专利名称：c－JUN N－末端激酶(JNK)和其它蛋白激酶的抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白激酶，尤其是属于促分裂原活化蛋白(MAP)激酶家族的c-Jun N-末端激酶(JNK)的抑制剂。有多种编码JNK的不同基因和同种型。JNK调控对环境压力和促炎细胞因子起反应的细胞因子，并且据表明在多种不同疾病的介导中起作用。本发明还涉及制备这些抑制剂的方法。本发明还提供了包含本发明抑制剂的药物组合物，和使用这些组合物来治疗和预防不同疾病的方法。
背景技术：
哺乳动物细胞通过激活信号传导级联而对细胞外刺激起反应，信号传导级联是由促分裂原活化蛋白(MAP)激酶家族介导的，MAP激酶包括细胞外信号调控激酶(ERKs)、p38 MAP激酶和c-Jun N-末端激酶(JNKs)。MAP激酶(MAPKs)是由多种不同的信号，包括生长因子、细胞因子、UV辐射、和应激诱导剂激活的。MAPKs是丝氨酸/苏氨酸激酶，并且其激活是通过在激活回路中在Thr-X-Tyr片断上的苏氨酸和酪氨酸的双重磷酸化而实现的。MAPKs磷酸化多种不同底物，包括转录因子，而转录因子调控特定基因组表达，并由此介导对刺激的特定反应。
一类值得特别关注的激酶是c-Jun NH2-末端蛋白激酶，其还称为JNKs。已经鉴定了三种不同的基因JNK1、JNK2、JNK3，并且在哺乳动物细胞中至少存在10种不同的JNKs剪切同种型[Gupta等人，EMBO J.，152760-70(1996)]。JNK成员是通过促炎细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(TNFa)和白介素-1β(IL-1β)，以及通过环境应力包括茴香霉素、UV辐射、缺氧、和渗透压休克激活的[Minden等人，Biochemica etBiophysica Acta，1333F85-F104(1997)]。
JNKs的下游底物包括转录因子c-Jun、ATF-2、Elk1、p53和细胞死亡结构域蛋白(DENN)[Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，952586-91(1998)]。各种JNK同种型以不同亲和力结合这些底物，这意味着在体内是通过不同JNKs的底物特异性来调控信号传导路径(Gupta等人，上文)。
据表明，JNKs与其它MAPKs在介导对癌症、凝血酶诱导的血小板聚集、免疫缺陷病症、自身免疫性疾病、细胞死亡、变态反应、骨质疏松以及心脏病的细胞反应方面起作用。涉及JNK路径激活的治疗目标包括慢性骨髓性白血病(CML)、类风湿性关节炎、哮喘、骨关节炎、局部缺血、癌症和神经变性疾病。
有几篇报道详细描述了与肝病或肝缺血发作有关的JNK激活的重要性[Nat.Genet.21326-9(1999)；FEBS Lett.420201-4(1997)；J.Clin.Invest.1021942-50(1998)；Hepatology 281022-30(1998)]。因此，JNK抑制剂可用于治疗多种不同的肝脏疾病。
据报道，JNK在心血管疾病例如心肌梗塞或充血性心力衰竭中起作用，因为据显示JNK介导对不同类型心脏应力的肥大反应[Circ.Res.83167-78(1998)；Circulation 971731-7(1998)；J.Biol.Chem.27228050-6(1997)；Circ.Res.79162-73(1996)；Circ.Res.78947-53(1996)；J.Clin.Invest.97508-14(1996)]。
据证实JNK级联还在T-细胞激活，包括IL-2启动子激活中起作用。因此，JNK抑制剂可具有用于改变病理性免疫反应的治疗价值[J.Immunol.1623176-87(1999)；Eur.J.Immunol.283867-77(1998)；J.Exp.Med.186941-53(1997)；Eur.J.Immunol.26989-94(1996)]。
已确认了JNK激活在各种癌症中的作用，这意味着JNK抑制剂可用于治疗癌症。例如，组成性激活的JNK与HTLV-1介导的肿瘤发生有关[Oncogene 1313542(1996)]。JNK可能在卡波济氏肉瘤(KS)中起作用，因为据认为bFGF和OSM对KS细胞的增殖作用是通过其激活JNK信号传导路径而介导的[J.Clin.Invest.991798-804(1997)]。涉及KS增殖的其它细胞因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6和TNFα的增殖作用也可能是JNK介导的。此外，在p210 BCR-ABL转化细胞中，c-jun基因的调控与与JNK活性一致，这表明JNK抑制剂可用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)[Blood 922450-60(1998)]。
JNK1和JNK2在多种不同组织中广泛表达。与其相反，JNK3在脑中选择性地表达，在心脏和睾丸中有较小程度的表达[Gupta等人，上文；Mohit等人，Neuron 1467-78(1995)；Martin等人，Brain Res.Mol.Brain Res.3547-57(1996)]。JNK3与海人草酸诱导的神经元细胞凋亡有关，这表明JNK在谷氨酸神经毒害的发病机理中起作用。在成人脑中，JNK3表达局限于海马CA1、CA4和下脚区域以及新皮质第3和5层中的锥体细胞[Mohit等人，上文]。急性缺氧的患者的CA1神经元表现出强的核JNK3-免疫反应性，而得自正常患者脑组织的海马神经元表现出最小的、扩散性细胞质染色[Zhang等人，上文]。因此，JNK3可能涉及海马中CA1神经元的缺氧和缺血损伤。
此外，在免疫化学上JNK3与阿尔茨海默氏病中的易受损害神经元一起定位[Mohit等人，上文]。JNK3基因的破坏会引起小鼠对兴奋毒性谷氨酸受体激动剂海人草酸的抗性，包括对癫痫活动、AP-1转录活性以及海马神经元细胞凋亡的作用，这表明JNK3信号传导路径在谷氨酸神经毒害发病机理中起着非常重要的作用(Yang等人，Nature，389865-870(1997))。
基于这些发现，JNK信号传导，尤其是JNK3信号传导涉及与细胞凋亡有关的神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、ALS(肌萎缩性侧索硬化)、癫痫和癫痫发作、亨廷顿氏舞蹈病、创伤性脑损伤、以及缺血和出血性中风。
在医药学上非常需要开发出可用于治疗与JNK激活有关的各种病症，尤其是因为对于大多数这些疾病来说，目前可采用的治疗选择较不充分。
最近，我们在于1998年5月4日提交的美国专利申请60/084056中描述了可结晶的JNK蛋白与-磷酸腺苷复合物，包括含有JNK3的复合物。该信息对于鉴定和涉及不同JNK的潜在抑制剂非常有用，这样的抑制剂具有上述治疗用途。
为了开发出能抑制MAPKs的药物例如p38抑制剂，人们已经作了大量工作。参见例如WO 98/27098和WO 95/31451。然而，就我们的知识而言，没有任何MAPK抑制剂能特异性地作用于JNKs而不作用于其它相关MAPKs。
因此，仍然非常需要开发出可用于治疗与JNK激活有关的各种病症的JNKs有效抑制剂，包括JNK3抑制剂。
发明概述现在已经发现，本发明化合物及其药物组合物能有效地用作c-JunN-末端激酶(JNK)的抑制剂。这些化合物具有通式I 其中R1是H、CONH2、T(n)-R、或T(n)-Ar2，n可以是0或1，且G、XYZ、和Q如下所述。优选的化合物是其中包含XYZ的环是噁唑的那些。优选的G基团是任选取代的苯基，并且优选的Q是嘧啶、吡啶或吡唑环。
这些化合物及其药物组合物可用于治疗或预防多种不同病症，例如心脏病、免疫缺陷病症、炎性疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病、骨破坏疾病例如骨质疏松、增殖性疾病、感染疾病和病毒疾病。这些组合物还可用于阻止细胞死亡和增生的方法，并因此可用于治疗或预防中风中的再灌注/缺血、心脏病发作、和器官缺氧。本发明组合物还可用于预防凝血酶引起的血小板聚集。本发明组合物尤其可用于治疗疾病例如慢性骨髓性白血病(CML)、类风湿性关节炎、哮喘、骨关节炎、缺血、癌症、肝脏疾病例如肝缺血、心脏病例如心肌梗塞和充血性心力衰竭、涉及T细胞激活的免疫病症、和神经变性疾病。
发明详述本发明提供了可用作JNK抑制剂的新的化合物、及其可药用衍生物。这些化合物具有通式I 其中X-Y-Z选自 R1是H、CONH2、T(n)-R、或T(n)-Ar2；R是脂族基团或取代的脂族基团；n是0或1；T是C(＝O)、CO2、CONH、S(O)2、S(O)2NH、COCH2或CH2；R2分别独立地选自氢、-R、-CH2OR、-CH2OH、-CH＝O、-CH2SR、-CH2S(O)2R、-CH2(C＝O)R、-CH2CO2R、-CH2CO2H、-CH2CN、-CH2NHR、-CH2N(R)2、-CH＝N-OR、-CH＝NNHR、-CH＝NN(R)2、-CH＝NNHCOR、-CH＝NNHCO2R、-CH＝NNHSO2R、-芳基、-取代的芳基、-CH2(芳基)、-CH2(取代的芳基)、-CH2NH2、-CH2NHCOR、-CH2NHCONHR、-CH2NHCON(R)2、-CH2NRCOR、-CH2NHCO2R、-CH2CONHR、-CH2CON(R)2、-CH2SO2NH2、-CH2(杂环基)、-CH2(取代的杂环基)、-(杂环基)、或-(取代的杂环基)；R3分别独立地选自氢、R、COR、CO2R或S(O)2R；G是R或Ar1；Ar1是芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂环基、或取代的杂环基，其中Ar1可任选与含有0-3个杂原子的部分不饱和或全不饱和5-7元环稠合；Q-NH是 其中Q-NH上的H可任选被R3替代；A是N或CR3；U是CR3、O、S、或NR3；Ar2是芳基、取代的芳基、杂环基或取代的杂环基，其中Ar2可任选与含有0-3个杂原子的部分不饱和或全不饱和5-7元环稠合；并且Ar2、包括如果存在时稠合环中的每个可取代的碳原子可任选独立地被下列基团取代卤素、R、OR、SR、OH、NO2、CN、NH2、NHR、N(R)2、NHCOR、NHCONHR、NHCON(R)2、NRCOR、NHCO2R、CO2R、CO2H、COR、CONHR、CON(R)2、S(O)2R、SONH2、S(O)R、SO2NHR、或NHS(O)2R，其中稠合环中的每个饱和碳可任选独立地被下列基团取代＝O、＝S、＝NNHR、＝NNR2、＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R、或＝NR；其中Ar2中每个可取代的氮原子可任选被R、COR、S(O)2R或CO2R取代。
