专利名称：包括南荛脂素和/或罗汉松脂素的药物组合物其作为肝保护剂的用途和从雪松中分离它 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及高产量地从植物雪松(Cedrus deodara)中分离两种名为(-)-罗汉松脂素(4，41-二羟基-3，31-二甲氧基木脂素-9，91-内酯)和(-)-南荛脂素(4，41，8-三羟基-3，31-二甲氧基木脂素-9，91-内酯)的化合物。本发明也确定了上述的化合物可作为肝保护剂、抗氧化剂或自由基清除剂使用。
背景技术：
像(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素这样的化合物没有发现有很大的商业价值。(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素的结构式如图1所示。木脂素广泛分布在被子植物和裸子植物中。它们的结构和生物活性的范围是宽广的。有文献指出(-)-罗汉松脂素表现出抑制CAMP磷酸二酯酶活性[W.Donald Macrae和G.H.NeilTowers，Biological activities of Lignans，Phytochemistry 23(6)，1207-20(1984)]。(-)-南荛脂素被发现可积极抵抗淋巴细胞白血病和具抗HIV的活性(M.K.Khamlach，R.Dhal和E.Brown；Premieres syntheses totales du(+)-南荛脂素，de la(-)-Trachelogenine，de la(-)-Nortrachelogenine et des lignoidesapparentes-Tetrahedran 48，10115-10126(1992))雪松的木材具有发汗剂，利尿剂和驱风剂特性，并有助于治疗发烧、痔疮和肺部及泌尿疾病。树皮的提取物是收敛剂，用于发烧，腹泻和痢疾。雪松的油树脂和从木材中获得的深色油由于可应用于溃疡及皮肤疾病而具有价值。
进一步看文件提出，从亚麻子中分离了木脂素，闭联-异落叶松脂素二葡糖苷(SDG)，它被报道具有多种活性(US专利5,4846,944)。天然的木脂素(-)-罗汉松脂素减少用H标记的5α-二氢睾酮(DHT)与人性激素结合球蛋白(SHBG)的结合。[Matthias Schottnerand Gerhard Spiteller(J.Nat.Prod.1998，61，119-121)]P.K.Agarwal和R.P.Rastogi(Phytochemistry.vol 21，No 6，pp 1459-1461，1982)报道从雪松中分离了两种木脂素内消旋-闭联异落叶松脂素和雪松素。
有报道从了哥王(Wikstroemia viridiflora)中以0.10％的产量分离(-)-罗汉松脂素和以0.124％的产量分离(+)-南荛脂素(南荛脂素，来自了哥王的新木脂素-Sheela Tandon和R.P.Rastogi；Phytochemistry 1976，vol 15，pp 1789-1791)。
Hans Achenbach，Reiner Waibel和Ivan Addae-Mensah，Ref.Phytochemi stry，Vol.22，No.3，pp 749-753，1983报道了(从埃及假虎刺(Carissa edulis)中提取木脂素和其它名为(-)-去甲络石素，番木瓜醇(carinol)和虎刺脂素(carissanol)。
有相当数量的流行病学证据显示富含水果和蔬菜的饮食与心血管疾病和其它种类癌症的危险性减少有联系。一般认为起到这些保护效果的有效要素只是抗氧化的植物化学物质。
近来的研究针对从植物源中找出植物化学物质，强调植物材料的多酚化合物作为抗氧化剂，抗突变，抗炎症，抗动脉硬化，抗糖尿病，抗肝毒素和抗微生物的介质。[Neil D.Westcott和Alister D.Muir的Overview of flax lignans，CorpUtilization Section，Saskatoon Research Centre，Agriculture and Agri-FoodCanada，107，Science Place，Saskatoon，SK S7N 0X2，Canada卷Volumn II-2000年1月-信息]。雪松茎的醇提取物被发现有抗癌活性。[Ref.Medicinal Plants ofIndia(ICMR)Vol.I，1976，pp.214 and 215]由于自由基介导的氧化压力与和年龄有关的疾病有关，抗氧化剂活性原理的医学重要性越来越得到重视。
自由基是含有不配对电子的高能分子。它们是通过正常的与氧有关的生物和环境过程产生的，并可引发级联反应产生更多的自由基。通常，体内产生的自由基的数量与抵抗它们起保护作用的抗氧化剂处于平衡。然而，体内存在的天然抗氧化剂只能处理最适产量的自由基，任何自由基的额外负担或缺乏抗氧化剂的保护会使平衡倾斜并导致氧化压力。
有必要从自然资源中分离自由基清除剂或抗氧剂要素，以制备对缓解疾病有作用的公式。因此，寻找其它具相关和重要生物特性的木脂素是必需的。
