专利名称：一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种选择性地在肿瘤细胞内增殖、而在正常细胞内基本不增殖、并在肿瘤细胞高效表达抗癌基因的重组病毒，及其构建和增殖的方法。
背景技术：
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。
大约90％肿瘤细胞具有端粒酶活性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，这表明端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记，到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成，1.RNA组份(hTERC)，它作为端粒重复合成的内源性模板；2.端粒酶结合蛋白(TEP1)；3.端粒酶催化亚基(telomerase catalytic subunit，简写hTERT)，也有人称为端粒酶逆转录酶基因(telomerase reverse transcriptasegene)。RNA组份和端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必需的成份。最近研究表明端粒酶催化亚基(hTERT)在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。因此端粒酶催化亚基启动子在极大多肿瘤细胞内呈激活状态。
基因治疗是近年兴起的一种新的治疗恶性肿瘤方法。其基因转染方法分病毒法及非病毒法两种。病毒法通常采用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒及痘苗病毒。逆转录病毒在体外具有较高的转染率，但病毒滴度偏低，在体内转染率较低，而且只能感染分裂期的细胞，同时具有整合至染色体，存在癌变的可能性的缺点。腺相关病毒具有转染分裂及静止细胞的能力，能持久的表达。非病毒法包括脂质体及基因枪等方法，其转染基因表达时间较短，转染率较低。腺病毒是目前肿瘤基因治疗中最常见病毒载体，已广泛地应用于人体基因治疗方案中，具有容易生产及纯化的特点，它在体内及体外均能有效转染分裂及静止细胞，无致癌性。
目前肿瘤基因治疗的主要障碍是不能有效地将目的基因特异性转染所有的肿瘤细胞，而基因治疗的疗效与肿瘤细胞受基因转染的数量密切相关，因此，研究与发展特异性转染所有肿瘤细胞的病毒载体系统在肿瘤基因治疗中至关重要。
解决这一个问题的一个关键性方法之一是应用在肿瘤细胞选择性复制的病毒。近三十年来，由于病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们已完成了多个病毒全部基因组的测序工作，并对其基因的一结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病毒基因进行结构修饰。病毒具有感染、复制增殖和溶解细胞的能力，经过修饰的病毒这种效应在肿瘤细胞内得到有效加强，病毒在肿瘤细胞内进行选择性复制，当病毒感染肿瘤细胞后可数千倍甚至数百万倍增加病毒的数量，从而裂解肿瘤细胞，释放出新的病毒，再次感染肿瘤细胞，再次复制增殖，直至将全部肿瘤细胞杀灭，由于这种病毒不能在正常细胞内增殖，故对正常细胞影响不太，这种病毒被称为肿瘤细胞特异性增殖病毒但迄今为止，尚未见到应用端粒酶启动子控制病毒早期基因的增殖病毒的报告发明内容本发明的目的在于提供一类能在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒及其构建方法，即该病毒能选择性地在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内复制及增殖，而在无端粒酶活性的正常细胞内基本不复制或基本不增殖，从而特异性抑制或杀灭肿瘤细胞。
基因转录激活的调节受反式作用因子(如转录因子)与顺式作用元件相互作用的影响。当缺乏或出现某些转录因子时会影响基因的转录水平。端粒酶催化亚基启动子及端粒酶RNA组份基因启动子在具有端粒酶活性的细胞内特异性激活，从而使该启动子控制的基因产生转录。本发明应用端粒酶催化亚基启动子或端粒酶RNA组份基因启动子控制病毒增殖及复制的必需基因，从而使病毒增殖必需基因只能在上述具有端粒酶活性的的细胞中表达，导致病毒只能在上述病毒具有端粒酶活性的细胞内增殖，而在上述无端粒酶活性的细胞内基本不增殖。这种修饰后的病毒载体可被用于在某些细胞混合物中杀灭具有端粒酶活性的特殊靶细胞，通过给予修饰后的病毒能选择性地在该种靶细胞中增殖，从而使这种靶细胞被增殖的病毒选择性的杀灭；在体外培养或在动物体内通过将修饰后的病毒与细胞复合物混合，病毒只能在靶细胞增殖，也就是说除了靶细胞，其它细胞不能被这种病毒杀死。由于病毒在靶细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中的该靶细胞被杀灭，一旦靶细胞被破坏，病毒不再能够再增殖。
本发明采用细胞专一的反应元件是端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。