除非另有说明，否则在本文中使用的术语具有下列定义。本文所用术语“脂族基团”是指直链、支链或环状C1-C12烃、优选具有1-6个碳原子的烃，所述烃是全饱和或者含有一个或多个不饱和单位。例如，合适的烃基包括取代或未取代的直链、支链或环状烷基、烯基、炔基及其组合体例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基、或(环烷基)烯基。单独使用或者作为较大基团一部分使用的术语“烷基”和“烷氧基”是指含有1-12个碳原子的直链和支链。单独使用或者作为较大基团一部分使用的术语“烯基”和“炔基”包括含有2-12个碳原子的直链和支链。术语“卤代烷基”、“卤代烯基”或“卤代烷氧基”是指被一个或多个卤素原子取代的烷基、烯基或烷氧基。术语“卤素”是指F、Cl、Br、或I。术语“杂原子”是指N、O或S，并包括氧化形式的任何氮和硫，以及季铵化形式的任何碱性氮。
单独使用或者作为较大基团例如“芳烷基”一部分使用的术语“芳基”是指5-14元芳环基团，例如苯基、苄基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基，以及杂环芳基或杂芳基例如2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁二唑基、5-噁二唑基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、3-哒嗪基、3-哒嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、5-四唑基、2-三唑基、5-三唑基、2-噻吩基、或3-噻吩基。
芳基还包括其中碳芳环或杂芳基环与一个或多个其它环稠合的稠合多环芳环系。其实例包括四氢萘基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并二氮杂基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基等。还包括在本文所用术语“芳基”范围内的是其中一个或多个碳芳环和/或杂芳基环与环烷基或非芳族杂环基稠合的基团，例如二氢化茚基或四氢苯并吡喃基。
术语“杂环”或“杂环基”是指在环中包含一个或多个杂原子例如氮、氧或硫的非芳族环。该环可以是5元、6元、7元或8元环和/或与另一个环例如环烷基或芳环稠合。其实例包括3-1H-苯并咪唑-2-酮、3-1-烷基苯并咪唑-2-酮、2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢吡喃基、3-四氢吡喃基、4-四氢吡喃基、2-四氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉基、3-吗啉基、4-吗啉基、2-硫代吗啉基、3-硫代吗啉基、4-硫代吗啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、4-噻唑烷基、二氮杂环戊酮(diazolonyl)、N-取代的二氮杂环戊酮、1-苯并吡咯酮基、苯并四氢吡喃、苯并三唑-1-基、苯并吡咯烷、苯并哌啶、苯并氧杂环戊烷、苯并硫杂环戊烷、和苯并四氢硫代吡喃。
本发明化合物可包含与含有0-3个杂原子的部分饱和或全不饱和5-7元环稠合的环。这样的稠合环可以是芳族或非芳族单环，其实例包括如上所述的芳基和杂环基环。
芳基(碳芳环和杂芳环)或芳烷基例如苄基或苯乙基可包含一个或多个取代基。在芳基的不饱和碳原子上的适当取代基的实例包括卤素、-R、-OR、-OH、-SH、-SR、保护的OH(例如酰氧基)、苯基(Ph)、取代的Ph、-OPh、取代的-OPh、-NO2、-CN、-NH2、-NHR、-N(R)2、-NHCOR、-NHCONHR、-NHCON(R)2、-NRCOR、-NHCO2R、-CO2R、-CO2H、-COR、-CONHR、-CON(R)2、-S(O)2R、-SONH2、-S(O)R、-SO2NHR、或-NHS(O)2R，其中R是脂族基团或取代的脂族基团。
脂族基团或非芳族杂环可包含一个或多个取代基。在脂族基团或非芳族杂环的饱和碳上的适当取代基的实例包括上述列举的关于不饱和碳、例如芳环中不饱和碳的取代基，以及下述取代基＝O、＝S、＝NNHR、＝NNR2、＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R、或＝NR。
在芳族或非芳族杂环上的可取代的氮原子可任选被取代。在氮原子上的合适的取代基包括R、COR、S(O)2R、和CO2R，其中R是脂族基团或取代的脂族基团。
通过将本文所述化合物的羧酸或酯部分进行电子等排或生物电子等排置换而产生的化合物也在本发明范围内。通过交换原子或原子团来产生具有与母羧酸或酯相类似的生物性质的新化合物而产生的电子等排物是本领域已知的。生物电子等排置换可以基于物理化学或拓扑学基础。羧酸的电子等排的实例是CONHSO2(烷基)例如CONHSO2Me。
对于本领域技术人员来说是显而易见的是，一些本发明化合物可以以互变异构形式或水合形式存在，所有这些形式的化合物都在本发明范围内。除非另有说明，否则本文所描述的结构还包括所有立体化学形式的结构；即相对于每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体和非对映异构体混合物包括在本发明范围内。除非另有说明，否则本文所描述的结构还包括其差异仅在于存在一个或多个富含同位素的原子的化合物。例如，具有本发明化合物结构，但是氢被氘或氚替代，或者碳被富含13C-或14C-的碳替代的化合物包括在本发明范围内。这样的化合物可用于例如生物测定中的分析工具或探针。
一个本发明实施方案涉及涉及定义如下的式I化合物其中含有XYZ的环是异噁唑，这样的化合物由式IA代表
其中R2优选为烷基例如甲基，或CH2(杂环基)例如CH2(N-吗啉基)；G优选为Ar1；且R1优选为T(n)-AR2或T(n)-R，其中n最优选为0。最优选的是其中G、R1、和R2如上所述，且Q-NH是氨基吡啶或氨基嘧啶，且NH在环的2位
或者Q-NH是氨基吡唑
下表1列出了IA化合物的代表性实例，其中Q是嘧啶、吡啶或吡唑，且R1是AR2，这样的化合物由式IIA代表。
表1式IIA化合物的实例
(其中Ar2是R1)
<p>R治疗(参考)在空腹情况下，给予一片单一口服剂量的Remeron(含有30毫克的米氮平)，然后给予200毫升无碳酸水。
治疗的持续时间两个单一剂量给药，间隔至少为期两周的清除期。
药代动力学给药前，给予米氮平15，30，45，60和90分钟以及2，2.5，3，4，6，8，12，16，24，36，48，72和96小时后取血样用于米氮平的浓度测定。从个体的血浆浓度-时间曲线得到下列参数Cmax，tmax，AUC0-tlast，t1/2，λz和AUC0-∞。由主要参数通过方差分析计算得到在90％置信区间(乘法模型)内的″测试/参考″的真实比率的Cmax，AUC0-tlast和AUC0-∞参数点估计值。如果90％置信区间完全在接受范围(0.80-1.25)内，可以将参数视为生物等效的。对于tmax，采用了一种等级上的ANOVA方法进行了典型的假设实验。
结果见表1。
结论对于最大浓度、从零时至最终可测量浓度的时间处的曲线下面积以及从零时至无限量处的曲线下面积来说，参考配方和测试配方是生物等效的。
实施例3抗抑郁作用的起效，以及体重、性功能和有关米氮平的其他效应的测试，可作为将按照本发明的剂量单位给予主要抑郁发作期(依据DSM-IV标准)的人类对象的给药结果。在治疗的第一和第二周内评估测试对象以检查抗抑郁活性。进一步的评价将两周进行一次。表1生物等效性测试结果
其中R1不是苯基的式IIA化合物的实例如下表2所示。表2.式IIA化合物的实例(R1不是苯基) IIA(R1不是苯基)
其中Ar1是未取代的苯基或者被一个或多个卤素、烷基或烷氧基取代的苯基的IIA化合物是优选的。定义如下的IIA化合物是更优选的其中Ar1如上所述，Ar2是可任选被一个或多个卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、羧基、烷氧基羰基、氰基、或CONH2取代的萘基或苯基，或者是二氢茚酮(例如在化合物IIAA-11中)。定义如下的IIA化合物也是优选的R1是任选取代的烷基或任选取代的环烷基，更优选烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、羟基烷基、吡啶基烷基、烷氧基环烷基、烷氧基羰基环烷基、或羟基环烷基。这些优选的化合物的实例包括IIAA-24、IIAA-33～IIAA-36、IIAA-38和IIAA-40。
一个本发明实施方案涉及式IA化合物，其中Q是嘧啶环，且R1是T-Ar2，其中T选自CO、CO2、CONH、S(O)2、S(O)2NH、COCH2和CH2。当R1是T-AR2时，优选的化合物是其中T是C(＝O)的那些。下表3列出了IIIA化合物的代表性实例
表3.IIIA化合物的实例
其中Ar1是未取代的苯基或者被一个或多个独立地选自卤素的取代基取代的苯基的IIIA化合物是优选的。定义如下的IIIA化合物是更优选的其中Ar1如上所述，且Ar2是噻吩基，未取代的苯基，或者被一个或多个独立地选自卤素、烷基、烷氧基、CO2H或CO2R的取代基取代的苯基。
