发明的限制，而是提供对上述方法有用的程序和数据库的指南。可使用的程序和数据库包括但不限于MacPattern(EMBL)，DiscoveryBase(分子应用集团(MolecularApplications Groups))，GeneMine(分子应用集团)，Look(分子应用集团)，MacLook(分子应用集团)，BLAST和BLAST2(NCBI)，BLASTN和BLASTX(Altschul等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，215403(1990))，FASTA(Pearson和Lipman，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，852444(1988))，Catalyst(分子模拟公司(Molecular Simulations Inc.))，Catalyst/SHAPE(分子模拟公司)，Cerius2.DBAccess(分子模拟公司)，HypoGen(分子模拟公司)，InsightII，(分子模拟公司)，Discover(分子模拟公司)，CHARMm(分子模拟公司)，Felix(分子模拟公司)，DelPhi(分子模拟公司)，QuanteMM(分子模拟公司)，Homology(分子模拟公司)，Modeler(分子模拟公司)，Modeller 4(Sali和Blundell，分子生物学杂志，234217-241(1997))，ISIS(分子模拟公司)，Quanta/Protein Design(分子模拟公司)，Weblab(分子模拟公司)，WebLab Diversity Explorer(分子模拟公司)，Gene Explorer(分子模拟公司)，SeqFold(分子模拟公司)，EMBL/Swissprotein数据库，MDL Available ChemicalsDirectory数据库，MDL Drug Data Report数据库。ComprehensiveMedicinal Chemistry数据库，Derwents’s World Drug Index数据库，和BioByteMasterFile数据库。在本文的教导下许多其它的程序和数据库对本领域的技术人员是显而易见的。
一旦选择和设计了肽试剂，可用本领域已知的许多方法来生产。另外，许多商业单位专门生产定制的肽，肽模拟物和化学试剂。下面的讨论提供了生产修饰小肽的一般方法。
获得肽试剂用于获得本文所述的修饰小肽的方法在这一部分公开。用自动肽合成仪(Syro，Multisyntech，Tubingen，德国)化学合成用于本文公开的实验的一些三肽。按照标准方法使用9-芴基甲氧羰基(fmoc)保护的氨基酸(Milligen，Bedford，MA)进行合成。冻干所有的肽，然后以适当的浓度溶于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中。使用PepS-15 C18柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)经过反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析肽。
在许多实施方案中，使用具有连到肽羧基末端上的调节基团的肽(“修饰的肽”)。在有些情况下，通过用氨基取代正常情况下存在于肽末端羧基上的羟基产生修饰的肽。即，代替末端COOH，合成肽具有CO-NH2。例如，优选的小肽包括甘氨酰-赖氨酰-甘氨酰胺(GKG-NH2)，半胱氨酰-谷氨酰胺酰-甘氨酰胺(CQG-NH2)，甘氨酰-脯氨酰-甘氨酰胺(GPG-NH2)，精氨酰-谷氨酰胺酰-甘氨酰胺(RQG-NH2)，赖氨酰-谷氨酰胺酰-甘氨酰胺(KQG-NH2)，丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰胺(ALG-NH2)，甘氨酰-缬氨酰-甘氨酰胺(GVG-NH2)，缬氨酰-甘氨酰-甘氨酰胺(VGG-NH2)，丙氨酰-丝氨酰-甘氨酰胺(ASG-NH2)，丝氨酰-亮氨酰-甘氨酰胺(SLG-NH2)，和丝氨酰-脯氨酰-苏氨酰胺(SPT-NH2)。除了合成的那些外，许多三肽也可从Bachem AG，瑞士购买，包括但不限于GKG-NH2，CQG-NH2和GPG-NH2。
有许多方法合成小肽，且上面的描述提供了获得本文公开的修饰小肽的实施方案的一种可能方法。制备类似于本文所述的小肽的肽模拟物的一些方法在本领域中是已知的。例如，大量的方法可参见美国专利号5288707；5552534；5811515；5817626；5817879；5821231和5874529，本文引用其全文以供参考。
选择，设计和生产肽试剂后，在一个或多个肽表征试验中进行试验以测定该肽试剂调节蛋白质-蛋白质相互作用和/或蛋白质聚合和/或蛋白质复合物装配的能力。例如，肽表征试验可评估肽试剂结合感兴趣的蛋白质，调节蛋白质聚合或蛋白质复合物装配，和预防疾病的能力。下面参照具体实施例和应用描述肽表征试验在鉴定用于掺入生物技术工具和药物的肽试剂中的应用。这些实施例和应用并不打算将本发明的范围限制在所讨论的具体实施方案，因为可采用本文所述的技术来调节一些其它的蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合事件和蛋白质复合物装配。
在下文中，提供了使用PPI技术抑制转录激活物NFκB二聚体化的描述。
转录激活物二聚体化的抑制转录因子rel/NFκB家族的成员在快速细胞反应的调节中起重要作用，例如，那些战胜感染或响应细胞压力所需的反应。这一蛋白质家族的成员以具有不同亲和力的二聚体化形成同型和杂二聚体。它们共有称为rel同源性区域(RHR)的结构基序，其C末端三分之一介导蛋白质二聚体化。(Huang等，结构(Structure)，51427-1436(1997))。已经了解了在其与DNA结合的同型二聚体形式中rel/NFκB家族成员p50和p65的晶体结构。这些结构表明p50和p65的二聚体化域的残基参与DNA结合且DNA-蛋白质和蛋白质二聚体化表面形成一个连续的重叠界面。(Huang等，结构，51427-1436(1997))。而且，已经获得了2.2埃和2.0埃分辨率的鼠p50和p65二聚体化域的晶体结构，对这两个结构的比较揭示了在三个位置的保守氨基酸改变引起其二聚体界面的不同。相应于鼠p50的254，267和307位置的氨基酸对观察到的二聚体化亲和力的区别起主要决定作用。(Huang等，结构，51427-1436(1997))。
可使用上述发现选择和设计调节NFκB二聚体化的肽试剂。使用鼠p50的晶体结构确定了p50的氨基酸残基254，267和307与NFκB的二聚体化相关。可在肽试剂表征试验中设计，生产和筛选相应于包含这些氨基酸残基的重叠序列的肽试剂。另外，可比较鼠p50模型与人p50模型以识别相应于氨基酸残基254，267和307的蛋白质区域。由于小鼠与人NFκB p50蛋白质的高度同源性，很可能氨基酸残基254，267和307或靠近这些位点的氨基酸对于人NFκB的二聚体化是必需的。另外，可选择和设计p50和p65其它区域的肽试剂且优选的肽试剂相应于在rel同源性区域(RHR)C末端发现的序列，它介导蛋白质二聚体化。(Huang等，结构，51427-1436(1997))。
一旦选择，设计和生产了相应于p50和p65区域的肽试剂，在肽试剂表征试验中筛选它们。起初进行结合试验。在一种方法中，将p50，p65或p105二聚体放入具有10,000mw截留的透析膜中(例如，Slide-A-lyzer，Piere)。作为替代方案，可将感兴趣的蛋白质固定在支持物(例如，亲和层析树脂或微量滴定板的孔)上。将放射性标记的肽试剂加入合适的缓冲液中并在4℃下进行结合反应过夜。按标准技术用125I或14C放射标记肽试剂或用其它可检测的信号进行标记。发生结合反应后，去掉含肽试剂的缓冲液，或在无放射性肽试剂的缓冲液中洗涤结合蛋白质的支持物或将含有感兴趣的蛋白质的透析膜在无放射性肽试剂的缓冲液中4℃透析2小时。随后，以闪烁法测量结合到支持物蛋白质上的放射性或透析过的蛋白质中存在的放射性。以这种方式可迅速鉴定结合p50，p65或p105的肽试剂。正如本领域的技术人员可理解的，在具体结合试验中可采用这些结合试验的改良形式，例如通过将感兴趣的蛋白质结合到微量滴定板上并筛选荧光标记的肽试剂的结合可将例如上述试验容易地用于高通量分析。
测定一个或多个肽试剂的结合后，进行评估肽试剂调节NFκB二聚体化的能力的试验。一个这种试验是凝胶移位试验。(参见，例如，Haskill等，美国专利号5846714)。NFκB二聚体结合具有序列TGGGGATTCCCCA(SEQ ID NO.1)的特异性调控DNA增强子，且具有该序列的放射性标记的(例如，32P)寡核苷酸可用于在低百分含量的非变性聚丙烯酰胺凝胶中分辨NFκB和寡核苷酸的复合物。
因此，评估肽试剂抑制NFκB二聚体化的能力的凝胶移位试验按如下完成。按常规方法放射性标记具有NFκB增强子序列的寡核苷酸。在各种浓度的候选肽试剂和具有NFκB的核提取物存在的条件下23℃孵育这些寡核苷酸15分钟。典型的结合条件包括10μg核提取物，10,000cpm寡核苷酸探针，10mM Tris，pH7.7，50mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM DTT，2μg poly dI-dC和10％甘油，存在于20μl终体积中。含有NFκB的核提取物可从各种细胞类型中获得，但优选从促细胞分裂原和佛波酯诱导的Jurkat T细胞获得。结合后，按Baldwin，DNA和蛋白质工程技术(DNA& Protein Eng.Tech.)，273-76(1990)所述在Tris/甘氨酸/EDTA缓冲液中形成的5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析该复合物。以20mA进行电泳2小时，然后凝胶在-70℃放射自显影过夜。由于与标记的寡核苷酸连接的NFκB二聚体复合物在电泳后可从保持与复合物相连的任何单体(p50或p65)中分辨出来，因此可迅速测定肽试剂抑制NFκB二聚体化的能力。优选的是，在一些实验过程中滴定不同肽试剂的浓度以找出较好抑制NFκB二聚体形成的量。
另外，经过用各种浓度的肽试剂处理用NFκB报道基因结构转染的细胞可测定候选肽试剂抑制细胞中NFκB转录激活的能力。例如，NFκB报道基因结构可包含与最小启动子和报道基因分子(例如，萤光素酶，氯霉素乙酰转移酶，或绿色荧光蛋白)连接的三个或多个增强子序列(例如，TGGGGATTCCCCA(SEQ ID NO1))。可使用分子生物学技术制备该报道基因结构。优选的是，将报道基因结构转染进在用促细胞分裂原和佛波酯刺激时可产生大量NFκB的细胞系，例如Jurkat细胞中。经过在各种浓度的肽试剂存在的条件下培养过的细胞中转染报道基因结构可筛选候选肽试剂。经过比较在未处理的对照细胞与肽试剂处理的细胞中检测到的报道分子信号水平，可测定特定肽试剂抑制NFκB介导的转录激活的能力。优选的是，使用上述技术选择，设计，生产和试验含有相应于鼠p50的254，267和307位的氨基酸和rel同源性区域C末端部分的其它氨基酸的肽试剂。以这种方式，可鉴定抑制NFκB激活的肽试剂用于掺入治疗和/或预防NFκB相关性疾病的药品中。
在下文中，提供了使用PPI技术抑制NFκB与IκB阻遏物的联系的描述。
转录阻抑物复合物的抑制使用PPI技术也可完成转录阻抑物复合物的抑制。例如，可在肽表征试验中选择，设计，生产和筛选相应于NFκB和IκB中涉及稳定NFκB/IκB复合物的蛋白质-蛋白质相互作用的序列的肽试剂，以鉴定有效调节NFκB/IκB复合物装配的肽试剂。
因此，选择和设计相应于已显示出涉及稳定NFκB/IκB复合物的序列的肽试剂。含有锚蛋白重复序列的域和羧基末端酸性尾部/PEST序列是发现涉及结合105 kDa NFκB杂二聚体的IκB的区域。(Latimer等，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)，182640(1998)和Malek等，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)，27325427(1998))。另外，NFκB的核定位序列，二聚体化域和氨基末端DNA结合域与IκB相互作用以稳定NFκB/IκB复合物。(Malek等，生物学化学杂志，27325427(1998))。选择，设计和生产相应于这些区域的肽试剂。