因此，申请人对于来自雪松的要素进行的详细的研究，此研究产生了两种名为罗汉松脂素和南荛脂素的有效要素的分离。尽管这些化合物迄今为止在荛花(Wikstromia spp.)中低产量的分离。因此，雪松是这些木脂素的新来源且它们在此分类中以相当高产量存在，使这项发明更为重要。
发明内容
本发明的主要目的涉及(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素作为自由基清除剂或抗氧化剂的用途。
本发明的另一目的涉及使用(-)-南荛脂素和作为肝保护剂的用途。
而本发明的又一目的是提供从雪松中分离(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素的方法。
本发明的还有一个目的是提供治疗动脉硬化症的方法。
发明简述因此，本发明提供了含有(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素，且用作自由基清除剂和抗氧化剂的新组合物。本发明也提供了含有(-)-南荛脂素并用作肝保护剂的新组合物。本发明进一步提供了从雪松中分离(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素及治疗动脉硬化症的方法。
发明详述因此，本发明提供了含有有效量的(-)-南荛脂素和添加剂，用作抗氧化剂的组合物在一个实施方式中，该组合物含有有效量的(-)-罗汉松脂素和添加剂，并用作抗氧化剂。
在另一个实施方式中，该组合物含有有效量的(-)-南荛脂素和添加剂，用作肝保护剂。
在一个实施方式中，以不影响或妨碍组合物活性要素的效率方式选择添加剂。这样的添加剂提高且不妨碍有效成分即(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素的活性。
在另一实施方式中，(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素与添加剂的比例在0.1∶10和2∶10的范围内。
在另一个实施方式中，(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素以250-300毫克每剂量存在。
本发明进一步提供了从雪松中分离(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素的过程。此过程包括步骤有a)用溶剂提取雪松研磨成粉状的植株部分，除去精油；b)在真空条件下浓缩提取物以获得剩余物；c)在步骤(b)得到的剩余物中加入乙酸乙酯；d)用传统方法分离溶剂；e)用含有约3％甲醇的氯仿对剩余物进行第一次洗脱以得到(-)-罗汉松脂素；和f)将步骤(e)得到的剩余物用约5％的甲醇进行第二次洗脱以获得(-)-南荛脂素。
在步骤(a)中使用的溶剂是正己烷和氯仿。
在另一实施方式中，用雪松的植株部分如树皮和树叶提取。
而在又一实施方式中，雪松的废弃植物地上部分用于上述的化合物。优选在此过程中使用精油提取后的剩余的废弃物。
有很多文献，如Inform Vol.11，pg.118-121上的论文提出氧自由基是造成发生动脉硬化的原因。并且抗氧化剂有助于阻止高胆固醇性动脉硬化。
因此，本发明的另一个特征是治疗动脉硬化，其中对需要的个体施用含有有效量的(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素的组合物。
(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素可与治疗上可接受的添加剂一起施用或联合施用。本领域技术人员可轻易确定(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素用于试验对象的有效量。然而，建议(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素的给药剂量在每剂250-300毫克，每天两次。尽管此组合物可口服也可全身途径使用，口服途径获得理想的最佳效果。
使用(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素的组合物可由技术中已知的传统方法制备。组合物可以是片剂、胶囊或糖浆等形式。技术中已知的合适添加剂可选择用于这些组合物的制备。
本质上，本发明的重点在于提供使用用作自由基清除剂和抗氧化剂的(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素的组合物的方法及使用(-)-南荛脂素作为肝保护剂的方法。
雪松的赤木质在精油工业上有广泛的用途。名叫“雪松木”油的油可应用于香料和香味。提取精油后的赤木质粉是副产品和废物。本发明涉及从雪松中分离和纯化化合物(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素及它们作为抗氧化剂和肝保护剂的作用。
现在这项发明涉及从新来源雪松分离两种名为(-)-罗汉松脂素(4，41-二羟基-3，31-二甲氧基木脂素-9，91-内酯)和(-)-南荛脂素(4，41，8-三羟基-3，31-二甲氧基木脂素-9，91-内酯)。本发明也涉及这些化合物作为抗氧化剂，肝保护剂和治疗动脉硬化的新用途。