其中R1是T-Ar1的其它化合物的实例如下所示，其中A是N或CH，且T是其中一个下述基团CH2(实例是IVA-1)、S(O)2(VA-1)、CONH(VIA-1)、COCH2(VIIA-1)、CO2(VIIIA-1)、和S(O)2NH(IXA-1)。在这些实施方案的其它实例中，苯基环可任选如上所述被取代。 本发明另一个实施方案涉及定义如下的式IA化合物，其中R1是T-R，R是C3-C6环烷基环或可任选被卤素取代的C1-C6直链或支链烷基或烯基，且T如上所述。当R1是T-R时，优选的化合物是其中T为C(＝O)的那些，由式XA代表。下表4表示的是XA化合物的代表性实例。 表4.XA化合物的实例(R2是CH3)
对于式I，优选的R2包括-CH2OR、-CH2OH、-CH2(杂环基)、-CH2(取代的杂环基)、-CH2N(R)2、和R例如甲基。其中R2不是甲基的化合物的代表性实例(式IXA)如下表5所示。
IXA(R2不是CH3)表5．化合物IXA的实例
式I的含XYZ的环可以是如上所示的异噁唑环，或者其可以是同分异构的异噁唑或“相反的”异噁唑(IB)。在该实施方案中，Q优选为嘧啶或吡啶环，其中A是N或CH，或者Q是吡唑环，且R2是脂族基团或取代的脂族基团。 IB化合物的实例如下表6所示。
表6 在本发明的另一个实施方案中，含有XYZ的环是式IC吡唑环 对于IC化合物，G优选为任选取代的芳基。式IC化合物的具体实例如下表7所示。 表7.IC化合物的实例
本发明的其它实施方案涉及其中含有XYZ的环是呋喃(ID)或三唑(IE)的化合物。这些实施方案的实例如下所示，其中R1是苯基，R2是氢，且A是N或CH。 ID-1(R2＝H) IE-1(R3＝H)ID-2(R2＝CH3) IE-1(R3＝CH3)对于式IB-IE化合物，Ar1和Ar2苯基环可如上文关于式IA异噁唑所示任选被取代。
本发明化合物一般可通过本领域技术人员已知的制备类似化合物的方法，例如下述一般反应方案和制备实施例所举例说明的方法制得。反应方案I (a)NCS，cat.py，CHCl3；(b)(CH3CO)2CH2，Et3N，EtOH；(c)DMA-DMF，回流；(d)胍盐酸盐，NaOMe，MeOH，回流；(e)PhBr，Pd2dba3，BINAP，NaOtBu，甲苯；(f)RCOCl，py，苯，回流反应方案I表示的是制备其中Q是嘧啶环的异噁唑的方法。可使用N-氯琥珀酰亚胺和催化量的吡啶将苯甲醛肟1转化成α-氯苯甲醛肟2。将2与2，4-戊二酮缩合，获得了异噁唑3，可用二甲基甲酰胺缩二甲醇处理异噁唑3，以获得烯胺4。进行水后处理，不用纯化，可用胍盐酸盐将4环合，以获得氨基嘧啶5。依据步骤(e)，在三(二亚苄基丙酮)二钯存在下，使用适当芳基溴可由5获得式IIA化合物。或者，依据步骤(f)，可在吡啶/苯溶剂中用适当酰氯处理，以获得式IVA化合物。如果酰氯是Ar2COCl，可以以类似方式获得式IIIA化合物。反应方案II 试剂(a)i.LDA，ii.2-苄氧基-N-甲氧基-N-甲基乙酰胺，-78℃-室温；(b)Et3N，EtOH，室温-回流；(c)过硫酸氢钾；(d)碘三甲基硅烷；(e)PPh3，CBr4；(f)吗啉，Et3N；(g)4-氨基环己醇，DMSO，80℃；(h)NaOEt，EtOH；(i)环己基胺，DMSO，80℃；(j)3∶1三氟乙酸/H2O；100℃。
上述反应方案II表示的是制备其中Q是嘧啶环，且R2被不同基团修饰的本发明异噁唑的方法。反应方案III 试剂(a)i.LDA，ii.N-甲氧基-N-甲基乙酰胺，-78℃-室温；(b)Et3N，EtOH，室温-回流；(c)N-溴琥珀酰亚胺，AIBN，CCl4，回流；(d)吗啉，K2CO3，DMF；(e)NaOMe，MeOH；(f)苯胺，Pd2(dba)3，BINAP，NaOtBu，甲苯，80℃；(g)环己基胺，Pd2(dba)3，BINAP，NaOtBu，甲苯，80℃.
上述反应方案III表示的是制备其中Q是吡啶，且R2被不同基团修饰的本发明异噁唑的方法。在反应方案II和III中，首先形成异噁唑环，然后在嘧啶或吡啶环的2-位上进行适当的NHR1取代。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可在形成异噁唑环之前在嘧啶或吡啶环的2-位上进行适当的NHR1取代。因此，可通过使用具有式XII的中间体进行步骤(b)来获得本发明异噁唑 其中A是N或CH；R1和R2如上所述；且PG是氢或氮保护基。氮保护基是众所周知的，并包括诸如苄基或CO2R的基团，其中R优选为烷基、烯丙基或苄基。反应方案IV 试剂(a)Et3N，EtOH；(b)DIBAL，甲苯，0℃；(c)CH3MgBr，THF；(d)(COCl)2，DMSO，Et3N，CH2Cl2；(e)DMF-DMA，甲苯，回流；(f)i.硫脲，MeONa，MeOH，ii.吡啶，氯仿，CH3I；(g)m-CPBA，CH2Cl2；(h)R1NH2，DMSO上述反应方案IV表示的是制备其中Q是嘧啶环的本发明相反异噁唑的合成途径。反应方案V 试剂(a)i.LDA，ii.N-甲氧基-N甲基苯甲酰胺；(b)Cl-C(＝N-OH)CO2Et，EtOH，Et3N，80℃；(c)氢化二异丁基铝，CH2Cl2，室温；(d)PPh3，CBr4，CH2Cl2；(e)哌啶，K2CO3，DMF；(f)BINAP，Pd2(dba)3，NaOtBu，环己基胺，甲苯，80℃。
上述反应方案V表示的是制备其中Q是吡啶环的本发明相反异噁唑的合成途径。反应方案VI 试剂a)NH2OH/HCl，H2O/EtOH；Na2CO3；(b)NCS，cat.吡啶，CHCl3；(c)CH3COCH2CO2CH3，Et3N，EtOH；(d)i.NaOH，MeOH，H2O；然后，ii.SOCl2，加热；(e)HO2CCH2CN，n-BuLi，-78-0℃；(f)H2NNH2，EtOH；(g)R-X，二氧六环。
上述反应方案VI表示的是制备其中Q是吡唑环的本发明化合物的一般合成方法。 试剂(a)LDA，THF；(b)4-F-C6H4CO2Et；(c)DMF-DMA，甲苯，回流；(d)H2NNH2.H2O，EtOH，回流；(e)R1NH2，封管，140℃。
上述反应方案VII表示的是制备其中XYZ环是吡唑环的本发明化合物的一般合成方法。
据信可用于制备本发明激酶抑制剂的一些中间体是新的。因此，本发明一个实施方案涉及上述化合物XII和式XIII所代表的化合物 其中X-Y是提供异噁唑或相反异噁唑环的N-O或O-N；A是N或CH；G是R、芳基或取代的芳基；R是脂族基团或取代的脂族基团；R2选自氢、-R、-CH2OR、-CH2OH、-CH＝O、-CH2SR、-CH2S(O)2R、-CH2(C＝O)R、-CH2CO2R、-CH2CO2H、-CH2CN、-CH2NHR、-CH2N(R)2、-CH＝N-OR、-CH＝NNHR、-CH＝NN(R)2、-CH＝NNHCOR、-CH＝NNHCO2R、-CH＝NNHSO2R、-芳基、-取代的芳基、-CH2(芳基)、-CH2(取代的芳基)、-CH2NH2、-CH2NHCOR、-CH2NHCONHR、-CH2NHCON(R)2、-CH2NRCOR、-CH2NHCO2R、-CH2CONHR、-CH2CON(R)2、-CH2SO2NH2、-CH2(杂环基)、-CH2(取代的杂环基)、-(杂环基)、或-(取代的杂环基)；且R1选自卤素、NH2、SR、或SO2R。
可在体外、体内、或细胞系中测定本发明JNK抑制剂的活性。体外测定包括确定抑制该激酶活性或激活的JNK的ATP酶活性的测定。例如参见下述测试实施例。另外的体外测定可定量测定本发明抑制剂结合JNK的能力，并且可如下所述来测定将抑制剂放射标记，然后结合，分离出抑制剂/JNK复合物，并测定结合的放射标记物的量；或者通过竞争性实验来测定，其中是将本发明新抑制剂与结合到已知放射配体上的JNK一起培养。根据要抑制的JNK类型或同种型，可使用任何类型或同种型的JNK。
可将本发明JNK抑制剂或其可药用盐配制成用于施用给动物或人的药物组合物。包含其量能有效地治疗或预防JNK介导的病症的JNK抑制剂和可药用载体的这些药物组合物是本发明另一实施方案。
术语“JNK介导的病症”是指已知JNK在其中起作用的任何疾病或其它有害病症。这样的病症包括但不限于炎性疾病、自身免疫性疾病、破坏性骨疾病、增殖性疾病、癌症、感染性疾病、神经变性疾病、变态反应、中风中的再灌注/缺血、心脏病发作、血管生成性疾病、器官缺氧、血管增生、心脏肥大、凝血酶诱导的血小板聚集、和与前列腺素内过氧化酶合酶-2有关的病症。
可用本发明化合物治疗或预防的炎性疾病包括但不限于急性胰腺炎、慢性胰腺炎、哮喘、变态反应、和成人呼吸窘迫综合征。
可用本发明化合物治疗或预防的自身免疫性疾病包括但不限于肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、硬皮病、慢性甲状腺炎、格雷夫斯氏病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性白细胞减少症、血小板减少症、特应性皮炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、多发性硬化、炎性肠病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、牛皮癣、或移植物对宿主疾病。
可用本发明化合物治疗或预防的破坏性骨疾病包括但不限于骨质疏松、骨关节炎、和多发性骨髓性骨疾病。
可用本发明化合物治疗或预防的增殖性疾病包括但不限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、转移性黑素瘤、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤和HTLV-1介导的肿瘤发生。
可用本发明化合物治疗或预防的血管生成疾病包括实体瘤、眼睛新血管生成、婴儿血管瘤。可用本发明化合物治疗或预防的感染性疾病包括但不限于脓毒病、脓毒性休克和志贺氏菌病。
可用本发明化合物治疗或预防的病毒性疾病包括但不限于急性肝炎感染(包括甲肝、乙肝和丙肝)、HIV感染和CMV视网膜炎。