接着，在评估其结合NFκB或IκB，抑制NFκB/IκB复合物形成，和抑制IκB-介导的转录阻抑的能力的肽表征试验中筛选候选肽试剂。为了评价肽试剂结合NFκB或IκB的能力，进行体外结合试验。正如以前所述，有一些本领域已知的体外结合试验类型且合适的方法涉及放射性标记的肽试剂与放置在支持物上或在透析膜内的NFκB或IκB蛋白质的结合。在一种方法中，NFκB或IκB蛋白质放置在具有10000mw截留的透析膜(例如，Slide-A-lyzer，Pierce)中或者感兴趣的蛋白质固定在支持物(例如，亲和层析树脂或微量滴定板的孔)上。然后，将放射性标记的肽试剂加入合适的缓冲液中，且在4℃下进行结合反应过夜。按照标准技术用125I或14C放射标记或者用其它可检测的信号标记肽试剂。发生结合反应后，去掉含有肽试剂的缓冲液，在无放射性肽试剂的缓冲液中洗涤结合蛋白质的支持物或者用有感兴趣的蛋白质的透析膜在不含放射性肽试剂的缓冲液中4℃下透析2小时。随后，以闪烁法测量结合在支持物蛋白质上的放射性或存在于透析蛋白质中的放射性。以这种方式可迅速鉴定与NFκB或IκB结合的肽试剂。正如本领域的技术人员可理解的，在具体结合试验中可采用这些结合试验的改良形式，例如通过将感兴趣的蛋白质结合到微量滴定板上并筛选荧光标记的肽试剂的结合可将例如上述试验容易地用于高通量分析。
测定一个或多个肽试剂的结合后，采用评估肽试剂抑制NFκB/IκB复合物形成的能力的试验。一个这种试验是凝胶移位试验。(参见，例如，Haskill等，美国专利号5846714)。NFκB二聚体结合具有序列TGGGGATTCCCCA的特异性调控DNA增强子，且具有该序列的放射性标记的(例如，32P)寡核苷酸可用于在低百分含量的非变性聚丙烯酰胺凝胶中分辨NFκB和寡核苷酸的复合物。
因此，评估肽试剂抑制NFκB/IκB复合物装配的能力的凝胶移位试验按如下完成。按常规方法放射性标记具有NFκB增强子序列的寡核苷酸。在各种浓度的候选肽试剂和具有NFκB和IκB的核提取物存在的条件下23℃培养这些寡核苷酸15分钟。典型的结合条件包括10μg核提取物，10,000cpm寡核苷酸探针，10mM Tris，pH7.7，50Mm NaCl，0.5mMEDTA，1mM DTT，2μg poly dI-dC和10％甘油存在于20μl终体积中。含有NFκB和IκB的核提取物可从各种细胞类型中获得，但优选从促细胞分裂原和佛波酯诱导的Jurkat T细胞获得。结合后，按Baldwin，DNA和蛋白质工程技术，273-76(1990)所述在Tris/甘氨酸/EDTA缓冲液中形成的5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析该复合物。以20mA进行电泳2小时，然后凝胶在-70℃放射自显影过夜。由于与标记的寡核苷酸连接的NFκB二聚体复合物在电泳后可在凝胶中分辨且NFκB/IκB复合物不能与增强子结合，因此可迅速测定肽试剂破坏或防止NFκB/IκB复合物形成的能力。优选的是，在一些实验过程中滴定不同肽试剂的浓度以找到较好抑制NFκB/IκB装配的量。相应于防止NFκB/IκB复合物缔合的NFκB或IκB区域的肽试剂可作为含有与NFκB连接的放射性标记的寡核苷酸的凝胶滞留产物被检测到，而不能破坏NFκB/IκB复合物的肽试剂用凝胶滞留试验不能分辨。
另外，经过用各种浓度的肽试剂处理用NFκB报道基因结构转染的细胞可测定候选肽试剂抑制细胞中IκB介导的转录阻抑的能力。例如，NFκB报道基因结构可包含与最小启动子和报道基因分子(例如，萤光素酶，氯霉素乙酰转移酶，或绿色荧光蛋白)连接的三个或多个增强子序列(例如，TGGGGATTCCCCA)。可使用分子生物学中的常规技术制备该报道基因结构。优选的是，将报道基因结构转染进具有IκB且在用促细胞分裂原和佛波酯刺激时可产生大量NFκB的细胞系，例如Jurkat细胞中。经过在各种浓度的肽试剂存在的条件下培养过的细胞中转染报道基因结构可筛选候选肽试剂。经过比较在未处理的对照细胞与肽试剂处理的细胞中检测到的报道分子信号水平，可测定特定肽试剂抑制IκB介导的转录阻抑的能力。相应于阻止NFκB/IκB复合物缔合的NFκB或IκB区域的肽试剂在该试验中表现出转录增加，而不能破坏NFκB/IκB复合物的肽试剂如果有任何转录也是很少。以这种方式，可鉴定破坏NFκB/IκB复合物的肽试剂，用于掺入治疗和/或预防NFκB相关性疾病的药品中。
在下文中，本发明人讨论了抑制细菌全毒素装配所必需的细菌毒素蛋白质聚合的修饰小肽的生产，鉴定和使用。
细菌毒素毒性的抑制一些细菌毒素具有由聚合蛋白质组成的超分子结构。例如，百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)具有105-kDa的外毒素，称为百日咳毒素，它引起百日咳，一种高度传染性婴儿和儿童呼吸疾病。百日咳毒素由5个多肽亚基(S1至S5)组成，以一些细菌毒素典型的A-B结构排列。(参见，Read等，美国专利号5856122)。S2，S3，S4(两个)和S5亚基形成五聚体(B寡聚体)，当它与S1亚基组合时形成全毒素。S1是具有ADP-核糖基转移酶和NAD-糖基水解酶活性的酶。S1活性是百日咳毒素(PT)毒性的主要起因。
B寡聚体介导全毒素与靶细胞的结合且帮助A原聚体进入。该基础结构的功能是与宿主细胞受体结合且使得S1亚基穿透胞质膜。(Armstrong和Peppler，感染和免疫(Infection & Immun.)，551294(1987))。经过修饰其细胞结合特性，例如，经过缺失S2亚基中的Asn-105和S3亚基中的Lys-105，和替代S3中的Tyr-82残基已将百日咳毒素脱毒性。(Lobet等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，17779-87(1993)和Loosmore等，感染免疫学，612316-2324(1993))。百日咳毒素以及许多其它细菌毒素的三维结构与PT共有功能和/或结构相似性，包括白喉毒素，霍乱毒素，假单胞菌外毒素A，大肠杆菌热不稳定毒素，和Vero细胞毒素-1。(Read等，美国专利号5856122，Choe等，自然357216-222(1992)，Allured等，美国国家科学院院报831320-1324(1986)，Brandhuber等，蛋白质3146-154(1988)，Sixma等，分子生物学杂志，2308990-9180(1993)，Sixma等，生物化学32191-198(1993)，和Stein等，自然355748-750(1992))。该三维结构信息和编码这些细菌毒素多肽的氨基酸序列可用于设计和生产抑制细菌毒素亚基聚合且因此抑制细菌毒素形成全毒素的肽试剂。
在一种方法中，使用百日咳毒素的三维模型选择对小肽抑制敏感的蛋白质-蛋白质相互作用区域。一个这种区域涉及S1的C末端(228至235)与占S1和B-寡聚体之间隐蔽表面28％的B-寡聚体孔之间的相互作用。因此，一个实施方案包含的肽试剂具有相应于与B-寡聚体相互作用的S1的区域的序列(例如，相应于S1重叠序列的小肽(228-235))。同样，构成S1和B-寡聚体之间隐蔽表面28％的S2，S3，S4和S5的区域用于选择和设计抑制全毒素形成的肽试剂。
由于PT的二聚体化在与靶细胞的结合中具有功能重要性，通过使用相应于蛋白质聚合所必需的蛋白质-蛋白质相互作用区域的肽试剂破坏该二聚体化过程可提供灭活全毒素的方法。S2中的一些残基含有促进二聚体化的特有氨基酸决定簇。(Read等，美国专利号5856122)。预测在S3中不保守的S2残基Glu-66，Asp-81，Leu-82和Lys-83负责PT聚合。另外，氨基酸残基82和83在糖缀合物结合中也是重要的。据认为S2和S4亚基的其它区域，例如S2的Trp-52和S4的残基Asp-1，Tyr-4，Thr-88和Pro-93涉及介导S2和S4亚基聚合的蛋白质-蛋白质相互作用。选择，设计和生产相应于涉及全毒素装配的毒素亚基区域的肽试剂。以相似的方式可进行抑制其它细菌毒素全酶聚合的肽试剂的选择，设计和生产，其它细菌毒素的实例是白喉毒素，假单胞菌外毒素A，大肠杆菌热不稳定毒素和Vero细胞毒素-1。
接着，在评估其结合毒素亚基蛋白，抑制全毒素形成，和抑制全毒素毒性效应的能力的肽表征试验中筛选候选肽试剂。为了评价肽试剂结合PT全毒素或构成全毒素的各蛋白质的能力，进行体外结合试验。正如以前所述，有一些本领域已知的体外结合试验类型且优选的方法涉及放射性标记的肽试剂与放置在透析膜内的PT蛋白质或全毒素的结合。在一种方法中，PT蛋白质或全毒素放置在具有10000mw截留的透析膜(例如，Slide-A-lyzer，Pierce)中。然后，将放射性标记的肽试剂加入合适的缓冲液中，且在4℃下进行结合反应过夜。按照标准技术用125I或14C放射标记或者用其它可检测的信号标记肽试剂。发生结合反应后，去掉含有肽试剂的缓冲液，具有感兴趣的蛋白质的透析膜在不含放射性肽试剂的缓冲液中4℃下透析2小时。随后，以闪烁测量存在于透析蛋白质中的放射性。以这种方式可迅速鉴定与PT蛋白质或全毒素结合的肽试剂。正如本领域的技术人员可预料到的，在具体结合试验中可采用这些结合试验的改良形式，例如通过将PT蛋白质或全毒素结合到微量滴定板上并筛选荧光标记的肽试剂的结合可将例如上述试验容易地用于高通量分析。
鉴定与PT蛋白质或全毒素结合的肽试剂后，进行评估肽试剂破坏全毒素的能力的试验。一些这类试验在本领域中是已知的。Head等提供了容易修改为测定肽试剂将PT全毒素裂解为PT亚基的能力的方法。(Head等，生物学化学杂志，2663617(1991))。因此，在一些实验中，在4℃下用肽试剂孵育纯化的PT(可从List生物学实验室公司获得)2小时。在其它实验中，纯化的PT首先在解离缓冲液中解离，然后放回存在肽试剂的生理学缓冲液中，之后允许在4℃下进行结合2小时。为了使全毒素处于解离条件下，逐滴加入解离缓冲液(6M尿素，0.1M NaCl，0.1M丙酸，pH4)，在4℃不搅拌条件下孵育毒素1小时。(Ito等，微生物病理(Microb.Pathog.)，5，189-195(1988))。如果在小体积(例如，25μl)中进行解离且将解离的亚基重悬于大体积的含有所需浓度肽试剂的生理学缓冲液(例如，975μl)中，可迅速恢复促进全毒素形成和肽试剂结合的条件。合适的生理学结合缓冲液是50mM Tris缓冲盐水(TBS)，pH7.4。
结合反应后，以高效液相色谱(HPLC)从解离复合物中分辨全毒素。将含有大约1mg亚基或全毒素(在1ml中)的结合反应物注射进预先用50mM Tris-缓冲盐水(TBS)，pH7.4平衡的TSK-G2000SW HPLC凝胶过滤柱中，流速为1.0ml/min。然后以λ＝280nm的吸光度测量峰值，收集馏分。在大约12-15min的滞留时间内纯化的PT作为单个峰迁移。解离的亚基出现具有两个峰的曲线图，代表A亚基和B亚基。以在上述试验中出现两个峰鉴定破坏PT全毒素或防止全毒素装配的肽试剂。优选的是，在一些实验过程中滴定不同肽试剂的浓度以找出较好地破坏或防止PT全毒素装配的量。
一旦鉴定破坏或防止PT全毒素装配的肽试剂，在以细胞为基础的或以动物为基础的系统中评价该分子抑制PT毒性效应的能力。一个以细胞为基础的试验分析PT对培养中中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的影响。基本上按Hewlett等所述进行CHO细胞试验(Hewlett等，感染免疫学(Infect.Immun.)，401198(1983))。CHO细胞在含有10％胎牛血清和各种浓度的肽试剂的Ham F-12(GIBCO实验室，Grand Island，N.Y.)培养基，5％ CO2的空气中生长和维持。在Ham F-12培养基中制备PT的系列两倍稀释液。在CHO细胞放入微量滴定孔中20小时后以10μl体积加入毒素。再培养24小时后，观察CHO细胞与毒素中毒相关的特征性生长形式。即，在紧密的细胞团中生长圆形，扁平细胞。相反，肽试剂处理的细胞(类似未施加毒素的对照细胞)表现出长形细胞单层。
在另一方法中，进行以动物为基础的试验以评估肽试剂干扰PT毒性的能力。按如下进行以动物为基础的攻击试验以鉴定相应于百日咳毒素亚基序列的小肽的有效性。在第0天用0.5ml修饰的小肽以三次剂量腹膜内注射Taconic小鼠(15至17g)使得血液中的小肽浓度达到100μM-300μM。每个剂量注射10只小鼠。在第2天，用百日咳博德特氏杆菌的标准剂量脑内注射攻击小鼠。在相同时间也注射对照小鼠以确定攻击的效力。攻击三天后，直到且包括第28天每天记录动物死亡数。在第28天，瘫痪的小鼠和具有脑水肿的小鼠也记录为死亡。结果记录为LD50，它是一半小鼠死亡的剂量。该实验的结果表明用小肽处理的小鼠的LD50大于未处理的小鼠，因此用修饰小肽处理可防止该疾病。以这种方式鉴定的肽试剂可掺入药品中用于治疗和预防PT的毒素效应。另外，通过使用上述方法，可选择，设计，生产破坏或防止其它细菌毒素，例如白喉毒素，假单胞菌外毒素A，大肠杆菌热不稳定性毒素，霍乱毒素，Vero细胞毒素1和2的装配的肽试剂，并根据肽表征试验筛选。