本发明提出的能特异性杀灭具有端粒酶活性肿瘤细胞的增殖型重组病毒，它至少有一个病毒增殖所必需的基因的表达受端粒酶启动子。它由在病毒增殖必需基因的转录起始位点与编码起始位点之间区域插入顺式作用元件而构成。该顺式作用元件特异性在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内激活，产生转录活性，而在无端粒酶活性正常细胞内基本不激活，不能产生转录活性。该顺式作元件至少含有以下顺序之一端粒酶逆转录酶基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。上述病毒增殖所必需的为病毒早期表达基因，如单纯疱疹病毒早早期表达基因ICE4。
本发明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因E1A、E1B、E2、E4。
人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本发明以腺病毒C亚属中的5型(Ad5)作为例证对本发明加以进一步具体说明，但不限于该例证。腺病毒基因分为两类，早期基因与晚期基因，早期基因包括E1A、E1B、E2、和E4。
E1A基因在病毒感染后即表达(0-2小时)，是最早表达腺病毒蛋白，它作为反式激活转录调节因子，是其它病毒早期基因蛋白表达所必需的，同时它反式激活其它病毒启动子。因此，缺乏E1A基因的表达，腺病毒DNA复制的必需基因产物不能产生，腺病毒不能有效复制及增殖。
E1B基因的转录受E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期病毒基因mRNA从细胞核转运到细胞浆中所必需的，E1B基因表达缺失可导致病毒后期基因表达不佳及不能关闭宿主细胞蛋白的合成。
E4基因位于病毒基因组的右未端，其开放阅读框3(ORF3)和ORF6能提高腺病毒主要晚期基因mRNA的水平。缺乏ORF3及ORF6蛋白功能，其病毒滴度比野生滴度低106倍。
腺病毒系统是由两个载体组成，一个载体提供腺病毒的左臂部分，另一个载体提供右臂，这两个载体至少有500nt的同源重组区，然而其转染细胞产生重组腺病毒，载体系统质粒pXC1(Mckinnon，Gene 1982，1939-42)，含有野生型Ad5左臂。pBHG10提供缺乏E3区Ad5右臂或pBHGE3提供Ad5右臂(含E3区)。
Ad5 E1A的转录起始位点与编码起始位点分别位于病毒基因组约560nt及610nt，在这个区域插入某种顺式作用元件，如端粒酶逆转录酶基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。首先，应用聚合酶链反应(PCR)技术在这区域构建限制性内切酶位点，PCR引物将被限制于Ad5基因组或携带Ad5部分基因组的质粒中，如有pBR322为背景的引物。应用含有EcoR I位点pBR322序列及含有Xba I位点Ad5序列，通过二次叠加PCR方法，在该区域创建一个新的唯一个酶切位点，该确切位点将用于插入病毒顺式作用元件。
相似的方案也被用于插入病毒顺式作用元件，来调节E1b Ad5的E1B启动子，由一个对Sp1单一高亲和为识别物和一个TATA box组成这区域位于1636到Sub-1701nt。通过插入病毒顺式作用元件在这个区域，将提供给E1B在细胞特异性转录。
本发明提供的能在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其修饰病毒基因组中非增殖必需区域插入有目的基因。该目的基因为(1)抑癌基因，(2)血管抑制基因，(3)细胞因子基因，(4)前药转换酶基因，(5)细胞凋亡基因中任一种。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为(1)抑癌基因，抑癌基因能抑制肿瘤细胞生长，抑癌基因包含以下任一个基因P53，Rb，NF1，VHL，APC。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为(2)血管抑制基因，血管抑制基因抑制肿瘤新生血管形成，可阻断肿瘤细胞的营养供应，从而导致肿瘤细胞因营养不足而死亡，肿瘤明显萎缩乃至完全消褪。同时抑制肿瘤新生血管的形成，也达到阻断肿瘤转移的通路的目的。血管抑制基因是以下任一个基因胶原蛋白XVIIII的C-末端片段的内皮抑素基因，血管生成抑素基因为血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构，Kringle1-5结构，Kringle1-3结构及Kringle1-3加上Kringle5结构，血小板反应蛋白基因，血小板因子4基因，纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因，胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素，干扰素诱生蛋白10，干扰素-γ诱生的单核因子，可溶性血管生长因子受体1，可溶性血管生长因子受体2，血管内皮细胞生长抑制因子，抗凝血酶III，尿激酶N末端片段基因，纤维结合素基因。