可用本发明化合物治疗或预防的神经变性疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、癫痫、癫痫发作、亨廷顿氏舞蹈病、创伤性脑损伤、缺血和出血性中风、脑缺血，或创伤性损伤引起的神经变性疾病，包括细胞凋亡导致的神经变性疾病，急性缺氧症、局部缺血或谷氨酸神经毒害。
“JNK引起的病症”还包括中风中的缺血/再灌注、心脏病发作、心肌缺血、器官缺氧、血管增生、心脏肥大、肝缺血、肝脏疾病、充血性心力衰竭、病理性免疫反应例如由T细胞引起的免疫反应、和凝血酶引起的血小板聚集。
此外，本发明JNK抑制剂还能抑制诱导性促炎性蛋白的表达。因此，可用本发明化合物治疗的其它“JNK引起的病症”包括水肿，痛觉缺失，发热，和疼痛例如神经肌肉疼痛、头痛、癌症疼痛、牙疼、和关节炎疼痛。
本发明化合物还可用作Src-类激酶、尤其是Src和Lck的抑制剂。关于这些激酶的一般评论，参见Thomas和Brugge，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.(1997)13，513；Lawrence和Niu，Pharmacol.Ther.(1998)77，81；Tatosyan和Mizenina，Biochemistry(Moscow)(2000)65，49。因此，这些化合物可用于治疗已知由一种或多种Src-类激酶引起的疾病或病症。这样的疾病或病症包括高钙血、再狭窄、血钙过多、骨质疏松、骨关节炎、骨转移的症状治疗、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化、牛皮癣、狼疮、移植物对宿主疾病、T细胞介导的高敏感性疾病、Hashimoto氏甲状腺炎、急性热病性多神经炎、慢性堵塞性肺病、接触性皮炎、癌症、佩吉特氏病、哮喘、缺血或再灌注损伤、变应性疾病、特应性皮炎、和变应性鼻炎。受Src活动影响的疾病特别包括高钙血、骨质疏松、骨关节炎、癌症、骨转移的症状治疗和佩吉特氏病。受Lck活动影响的疾病特别包括自身免疫性疾病、变态反应、类风湿性关节炎、和白血病。其中Ar2是芳基的式II-A和I-B化合物可尤其用于治疗与Src类激酶，特别是Src或Lck有关的疾病。
除了本发明化合物以外，在组合物中也可以使用本发明化合物的可药用衍生物或前药来治疗或预防上述病症。
“可药用衍生物或前药”是指具有下述特征的本发明化合物的任何可药用盐、酯、酯的盐或其它衍生物当施用给接受者时，其能直接或间接提供本发明化合物或其具有抑制活性的代谢物或残余物。特别合适的衍生物或前药是这样的当施用给哺乳动物时，其能提高本发明化合物的生物利用度(例如通过使口服施用的化合物更易于吸收到血液中)，或者促进母化合物递送到生物隔室(例如脑或淋巴系统)中(相对于母化合物)。
本发明化合物的可药用前药包括但不限于，酯、氨基酸酯、磷酸酯、金属盐和磺酸酯。
本发明化合物的可药用盐包括由可药用无机或有机酸和碱制得的那些。合适的酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。其它酸例如草酸，虽然自身不是可药用的，但是可用于制备在本发明化合物及其可药用酸加成盐的制备过程中用作中间体的盐。
由适当碱制得的盐包括碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如镁盐)、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。本发明还涉及将本发明化合物的任何含氮碱性基团季铵化。水或油溶性或可分散的产品可通过这样的季铵化获得。
可在这些药物组合物中使用的可药用载体包括但不限于离子交换剂，矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白例如人血清白蛋白，缓冲物质例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸盐(酯)，蜡，聚乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。
本发明组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾剂给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或经由植入的贮药库给药。本文所用术语“非胃肠道给药”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、伤口内和颅内注射或输注技术。本发明组合物优选口服、腹膜内或静脉内给药。
无菌注射形式的本发明组合物可以是水或油悬浮液。可依据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制这些悬浮液。无菌注射制剂还可以是在无毒非胃肠道可接受稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂当中，可使用水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常是使用无菌不挥发油来作为溶剂或悬浮剂。对于此，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，例如天然可药用油如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化变型。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素，或者通常用于配制可药用剂型包括乳液和悬浮液的类似分散剂。为了进行配制，还可以使用其它常用于制备可药用固体、液体、或其它剂型的表面活性剂例如吐温、司盘和其它乳化剂或生物利用度促进剂。
本发明组合物可在任何口服剂型中口服施用，这样的口服剂型包括但不限于胶囊、片剂、水悬浮液或溶液。对于口服片剂，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服施用，适用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当需要水悬浮液来口服使用时，可将活性组分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要的话，还可以加入一些甜味剂、矫味剂或着色剂。
或者，本发明药物组合物可以以直肠给药用栓剂施用。这样的栓剂可通过将活性剂与具有下述性质的适当非刺激性赋形剂混合来制得其在室温为固体，但是在直肠温度为液体，因此其在直肠中熔化以释放药物。这样的材料包括椰子油、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明药物组合物还可以局部施用，尤其是当治疗目标包括易于通过局部施用来实现治疗的区域或器官时更是如此，包括眼睛、皮肤、或下部肠道的疾病。对于每一这些区域或器官，合适的局部施用制剂易于制得。
局部施用到下部肠道可通过使用直肠栓剂(见上文)或合适的灌肠剂来实现。还可以使用局部透皮贴剂。
为了局部施用，可在含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分的适当软膏中配制药物组合物。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可在含有悬浮或溶解在一种或多种可药用载体中的活性组分的适当洗剂或霜剂中配制药物组合物。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨醇一硬脂酸酯、吐温60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苄基醇和水。
对于眼用，可在等渗、pH调节的无菌盐水中配制成微粒化悬浮液，或优选在等渗、pH调节的无菌盐水中配制成溶液，所述制剂中加入或不加入防腐剂例如苯扎氯铵。或者，对于眼用，可在膏剂例如凡士林中配制药物组合物。
本发明药物组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入来施用。这样的组合物是依据本领域众所周知的技术，使用苄基醇或其它合适的防腐剂、用于提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或其它常用的稳定剂或分散剂而制得的，并且可制成在盐水中的溶液。
可以与载体混合以制得单位剂型的JNK抑制剂的量将取决于所治疗的宿主、特定的给药方式。优选这样配制组合物，即可以给接受这些组合物的患者施用约0.01-100mg/kg体重/天抑制剂的剂量。
应当理解，对于任何特定患者，具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速度、药物合并用药、和临床医师的判断以及所治疗的特定疾病的严重程度。抑制剂的量还取决于组合物中的特定化合物。
依据另一个实施方案，本发明提供了治疗或预防JNK介导的病症的方法，包括患者施用其中上述药物组合物的步骤。本文所用术语“患者”是指动物、优选人。
所述方法优选用于治疗或预防炎性疾病、自身免疫性疾病、破坏性骨疾病、增殖性疾病、感染性疾病、变性性疾病、神经变性疾病、变态反应、中风中的再灌注/缺血、心脏病发作、血管生成性疾病、器官缺氧、血管增生、心脏肥大、和凝血酶诱导的血小板聚集、或任何上述特定疾病或病症。
根据欲治疗或预防的特定JNK介导的病症，可以联合施用通常用于治疗或预防所述病症的其它药物和本发明抑制剂。例如，可以将化疗剂或其它抗增殖剂与本发明INK抑制剂联合施用来治疗增殖性疾病。
所述其它治疗剂可以与含有本发明JNK抑制剂的组合物分别施用，或者作为多剂量给药方案的一部分来施用。或者，所述其它治疗剂可以是与本发明JNK抑制剂在单一组合物中混合的单一剂型的一部分。
提供下述实施例来更充分地理解本发明。应当理解，这些实施例仅是为了举例说明，而不应理解为以任何方式限制本发明。
实施例1苯甲醛肟.