在下面公开的其它实施方案中，生产和鉴定修饰的小肽并用于抑制涉及与诸如阿尔茨海默氏疾病和朊病毒疾病等神经变性疾病发作相关的超分子结构形成的蛋白质(例如，肌动蛋白和β-淀粉样肽)聚合。
肌动蛋白和β-淀粉样肽聚合的抑制也可使用肽试剂抑制或防止涉及与纤维状蛋白异常装配相关的疾病(例如阿尔茨海默氏疾病(AD)和朊病毒疾病)发作的蛋白质聚合。与AD相似，人朊病毒疾病、克-雅病和格-施-沙病的特征是神经变性的缓慢发作。这些疾病中的脑病理学类似于AD，其特征也是正常细胞蛋白，朊病毒蛋白质(PrP)(而不是与AD相关的β-淀粉样肽)的聚集。(Baker和Ridley，神经变性(Neurodegeneration)，13-16(1992)，Prusiner，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)，310661-663(1984)和Prusiner，科学，2521515-1522(1991))。
据信瘙痒病的传染原经过加速正常情况下速率确定的淀粉样蛋白形成中的步骤发挥作用。(Griffith，自然，2151043-1044(1967)和Prusiner，科学，2521515-1522(1991))。很多人相信这一步骤(作为成核依赖型聚合的限定性特征的有序核心的形成)与人朊病毒疾病和AD中的淀粉样蛋白形成在机理上是相关的。(Jarret和Lansbury，细胞(Cell)，731055-1058(1993))。因此，破坏淀粉样蛋白形成的成核(seeding)可能是治疗或防止瘙痒病传播和AD起动的一种方法。
成核依赖型蛋白质聚合说明了许多完全已知的过程，包括蛋白质结晶，微管装配，鞭毛装配，镰状细胞血红蛋白纤丝形成，噬菌体前衣壳装配和肌动蛋白聚合。在一种解释中，核形成需要一系列的缔合步骤，这些步骤在热力学上是不利的(Kn＜＜1)，因为产生的分子间相互作用不超过缔合的熵消耗。(Chothia和Janin，自然，256705(1975))。一旦形成核，单体的进一步加入变成在热力学上是有利的(Kg＞＞1)，因为单体在多个位点与生长的聚合体接触，导致迅速聚合/生长。即，成核以较低的过饱和水平限速。因此，向动态可溶的过饱和溶液中加入核或预制核导致立即聚合。然而，经过测定导致聚合的蛋白质-蛋白质相互作用所必需的核区域，可选择和设计针对这些区域的肽试剂并根据其抑制或防止“成核”或聚合的能力进行鉴定。该肽试剂可掺入药品中且可用于治疗和防止类似AD和朊病毒疾病的神经变性疾病。已报道使用与诸如生物素和其它环形和杂环化合物和具有相似空间“形状(bulk)”的其它化合物连接的具有6-60个氨基酸残基的β-淀粉样肽来抑制天然β-淀粉样肽的聚集。(美国专利号5817626)。
在病理学上，阿尔茨海默氏病(AD)的特征在于在受害者大脑中存在明显的病变。这些大脑病变包括称为神经原纤维缠结(NFT)的异常细胞内纤丝和在老年斑或淀粉样蛋白斑中淀粉样蛋白质的细胞外沉积。淀粉样蛋白斑的主要蛋白质组分鉴定为4千道尔顿肽(40-42个氨基酸)，称为β-淀粉样肽。(Glenner等，生物化学和生物物理学研究通信(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，120885-890(1984)和Masters等，美国国家科学院院报，824245-4249(1985))。在正常成年人大脑中经常观察到β-淀粉样肽的散布沉积，而AD大脑组织的特征在于有更紧密的，核心致密的β-淀粉样蛋白斑。(参见，例如，Dayies等，神经学(Neurology)381688-1693(1988))。β-淀粉样肽的神经毒性依赖于其使聚集物或聚合体“成核”的能力，该聚集物或聚合体在胞质膜上积累并破坏细胞钙的体内稳态。通过谷氨酸受体和电压依赖型通道的钙流入介导神经元中的大量功能和结构反应。然而无节制的钙流入可损伤或杀死神经元细胞。β-淀粉样肽的聚集或聚合可引起钙大量流入，后者损伤或杀死神经细胞。
肌动蛋白微丝是主要的细胞骨架成份，其聚合状态对钙高度敏感。松胞菌素化合物引起肌动蛋白解聚，降低谷氨酸和膜去极化诱导的钙流入，消除由胞质膜上β-淀粉样蛋白聚合介导的钙流入。(Mattson，美国专利号5830910)。因此，组成细胞骨架的肌动蛋白微丝在调节钙的体内稳态中发挥积极的作用且影响肌动蛋白聚合的化合物可减轻各种神经变性病症中的神经元损伤。因此，在其它实施方案中，选择，设计和生产相应于涉及肌动蛋白聚合的肌动蛋白序列的肽试剂并根据其抑制肌动蛋白聚合的能力进行鉴定，从而对抗由β淀粉样肽聚集诱导的钙流入。类似地，可使用相应于β-淀粉样肽的序列的肽试剂防止β-淀粉样肽在胞质膜上的聚集，从而对抗由β-淀粉样肽聚集诱导的钙流入。另外，结合相应于肌动蛋白和β-淀粉样蛋白的区域的肽试剂的疗法包括在本发明的一些实施方案的范围内。
可采用上述策略设计，生产和鉴定相应于与聚合有关的肌动蛋白和β-淀粉样肽序列的肽试剂。另外，一般来说，考虑文献中的突变分析，蛋白质模拟和药物相互作用分析或按常规方法进行这些测定以设计并选择相应于涉及蛋白质聚合的序列的合适肽试剂。当然，可随机选择小肽。然后生产肽试剂(例如，通过使用上述方法)。接着，通过实施评估肽试剂结合感兴趣的蛋白质，抑制或防止蛋白质的聚合或结合，和减轻与聚合的蛋白质或超分子装配相关的疾病状态的能力的肽表征试验鉴定所选择的小肽。可采用任意数量或顺序的肽表征试验鉴定抑制蛋白质聚合或超分子复合物装配的小肽。
由于松胞菌素结合迅速生长的(具倒钩的)肌动蛋白末端，从而阻断所有的缔合与解离反应，因此相应于肌动蛋白序列倒钩末端的小肽可干扰肌动蛋白聚合。因此，可选择，设计和生产相应于肌动蛋白该区域的肽试剂。
已显示β-淀粉样肽两个疏水氨基酸的突变和替代降低淀粉样蛋白产生力(amyloidogenicity)。(Hilbich等，分子生物学杂志，228460-473(1992))。发现β-淀粉样肽残基17至20周围的保护较好的疏水核心对于形成β-折叠结构和其它淀粉样特性是重要的。据信该区域在装配和稳定淀粉样蛋白斑中发挥重要作用。因此，可选择，设计和生产相应于β-淀粉样肽该区域的肽试剂。
一旦制备，在肽表征试验中筛选该肽。为了评估肽试剂结合肌动蛋白或β-淀粉样肽(从Sigma获得的纯化形式)的能力，用放射标记的肽试剂进行体外结合试验。如前所述，优选的方法涉及在透析膜中处理感兴趣的蛋白质和用放射性标记的肽试剂结合蛋白质。因此，将感兴趣的蛋白质放置在具有10000mw截留的透析膜(例如，Slide-A-lyzer，Pierce)中。然后，将放射性标记的肽试剂加入合适的缓冲液中，且在4℃下进行结合反应过夜。按照标准技术用125I或14C放射标记或者用其它可检测的信号标记肽试剂。发生结合反应后，去掉含有肽试剂的缓冲液，具有感兴趣的蛋白质的透析膜在不含放射性肽试剂的缓冲液中4℃下透析2小时。随后，以闪烁测量存在于透析蛋白质中的放射性。以这种方式可迅速鉴定与肌动蛋白或β-淀粉样肽结合的肽试剂。正如本领域的技术人员可预料到的，在具体结合试验中可采用这些结合试验的改良形式，例如通过将肌动蛋白或β-淀粉样肽结合到微量滴定板上并筛选荧光标记的肽试剂的结合可将例如上述试验容易地用于高通量分析。
鉴定与肌动蛋白或β-淀粉样肽结合的肽试剂后，进行评估肽试剂破坏肌动蛋白或β-淀粉样肽聚合的能力的试验。至于涉及肌动蛋白聚合的抑制，可使用免疫组织化学技术。因此，在已用肽试剂处理的细胞上进行免疫荧光试验，用对肌动蛋白特异性的抗体(例如，单克隆抗肌动蛋白-FITC偶联物(克隆号AC-40)Sigma F3046)测定存在的聚合肌动蛋白。转化的小鼠成神经细胞瘤细胞和正常成纤维细胞适合于这些实验且用不同量的肽试剂接触这些细胞，固定，用抗肌动蛋白抗体染色并按照标准免疫荧光技术进行分析。
在一种方法中，转化的小鼠成神经细胞瘤克隆N1E-115的细胞在补充了5％胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagles培养基(DMEM)中在10％CO2的空气中37℃下生长。正常的小鼠成纤维细胞(Swiss/3T3)在补充了10％胎牛血清的DMEM中生长。细胞与100μM-300μM的肽试剂接触过夜或不加肽试剂(对照)，随后重新铺在含有盖玻片的35-mm塑料组织培养皿上。经过向生长培养基中加入2％二甲基亚砜(DMSO)获得分化的成神经细胞瘤细胞。
然后将盖玻片上的细胞在冰上冷却，去掉培养基，在冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞。洗涤后，细胞在2％低聚甲醛(PFA)，4％PFA的PBS 1∶1稀释液，和1％Triton X-100中在冰上固定30分钟，或在100％甲醇中-10℃下固定15分钟。固定后，去掉固定液并在4℃ PBS中洗涤细胞两次(每次洗涤5分钟)。以1∶75的稀释液加入FITC标记的抗肌动蛋白抗体且在4℃下进行结合1小时。随后，细胞在4℃PBS中洗涤4次(每次洗涤5分钟)。
细胞的显微镜检查揭示了未处理的细胞具有大量的被FITC抗肌动蛋白抗体标记的肌动蛋白微丝。未处理的细胞显示出特征为长肌动蛋白束的有组织的肌动蛋白。特别是成神经细胞瘤细胞显示出平滑的轮廓，代表微端丝。相反，用相应于涉及肌动蛋白聚合的肌动蛋白序列的肽试剂处理的细胞显示出细胞聚集，失去微端丝和改变生长锥。另外，在正常细胞中发现的长肌动蛋白束不再可见且在细胞质和皱褶的膜中发现肌动蛋白的强标记。经过使用上述技术，可设计，生产相应于肌动蛋白序列的肽试剂，并依其结合肌动蛋白和防止肌动蛋白聚合的能力进行筛选。作为加入的阳性对照，可用松胞菌素化合物处理细胞且免疫荧光将显示肌动蛋白的解聚合，其特征在于缺乏长的肌动蛋白束。
至于测定抑制β-淀粉样肽聚集/聚合的试剂，一些方法是已知的。在一种方法中，将β-淀粉样蛋白质(1-40)以2mg/ml溶于六氟异丙醇(HFIP；Aldrich化学公司)中。将HFIP溶液的等分试样转移到试管中，将氩气流通过各试管以蒸发HFIP。所得的β-淀粉样肽膜溶于DMSO中且向各试管中加入小的特氟隆包裹的磁力搅拌棒。向DMSO溶液中搅拌加入合适的缓冲液(例如，100mM NaCl，10mM磷酸钠pH7.4)。连续搅拌所得的混合物且在400nm下监测光密度以观察不溶性肽聚集物的形成。在对照样品中，经过测定在400nm下光密度的增加容易分辨肽聚集物。然而，存在肽试剂时，以在400nm下比对照样品具有较低的光密度检测出抑制β-淀粉样肽聚集。
在第二种试验中，使用荧光测定试验测定β-淀粉样蛋白聚集。(Levine，蛋白质科学(Protein Science)2404-410(1993))。在该试验中，将染料硫黄素T(ThT)与β-淀粉样蛋白质溶液接触。染料ThT与聚集的β-淀粉样蛋白质缔合但不与单体或松散结合的β-淀粉样蛋白缔合。当与β-淀粉样蛋白质缔合时，ThT在450nm下产生最大激发，且与游离染料在385nm和455nm相比在482nm下发射增强。因此，将存在或没有相应于β-淀粉样蛋白质序列的肽试剂的β-淀粉样蛋白质等分试样加入反应容器中且加入含有硫黄素T(10mM；从Aldrich化学公司获得)的50mM磷酸钾缓冲液pH7.0中。在450nm下进行激发并在482nm处测量发射。正如上述聚集试验，具有抑制β-淀粉样肽聚集的肽试剂的样品与444nm处游离染料的发射相比在482nm处显示出微弱的发射，而对照样品在482nm处显示出较大发射，在444nm发射很少。
在第三种试验中，通过混合β-淀粉样肽与肽试剂并用刚果红染色混合物测定本发明的肽试剂破坏β-淀粉样蛋白聚集的能力。如果被染料刚果红染色，所有类型的淀粉样蛋白在偏振光下显示出绿色双折射。然而，由于存在肽试剂而不能聚集的β-淀粉样肽在偏振光下不表现出绿色双折射。因此，将大约0.5至1mg冻干的β-淀粉样肽悬浮于含100至300μM肽试剂的100μl PBS，pH7.4中。加入β-淀粉样肽后，加入5μl刚果红溶液(1％溶于水中)。然后将20μl悬液放在显微镜载玻片上并在显微镜下在偏振光和非偏振光下立即镜检。可以200×的第一放大倍数拍照。在对照样品中，例如，不含肽试剂，将观察到聚集的β-淀粉样肽和绿色双折射，然而，具有肽试剂的样品显示出β-淀粉样蛋白聚集和绿色双折射减少。
另外，使用电子显微镜可评估存在和不含肽试剂时β-淀粉样蛋白聚集。对于纤丝形成，将70％ HCOOH中的β-淀粉样肽溶液(1mgβ-淀粉样肽/200μl)用含有和不含肽试剂的PBS和HCOOH的混合物室温下透析5天。在这段时间期间，透析缓冲液中PBS的量从20％增加到100％。将含有和不含肽试剂的PBS中的β-淀粉样肽的新鲜悬液(透析后)放在碳包裹的，去离子的铜网上，干燥，用2％(w/v)乙酸双氧铀负染并在电子显微镜下观察。β-淀粉样肽的特征性特征是其倾向于聚集成大分子量的不溶性纤丝。该聚集容易被电子显微镜检测且具有大约5nm的直径，长度达到200nm。然而与肽试剂接触的含有β-淀粉样肽的样品如果有纤丝的话，也显示很少。