现在这项发明体现从一全新来源分离两种抗氧化要素，(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素，和与已知的生物学上证实的抗自由基介质，抗异常油脂和抗肝毒素功效比较的它们的自由基清除剂特性。
附图简述本发明由
，其中图1描绘(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素的结构式。
图2(a)和(b)描述(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素自由基活性的图解。
图3(-)-南荛脂素肝保护活性的图解。
现在这项发明的一些实施方式由以下的实施例表现，这些实施例不应构成本发明发明范围的限制。
实施例1分离罗汉松脂素和南荛脂素过程的实验操作200克雪松的干木粉装入索克利特抽提装置。粉末首先用正己烷去除精油组合物。提取正己烷后的剩余物进一步用氯仿提取。氯仿提取物在真空条件下浓缩。稠糖浆剩余物用乙酸乙酯溶解，50克剩余物用约60毫升乙酸乙酯。将分离的乙酸乙酯中的剩余物滴加入约5升正己烷。过滤分离的35-g固体。
固体装入60 120目，3.5厘米直径硅胶柱。柱装到60厘米的高度。最初柱由氯仿洗脱接着用含3％甲醇的氯仿洗脱以得到罗汉松脂素。
进一步用含5％甲醇的氯仿洗脱柱产出(-)-南荛脂素。
(-)-罗汉松脂素产量约为0.06克。
(-)-南荛脂素产量约为8.0克。
获得90％纯度的化合物(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素。
(-)-罗汉松脂素和南荛脂素光谱化学及物理特性如下(-)-罗汉松脂素1.分子式C20H22O62.1H-NMRδ2.53(4H，m)，2.95(2H，br s)，3.86(6H，s)，4.20-4.40(2H，m)，5.50(2H，-OH)，6.40-6.80(6H，m)。
3.13C-NMRδ34.48(C-8)，38.10(C-8’)，40.90(C-7)，46.60(C-7’)，55.70(2X-OMe)，71.3(O-CH2-O)，111.01，111.53，114.11，114.40，121.21，121.95，128.32，129.45，129.70，144.30，146.38(12X Ar-C)，178，64(-C＝O)4.MS358(M+)5.IRCm-13560(-OH)，1765(γ-内酯)6.[α]D-37.09(28℃)(-)-南荛脂素1.分子式C20H22O72.1H-NMR2.40-2.55(2H，m)，2.65-2.80(2H，m)，3.10-3.20(1H，d)，3.85(6H，d)，3.95(2H，br d)，5.60(2H，d)，6.50-6.80(6H，m)3.13C-NMRδ31.50(C-7)，41.90(C-8)，43.74(C-7)，55.94(2X-OMe)，70.26(O-CH2-O)，76.33(-C-OH)111.55，112.81，114.35，114.56，116.82，121.42，123.12，126.20，130.35，144.27，144.95，146.59(12X Ar-C)4.MS374(M+)5.[α]D-30.90(28℃)实施例2体外评估自由基清除剂抗氧化能力测试化合物((-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素的抗氧化活性，与最广泛使用的自由基2，2-联苯基-1-间三硝苯基羟基自由基(DPPH)的清除剂比较其能力/性能。用充分接受和测试的丙丁酚和α-生育酚作为参考化合物。准备1毫克/毫升DMSO浓度的化合物[(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素]，随后，用DMSO系列稀释到低浓度，将100毫升测试化合物在Tris-HCl缓冲液(PH7.4)中重新配成1毫升。将其与等体积的500μm DPPH自由基的乙醇溶液反应。在暗处放置45分钟，记录下517nm处的吸光度。不加化合物的自由基作为对照，计算自由基清除剂活性百分比。所有的读数都要读三次。结果(图2(a)和(b)和3)表明考虑的化合物具比参考标准更强的抗氧化/自由基清除剂能力。图2(a)和(b)显示其中(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素的抗氧化能力与通常使用的丙丁酚和维生素E对比的数据。容易看出在浓度低很多情况下测试化合物总是表现出比参考化合物更高的抗氧化活性。
实施例3四氯化碳是诱导自由基介导的肝毒性的经典方法。为了评估化合物(-)-南荛脂素的自由基介导的肝中毒和肝保护特性，采用了这种方法。选择雄性wistar大鼠用于研究。化合物溶解于少量的DMSO并在阿拉伯树胶/水中重建。化合物在CCl4给药前1小时以250毫克/千克-体重剂量口服给过夜禁食老鼠。一小时后以2.5毫升/千克剂量口服CCl4和液体石蜡的混合物(1∶1，v/v)。继续禁食。然而，水随意提供。CCl4给药5小时后，从眼眶后沟(神经)丛中取血。血清天冬氨酸酶转氨酶和血清丙胺酸转氨酶作为肝中毒标记测量。表1和图3表明化合物(-)-南荛脂素起重要的保护作用。图3表明(-)-南荛脂素显著地防止CCl4在老鼠中引起中毒。
表1.