向溶于乙醇(50mL)的苯甲醛(10.0g，94mmol)中加入溶于水(50mL)中的羟胺盐酸盐(6.5g，94mmol)，然后加入碳酸钠水溶液(50mL)。将该反应溶液搅拌2小时。倒入盐水中，并用乙醚萃取2次。用硫酸镁将合并的萃取液干燥。蒸发，获得了苯甲醛肟(11.0g，收率为96.5％)，为无色油状物。1H NMR(CDCl3)δ7.40-7.50(m，3H)，7.60-7.70(m，2H)，8.22(s，1H)，9.1(bs，1H)。
实施例2α-氯苯甲醛肟(苯甲酰氯肟)。
在室温，向溶于氯仿的苯甲醛肟(12.2g，0.1mol)中加入催化量的吡啶，然后加入N-氯琥珀酰亚胺(13.35g，0.1mol)。将该反应混合物搅拌1.5小时，然后加入饱和氯化钠水溶液。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层(2次)，并用硫酸镁干燥。减压除去溶剂，获得了13.85gα-氯苯甲醛肟。收率为87％。
实施例31-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-乙酮(化合物3)。
在室温向戊-2，4-二酮(13.23g，0.132mol)和三乙胺(13.35g，0.132mol)在乙醇内的溶液中加入α-氯苯甲醛肟(13.70g，0.088mol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。向该反应中加入乙酸乙酯和饱和氯化钠水溶液。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相(2次)，用硫酸镁干燥，减压除去有机溶剂，获得了17.7g本标题化合物。收率为100％。
实施例44-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-嘧啶-2-基胺(化合物5)。
将上述化合物3(17.7g，0.088mol)与二甲基甲酰胺缩二甲醇(DMFDMA)(160g，0.132mol)回流过夜。向该反应混合物中加入乙酸乙酯和饱和氯化钠水溶液。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机相(2次)，并干燥(MgSO4)。减压除去有机溶剂，并将粗产物溶解在200mL甲醇中。向该溶液中加入在100mL甲醇中的胍盐酸盐(10.5g，0.110mol)，然后加入在100mL甲醇中的甲醇钠(6.17g，0.114mol)。将该反应混合物回流过夜，然后冷却至室温。将反应溶剂浓缩至总共大约100mL体积，并过滤出沉淀产物。滤饼获得了本标题化合物(9.3g)。两个步骤的总收率为46％。
实施例5[4-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-嘧啶-2-基]-苯基-胺(化合物IIA)。
向50mg(0.2mmol)4-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-嘧啶-2-基胺在1mL甲苯内的溶液中依次加入63μL(0.6mmol)溴苯、10mg三(二亚苄基丙酮)二钯、10mg BINAP和39mg(0.4mmol)叔丁醇钠。将该混合物加热回流16小时，用乙酸乙酯稀释，过滤，依次用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并真空浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，用乙酸乙酯-己烷1∶3洗脱，获得了24mg(36％)本标题化合物，为黄色油状物。
实施例65-甲基-3-苯基-异噁唑-4-甲酸甲酯。
在5℃，将新制备的苯甲酰氯肟的乙醇溶液(14.0g，90mmol)(100mL)滴加到乙酰乙酸甲酯(11.18g，96mmol)和三乙胺(13mL，103mmol)在乙醇(50ml)内的溶液中。在室温搅拌12小时后，用二氯甲烷将该溶液稀释，用1N HCl、饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，蒸发，获得了琥珀色油状物。通过快速色谱(硅胶)纯化，用10％乙酸乙酯在己烷中的混合物洗脱，获得了本标题化合物(7.56g，39％收率)，为白色固体MS m/z MH+218(100)；1H NMR(CDCl3)δ2.78(s，3H)，3.81(s，3H)，7.45-7.55(m，3H)，7.65-7.69(m，2H)。
实施例75-甲基-3-苯基-异噁唑-4-甲酸。
向在甲醇(12mL)内的5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-甲酸甲酯(0.853g，3.69mmol)中加入2N NaOH(8mL)，将该反应溶液在室温搅拌60小时。用水将该溶液稀释，并用乙酸乙酯萃取2次。用盐水洗涤合并的萃取液，用硫酸镁干燥，并浓缩。重结晶(己烷/乙酸乙酯)，获得了白色固体(0.540g，收率为72％)。
实施例85-甲基-3-苯基-异噁唑-4-甲酰氯。
在70℃，将5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-甲酸(0.54g，2.56mmol)用SOCl2(2mL)处理1小时。真空浓缩，获得了黄色油状物，不用纯化直接使用。
实施例93-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-3-氧代-丙腈。
在-78℃下，向含有-个1，1’-联吡啶晶体的氰基乙酸(0.43g，5.12mmol)的THF溶液中加入正丁基锂(6.4mL，10.24mmol)。将温度温热至0℃，获得了粉红色溶液。冷却至-78℃以后，滴加在THF(5mL)中的5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-甲酰氯(0.567g，2.56mmol)。将该混合物在-78℃搅拌1小时，再在室温搅拌1小时。用1N HCl(13mL)中止该反应，并用二氯甲烷萃取2次。将合并的萃取液用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，获得了本标题化合物(0.391g，收率为67％)。
实施例10N-[5-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-2H-吡唑-3-基]-苯甲酰胺。
将在乙醇(3mL)中的3-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-3-氧代-丙腈(0.391g，1.73mmol)用肼(0.168mL，3.46mmol)处理，并加热至回流。真空蒸发，获得了5-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-2H-吡唑-3-基胺，不用纯化直接使用。向在二氧六环内的所得胺(0.039g，0.16mmol)中加入三乙胺，然后加入苄基氯(0.019mL，0.16mmol)。将该溶液在10℃搅拌1小时，并在室温搅拌2小时。用水将该溶液稀释，用乙酸乙酯萃取，用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸镁干燥，并真空浓缩。通过HPLC纯化，获得了1.4mg本标题化合物。
实施例111-苄氧基-3-(2-甲基硫烷基嘧啶-4-基)-丙-2-酮(化合物7)。
在-78℃，用10分钟向4-甲基-2-甲基硫烷基嘧啶(9.60g，68.5mmol)在THF(150mL)内的搅拌溶液中滴加LDA(2.0M THF/己烷，41.1mL，82.2mmol)。将该溶液在-78℃搅拌15分钟，温热至0℃，保持10分钟，再冷却至-78℃，保持15分钟。然后用45分钟滴加3-苄氧基-N甲基-N-甲氧基乙酰胺(17.2g，82.2mmol)在THF(30mL)中的溶液。在-78℃保持15分钟后，将该溶液温热至0℃，并保持30分钟。用HCl(1M，85mL)中止该反应，并搅拌1小时。将该溶液倒入饱和碳酸氢钠(300mL)中，用乙醚萃取(3×200mL)，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，20％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(13.75g，47.7mmol，收率为69％)。
实施例124-[5-苄氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-2-甲基硫烷基-嘧啶(化合物8)。
用30分钟向上述化合物7(13.75g，47.7mmol)和Et3N(14.6mL，105mmol)在EtOH(200mL)内的搅拌溶液中加入4-氟苯甲酰氯肟(56mmol)在EtOH中的溶液(50mL)。将该溶液在25℃搅拌15分钟。然后加热回流90分钟。将该溶液冷却至25℃。再加入Et3N(7.3mL，52mmol)，然后用1小时滴加4-氟苯甲酰氯肟(38.5mmol)在EtOH中的溶液(50mL)。将该溶液回流1小时，这时TLC表明所有异噁唑原料都已消耗完。将溶液冷却至25℃并浓缩。将粗产物置于二氯甲烷(50mL)中，倒入饱和碳酸氢钠水溶液(150mL)中，用二氯甲烷萃取(3×150mL)，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，20％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(14.2g，34.8mmol，60％)，其纯度(＞85％)足以进行随后的反应。
实施例134-[5-苄氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-2-甲磺酰基-嘧啶(化合物9)。
在25℃，用10分钟向上述化合物8(2.00g，4.91mmol)在MeOH(50mL)内的搅拌溶液中滴加过硫酸氢钾(7.07g，11.5mmol)在H2O(50mL)中的溶液。20小时后，将该溶液倒入H2O(75mL)中，用二氯甲烷萃取(3×75mL)，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，45％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(1.60g，3.64mmol，74％)。
实施例14[3-(4-氟-苯基)-4-(2-甲磺酰基-嘧啶-4-基)-异噁唑-5-基]-甲醇(化合物10)。
在0℃，搅拌下向上述化合物9(750mg，1.70mmol)在CHCl3(8.5mL)的溶液中加入三甲基甲硅烷基碘(0.73mL，5.1mmol)。将该反应在0℃搅拌30分钟。然后再加入三甲基甲硅烷基碘(0.48mL，3.4mmol)。40分钟后，将该溶液温热至25℃，并继续搅拌22小时。用H2O-MeOH(2mL)中止反应，并搅拌1小时。将该溶液倒入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)中，用EtOAc萃取(3×30mL)，并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，80％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(530mg，1.52mmol，89％)。
实施例154-[5-(溴甲基)-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-2-甲磺酰基-嘧啶(化合物11)。