为了确定相应于肌动蛋白序列和β-淀粉样蛋白序列的肽试剂破坏β-淀粉样肽聚集诱导的钙流入的能力，使用海马细胞培养物进行功能试验。建立解离胚胎的大鼠海马细胞培养物并在塑料的35mm培养皿，96孔板，或玻璃底35mm培养皿中的聚乙烯亚胺覆盖的基底上维持。细胞密度维持在大约70-100个细胞/mm2。细胞在补充了10％胎牛血清，且含有20mM丙酮酸钠的Eagles最小基础培养基中维持。在6-10日龄的培养物上进行实验，此时神经元表现出由NMDA和α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸(AMPA)/红藻氨酸受体介导的对谷氨酸的钙反应，且易受兴奋性毒性(excitotoxicity)和β-淀粉样蛋白毒性伤害。通过在无菌蒸馏水中以1mM的浓度溶解肽在临用前制备β-淀粉样肽25-35和1-40(分别是Sigma A1075，A4559)。当放在培养基中时这些肽迅速聚集且当以可溶性形式加入培养物中时在48小时期间逐渐杀死神经元。(Mattson，美国专利号5830910，本文引用以供参考)。
经过在处理前即刻和在处理后的时间点在相同的显微镜视野中(10×物镜)计数活的神经元来定量神经元存活率。另外，经过使用荧光平板阅读器定量在Alamar蓝色荧光(Alamar实验室)存在下在96孔板上生长的细胞。Alamar蓝是一种非荧光底物，被细胞代谢物还原后，变成发荧光。以形态学标准评估神经元的活力。具有均匀直径的输入神经突和具有平滑，圆形外表的胞体的神经元认为是有活力的，而具有破碎的神经突的神经元和带空泡或膨胀胞体的神经元认为是无活力的。
存活率值表示为实验处理前存在的神经元起始数的百分数。在相应于蛋白质聚合所必需的肌动蛋白序列和/或β-淀粉样蛋白序列的肽试剂存在下，观察到超过50％的神经元存活。预期的是，经过细胞与相应于肌动蛋白或β-淀粉样肽序列或两者的序列的肽试剂接触诱导的神经元存活率在50-100％之间。优选的是，神经元存活率是60-100％且神经元存活率可以是55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％和100％。相反，用100mM谷氨酸培养的细胞显示出不足25％的神经元存活率，在β-淀粉样肽存在下培养的细胞显示不足50％的神经元存活率。另外，在用相应于肌动蛋白序列和/或β-淀粉样肽的肽试剂预处理1小时的细胞中，谷氨酸神经毒性下降。
在另一试验中，经过使用钙指示剂染料Fura-2在存在和不存在相应于肌动蛋白和/或β-淀粉样肽序列的肽试剂的条件下测定钙流入量。在一种方法中，使用Ca2+指示剂染料Fura-2显示的荧光比率显像定量在存在和不存在相应于肌动蛋白或β-淀粉样肽序列或两者的肽试剂的条件下用谷氨酸或β-淀粉样肽处理的神经元胞体中的Ca2+。在2mM的Ca2+指示剂染料Fura-2的乙酰氧基甲基酯形式存在的条件下培养细胞30-40分钟，然后用新鲜培养基洗涤两次(2ml/次洗涤)并在显像前培养至少40分钟。显像前即刻用含有10mM HEPES缓冲液和10mM葡萄糖的Hanks平衡盐溶液(Gibco)取代正常培养基。使用带油镜的ZeissAttofluor系统或带40×油镜的Quantex系统显像细胞。然而，本领域的技术人员可预料得到可采用其它显微镜系统。
使用两种不同激发波长(334和380nm)的荧光发射的比率用于测定钙流入量。使用不含Ca2+或Ca2+饱和(1mM)的溶液校准系统。Fura-2钙显像揭示了相应于肌动蛋白或β-淀粉样肽或两者之序列的肽试剂减弱对谷氨酸和β-淀粉样肽诱导的膜去极化的[Ca2+]i反应。在对照培养物中，例如，50mM谷氨酸诱导神经元[Ca2+]i迅速增加。相反，用300μM肽试剂预处理1小时的神经元中对谷氨酸的[Ca2+]i反应降低。另外，在用β-淀粉样肽预处理3小时的培养物中对谷氨酸的神经元[Ca2+]i反应极大地增强。然而，在相应于肌动蛋白或β-淀粉样肽序列的肽试剂存在的条件下在β-淀粉样蛋白预处理的培养物中对谷氨酸的[Ca2+]i反应的增强受到抑制。这些实验证实了在存在相应于肌动蛋白和β-淀粉样肽序列的肽试剂的条件下引起的肌动蛋白解聚合和/或β-淀粉样肽解聚合可降低由谷氨酸和β-淀粉样蛋白介导的膜去极化诱导的[Ca2+]i流入。
正如上部分所述，采用相应于肌动蛋白序列和β-淀粉样肽序列的两种肽试剂的组合疗法是本发明的实施方案。经过使用上述试验，可选择，设计，生产和表征结合肌动蛋白和β-淀粉样肽的肽试剂。通过施用相应于肌动蛋白和β-淀粉样肽两者的序列的肽试剂可获得较好的反应(例如，较少的Ca2+流入)。另外，经过使用类似于上述的方法，可选择，设计，生产和表征抑制朊病毒相关蛋白斑形成的肽试剂。按上述选择，设计，生产和表征的肽试剂可掺入药物中用作治疗和防止诸如阿尔茨海默氏疾病和朊病毒疾病等神经变性疾病的治疗剂和预防剂。经过施用该药物实现治疗患有诸如阿尔茨海默氏疾病等神经变性疾病的患者的方法。(参见，Findeis等，美国专利号5817626，β-淀粉样肽聚集的调节剂)。另外，可在表现出阿尔茨海默型神经变性疾病的转基因小鼠中试验该肽的效力。(Gains等，自然，373523-527(1995))。这些转基因小鼠表达高水平的人突变淀粉样前体蛋白质且逐渐形成许多与阿尔茨海默氏疾病相关的病理学症状。在下面的说明书中，描述了使用PPI技术破坏微管蛋白聚合以治疗和预防癌症。
微管蛋白聚合的抑制在另一方面，描述了抑制微管蛋白聚合的肽试剂的生产和使用。抑制微管蛋白聚合的肽试剂用作生物技术工具和治疗各种类型的癌症的治疗剂。例如，相应于微管蛋白α或β亚基或两者的序列的肽试剂可防止微管蛋白聚合且用作抗肿瘤剂。该小肽-微管蛋白聚合抑制剂可掺入药物中用于治疗白血病，黑素瘤和结肠，肺，卵巢，CNS，和肾脏癌症，以及其它癌症。优选的是，肽试剂可用于治疗结肠癌。
证实有强烈细胞毒性和抗肿瘤活性的各种临床上有前途的化合物已知通过有效抑制微管蛋白聚合发挥其主要作用方式。(Gerwick等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，591243(1994))。这类抗肿瘤化合物与微管蛋白结合，从而抑制微管蛋白聚合成微管的能力，而微管是细胞维持和细胞分裂的必需化合物。(Owellen等，癌症研究(CancerRes.)，361499(1976))。目前，最认可和临床上最有用的治疗癌症的微管蛋白聚合抑制剂包括长春花碱，长春花新碱，rhizoxin，combretastin A-4和A-2，和紫杉醇。(Pinney，美国专利号5886025)。
微管蛋白是球形α和β微管蛋白亚基的杂二聚体。经过使用微管蛋白的光亲和标记试剂，研究者已在微管蛋白上鉴定了三种不同的小分子结合位点秋水仙碱位点，长春花碱位点和rhizoxin位点。另外，光亲和标记试剂揭示了rhizoxin与β-微管蛋白上的Met-363-Lys-379位点结合。(Sawada等，生物化学药理学(Biochem.Pharmacol.)451387(1993))。另外，发现基于紫杉醇的试剂标记β-微管蛋白的N-末端31个氨基酸残基。(Swindell等，医学化学杂志(J.Med.Chem.)，371446(1994)和Rao等，生物学化学杂志，2693132(1994))。优选的是，针对相应于这些区域的序列选择和设计这些实施方案的肽试剂。
一旦进行了选择，设计和生产，就筛选肽试剂结合微管蛋白的能力。通过使用相似于上面所述的方法，将微管蛋白(Sigma T 4925)放置在透析膜(例如，Slide-A-lyzer，Pierce)中。然后，将放射性标记的肽试剂加入合适的缓冲液中，且在4℃下进行结合反应过夜。按照标准技术用125I或14C放射标记或者用其它可检测的信号标记肽试剂。发生结合反应后，去掉含有肽试剂的缓冲液，具有感兴趣的蛋白质的透析膜在不含放射性肽试剂的缓冲液中4℃下透析2小时。随后，以闪烁测量存在于透析蛋白质中的放射性。经过在闪烁液中检测放射性可迅速鉴定与微管蛋白结合的肽试剂。正如本领域的技术人员可预料到的，在具体结合试验中可采用这些结合试验的改良形式，例如通过将微管蛋白结合到微量滴定板上并筛选荧光标记的肽试剂的结合可将上述试验容易地用于高通量分析。
鉴定了与微管蛋白结合的肽试剂后，进行评估肽试剂破坏微管蛋白聚合的能力的试验。一个合适的试验系统是Bai等，癌症研究，564398-4406(1996)所述的系统。在无GTP的条件下37℃预孵育15分钟后在0.25ml反应混合物中评价在肽试剂存在和不存在的条件下对谷氨酸诱导的纯化微管蛋白装配的抑制。典型的反应混合物的终浓度是1.0mg/ml(10μM)微管蛋白，300μM肽试剂，1.0M谷氨酸一钠，1.0mMMgCl2，0.4mM GTP，和4％(v/v)DMSO。经过在75秒从0℃跳跃到37℃起动装配且可在Gilford分光光度计中在350nm下监测。20分钟后评估反应的程度。在肽试剂存在的条件下，在350nm处检测到极少的吸光度。相反，无肽试剂时，在350nm处检测到明显的吸光度。
也可以在7.5×300mm TSK G3000SW凝胶渗透柱上以适合Ramona5-LS流式检测器的LKB系统经过HPLC追踪存在和不存在肽试剂时的微管蛋白聚集。用含有0.1 M MES(pH6.9)和0.5mM MgCl2的溶液平衡柱子。用Raytest软件在IBM兼容机上评估吸光度数据。存在肽试剂时，在350nm下检测到极低的吸光度。相反，不存在肽试剂时，在350nm下检测到明显的吸光度。另外，可使用电子显微镜评估存在和不存在肽试剂时的微管蛋白聚集。因此，将5μl反应液放在200目碳包裹的，Formavar处理的铜网上，5-10秒后，用5-10滴0.5％的乙酸双氧铀洗去未结合的样品。经过吸收到撕裂的滤纸上去除过量的染液，在电子显微镜下检查负染样品。存在肽试剂时，可见极少的微管蛋白束。相反，不存在肽试剂时，可观察到大量数量的微管蛋白束。
也可试验肽试剂抑制肿瘤细胞生长的能力。在针对一些人癌细胞系，包括卵巢CNS，肾脏，肺，结肠和黑素瘤细胞系的生长抑制活性方面评价相应于微管蛋白序列的肽试剂的细胞毒性。所用的试验在Monks等(参见，例如，Monks等，国家癌症研究所杂志(J.Nat.Cancer Inst.)，83757-766(1991)，本文引用以供参考)中描述。简单地说，用吸管(100μl)将根据具体细胞类型和期望的靶细胞密度(根据细胞生长特征大约每孔5000-40000个细胞)稀释的细胞悬液加入96孔微量滴定板中。使接种物在37℃下预培养24-28小时使其稳定。在5％ CO2的空气和100％湿度中用肽试剂培养48小时。
原位固定细胞，接着用结合细胞大分子的碱性氨基酸的蛋白质结合染料sulforhodamine B(SRB)染色进行细胞生长的测定。以分光光度术测量可溶性染色。优选评估相应于微管蛋白序列的肽试剂对P388白血病细胞的细胞毒活性。可测定所试验的各肽试剂的ED50值(定义为抑制50％的细胞生长所需的有效剂量)。存在肽试剂时培养的癌细胞表现出极少的增殖和细胞生长，而不存在肽试剂时，癌细胞增增殖。按上述选择，设计，生产和表征的肽试剂可掺入药物中用作治疗和预防各种形式的癌症的治疗剂和预防剂。下面的描述讨论了使用PPI技术破坏病毒衣壳装配以治疗和预防病毒感染。
病毒衣壳装配的抑制另一方面包括生产和使用肽试剂以抑制病毒感染。抑制病毒感染的肽试剂用作生物技术工具和用作治疗各种形式的病毒疾病的治疗剂。例如，相应于病毒衣壳蛋白序列的肽试剂可防止衣壳聚合且可用作抗病毒剂。这些抗病毒肽试剂可掺入药物中用于治疗HIV-1，HIV-2和SIV，以及各种病毒感染类型。
首先，选择，设计和生产相应于HIV-1，HIV-2和SIV(“p24”)的病毒衣壳蛋白的肽试剂。p24蛋白聚合形成病毒衣壳且它是形成慢病毒核壳的整合成份。生产和在表征试验中筛选相应于据信涉及使得衣壳可以聚合的蛋白质-蛋白质相互作用的p24序列的表1所列小肽的酰胺形式。按照以前公开的方法合成这些肽试剂，当然也可使用本领域已知的任何方法合成。
表1Leu-Lys-Ala(LKA) Arg-Gln-Gly(RQG)Iso-Leu-Lys(ILK) Lys-Gln-Gly(KQG)Gly-Pro-Gln(GPQ) Ala-Leu-Gly(ALG)Gly-His-Lys(GHK) Gly-Val-Gly(GVG)Gly-Lys-Gly(GKG) Val-Gly-Gly(VGG)Ala-Cys-Gln(ACQ) Ala-Ser-Gly(ASG)Cys-Gln-Gly(CQG) Ser-Leu-Gly(SLG)Ala-Arg-Val(ARV) Ser-Pro-Thr(SPT)Lys-Ala-Arg(KAR) Gly-Ala-Thr(GAT)His-Lys-Ala(HKA) Lys-Ala-Leu(KAL)Gly-Pro-Gly(GPG)所用的缩写Leu-亮氨酸Lys-赖氨酸Gln-谷氨酰胺 Ala-丙氨酸His-组氨酸Ileu-异亮氨酸Cys-半胱氨酸 Gly-甘氨酸Pro-脯氨酸Arg-精氨酸Val-缬氨酸Thr-苏氨酸Ser-丝氨酸为了确定表1所列的肽试剂是否能结合病毒衣壳蛋白p24，进行体外结合试验。如前所述，使用具有小于10kD孔径的透析膜进行基于透析的结合试验。(Slide-A-Lyzer，Pierce)。将50微升10μM的重组蛋白质p24，gp120(AIDS计划，NCIB惠赠)和BSA(Sigma)贮液导入分开的透析膜中，用由150mM NaCl和50mM Tris-HCl，pH7.4缓冲液，和27.5M的14C-GPG-NH2(Amersham Ltd.UK)组成的500ml溶液4℃下透析蛋白质2天。随后，取出10或5微升等分试样的透析p24，gp120和BSA并与在闪烁瓶中的3ml ReadySafe(Beckman)混合。然后经过闪烁计数检测C14。