表1.血清天冬氨酸转氨酶(AST)和丙胺酸转氨酶(ALT)在口服化合物和CCl4前和给药后5小时的状况。(数据是平均数±标准偏差，括号内的数字是每组动物的数量)。
依照本发明的实践，发现能以高产量从新的来源，例如植物雪松分离(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素。也发现(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素表现出抗氧化特性和肝保护特性。
优点近来抗氧化化合物由于在多来源疾病即冠心病，癌症，糖尿病，风湿病和炎症(其中自由基在引起/发展疾病中起重要作用)中有广谱活性而引起注意。现在许多注意投向了利用自然资源，从自然资源中获得抗氧化化合物。
使用纯化合物(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素因此，此用法比目前使用的具类似特性的化合物混合物更好。同样重要，值得注意的是与分离被广泛作为抗氧化剂使用的生育酚相比，分离(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素的过程非常经济。
(-)-罗汉松脂素和(-)-南荛脂素以超过90％的高纯度使用。发现当使用剂量在动物中为250毫克/千克体重时，它们非常有效。
权利要求
1.一种用作抗氧化剂或自由基清除剂的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素和/或联合添加剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，以不影响或妨碍(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素效力的方式选择添加剂。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，从选自碳水化合物、蛋白质、糖的营养物和药物学上可接受的载体中选择添加剂。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素与添加剂的比例在0.4∶10到2∶10的范围内。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素的用量为每剂250到300毫克。
6.一种用作肝保护剂的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的(-)-南荛脂素和/或联合添加剂。
7.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，以不影响或妨碍(-)-南荛脂素效力的方式选择添加剂。
8.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，从选自碳水化合物、蛋白质、糖的营养物和药学上可接受的载体中选择添加剂。
9.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，(-)-南荛脂素与添加剂的比例在0.4∶10到2∶10的范围内。
10.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，(-)-南荛脂素的用量为每剂量250到300毫克。
11.一种从植物雪松中分离(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素的方法，其特征在于，所述方法包括步骤a)用溶剂提取雪松研磨成粉状的植物部分以去除精油；b)在真空条件下浓缩提取物以获得剩余物；c)在步骤(b)得到的剩余物中加入乙酸乙酯；d)用常规方法分离溶剂；e)用含3％甲醇的氯仿初次洗脱剩余物以获得(-)-罗汉松脂素；和f)用含5％甲醇的氯仿第二次洗脱步骤(e)得到的剩余物以获得(-)-南荛脂素。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，溶剂是正己烷和氯仿。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述雪松的植物部分选自从雪松提取精油后剩余的废弃物质。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述(-)-南荛脂素的产量是约4％的植物干材料。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，(-)-罗汉松脂素的产量是约0.03％的植物干材料。
16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，化合物(-)-罗汉松脂素有如下光谱化学和物理特性.a)分子式C20H22O6b)1H-NMRδ2.53(4H，m)，2.95(2H，br s)，3.86(6H，s)，4.20-4.40(2H，m)，5.50(2H，-OH)，6.40-6.80(6H，m)；c)13C-NMRδ4.48(C-8)，38.10(C-8’)，40.90(C-7)，46.60(C-7’)，55.70(2X-OMe)，71.3(O-CH2-O)，111.01，111.53，114.11，114.40，121.21，121.95，128.32，129.45，129.70，144.30，146.38(12X Ar-C)，178，64(-C＝O)d)MS358(M+)e)IRCm-13560(-OH)，1765(γ-内酯)f)[α]D-37.09(28℃)。