在25℃，向上述化合物10(250mg，0.716mmol)和CBr4(473mg，1.43mmol)在二氯甲烷(14mL)内的搅拌下的溶液中加入PPh3(244mg，0.93mmol)。10分钟后，再加入PPh3(50mg，0.19mmol)以使反应进行完全。15分钟后，将该溶液浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，50％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(265mg，0.643mmol，90％)。
实施例164-[3-(4-氟-苯基)-4-(2-甲磺酰基-嘧啶-4-基)-异噁唑-5-基甲基]-吗啉(化合物12)。
在25℃，向上述化合物11(41mg，0.099mmol)和Et3N(20μL，0.15mmol)在CH3CN(0.5mL)内的溶液中加入吗啉(9.6μL，0.11mmol)。15分钟后，将该溶液浓缩。通过制备薄层色谱(SiO2，EtOAc)纯化，获得了本标题化合物(29mg，0.069mmol，70％)。
实施例174-{4-[3-(4-氟-苯基)-5-(吗啉-4-基甲基)异噁唑-4-基]嘧啶-2-基氨基}环己醇(化合物XIA-42)。
将化合物13(29mg，0.069mmol)和反式-4-氨基环己醇(24mg，0.21mmol)在DMSO(0.21mL)中的搅拌溶液在80℃加热4小时。将该溶液倒入半饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)中，用EtOAc萃取(5×5mL)，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，10％MeOH-CH2Cl2)，将获得的产物通过离子交换色谱(SCX树脂，洗脱剂0.25M NH3在50％MeOH-CH2Cl2中的溶液)，获得了本标题化合物(27mg，0.057mmol，83％)。
实施例184-[5-乙氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-2-甲基硫烷基-嘧啶(化合物13)。
在25℃，向上述化合物8(103mg，0.27mmol)在EtOH(2.0mL)内的搅拌溶液中加入NaOEt(21％w/v EtOH，0.40mL，1.23mmol)。2小时后，用饱和氯化铵水溶液(3mL)中止反应、CH2Cl2(3×5mL)干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，25％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(58mg，0.17mmol，62％)。
实施例194-[5-乙氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-2-甲磺酰基-嘧啶(化合物14)。
该化合物是这样制得的按照类似于在实施例13中描述的方法，但是使用化合物13(58mg，0.17mmol)作为原料，获得了本标题化合物(64mg，0.17mmol，100％)，不用纯化或鉴定直接用于随后的反应。
实施例20环己基-{4-[5-乙氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-嘧啶-2-基}胺(化合物XIA43)该化合物是这样制得的按照类似于实施例17中描述的方法，使用化合物14(64mg，0.17mmol)和环己基胺(58μL，0.51mmol)作为原料，获得了本标题化合物，为粗产物。HPLC纯化(C-18，梯度洗脱，10-90％H2O-CH3CN)后，萃取到EtOAc中，用HCl-Et2O(1M，1mL)将该粗产物转化成盐酸盐。真空除去溶剂，获得了本标题化合物，为盐酸盐(55mg，0.13mmol，从化合物13开始两步的收率为76％)。
实施例21环己基-{4-[5-苄氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-嘧啶-2-基}胺(化合物XIA-44)该化合物是这样制得的按照类似于实施例17中描述的方法，使用上述化合物9(500mg，1.14mmol)和环己基胺(340μL，3.42mmol)作为原料。通过快速色谱纯化(SiO2，30％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(488mg，1.06mmol，93％)。
实施例22[4-(2-环己基氨基-嘧啶-4-基)-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-5-基]甲醇(化合物XIA-45)
将化合物XIA-44(461mg，1.01mmol)在TFA-H2O(3∶1，8mL)内的搅拌溶液在80℃加热2小时。将该溶液浓缩，把粗的混合物置于二氯甲烷(25mL)中，倒入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)中，用二氯甲烷萃取(3×25mL)，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。TLC(50％EtOAc-己烷)表明消耗了约50％化合物XIA-44原料。将该粗的混合物溶解在TFA-H2O(3∶1，8mL)中，将所得溶液在100℃加热22小时。将该溶液浓缩，把粗的混合物置于二氯甲烷(25mL)中，倒入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)中，用二氯甲烷萃取(3℃25mL)，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，40％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(313mg，0.85mmol，84％)。
实施例231-(2-溴-吡啶-4-基)-丙-2-酮(化合物16)。
在-78℃，用10分钟向2-溴-4-甲基吡啶(化合物15)(20.20g，117.4mmol)在THF(250mL)内的搅拌溶液中滴加LDA(2.0M THF/己烷，70.5mL，141mmol)。将该溶液在-78℃搅拌35分钟。然后用10分钟滴加N-甲氧基-N-甲基乙酰胺(14.5g，141mmol)在THF(30mL)中的溶液。在-78℃反应15分钟后，将该溶液温热至0℃，并搅拌1小时。将该溶液倒入H2O(250mL)中，用乙醚(3×250mL)萃取，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化(SiO2，20％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(16.75g，78.2mmol，67％)。
实施例242-溴-4-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-吡啶(化合物17a)。
用90分钟向化合物16(1.71g，8.0mmol)和Et3N(2.23mL，16mmol)在EtOH(16mL)内的搅拌溶液中加入苯甲酰氯肟(1.62g，10.4mmol)在EtOH(16mL)中的溶液。将该溶液在25℃搅拌90分钟。然后将该溶液加热回流24小时。将该溶液冷却至25℃，并浓缩。将粗产物置于二氯甲烷(50mL)中，倒入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)中，用二氯甲烷萃取(3×50mL)，干燥(Na2SO4)，并过滤。通过快速色谱纯化(SiO2，20％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(1.32g，4.19mmol，52％)。2-溴-4-[3-(4-氟-苯基)-5-甲基-异噁唑-4-基]-吡啶(化合物17b)导按照类似方法用4-氟苯甲酰氯肟制得的。
实施例252-溴-4-(5-溴甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-吡啶(化合物18a)。
将上述化合物17a(404mg，1.28mmol)、N-溴琥珀酰亚胺(239mg，1.35mmol)和AIBN(11mg，0.064mmol)在CCl4(3mL)中的搅拌溶液加热至回流，并在300W灯下放置18小时。用二氯甲烷(15mL)将该溶液稀释，用水(3×10mL)萃取、盐水(40mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，通过快速色谱纯化(SiO2，20％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(287mg，0.728mmol，57％)。2-溴-4-[5-溴甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基]-吡啶(化合物18b)是按照类似方法用化合物17b作为原料制得的。
实施例262-溴-4-(5-甲氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基)-吡啶(化合物19b)。
向上述化合物18b(200mg，0.485mmol)中加入NaOMe(0.5M MeOH溶液，2.0mL，1.0mmol)。将该溶液在25℃搅拌90分钟。然后将该溶液倒入盐水中，用EtOAc萃取(4×15mL)，干燥(MgSO4)，经由硅藻土塞过滤。将溶剂蒸发，获得了本标题化合物(175mg，0.482mmol，99％)。
实施例274-(4-(2-溴-吡啶-4-基)-3-苯基-异噁唑-5-基甲基)-吗啉(化合物20a)。
将上述化合物18a(484mg，1.22mmol)、吗啉(0.45mL，5.1mmol)和碳酸钾(340mg，2.45mmol)在无水DMF(2mL)中的搅拌溶液在40℃温热18小时。将该溶液倒入盐水(10ml)中，用二氯甲烷(3×15mL)萃取，干燥(MgSO4)，并过滤。通过快速色谱纯化(SiO2，50％EtOAc-己烷)，获得了本标题化合物(461mg，1.15mmol，94％)。
实施例28[4-(5-甲基-3-苯基-异噁唑-4-基)-吡啶-2-基]苯基-胺(化合物IIA-52)。
在25℃，向化合物17a(20mg，0.063mmol)、苯胺(7.0μL，0.076mmol)和BINAP(5.6mg，0.009mmol)在甲苯(0.6mL)内的搅拌溶液中加入Pd2(dba)3(2.7mg，0.003mmol)，然后加入NaOtBu(9.1mg，0.095mmol)。将该溶液在80℃加热2小时。将该溶液冷却，过滤并浓缩。通过制备薄层色谱纯化(SiO2，5％EtOAc/CH2Cl2)，获得了本标题化合物(12.6mg，0.0385mmol，61％)。
实施例29环己基-[4-(5-甲氧基甲基-3-(4-氟-苯基)-异噁唑-4-基)-吡啶-2-基]-胺(化合物XIA29)。
在25℃，向上述化合物19b(20mg，0.050mmol)、环己基胺(11μL，0.13mmol)、和BINAP(4.7mg，0.0075mmol)在甲苯(0.4mL)内的搅拌溶液中加入Pd2(dba)3(2.3mg，0.0025mmol)，然后加入NaOtBu(12mg，0.13mmol)。将该溶液在80℃加热15小时。将该溶液冷却，倒入H2O(5mL)中，用EtOAc萃取(4×5mL)，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。通过HPLC纯化(梯度洗脱，90-10％H2O-CH3CN)，获得了本标题化合物(9.1mg，0.022mmol，44％)。
实施例303-甲基-5-苯基-异噁唑-4-甲腈(化合物24)。