在表2中，提供了代表性的基于透析的结合试验的结果。值得注意的是，在透析平衡时观察到p24与GPG-NH2缔合。与p24缔合的放射性GPG-NH2的量比缓冲液中大7.5倍。相反，相对于在透析缓冲液中存在的量，没有可注意量的放射性GPG-NH2与gp120或BSA缔合。这些结果证明了诸如GPG-NH2的小肽与p24结合。
表2
对与修饰小肽接触的HIV-1颗粒进行电子显微镜检可获得肽试剂抑制或防止病毒衣壳蛋白聚合且因此抑制或防止正常核壳装配的证据。在这组实验中，用HIV-1 SF-2病毒以300TCID50在37℃下感染HUT78细胞1小时。随后，洗涤和沉淀感染细胞3次。之后，细胞重悬于补充了10％FBS，抗生素(100u/mml)和polybrene(3.2μg/ml)的RPMI培养基中。在感染后3，5或7天以1μM或10μM的浓度向细胞培养物中加入GPG-NH2。对照样品施加0.5μM Ritonavir(蛋白酶抑制剂)。培养细胞到第14天，此时，细胞用常规方法在2.5％戊二醛中固定。然后将固定的细胞在1％OsO4中后固定并脱水，用环氧树脂包埋，使包埋块聚合。制备大约60-80nm厚的病毒感染的细胞切片以容纳核壳宽度。切片固定在载网上，用1.0％乙酸双氧铀染色并以80kV的加速电压在Zeiss CEM 902显微镜中分析。显微镜装配有分光计以提高成像质量，使用液氮冷却井以减少光束损伤。在一些双盲试验中检查具有对照和GPG-NH2培养的细胞的切片的载网。
对未处理的HIV颗粒的电子显微镜检揭示了特征性圆锥形核壳和在核壳长度内伸展的被包围的均匀染色的RNA。(见图1)。相反，图2提供了两个电子显微照片，显示了与病毒蛋白酶抑制剂Ritonavir接触的一些HIV-1颗粒。用Ritonavir处理的感染细胞表现出没有可分辨的核壳的畸形结构，与预期一样。图3提供的电子显微照片显示了接触GPG-NH2的病毒颗粒。接触GPG-NH2的具有HIV-1颗粒的细胞表现出具有可分辨的衣壳结构的HIV-1颗粒，不同于Ritonavir处理的颗粒。更具体地说，在一些三肽处理的病毒颗粒中，圆锥形衣壳结构似乎部分完整，但RNA以球形形状积累在衣壳外部或在衣壳顶部(宽末端)。另外，一些衣壳观察到具有形态很少或不类似于正常核壳的畸形结构，可见RNA在该结构外部或在该结构内部的一端。从这些试验可清楚地知道小肽干扰病毒衣壳蛋白的聚合和核壳的正确形成。
接着，评估肽试剂抑制病毒感染的能力。因此，表1所列的肽试剂用于一些病毒(例如，HIV-1，HIV-2，和SIV)感染试验。以逆转录酶活性，细胞上清中的p24蛋白的浓度，和以显微镜检评估HIV-1合胞形成来监测HIV-1，HIV-2和SIV感染的效率。在起始实验中，筛选一些修饰的三肽在H9细胞中抑制HIV-1，HIV-2和SIV感染的能力。一旦鉴定了抑制性三肽，进行更具体的试验测定各种浓度的选定三肽和组合处理(例如，使用一个以上的修饰三肽的组合)的效力。
在实验1和2中，用HIV-1，HIV-2或SIV以25 TCID50感染大约200,000个H9细胞以试验下列合成三肽IKA-NH2，ILK-NH2，GPQ-NH2，GHK-NH2，GKG-NH2，ACQ-NH2，CQG-NH2，ARV-NH2，KAR-NH2，HKA-NH2，GAT-NH2，KAL-NH2，和GPG-NH2的抑制效力。因此，将H9细胞重悬于含有或不含不同肽(大约100μM)的补充了10％(v/v)加热灭活的胎牛血清(FBS)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100u/ml)(均从GIBCO获得)，和Polybrene(g/ml)(可从Sigma获得)的1ml RPMI 1640培养基中。随后，在20-30μl体积中以25 TCID50加入病毒。细胞与病毒在37℃下培养1小时，然后以170×g沉淀7分钟。在不含肽的RPMI培养基中室温下洗涤细胞3次并按上述以170×g沉淀7分钟。最后一次洗涤后，将细胞重悬于24孔板(Costar公司)的RPMI培养基中并在37℃下潮湿的5％CO2中维持。
当在感染后4，7，10和14天更换培养基时收集并分析培养上清。为了监测病毒复制，使用商业上可获得的Lenti-RT活性试剂盒(CavidiTech，Uppsala，瑞典)试验上清中的逆转录酶(RT)活性。借助于标准的回归线测定RT的量。结果表示为吸光度值(OD)且吸光度越高表示蛋白质浓度越高和病毒感染越强。也经过显微镜检查监测合胞体的形成。表3和4分别显示了实验1和2的细胞培养物上清的吸光度值。
在实验3中(表5)，用HIV-1，HIV-2或SIV以25 TCID50感染大约200,000个H9细胞以试验不同浓度的肽GPG-NH2，GKG-NH2和CQG-NH2及这些肽的组合(所示的浓度相应于各三肽的浓度)的抑制效力。如上所述，将H9细胞重悬于含有或不含各种浓度的不同肽的补充了10％(v/v)加热灭活的胎牛血清(FBS)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100u/ml)，和Polybrene(g/ml)的1ml RPMI 1640培养基中。随后，在20-30μl体积中以25 TCID50加入病毒。细胞与所示病毒在37℃下培养1小时，然后以170×g沉淀7分钟。在不含肽的RPMI培养基中室温下洗涤细胞3次并按上述以170×g沉淀7分钟。最后一次洗涤后，将细胞重悬于24孔板(Costar公司)的RPMI培养基中并在37℃下潮湿的5％CO2中维持。
当在感染后4，7，和11天更换培养基时收集培养物上清。如上所述，经过使用Lenti-RT活性试剂盒(Cavidi Tech)检测上清中的逆转录酶(RT)活性来监测各病毒的复制。借助于标准的回归线测定RT的量。结果表示为吸光度值(OD)且吸光度越高表示蛋白质浓度越高和病毒感染越强。表4显示了实验3的细胞培养物上清的吸光度值。
在实验4中(表6)，用HIV-1以25 TCID50感染大约200,000个H9细胞以试验不同浓度的肽GPG-NH2，GKG-NH2和CQG-NH2及这些肽的组合(所示的浓度相应于三肽的总浓度)的抑制效力。如上所述，将H9细胞重悬于含有或不含各种浓度的不同肽的补充了10％(v/v)加热灭活的胎牛血清(FBS)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100u/ml)，和Polybrene(g/ml)的1ml RPMI 1640培养基中。随后，在20-30μl体积中以25 TCID50加入病毒。细胞与所示病毒在37℃下培养1小时，然后以170×g沉淀7分钟。在不含肽的RPMI培养基中室温下洗涤细胞3次并按上述以170×g沉淀7分钟。最后一次洗涤后，将细胞重悬于24孔板(Costar公司)的RPMI培养基中并在37℃下潮湿的5％CO2中维持。
当在感染后4，7，和11天更换培养基时收集培养物上清。如上所述，经过使用Lenti-RT活性试剂盒(Cavidi Tech)检测上清中的逆转录酶(RT)活性来监测各病毒的复制。借助于标准的回归线测定RT的量。结果表示为吸光度值(OD)且吸光度越高表示蛋白质浓度越高和病毒感染越强。表5显示了实验4的细胞培养物上清的吸光度值。将第11天分析的上清稀释5倍以便检测可以更精确地测定。
在实验5中(表7)，用HIV-1以25 TCID50感染大约200,000个H9细胞以试验不同浓度的肽GPG-NH2，GKG-NH2和CQG-NH2及这些肽的组合的抑制效力。如上所述，将H9细胞重悬于含有或不含各种浓度的不同肽的补充了10％(v/v)加热灭活的胎牛血清(FBS)，青霉素(100u/ml)和链霉素(100u/ml)，和Polybrene(g/ml)的1ml RPMI 1640培养基中。随后，在20-30μl体积中以25 TCID50加入病毒。细胞与所示病毒在37℃下培养1小时，然后以170×g沉淀7分钟。在不含肽的RPMI培养基中室温下洗涤细胞3次并按上述以170×g沉淀7分钟。最后一次洗涤后，将细胞重悬于24孔板(Costar公司)的RPMI培养基中并在37℃下潮湿的5％CO2中维持。
当在感染后4，7，和14天更换培养基时收集培养物上清。经过检测上清中p24的存在来监测各病毒的复制。使用商业上可获得的HIV p24抗原检测试剂盒(Abbott)测定HIV p24抗原。结果表示为吸光度值(OD)且吸光度越高表示蛋白质浓度越高和病毒感染越强。在有些情况下，制备上清的系列稀释液以便更精确地检测p24的浓度。表6显示了实验5的细胞培养物上清的吸光度值。正如下面更详细讨论的，发现三肽GPG-NH2，GKG-NH2和CQG-NH2及这些肽的组合有效抑制HIV-1，HIV-2，和SIV感染。
在实验6中(表8和图4)，用HIV-1以25 TCID50感染大约200,000个HUT78细胞以试验GPG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2，和SPT-NH2的抑制效力。将HUT细胞重悬于含有或不含上述不同小肽(大约100μM)的补充了10％(v/v)加热灭活的胎牛血清(FBS，GIBCO)，青霉素(100u/ml)，链霉素(100u/ml)和Polybrene(Sigma，2μg/ml)的1ml RPMI 1640培养基中。随后，在20μl体积中以25 TCID50加入HIV-1病毒。细胞与病毒在37℃下培养1小时，随后以170×g沉淀细胞7分钟。按上述经过以170×g沉淀细胞7分钟在不含肽的RPMI培养基中室温下洗涤细胞3次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于24孔板(Costar公司)的RPMI培养基中并在37℃下潮湿的5％CO2中维持。当在感染后4，7，和11天更换培养基时收集培养物上清并使用HIV-1 p24 ELISA试剂盒(Abbott实验室，NorthChicago，USA)监测病毒p24产生。正如下面所讨论的，发现小肽RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2，和SPT-NH2有效抑制HIV-1感染。
表3实验1-(现制的肽)第7天的RT第10天的RT
*值代表光密度(OD)
表4实验2-(现制的肽)第7天的RT 第10天的RT
*值代表光密度(OD)
表5实验3-(从Bachem获得的肽)第7天的RT第10天的RT
*值代表光密度(OD)
表6实验4-(从Bachem获得的肽)第7天的RT 第10天的RT
*值代表光密度(OD)
表7实验5-(现制的肽)
*100μM GPG-NH2+GKG-NH2+CQG-NH2*值代表光密度(OD)
表8实验6-(现制的肽)
在表1所列的小肽中，GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2抑制和/或防止HIV-1感染，GKG-NH2，CQG-NH2和GPG-NH2也显示出抑制或防止HIV-2和SIV感染。应明白尽管没有分析小肽RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2防止或抑制HIV-2和SIV感染的能力，但由于HIV-2和SIV在小肽GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2所相应的区域的衣壳蛋白质结构上共有明显的同源性的事实，预期其抑制或防止HIV-2或SIV感染。