17.如权利要求11所述的方法，其特征在于，化合物(-)-南荛脂素有如下光谱化学和物理特性a)分子式C20H22O7b)1H-NMR2.40-2.55(2H，m)，2.65-2.80(2H，m)，3.10-3.20(1H，d)，3.85(6H，d)，3.95(2H，br d)，5.60(2H，d)，6.50-6.80(6H，m)c)13C-NMRδ31.50(C-7)，41.90(C-8)，43.74(C-7)，55.94(2X-OMe)，70.26(O-CH2-O)，76.33(-C-OH)111.55，112.81，114.35，114.56，116.82，121.42，123.12，126.20，130.35，144.27，144.95，146.59(12X Ar-C)d)MS374(M+)e)[α]D-30.90(28℃)。
18.(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素的用途，其特征在于，用于制造治疗动脉硬化症的组合物。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素与治疗上可接受的添加剂一起或联合使用。
20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，以不影响或妨碍(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素效力的方式选择添加剂。
21.如权利要求18所述的用途，其特征在于，从选自碳水化合物、蛋白质、糖的营养物和药学上可接受的载体中选择添加剂。
22.如权利要求18所述的用途，其特征在于，(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素与添加剂的比例在0.4∶10到2∶10的范围内。
23.如权利要求18所述的用途，其特征在于，(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素的用量范围为每剂250到300毫克，每天两次。
24.如权利要求18所述的用途，其特征在于，口腔施用(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素。
25.一种用(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素作为抗氧化剂和自由基清除剂的方法，其特征在于，该方法包括对需要的个体施用有效量的(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素与治疗上可接受的添加剂一起或联合给药。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，以不影响或妨碍(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素效力的方式选择添加剂。
28.如权利要求25所述的方法，其特征在于，从选自碳水化合物、蛋白质、糖的营养物和药学上可接受的载体中选择添加剂。
29.如权利要求25所述的方法，其特征在于，(-)-南荛脂素和/或(-)-罗汉松脂素与添加剂的比例在0.4∶10到2∶10的范围内。
30.如权利要求25所述的方法，其特征在于，(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素的用量范围为每剂250到300毫克，每天两次。
31.如权利要求25所述的方法，其特征在于，口腔施用(-)-南荛脂素或(-)-罗汉松脂素。
32.(-)-南荛脂素的用途，其特征在于，该用途是用于制造用作肝保护剂的组合物。
33.如权利要求32所述的用途，其特征在于，(-)-南荛脂素与治疗上可接受的添加剂一起或联合施用。
34.如权利要求32所述的用途，其特征在于，以不影响或妨碍(-)-南荛脂素功效的方式选择添加剂。
35.如权利要求32所述的用途，其特征在于，从选自碳水化合物、蛋白质、糖的营养物和药学上可接受的载体中选择添加剂。
36.如权利要求32所述的用途，其特征在于，(-)-南荛脂素与添加剂的比例在0.4∶10到2∶10的范围内。
37.如权利要求32所述的用途，其特征在于，(-)-南荛脂素的用量范围为每剂250到300毫克，每天两次。
38.如权利要求32所述的用途，其特征在于，(-)-南荛脂素口腔给药。
全文摘要
本发明涉及称为(－)－罗汉松脂素和(－)－南荛脂素的化合物与治疗上可接受的添加剂一起或联合的分离，用于抗氧化剂和肝保护剂。
文档编号A61P1/16GK1484528SQ00819981
公开日2004年3月24日 申请日期2000年10月23日 优先权日2000年10月23日
发明者J·M·拉奥, P·V·斯里尼瓦斯, J·S·亚达, K·V·拉加万, A·K·蒂瓦里, J M 拉奥, 亚达, 拉加万, 斯里尼瓦斯, 蒂瓦里 申请人:科学工业研究委员会