向苯甲酰基乙腈的乙醇溶液中加入1.5当量三乙胺，然后加入1.5当量乙酰氯肟，将该反应混合物在室温搅拌4小时。向该反应混合物中加入乙酸乙酯和盐水。用硫酸镁将有机相干燥，减压除去溶剂。色谱纯化后，以72％的收率获得了本标题化合物。
实施例313-甲基-5-苯基-异噁唑-4-甲醛(化合物25)。
在0℃，向上述化合物24的甲苯溶液中加入1.2当量DIBAL-H/HAX。将该反应在0℃搅拌3小时，温热至室温，并在室温搅拌过夜。将该反应混合物缓慢地转移到1N HCl中，然后用乙酸乙酯萃取。用硫酸镁将有机相干燥，并减压浓缩。通过色谱法纯化粗产物，以57％的收率获得了本标题化合物。
实施例321-(3-甲基-5-苯基-异噁唑-4-基)-乙醇(化合物26)。
在室温，向上述化合物25的THF溶液中缓慢地加入1.4当量溴化甲基镁。将该反应混合物在室温搅拌1小时。向该反应混合物中加入乙酸乙酯和1N HCl。用盐水洗涤有机相，并用硫酸镁干燥。减压除去溶剂，以96％的收率获得了粗产物，不用纯化直接用于下一步骤。
实施例331-(3-甲基-5-苯基-异噁唑-4-基)-乙酮(化合物27)。
在-78℃，向草酰氯的二氯甲烷溶液中加入DMSO，将该混合物在-78℃搅拌15分钟，然后加入上述化合物26的二氯甲烷溶液。将该反应混合物在-78℃搅拌30分钟，加入三乙胺，然后将该反应混合物逐渐温热至室温。向该反应混合物中加入乙酸乙酯和盐水。用硫酸镁将有机相干燥，减压除去溶剂。以94％的收率获得了粗产物，不用纯化直接用于下一步骤。
实施例343-二甲基氨基-1-(3-甲基-5-苯基-异噁唑-4-基)-丙烯酮(化合物28)。
将上述化合物27与过量DMF-DMA的甲苯溶液回流20小时。向该反应混合物中加入乙酸乙酯和盐水，用硫酸镁将有机相干燥，减压除去溶剂。所得粗产物不用纯化直接用于下一步骤。
实施例354-(3-甲基-5-苯基-异噁唑-4-基)-2-甲基硫烷基-嘧啶(化合物29)。
将上述化合物28、2当量硫脲和1.5当量甲醇钠的甲醇溶液回流2天。向该反应混合物中加入乙酸乙酯和1N HCl，用盐水洗涤有机相，用硫酸镁干燥，并减压除去溶剂。将粗产物溶解在氯仿中，向其中加入1.5当量碘甲烷和1.5当量吡啶。将该反应混合物在室温搅拌2小时。向该反应混合物中加入二氯甲烷和1N HCl，用盐水洗涤有机相，并用硫酸镁干燥。减压除去溶剂，通过色谱法纯化粗产物，获得了本标题化合物。收率为32％。
实施例364-(3-甲基-5-苯基-异噁唑-4-基)-2-甲磺酰基-嘧啶(化合物30)。
向上述化合物29的二氯甲烷溶液中加入2当量m-CPBA，并将该反应在室温搅拌过夜。用1N NaOH将该反应混合物洗涤2次，用盐水洗涤2次，并用硫酸镁干燥。减压除去溶剂，通过色谱法纯化粗产物，以79％的收率获得了本标题化合物。
实施例37化合物IB。
将上述化合物30和3当量所需胺的DMSO溶液在80℃加热4小时。分析HPLC表明反应完全后，通过反相HPLC纯化粗产物，获得了所需的化合物IB。收率一般在80％以上。
下述实施例描述的是，如何将本发明化合物作为蛋白激酶抑制剂、尤其是c-Jun-N-末端激酶抑制剂来进行测试。
实施例38JNK3蛋白的克隆、表达和纯化用公开的JNK3α1 cDNA作为查询关键词，对EST数据库进行BLAST检索以确定含有人JNK3α1完整编码序列的EST克隆(#632588)。使用采用pfu聚合酶(Strategene)的聚合酶链反应(PCR)将限制位点引入到cDNA中，以在NcoI和BamHI位点克隆至pET-15B表达载体。在大肠杆菌中表达蛋白。由于表达的全长蛋白(Met 1-Gln 422)的溶解性不佳，制备在40位Ser残基(Ser 40)开始的N-末端截短蛋白。该截短相当于JNK1和JNK2蛋白的Ser 2，并且之前是甲硫氨酸(起始)和甘氨酸残基。加入甘氨酸残基以引入用于克隆到表达载体内的NcoI位点。此外，通过PCR进行系统C-末端截短以确定生成衍射质量晶体的构建物。一个这样的构建物编码JNK3α1的氨基酸残基Ser40-Glu402，并且在Met和Gly后面。
该构建物是使用下述脱氧寡核苷酸作为引物通过PCR制得的5’GCTCTAGAGCTCCATGGGCAGCAAAAGCAAAGTTGACAA 3’(具有下划线表示的起始密码子的正向引物)(SEQ ID NO1)和5’TAGCGGATCCTCATTCTGAATTCATTACTTCCTTGTA 3’(具有下划线表示的终止密码子的反向引物)(SEQ ID NO2)并通过DNA测序来证实。
对照实验表明，在体外当用上游激酶MKK7激活时，截短的JNK3蛋白具有对髓鞘碱性蛋白的等价激酶活性。
用JNK3表达构建物转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)，并在补充有100μg/ml羧苄青霉素的LB中在摇瓶内于30℃生长，直至细胞处于对数期(OD600～0.8)。加入终浓度为0.8mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶(IPTG)，2小时后，通过离心收集细胞。
将含有JNK3的大肠杆菌细胞糊状物重悬在10体积/g裂解缓冲液(50mM HEPES，pH7.2，含有10％甘油(v/v)，100mM NaCl，2mM DTT，0.1mM PMSF，2μg/ml胃蛋白酶抑制剂，1μg/ml E-64和1μg/ml亮抑蛋白酶肽)中。使用微流化床将细胞在冰上裂解，并以100,000×g于4℃离心30分钟。将该100,000×g上清液用缓冲液A(20mM HEPES，pH7.0，10％甘油(v/v)，2mM DTT)进行1∶5稀释，并通过SP-Sepharose(Pharmacia)阳离子交换色谱(柱尺寸2.6×20cm)于4℃纯化。用体积是柱5倍的缓冲液A洗涤树脂，然后用体积是柱5倍的含有50mM NaCl的缓冲液A洗脱。用体积是柱7.5倍的线性梯度的50-300mM NaCl将结合的JNK3洗脱下来。用150-200mM NaCl洗脱JNK3。
实施例39激活JNK3在50mM HEPES缓冲液中将5mg JNK3稀释至0.5mg/ml，其中该缓冲液pH为7.5，并含有100mM NaCl，5mM DTT，20mM MgCl2和1mM ATP。加入下述摩尔比的GST-MKK7(DD)1∶2.5 GST-MKK7JNK3。在25℃培养30分钟后，通过在Centriprep-30(Amicon，Beverly，MA)中超滤将该反应混合物浓缩5倍，稀释至10ml，并加入1mM ATP。该操作重复3次以除去ADP和补充ATP。ATP的终浓度为5mM，将该混合物在4℃孵育过夜。
通过透析或超滤将JNK3/GST-MKK7(DD)反应混合物交换到50mMHEPES缓冲液(pH7.5，含有5mM DTT和5％甘油(w/v))中。将该反应混合物调节至1.1M磷酸钾，pH7.5，并使用Rainin Hydropore柱通过疏水相互作用色谱(在25℃)纯化。在这些条件下，GST-MKK7和未激活的JNK3不结合，这样当以1ml/分钟的速度展开1.1-0.05M磷酸钾梯度时，双重磷酸化的JNK3与单磷酸化的JKN被分离开。将激活的JNK3(即双重磷酸化的JNK3)以0.25-1mg/ml于-70℃贮存。
实施例40
JNK抑制测定通过分光光度偶联酶分析来测定化合物对JNK3的抑制作用。在该测定中，将固定浓度的激活的JNK3(10nM)与溶解在DMSO中的不同浓度的抑制剂在缓冲液(含有0.1M HEPES缓冲剂，pH7.5，含有10mM MgCl2，2.5mM磷酸烯醇丙酮酸，200μM NADH，150ug/mL丙酮酸激酶，50μg/mL乳酸脱氢酶，和200μM EGF受体肽)中于30℃孵育10分钟。EGF受体肽的序列为KRELVEPLTPSGEAPNQALLR，并且是JNK3催化的激酶反应中的磷酰基受体。通过加入10μM ATP来起始反应，把测定板插到保持在30℃的分光光度计分析板隔室中。监测作为时间函数的在340nm的吸收度下降。将作为抑制剂浓度函数的下降速度数据拟合成竞争性抑制动力学模型来确定Ki。
对于所选的本发明化合物，在JNK抑制测定中的活性如表8所示。Ki低于0.1微摩尔(μM)的化合物估为“A”，Ki为0.1-1μM的化合物估为“B”，Ki大于1μM的化合物估为“C”。表8JNK3抑制测定中的活性。
实施例41Src抑制测定测定作为在杆状病毒细胞中表达和纯化的全长重组人Src激酶(得自Upstate Biotechnology，cat.no.14-117)的抑制剂的化合物。通过测定从ATP掺入到组合物的随机聚Glu-Tyr聚合物底物的酪氨酸中的33P来监测Src激酶活性，Glu∶Tyr＝4∶1(Sigma，cat.no.P-0275)。测定组分的终浓度如下0.05M HEPES，pH7.6，10mM MgCl2，2mM DTT，0.25mg/ml BSA，10μMATP(1-2μCi33P-ATP/反应)，5mg/ml聚Glu-Tyr，和1-2个单位重组人Src激酶。在一般测定中，将除ATP之外的所有反应组分预混合，并以等分试样加到测定板的孔中。向孔中加入溶解在DMSO中的抑制剂，使最终的DMSO浓度为2.5％。将测定板在30℃孵育10分钟，然后起始与33P-ATP的反应。反应20分钟后，用150μl含有20mM Na3PO4的10％三氯乙酸(TCA)中止反应。将反应中止的样本转移到安装在滤板真空歧管上的96-孔滤板(Whatman，UNI-Filter GF/FGlass Fiber Filter，cat no.7700-3310)中。用含有20mM Na3PO4的10％TCA将滤板洗涤4次，然后用甲醇洗涤4次。向每个孔中加入200μl闪烁液体。将滤板密封，并用TopCount闪烁计数器测定在滤器上的放射性的量。
结果发现，在该Src测定中，活性最强的化合物是其中G是任选取代的芳基，且R1是Ar2的式I化合物。
实施例42Lck抑制测定测定作为从牛胸腺纯化的lck激酶(得自Upstate Biotechnology，cat.no.14-106)的抑制剂的化合物。通过测定从ATP掺入到组合物的随机聚Glu-Tyr聚合物底物的酪氨酸中的33P来监测Src激酶活性，Glu∶Tyr＝4∶1(Sigma，cat.no.P-0275)。测定组分的终浓度如下0.05M HEPES，pH7.6，10mM MgCl2，2mM DTT，0.25mg/ml BSA，10μM ATP(1-2μCi33P-ATP/反应)，5mg/ml聚Glu-Tyr，和1-2个重组人lck激酶单位。在一般测定中，将除ATP之外的所有反应组分预混合，并以等分试样加到测定板的孔中。向孔中加入溶解在DMSO中的抑制剂，使最终的DMSO浓度为2.5％。将测定板在30℃培养10分钟，然后起始与33P-ATP的反应。反应20分钟后，用150μl含有20mM Na3PO4的10％三氯乙酸(TCA)中止反应。将反应中止的样本转移到安装在滤板真空歧管上的96-孔滤板(Whatman，UNI-Filter GF/F Glass Fiber Filter，cat no.7700-3310)中。用含有20mM Na3PO4的10％TCA将滤板洗涤4次，然后用甲醇洗涤4次。向每个孔中加入200μl闪烁液体。将滤板密封，并用TopCount闪烁计数器测定在滤器上的放射性的量。
结果发现，在该lck测定中，活性最强的化合物是其中G是任选取代的芳基，且R1是Ar2的式I化合物。
虽然已经描述了多个本发明实施方案，但是很明显，可以改变我们的基本实施例来提供使用本发明化合物和方法的其它实施方案。因此，应当理解，本发明范围由权利要求书限定，而不是由举例说明的具体实施方案限定。
权利要求