实验1-6的结果(在表3-8和图4中显示)证实相应于病毒衣壳蛋白序列、具有甘氨酸作为羧基末端氨基酸的酰胺形式的小肽GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，和SLG-NH2抑制或防止HIV感染。含羧基末端丙氨酸残基(Leu-Lys-Ala(LKA)和His-Lys-Ala(HKA))或羧基末端谷氨酰胺残基(Gly-Pro-Gln(GPQ)和Ala-Cys-Gln(ACQ))的肽不能防止HIV感染。然而，在氨基末端的甘氨酸不是抑制因子，因为具有氨基末端甘氨酸残基的肽Gly-Pro-Gln(GPQ)，Gly-His-Lys(GHK)和Gly-Ala-Thr(GAT)不能防止感染和合胞体形成。另外，具有其它不带电极性侧链，例如Gly-Pro-Gln(GPQ)，Ala-Cys-Gln(ACQ)和Gly-Ala-Thr(GAT)或在羧基末端具有非极性侧链，例如Ala-Arg-Val(ARV)，His-Lys-Ala(HKA)，Lys-Ala-Leu(KAL)和Leu-Lys-Ala(LKA)的肽不能防止感染。尽管在羧基末端的甘氨酸残基似乎与抑制HIV和SIV感染相联系，但小肽羧基末端的其它氨基酸残基或修饰的氨基酸残基也抑制HIV和SIV感染。例如，已显示Ser-Pro-Thr(SPT)抑制或防止HIV-1感染。
在一些实验中，小肽对HIV-1、HIV-2和SIV感染的影响是浓度和时间依赖性的。低到5μM和20μM的GKG-NH2，CQG-NH2，和GPG-NH2和其组合的浓度依然可有效降低HIV-1，HIV-2和SIV感染。然而，100μM或更大浓度的三肽GKG-NH2，CQG-NH2，和GPG-NH2和其组合可更有效地抑制HIV-1，HIV-2和SIV感染。如表7所示，以细胞上清中的p24抗原检测到300μM的GKG-NH2和CQG-NH2降低HIV-1感染性几乎100％。表7中列出的降低百分数是经过将在肽处理的样品中检测到的p24抗原的量除以在对照样品中检测到的p24抗原的量，将该被除数乘以100以获得百分数，并用100％减去该被除数百分数而计算的。例如，GPG-NH2表现出的降低百分数为 且100％-3％＝97％在前5个实验(表3-7)中，显示了等于或大于5μM浓度的三肽GKG-NH2，CQG-NH2，和GPG-NH2和其组合抑制HIV-1，HIV-2和SIV感染。
在第6个实验(表8和图4)中，已显示小肽RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2以100μM有效抑制和/或防止HIV-1感染。如表7中所示，在以上清中衣壳蛋白p24的量进行测量时，用小肽RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，和SLG-NH2可实现几乎100％的病毒降低。表8中所示的p24降低百分数按上面表7中所述计算。尽管GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，和SPT-NH2在100μM时抑制或防止HIV-1感染的效力较小，但相信在较高浓度时该三肽更有效。表3-8和图4所示的实验1-6提供的数据证实相应于病毒衣壳蛋白序列的小肽在大范围的浓度内是有效的抗病毒剂。
在上述实验中，已证实了具有相应于病毒衣壳蛋白序列的修饰小肽通过与病毒衣壳蛋白结合，防止或抑制病毒衣壳蛋白聚合且从而破坏正确衣壳装配和病毒感染来抑制病毒感染(例如，HIV-1，HIV-2和SIV感染)。可使用上面详细描述的许多试验来鉴定任何小肽，修饰的小肽，寡肽或肽模拟物防止或抑制HIV或SIV感染的能力。也可使用类似技术来鉴定任何小肽，修饰的小肽，寡肽或肽模拟物防止或抑制其它病毒感染的能力。另外，这组实验提供了这样的肽试剂的另一例子，该肽试剂是蛋白质聚合所必需的蛋白质-蛋白质相互作用的有效抑制剂。
由于已知一些病毒衣壳蛋白的序列，因此设计，生产和鉴定防止不同病毒衣壳蛋白正确聚合的酰胺形式的小肽是容易的。例如，一些病毒衣壳蛋白含有20个氨基酸长的同源性区域，称为主要同源性区域(MHR)，它存在于许多癌病毒和慢病毒的羧基末端域内。(见图5)。图5显示了HIV-1的羧基末端域(残基146-231)且比较了该序列与其它病毒的衣壳蛋白序列，其中的一些病毒感染鸟类，小鼠和猴。值得注意的是，发现在这些病毒衣壳蛋白的序列中有相当大的同源性。研究者观察到羧基末端域是HIV-1中衣壳二聚体化和病毒装配所必需的。(Gamble等，科学278849(1997)，本文引用以供参考)。尽管在本说明书中描述的试验中表现出抗病毒活性的小肽全部或部分相应于HIV-1，HIV-2或SIV羧基末端域的区域，但病毒N-末端域的区域对于衣壳聚合也是重要的，因此设计和合成全部或部分相应于病毒衣壳蛋白N-末端区域的氨基酸的小肽也是本发明的合适的实施方案。然而，使用全部或部分相应于病毒衣壳蛋白MHR区域和羧基末端域内的氨基酸的小肽是本发明优选的实施方案。
经过设计和生产相应于图5中公开的序列区域的小肽，寡肽，和/或肽模拟物，使用上面讨论的筛选技术或本领域技术人员显而易见的对这些试验的改良形式可迅速鉴定抑制HIV，SIV，RSV，HTLV-1，MMTV，MPMV和MMLV感染的新分子。另外，许多其它病毒衣壳蛋白的序列是已知的，例如，沙粒病毒，轮状病毒，环状病毒，逆转录病毒，乳头瘤病毒，腺病毒，疱疹病毒，副粘病毒，粘液病毒和嗜肝DNA病毒科的成员。可选择全部或部分相应于这些序列的一些小肽，寡肽，和/或肽模拟物并通过使用本文所述的病毒感染试验，病毒衣壳蛋白结合试验，和电子显微镜检技术，或者在本说明书的教导下对本领域的技术人员显而易见的这些试验的改良形式迅速筛选以鉴定有效抑制和/或防止病毒感染的那些肽试剂。
合适的实施方案是包括具有修饰羧基末端，用于破坏蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和超分子复合物装配的小肽(大于一个氨基酸且小于或等于10个氨基酸长)的肽试剂。优选的是，使用具有相应于涉及蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合事件，或超分子复合物装配的蛋白质区域的序列的二肽，三肽，寡肽和相应的肽模拟物。例如，本发明的寡肽可具有4个氨基酸，5个氨基酸，6个氨基酸，7个氨基酸，8个，9个或10个氨基酸，且本发明的肽模拟物可具有类似于4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的结构。理想的寡肽可包括在三肽GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2中发现的全部或部分序列。类似于二肽，三肽和寡肽的肽模拟物也可相应于在GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2中发现的序列。
优选的是小肽在其羧基末端具有调节基团(例如，酰胺基)(CO-NH2)而不是羧基(COOH)。也可使用在其羧基末端具有其它调节基团的小肽，但合适的是，附着的调节基团与酰胺基团具有相同的电荷和立体行为。(参见Vahlne等的美国专利号5627035，比较羧基末端具有不同取代基的肽的试验)。意想不到的是，本发明人发现调节基团(例如，酰胺基或化学和立体行为类似于酰胺基的取代基)使得肽试剂与感兴趣的蛋白质相互作用，从而破坏蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和超分子复合物装配。
在下面说明书中，提供了制备含有二肽，三肽，小于或等于10个氨基酸的寡肽和类似于三肽和小于或等于10个氨基酸的寡肽的肽模拟物(统称为“肽试剂”)的生物技术工具和药用组合物的一些方法。应注意术语“肽试剂”包括二肽，三肽，小于或等于10个氨基酸的寡肽。例如，“肽试剂”是2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸的肽和类似于2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸的肽的肽模拟物。另外，“肽试剂”是如下所述作为多聚体或多聚化试剂提供的2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸的肽或类似于2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸的肽模拟物。
合适的生物技术工具或预防剂或治疗剂的组分以获得对蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合事件，或超分子复合物装配有足够亲和力或抑制的形式或方式提供肽试剂。尽管天然单体肽试剂(例如，表现为各携带仅一个结合表位的肽试剂的分离单位)是足够的，但合成配体或多聚体配体(例如，表现为具有一些结合表位的肽试剂的多个单位)具有大得多的抑制蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合和超分子复合物装配的能力。应注意术语“多聚体(multimeric)”是指存在一个以上单位的配体，例如一些单个分子的三肽，寡肽，或肽模拟物，它不同于术语“多聚化(multimerized)”，多聚化是指存在连接成单个分离单元的一个以上的配体，例如，串联连接的一些三肽，寡肽或肽模拟物分子。
经过将肽试剂偶连到大分子支持物上可获得多聚体试剂(合成的或天然的)。“支持物”也称为载体，树脂或用于附着，固定或稳定肽试剂的任何大分子结构。固体支持物包括，但不限于，反应盘的孔壁，试管，聚苯乙烯珠，磁珠，硝酸纤维素条，膜，微粒例如乳胶颗粒，绵羊(或其它动物)红血细胞，人工细胞和其它。对于药物制备，支持物也可理解为载体。
大分子支持物可具有疏水表面，它以疏水非共价相互作用与肽试剂的一部分相互作用。支持物的疏水表面也可以是聚合物，例如塑料或连接了疏水基团的任何其它聚合物，例如，聚苯乙烯，聚乙烯或聚乙烯类。另外，肽试剂可共价结合到包括蛋白质和寡聚/多聚糖(例如，纤维素，淀粉，糖原，脱乙酰壳多糖或胺化sepharose)的载体上。在后面这些实施方案中，可使用诸如羟基或氨基等肽试剂上的反应基团与载体上的反应基团连接以产生共价键。支持物也可以具有与肽试剂相互作用的带电表面。另外，支持物可具有能被化学激活的其它反应基团以便附着肽试剂。例如，溴化氰活化的基质，环氧活化的基质，硫和硫丙基凝胶，氯甲酸硝基苯基酯和N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸键接，和环氧乙烷丙烯酸支持物在本领域中是常用的。
支持物也可包含无机载体，例如，硅氧化物材料(例如，硅胶，沸石，硅藻土或胺化玻璃)，肽试剂通过羟基，羧基或氨基和载体上的反应基团共价连接到其上。而且，在一些实施方案中，脂质体或脂双层(天然的或合成的)预期可作为支持物，肽试剂以脂质体工程技术附着到膜表面或掺入膜中。在一种方法中，脂质体多聚体支持物含有暴露在双层表面的肽试剂和将肽试剂锚着到脂双层上的第二域。锚着点可由疏水氨基酸残基组成，类似于已知的跨膜域，或可包含以常规技术附着到第一域上的神经酰胺。
用于身体的支持物或载体(即，用于预防或治疗应用)是生理学上合适的，无毒的，且优选无免疫反应性。用于身体的预期载体包括多聚-L-赖氨酸，多聚-D，L-丙氨酸，脂质体和Chromosorb(Johns-Manville Products，Denver Co.)。已在人体中试验了配体连接的Chromosorb(Synsorb-Pk)对溶血性尿毒症综合征的预防且报道为不出现副作用。(Armstrong等，传染病杂志(J.InfectiousDiseases)，1711042-1045(1995))。对于有些实施方案，本发明人预期施用具有附着受试者身体内的肽试剂的能力的“裸露”载体(即，不含附着的肽试剂)。在该方法中，预期进行“前药型”疗法，其中与肽试剂分开施用裸露载体，一旦两者均存在于受试者身体中，载体和肽试剂装配成多聚体复合物。
预期也可在肽试剂和支持物之间插入适当长度的接头，例如λ接头，以便肽试剂具有更大的灵活度，从而克服由支持物产生的任何空间障碍。经过在本说明书详细描述的试验中筛选有各种接头的肽试剂可确定接头的合适长度。
含有一个以上类型的肽试剂的复合支持物也是一个实施方案。“复合支持物”可以是载体，树脂，或用于附着或固定两个或多个不同肽试剂的任何大分子结构，所述的肽试剂与诸如p24等壳粒蛋白结合，和/或干扰衣壳装配和/或抑制病毒感染，例如HIV或SIV感染。在一些实施方案中，预期脂质体或脂双层(天然的或合成的)用于构建复合支持物且使用脂质体工程技术将肽试剂附着到膜表面或掺入膜中。如上所述，预期也可在肽试剂和支持物之间插入适当长度的接头，例如λ接头，以便在分子中具有更大的灵活性，从而克服可能产生的任何空间障碍。经过在本说明书详细描述的试验中筛选有各种接头的配体可确定接头的合适长度。