1.式I化合物 其中X-Y-Z选自 R1是H、CONH2、T(n)-R、或T(n)-Ar2；R是脂族基团或取代的脂族基团；n是0或1；T是C(＝O)、CO2、CONH、S(O)2、S(O)2NH、COCH2或CH2；各个R2分别独立地选自氢、-R、-CH2OR、-CH2OH、-CH＝O、-CH2SR、-CH2S(O)2R、-CH2(C＝O)R、-CH2CO2R、-CH2CO2H、-CH2CN、-CH2NHR、-CH2N(R)2、-CH＝N-OR、-CH＝NNHR、-CH＝NN(R)2、-CH＝NNHCOR、-CH＝NNHCO2R、-CH＝NNHSO2R、-芳基、-取代的芳基、-CH2(芳基)、-CH2(取代的芳基)、-CH2NH2、-CH2NHCOR、-CH2NHCONHR、-CH2NHCON(R)2、-CH2NRCOR、-CH2NHCO2R、-CH2CONHR、-CH2CON(R)2、-CH2SO2NH2、-CH2(杂环基)、-CH2(取代的杂环基)、-(杂环基)、或-(取代的杂环基)；各个R3分别独立地选自氢、R、COR、CO2R或S(O)2R；G是R或Ar1；Ar1是芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂环基、或取代的杂环基，其中Ar1可任选与含有0-3个杂原子的部分不饱和或全不饱和5-7元环稠合；Q-NH是 其中Q-NH上的H可任选被R3替代；A是N或CR3；U是CR3、O、S、或NR3；Ar2是芳基、取代的芳基、杂环基或取代的杂环基，其中Ar2可任选与含有0-3个杂原子的部分不饱和或全不饱和5-7元环稠合；其中Ar2、包括如果存在时稠合环中的每个可取代的碳原子可任选独立地被下列基团取代卤素、R、OR、SR、OH、NO2、CN、NH2、NHR、N(R)2、NHCOR、NHCONHR、NHCON(R)2、NRCOR、NHCO2R、CO2R、CO2H、COR、CONHR、CON(R)2、S(O)2R、SONH2、S(O)R、SO2NHR、或NHS(O)2R，其中稠合环中的每个饱和碳可再任选独立地被下列基团取代＝O、＝S、＝NNHR、＝NNR2、＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R、或＝NR；其中Ar2中每个可取代的氮原子可任选被R、COR、S(O)2R或CO2R取代；条件是当G是苯基，X-Y-Z是N-O-CR2，A是N，且R2是甲基时，R1不是氢或COCH3。
2.权利要求1的化合物，其中G是Ar1。
3.具有下式的权利要求2的化合物
4.权利要求3的化合物，其中Q-NH选自
5.权利要求4的化合物，其中R1是烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、羟基烷基、吡啶基烷基、烷氧基环烷基、环烷基、烷氧基羰基环烷基、羟基环烷基、Ar2或T-Ar2，其中T是C(＝O)。
6.权利要求5的化合物，其中R1环己基、环己醇-4-基、环己酮-4-基、2-丙-1-醇、2-甲氧基-1-甲基乙基、3-丁酰烷基酯、2-吡啶基-2-乙基，或任选取代的苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、噻吩基或二氢茚基。
7.权利要求6的化合物，其中R2是任选取代的烷基。
8.选自表1-7所列出的化合物的化合物。
9.具有下式的化合物 其中A是N或CH；PG是氢或氮保护基；R1是H、T(n)-R、或T(n)-Ar2；R是脂族基团或取代的脂族基团；n是0或1；T是C(＝O)、CO2、CONH、S(O)2、S(O)2NH、COCH2或CH2；且各个R2分别独立地选自氢、-R、-CH2OR、-CH2OH、-CH＝O、-CH2SR、-CH2S(O)2R、-CH2(C＝O)R、-CH2CO2R、-CH2CO2H、-CH2CN、-CH2NHR、-CH2N(R)2、-CH＝N-OR、-CH＝NNHR、-CH＝NN(R)2、-CH＝NNHCOR、-CH＝NNHCO2R、-CH＝NNHSO2R、-芳基、-取代的芳基、-CH2(芳基)、-CH2(取代的芳基)、-CH2NH2、-CH2NHCOR、-CH2NHCONHR、-CH2NHCON(R)2、-CH2NRCOR、-CH2NHCO2R、-CH2CONHR、-CH2CON(R)2、-CH2SO2NH2、-CH2(杂环基)、-CH2(取代的杂环基)、-(杂环基)、或-(取代的杂环基)。
10.下式所示化合物 其中X-Y是提供异噁唑或相反异噁唑环的N-O或O-N；A是N或CH；G是R、芳基或取代的芳基；R是脂族基团或取代的脂族基团；R2选自氢、-R、-CH2OR、-CH2OH、-CH＝O、-CH2SR、-CH2S(O)2R、-CH2(C＝O)R、-CH2CO2R、-CH2CO2H、-CH2CN、-CH2NHR、-CH2N(R)2、-CH＝N-OR、-CH＝NNHR、-CH＝NN(R)2、-CH＝NNHCOR、-CH＝NNHCO2R、-CH＝NNHSO2R、-芳基、-取代的芳基、-CH2(芳基)、-CH2(取代的芳基)、-CH2NH2、-CH2NHCOR、-CH2NHCONHR、-CH2NHCON(R)2、-CH2NRCOR、-CH2NHCO2R、-CH2CONHR、-CH2CON(R)2、-CH2SO2NH2、-CH2(杂环基)、-CH2(取代的杂环基)、-(杂环基)、或-(取代的杂环基)；且R1选自卤素、NH2、SR、或SO2R；条件是当A是CH时，R1不是Br或Cl。
11.药物组合物，含有能有效地抑制JNK的量的权利要求1-8任一项的化合物和可药用载体。
12.在哺乳动物中治疗能通过用蛋白激酶抑制剂治疗来减轻的疾病或病症的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用治疗有效量的式I化合物 其中X-Y-Z选自 R1是H、CONH2、T(n)-R、或T(n)-Ar2；R是脂族基团或取代的脂族基团；n是0或1；T是C(＝O)、CO2、CONH、S(O)2、S(O)2NH、COCH2或CH2；各个R2分别独立地选自氢、-R、-CH2OR、-CH2OH、-CH＝O、-CH2SR、-CH2S(O)2R、-CH2(C＝O)R、-CH2CO2R、-CH2CO2H、-CH2CN、-CH2NHR、-CH2N(R)2、-CH＝N-OR、-CH＝NNHR、-CH＝NN(R)2、-CH＝NNHCOR、-CH＝NNHCO2R、-CH＝NNHSO2R、-芳基、-取代的芳基、-CH2(芳基)、-CH2(取代的芳基)、-CH2NH2、-CH2NHCOR、-CH2NHCONHR、-CH2NHCON(R)2、-CH2NRCOR、-CH2NHCO2R、-CH2CONHR、-CH2CON(R)2、-CH2SO2NH2、-CH2(杂环基)、-CH2(取代的杂环基)、-(杂环基)、或-(取代的杂环基)；各个R3分别独立地选自氢、R、COR、CO2R或S(O)2R；G是R或Ar1；Ar1是芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂环基、或取代的杂环基，其中Ar1可任选与含有0-3个杂原子的部分不饱和或全不饱和5-7元环稠合；Q-NH是 其中Q-NH上的H可任选被R3替代；A是N或CR3；U是CR3、O、S、或NR3；Ar2是芳基、取代的芳基、杂环基或取代的杂环基，其中Ar2可任选与含有0-3个杂原子的部分不饱和或全不饱和5-7元环稠合；其中Ar2、包括如果存在时的稠合环上的每个可取代的碳原子可任选独立地被下列基团取代卤素、R、OR、SR、OH、NO2、CN、NH2、NHR、N(R)2、NHCOR、NHCONHR、NHCON(R)2、NRCOR、NHCO2R、CO2R、CO2H、COR、CONHR、CON(R)2、S(O)2R、SONH2、S(O)R、SO2NHR、或NHS(O)2R，其中稠合环中的每个饱和碳可再任选独立地被下列基团取代＝O、＝S、＝NNHR、＝NNR2、＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R、或＝NR；其中Ar2中每个可取代的氮原子可任选被R、COR、S(O)2R或CO2R取代。
13.权利要求12的方法，其中所述疾病可通过用JNK抑制剂治疗来减轻。
14.权利要求12的方法，其中所述疾病选自炎性疾病、自身免疫性疾病、破坏性骨疾病、增殖性疾病、感染性疾病、神经变性疾病、变态反应、中风中的再灌注/缺血、心脏病发作、血管生成性疾病、器官缺氧、血管增生、心脏肥大、凝血酶诱导的血小板聚集、或与促炎细胞因子有关的病症。
15.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防选自下列的炎性疾病急性胰腺炎、慢性胰腺炎、哮喘、变态反应、和成人呼吸窘迫综合征。
16.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防选自下列的自身免疫性疾病肾小球性肾炎、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、硬皮病、慢性甲状腺炎、格雷夫斯氏病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性白细胞减少症、血小板减少症、特应性皮炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、多发性硬化、炎性肠病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、牛皮癣、或移植物对宿主疾病。
17.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防选自下列的破坏性骨疾病骨质疏松、骨关节炎、或多发性骨髓瘤性骨疾病。
18.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防选自下列的增殖性疾病急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、转移性黑素瘤、卡波济氏肉瘤、或多发性骨髓瘤。
19.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防选自下列的神经变性疾病阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈病、脑缺血或创伤性损伤引起的神经变性疾病、谷氨酸神经毒害或缺氧症。
20.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防中风中的缺血/再灌注或心肌缺血、肾缺血、心脏病发作、器官缺氧或凝血酶引起的血小板聚集。
21.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防与T细胞激活有关的病症或病理性免疫反应。
22.权利要求12的方法，其中所述方法是用于治疗或预防选自实体瘤、眼睛新血管生成、或婴儿血管瘤的血管生成性疾病。
23.权利要求12的方法，其中所述疾病或病症可通过用Src类激酶抑制剂治疗来减轻。
24.权利要求23的方法，其中所述疾病或病症选自高钙血、再狭窄、血钙过多、骨质疏松、骨关节炎、骨转移的症状治疗、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化、牛皮癣、狼疮、移植物对宿主疾病、T细胞介导的过敏性疾病、Hashimoto氏甲状腺炎、急性热病性多神经炎、慢性堵塞性肺病、接触性皮炎、癌症、佩吉特氏病、哮喘、缺血或再灌注损伤、变应性疾病、特应性皮炎、或变应性鼻炎。
全文摘要
本发明提供了式(I)化合物,其中R
文档编号A61P13/12GK1378541SQ00814178
公开日2002年11月6日 申请日期2000年8月11日 优先权日1999年8月13日
发明者J·格林, G·比米斯, A-L·格里洛特, M·勒德鲍尔, F·萨里图罗, E·哈林顿, H·高, C·贝克, J·曹, M·黑尔 申请人:沃泰克斯药物股份有限公司