在本发明的其它实施方案中，上面讨论的多聚体支持物和复合支持物可附着到多聚化的配体上以便分别产生“多聚化-多聚体支持物”和“多聚化-复合支持物”。例如，可经过使用分子生物学的常规技术串联偶连两个或多个肽试剂获得多聚化的配体。配体的多聚化形式对于许多应用是具有优势的，因为可获得具有与诸如p24等壳粒蛋白结合，和/或干扰衣壳装配和/或抑制病毒感染例如HIV或SIV感染的更好能力的试剂。另外，在组成多聚化试剂的各个域之间插入诸如柔性λ接头等接头或间隔子是具有优势的实施方案。例如，在蛋白质结合域之间插入适当长度的λ接头可使得在分子中具有更大的柔性且可克服空间障碍。类似地，在多聚化配体和支持物之间插入接头可促进柔性更大且限制由支持物产生的空间障碍。经过在本说明书详细描述的试验中筛选带各种接头的配体可确定接头的合适长度。
在优选的实施方案中，使用修饰的三肽GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2产生上述各种类型的支持物。也优选使用三肽GPG-NH2，GKG-NH2，CQG-NH2，RQG-NH2，KQG-NH2，ALG-NH2，GVG-NH2，VGG-NH2，ASG-NH2，SLG-NH2和SPT-NH2构建统称为“支持物结合的试剂”的多聚体支持物，复合支持物，多聚化-多聚体支持物，或多聚化-复合支持物。
一些制备和使用本文公开的组合物的方法也是实施方案。在一种方法中，以PPI技术获得的肽试剂掺入药物中。即，选择，设计，生产并鉴定了其防止或抑制蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合事件或疾病的肽试剂(例如，以其在肽表征试验中的效果鉴定的肽试剂)掺入药物中用于治疗人类疾病。在一些方面，选择和设计借助于计算机系统实现。例如，搜索程序和检出程序用于访问一个或多个数据库以选择和设计抑制蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合，或超分子复合物装配的肽试剂。另外，使用上述推理性药物设计的方法选择和设计肽试剂。一旦选择和设计，就“获得”了肽试剂(例如，生产或从商业单位购买)。接着，在评估肽试剂结合感兴趣的蛋白质，破坏蛋白质聚合，和防止或治疗疾病的能力的肽表征试验中筛选肽试剂。然后根据其在这些表征试验中的效果选择肽试剂。产生具有代表肽试剂的符号和代表肽表征试验中效果的一个或多个符号的总体特征，可比较这些总体特征以选择合适的肽试剂用于掺入药物中或用于进一步选择和设计新的肽试剂。一旦表征，肽试剂可按常规技术掺入药物中。
按照盖仑药剂学的常规方法加工药理学上有活性的化合物以产生药剂用于给患者(例如包括人类的哺乳动物)给药。肽试剂可经过和不经修饰掺入药品中。另外，生产按一些途径传递肽试剂或编码小肽的核酸序列的药物或治疗剂是一个实施方案。例如，但不用作限制，具有编码破坏蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质聚合事件，或超分子复合物装配的小肽的序列的DNA，RNA，和病毒载体在本发明的范围内。编码所需肽试剂的核酸可单独或与肽试剂组合给药。
可采用与常规赋形剂混合的肽试剂，即，赋形剂是适合于肠胃外，肠道(例如，口服)或局部应用的与肽试剂无有害反应的药用上可接受的有机或无机载体物质。合适的药用上可接受的载体包括，但不限于，水，盐溶液，乙醇，阿拉伯胶，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明胶，糖类(例如乳糖，直链淀粉或淀粉)，硬脂酸镁，滑石，硅酸，粘性石蜡，香料油，脂肪酸甘油单酯和甘油二酯，季戊四醇脂肪酸酯，羟基甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，等。可灭菌药用制品且如果需要，与例如润滑剂，保存剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，用于影响渗透压的盐，缓冲液，染色，调味和/或芳香物质等与活性化合物无有害反应的辅剂混合。如果需要，它们也可与其它活性剂(例如，维生素)组合。
具体肽试剂制剂用药的有效剂量和方法根据不同患者和疾病的阶段，以及本领域的技术人员已知的其它因素进行变化。用细胞培养物或实验动物中的标准药学方法可测定该化合物的治疗效果和毒性，例如ED50(在群体的50％中治疗上有效的剂量)和LD50(对群体的50％的致死剂量)。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数，可表示为LD50/ED50比。优选表现出大治疗指数的药用组合物。从细胞培养试验和动物试验获得的数据用于配制一定范围的剂量用于人类用途。该化合物的剂量优选位于包括具有很小或无毒性的ED50的循环浓度范围内。该剂量依赖于采用的剂量形式，患者的敏感性和用药途径在该范围内变动。
由各医生根据所要治疗的病人来选择精确剂量。可调节剂量和给药以提供足够水平的活性部分或维持所需效力。可考虑的其它因素包括疾病症状的严重性，患者的年龄，体重和性别；饮食，给药时间和频率，药物组合，反应敏感性，和对治疗的耐受性/反应。短期作用药物组合物可每天给药，而长效药用组合物可每2，3到4天，每周，或每2周一次给药。根据具体制剂的半寿期和清除速率，本发明的药用组合物可每天给药一次，两次，3，4，5，6，7，8，9，10或更多次。
正常剂量依赖于给药途径可从大约1到100000微克，直到大约10克总剂量之间变动。合适的剂量包括250μg，500μg，1mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg，300mg，350mg，400mg，450mg，500mg，550mg，600mg，650mg，700mg，750mg，800mg，850mg，900mg，1g，1.1g，1.2g，1.3g，1.4g，1.5g，1.6g，1.7g，1.8g，1.9g，2g，3g，4g，5g，6g，7g，8g，9g和10g。另外，在以局部形式施用药剂的实施方案中本发明的肽试剂的浓度可以很高。在一些实施方案中可以使用肽试剂的摩尔浓度。局部用药和/或覆盖医疗设备的合适浓度范围为从100μM到800mM。这些实施方案中优选的浓度范围为从500μM到500mM。例如，用于局部用药和/或覆盖医疗设备的优选浓度包括500μM，550μM，600μM，650μM，700μM，750μM，800μM，850μM，900μM，1mM，5mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM，120mM，130mM，140mM，150mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，300mM，325mM，350mM，375mM，400mM，425mM，450mM，475mM，和500mM。在文献，(参见，例如，美国专利号4657760；5206344；或5225212)和下文中提供了关于具体剂量和递送方法的指南。
更具体的说，本发明的肽试剂的剂量是提供足够肽试剂以达到所需效果的剂量。因此，本发明的剂量的实施方案可产生大约0.1μM到500mM的组织或血液浓度或两者。合适的剂量产生大约1到800μM的组织或血液浓度或两者。优选的剂量产生大于大约10μM到大约500μM的组织或血液浓度。例如，优选的剂量是实现10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，35μM，40μM，45μM，50μM，55μM，60μM，65μM，70μM，75μM，80μM，85μM，90μM，95μM，100μM，110μM，120μM，130μM，140μM，145μM，150μM，160μM，170μM，180μM，190μM，200μM，220μM，240μM，250μM，260μM，280μM，300μM，320μM，340μM，360μM，380μM，400μM，420μM，440μM，460μM，480μM，和500μM的组织或血液浓度或两者所需要的小肽的量。尽管产生大于800μM的组织浓度的剂量不是优选的，但它们可用于本发明的一些实施方案中。也可提供肽的连续输注以维持按血液水平测量的组织中的稳定浓度。
肽试剂的给药途径包括，但不限于，局部，经皮肤，肠胃外，胃肠道，经支气管，和经肺泡用药。通过局部施用含有肽的乳剂，凝胶，漂洗液等可实现局部给药。通过施用能使得肽试剂穿透皮肤并进入血流的乳剂，漂洗液，凝胶等可实现经皮肤给药。肠胃外给药途径包括，但不限于，电的或直接注射，例如直接注射进中央静脉管中，静脉内，肌肉内，腹膜内或皮下注射。胃肠道给药途径包括，但不限于，吞食和直肠给药。经支气管和经肺泡给药途径包括，但不限于，经口腔或鼻内吸入。
适合于局部应用的含肽试剂化合物的组合物包括，但不限于，生理学上可接受的植入物，软膏，乳剂，漂洗液，和凝胶。肽至少最低限度可溶于其中的任何液体，凝胶或固体，药用上可接受的基质都适合于本发明的局部使用。局部应用的组合物在性交期间防止HIV传播时特别有用。用于该用途的合适的组合物包括，但不限于阴道或肛门栓剂，乳剂和灌洗液。
适合于经皮肤给药的肽试剂的组合物包括，但不限于直接施用到皮肤上或掺入诸如经皮肤装置(“经皮肤的膏药”)等保护性载体上的药用上可接受的悬液，油，乳剂，和软膏。合适的乳剂，软膏等的例子可参见《医生桌面参考书》(Physician＇s Desk Reference)。合适的经皮肤装置的例子在，例如，Chinen等的1989年4月4日出版的美国专利号4818540中描述，本文引用以供参考。
适合于肠胃外给药的肽试剂的组合物包括，但不限于药用上可接受的无菌等渗溶液。该溶液包括但不限于用于注射进中央静脉管，静脉内，肌肉内，腹膜内或皮下注射肽试剂的盐水和磷酸盐缓冲盐水。
适合于经支气管和经肺泡给药的肽试剂的组合物包括，但不限于用于吸入的各种类型的气雾剂。例如，戊烷脒经气雾剂鼻内施用给AIDS病人以防止由pneumocystis carinii引起的肺炎。适合于经支气管和经肺泡施用肽试剂的装置也是实施方案。该装置包括但不限于喷雾器和汽化器。容易改装各种形式的通常可获得的喷雾器和汽化器用于传递肽试剂。
适合于胃肠道给药的肽试剂的组合物包括，但不限于用于吞食的药用上可接受的粉末，丸剂或液体和用于直肠给药的栓剂。由于是HIV感染最常用的途径且使用容易，因此胃肠道给药，特别是口服是本发明优选的实施方案。已制备具有三肽(GPG-NH2)的500毫克胶囊且发现贮存于4℃时最少12个月是稳定的。正如以前在其它病毒-宿主系统中所显示的，小肽的特异性抗病毒活性可在口服用药后在血清中检测。(Miller等，应用微生物学(Appl.Mocrobiol.)，161489(1968))。
该肽试剂也适合于用于预防HIV感染较重要的情况。例如，医护人员经常接触HIV阳性和其分泌物及体液含HIV病毒的病人。另外，肽试剂可配制成在性交期间使用以防止HIV传播的抗病毒组合物。该组合物在本领域中是已知的且也在Modak等的1990年5月3日以PCT公开号WO90/04390公开的国际申请中进行了描述，本文引用以供参考。
本发明的方面还包括覆盖医用装备，例如手套，被单，和工作台面防止HIV传播。作为替代，肽试剂可浸渍进聚合医用装置中。特别优选的是用作医用手套和避孕套的覆盖物。以含有肽的粉末或以肽试剂悬浮于其中的聚合覆盖物提供适用于医疗装置的覆盖物。用于覆盖物或装置的合适的聚合材料是生理学上可接受的材料且通过该材料可扩散治疗有效量的肽试剂。合适的聚合物包括，但不限于，聚氨基甲酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚酰胺，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯，聚四氟乙烯，聚氯乙烯，乙酸纤维素，硅弹性体，胶原蛋白，丝等。例如，该覆盖物在Fox等的1986年9月16日出版的美国专利号4612337中进行了描述，本文引用以供参考。
单体和多聚体肽试剂适合于作为预防措施或作为治疗已患有该疾病的受试者的治疗剂来治疗受试者。因此，人类疾病的治疗方法是本发明的实施方案。尽管可用该肽作为预防剂治疗任何人，但最合适的受试者是有得特定疾病的风险的人。例如，在本发明的许多方法中，首先鉴定有风险的个体。
患有NFκB-相关疾病(例如，炎症性疾病或免疫疾病)的个体可根据与该转录激活物相关的基因产物的表达水平进行鉴定。例如，具有过度表达细胞因子的个体可用基于蛋白质或基于RNA的诊断进行鉴定。一旦鉴定，可给个体施用抑制NFκB二聚体化的治疗有效量的肽试剂。以相似的方式，可治疗过度表达lκB的个体。因此，用基于蛋白质或基于RNA的诊断鉴定个体，且一旦鉴定，可给个体施用破坏NFκB/IκB复合物形成的治疗有效量的肽试剂。
另外，可治疗遭受细菌毒素毒性作用的个体。尽管肽试剂可作为预防剂施用给任何人用于改善细菌毒素的毒性作用，但优选鉴定感染的个体或有细菌感染风险的人。可作出该决定的许多诊断试验在本领域是已知的。一旦鉴定，可给该个体施用破坏细菌全毒素形成的治疗上有效量的肽试剂。
其它实施方案包括治疗和预防阿尔茨海默氏疾病和瘙痒症的方法。尽管许多人具有得该疾病的风险且可在此基础上进行鉴定，但具有与阿尔茨海默氏疾病相关的家族历史或遗传标记的个体或者试验为朊病毒相关蛋白存在阳性的个体优选鉴定为危险患者。鉴定具有形成阿尔茨海默氏疾病风险的人的一些诊断方法已有报道。(例如，参见美国专利号5744368；5837853；和5571671)。可使用这些方法鉴定具有形成阿尔茨海默氏疾病风险的人，或可采用本领域的技术人员已知的其它方法。一旦鉴定，给患有阿尔茨海默氏疾病的个体或者具有形成阿尔茨海默氏疾病风险的患者施用按上文详细描述的方法(统称为“PPI技术”)选择，设计，生产和表征的治疗上安全且有效量的肽试剂。同样，当病人被鉴定为具有朊病毒相关蛋白证据时，PPI技术用于产生给需要的受试者施用以便治疗该症状的药物。
本发明的另一实施方案是治疗或预防癌症的方法，其中鉴定患有癌症的患者或具有患癌症风险的患者，然后施用治疗上安全和有效量的以PPI技术获得的肽试剂。可使用该方法治疗或预防与微管蛋白聚合相关的各种形式的癌症，包括但不限于白血病，前列腺癌和结肠癌。尽管在某些情况下，每个人都具有形成癌症的风险且因此被鉴定为需要治疗的个体，但鉴定具有医疗历史或家族历史的合适个体用于治疗。确定人们是否具有形成不同形式的癌症的风险的一些诊断方法是可得到的。例如，美国专利号5891857提供了基于BRCA1检测诊断乳腺癌，卵巢癌，结肠癌和肺癌的方法，美国专利号5888751提供了经过检测SCP-1，标记检测细胞转化的一般方法，美国专利号5891651提供了经过从粪便中回收结肠上皮细胞或其碎片检测结肠瘤的方法。美国专利号5902725提供了经过测定三分叉的具有连接寡糖的前列腺特异性抗原的存在来检测前列腺癌的方法，美国专利号5916751提供了经过检测TGFB-4基因的存在来诊断结肠或卵巢粘液腺癌或睾丸腺癌的方法。还有许多基于遗传和基于血液筛选的方法是已知的。
另外，提供了治疗病毒疾病的方法。因此，鉴定感染个体，然后施用治疗上有效量的破坏病毒衣壳装配且因此打断病毒感染的肽试剂。优选将具有病毒感染的个体或具有病毒感染风险的个体鉴定为有需要的对象。
另外，在一些实施方案中，将肽试剂与其它常规疗法结合用药以便治疗人类疾病。在一个方法中，施用肽试剂与细胞减少疗法(例如，肿瘤的手术切除)结合以便实现比仅用手术切除所提供的更好的杀肿瘤反应。在另一实施方案中，施用肽试剂与放射疗法结合以便在患者中实现比仅用放射治疗所提供的更好的杀肿瘤反应。另外，肽试剂可与化疗剂结合给药。此外，施用肽试剂可与放射免疫疗法结合以便治疗癌症比仅用放射免疫治疗所出现的更有效。另外，本发明的肽试剂可与抗病毒剂，或用于治疗阿尔茨海默氏疾病的药剂结合给药。
在一些优选的实施方案中，含有肽试剂的治疗剂与治疗病毒感染，例如HIV感染的其它治疗剂结合用药，以便获得更好的病毒反应。目前，有4种不同类型的药物在临床上用于人类HIV感染的抗病毒治疗。它们是(i)核苷类似物逆转录酶抑制剂(NRTIs)，例如齐多夫定，拉米夫定，双脱氧胸苷，去羟肌苷，abacavir，和扎西他滨；(ii)核苷酸类似物逆转录酶抑制剂，例如adetovir和pivaxir；(iii)非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)，例如，efavirenz，奈韦拉平，和delavirdine；和(iv)蛋白酶抑制剂，例如indinavir，nelfinavir，ritonavir，沙奎那韦，和amprenavir。通过同时使用2，3，或4种不同类型的药物结合本发明的肽试剂给药，HIV形成抗性的可能性较小，因为克服不同类型的药物和肽试剂的多重突变在同一病毒颗粒中出现的可能性较小。
因此本发明优选的实施方案是肽试剂与核苷类似物逆转录酶抑制剂，核苷酸类似物逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂以本领域的技术人员已知的剂量和方法结合给药。含有本发明的肽试剂和核苷类似物逆转录酶抑制剂，核苷酸类似物逆转录酶抑制剂，非核苷逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的药物也是本发明的实施方案。
尽管参照实施方案和实施例描述了本发明，应明白可作出各种修改而不偏离本发明的精神。因此，本发明仅受到下面权利要求书的限制。本文引用的所有文献特意地并入以供参考。
权利要求
1.抑制转录激活的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，而且其中所述的组合物通过破坏转录激活物的二聚体化抑制转录激活。
2.抑制转录阻抑的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中所述的组合物通过破坏转录阻抑物与转录激活物的缔合来抑制转录阻抑。
3.抑制细菌全毒素装配的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中毒素蛋白亚基的缔合来抑制细菌全毒素的装配。
4.抑制肌动蛋白聚合的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中肌动蛋白亚基的缔合来抑制肌动蛋白聚合。
5.抑制β-淀粉样肽聚集的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中β-淀粉样蛋白亚基的缔合来抑制β-淀粉样肽的聚集。
6.抑制微管蛋白复合物装配的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中微管蛋白亚基的缔合来抑制微管蛋白复合物的装配。
7.抑制转录激活的方法，包括给细胞提供有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
8.抑制转录阻抑的方法，包括给细胞提供有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
9.抑制细菌全毒素装配的方法，包括给细胞提供有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
10.抑制肌动蛋白聚合的方法，包括给细胞提供有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
11.抑制β-淀粉样肽聚集的方法，包括给细胞提供有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
12.抑制微管蛋白聚合的方法，包括给细胞提供有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
13.治疗和预防炎症性疾病的方法，包括鉴定过量表达NFκB或具有过量表达NFκB风险的个体；和给所述的个体施用有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
14.治疗和预防人类疾病的方法，包括鉴定过量表达NFκB或具有过量表达NFκB风险的个体；和给所述的个体施用有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
15.治疗和预防人类疾病的方法，包括鉴定过量表达IκB或具有过量表达IκB风险的个体；和给所述的个体施用有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
16.治疗和预防阿尔茨海默氏疾病的方法，包括鉴定患有阿尔茨海默氏疾病或具有患阿尔茨海默氏疾病风险的个体；和给所述的个体施用有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
17.治疗和预防癌症的方法，包括鉴定患有癌症或具有患癌症风险的个体；和给所述的个体施用有效量的具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸。
18.制备药物的方法，包括(a)选择相应于涉及蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质区域的肽试剂；(b)获得步骤(a)中选择的肽试剂；(c)鉴定步骤(b)中获得的肽试剂从结合蛋白质的能力、防止蛋白质聚合的能力、调节细胞反应的能力选择的特征；和(d)将步骤(c)鉴定的肽试剂掺入药物中。
19.权利要求18的方法，其中肽试剂是具有式X1X2X3-NH2的酰胺形式的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2。
20.权利要求19的方法，其中鉴定步骤包括肽表征试验。
21.抑制转录激活的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-R的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分，其中所述的组合物通过破坏转录激活物的二聚体化抑制转录激活。
22.抑制转录阻抑的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-R的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分，其中所述的组合物通过破坏转录阻抑物与转录激活物的缔合来抑制转录阻抑。
23.抑制细菌全毒素装配的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-R的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中毒素蛋白亚基的缔合来抑制细菌全毒素的装配。
24.抑制肌动蛋白聚合的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-R的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中肌动蛋白亚基的缔合来抑制肌动蛋白聚合。
25.抑制β-淀粉样肽聚集的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-R的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中β-淀粉样蛋白亚基的缔合来抑制β-淀粉样肽的聚集。
26.抑制微管蛋白复合物装配的组合物，包含有效量的具有式X1X2X3-R的肽，其中X1，X2，和X3是任意氨基酸且所述的肽不是Gly-Pro-Gly-NH2，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分，其中所述的组合物通过防止蛋白质复合物中微管蛋白亚基的缔合来抑制微管蛋白复合物的装配。
27.权利要求21，22，23，24，25，或26的组合物，其中肽具有式X4X5X6X7X8X9X10X1X2X3-R，其中X4，X5，X6，X7，X8，X9，和X10是任意氨基酸且其中任意1，2，3，4，5，6或7个氨基酸不存在，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分。
28.抑制转录激活的方法，包括给细胞提供有效量的权利要求21或27的肽。
29.抑制转录阻抑的方法，包括给细胞提供有效量的权利要求22或27的肽。
30.抑制细菌全毒素装配的方法，包括给细胞提供有效量的权利要求23或27的肽。
31.抑制肌动蛋白聚合的方法，包括给细胞提供有效量的权利要求24或27的肽。
32.抑制β-淀粉样肽聚集的方法，包括给细胞提供有效量的权利要求25或27的肽。
33.抑制微管蛋白聚合的方法，包括给细胞提供有效量的权利要求26或27的肽。
34.一种药物，含有治疗或预防有效量的权利要求27的组合物。
35.治疗人类疾病的方法，包括鉴定需要抑制蛋白质-蛋白质相互作用的试剂的个体；和给所述的个体施用含有治疗有效量的权利要求27的组合物的药物。
36.一种药物，含有有效量的具有式X4X5X6X7X8X9X10X1X2X3-R的肽，其中X4，X5，X6，X7，X8，X9，和X10是任意氨基酸且其中任意1，2，3，4，5，6或7个氨基酸不存在，其中R是附着到所述肽羧基末端上的调节基团且R包含酰胺基团或具有相似电荷和空间形状的其它部分。
全文摘要
本发明涉及调节蛋白质聚合和超分子蛋白质复合物装配所必需的蛋白质－蛋白质相互作用的肽的发现。更具体地说,公开了将包含具有修饰的羧基末端的各种小肽的生物技术工具和药物用于人类疾病的研究和治疗或预防。
文档编号A61P25/28GK1377276SQ00813617
公开日2002年10月30日 申请日期2000年6月29日 优先权日1999年8月9日
发明者A·瓦赫尼 申请人:特里帕普股份公司