血管抑制基因中含有编码分泌型信号肽。该分泌型信号肽可以是下述中的任何一种血管生成抑制因子自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白K链信号肽。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为细胞因子基因，细胞因子基因具有激活免疫细胞，增加造血功能等，细胞因子基因包含以下任一个基因白细胞介素2，白细胞介素12，粒-单集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，Light或Flt3配体。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为前药转换酶基因，前药转换酶基因可使无毒性药物转变成毒性药物，从而增强对肿瘤细胞的杀伤。前药转换酶基因包含以下任一个基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶，水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶或大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶。
本发明提供的上述重组病毒携带的目的基因为细胞凋亡基因，细胞凋亡基因可导致真核细胞凋亡，细胞凋亡基因包含以下任一个基因ICE，capase-3，capase-8，capase-9。
随着病毒在肿瘤细胞内复制，目的基因拷贝数增加，使肿瘤细胞高效表达目的基因。
本发明提出的能在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒构建方法如下，将两个分别含有腺病毒左臂及右臂的载体共转染给会产生重组腺病毒的细胞，这两个腺病毒载体中至少有一个载体中腺病毒增殖非必需区插入目的基因，同时这两个腺病毒载体中至少有一个载体中腺病毒早期表达基因E1A、E1B、E2及E4区转录起始位点与编码起始位点之间区域插入某种顺式作用元件，该顺式作用元件至少含有以下顺序之一端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内产生转录活性，而无端粒酶活性的正常细胞内不激活，不能产生转录活性。
将具有端粒酶活性的肿瘤细胞中特异性激活的端粒酶催化亚基基因启动子插入腺病毒早期基因转录起始位点与编码起始位点之间区域可以通过以下方法完成通过聚合酶链式反应(PCR)技术在腺病毒早期基因转录起始位点与编码起始位点之间区域做一个酶切位点，通过酶切，将上述顺式作用元件插入该位点，从而使腺病毒早期基因受控于端粒酶催化亚基基因启动子或端粒酶RNA组份基因启动子。
本发明还提出前述能在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒的增殖方法，即将重组病毒(如重组腺病毒)感染端粒酶阳性的哺乳类细胞，从而使重组病毒特异性地在端粒酶阳性的哺乳类细胞中增殖。
使用只能具有端粒酶活性的特殊靶细胞内增殖的腺病毒，在靶细胞允许腺病毒增殖并导致细胞死亡。在体外培养或在动物体内通过将修饰后的腺病毒与细胞复合物混合，腺病毒只能在具有端粒酶活性的细胞内增殖，也就是说除了具有端粒酶活性的细胞外，其他细胞不能被这种腺病毒杀死，由于腺病毒在具有端粒酶活性的细胞内增殖及扩增，从而使混合细胞中具有端粒酶活性的细胞被杀灭，一旦该具有端粒酶活性的细胞被破坏，腺病毒不再能够再增殖。
本发明提出上述重组病毒实际应用。例如将该重组病毒(如重组腺病毒)用于体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，导致细胞毒性。将重组病毒(例如重组腺病毒)用于抑制具有端粒酶活性的肿瘤细胞生长。将重组病毒(例如重组腺病毒)用于体内选择性杀灭具有端粒酶活性的肿瘤细胞。
本发明提出的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒与化学治疗药物(如顺铂、5-氟脲嘧啶、丝裂霉素C、碳铂、环磷酰胺等)一起可以组成复合物，其作为抗肿瘤药物效果更好。
本发明具有如下有益效果
1.本发明提供一类治疗具有端粒酶活性的肿瘤的增殖型重组病毒，动物实验证明，这种重组病毒可用于治疗具有端粒酶活性的肿瘤。
2.本发明提供一类治疗具有端粒酶活性的肿瘤的增殖型重组病毒的构建方法。该方法简便易行可用于构建多种治疗具有端粒酶活性的增殖型重组病毒。
3.本发明提供一种在体内及体外杀灭具有端粒酶活性的肿瘤细胞、而不影响无端粒酶活性的正常细胞的方法。
具体实施例方式
例1携带端粒酶催化亚基基因启动子的克隆载体的构建。
自新鲜的正常人肝组织中抽提基因组DNA，应用巢式多聚酶链反应(PCR)技术扩增端粒酶催化亚基基因启动子(方法参见PCRProtools Current Methods and Applications，White BA主编，HumanaPress Inc.1993年出版-文献1)，在启动子5’端入EcoR I、Not I及Bgl I三个酶切位点，在启动子3’端加入Swa I、BamH I两个酶切位点。
引物1CGG GCT CCC AGT GGA TTC引物2AAC GTG GCC AGC GGC AGC ACC TC引物3GGA ATT CGC GGC CGC AGA TCT CAC AGA CGC CCA GGA ACC引物4CGG GAT CCA TTT AAA TTG GCC GGG GCC AGG GCT TC引物1与引物2进行第一次PCR扩增，回收370bp片段，再用引物3与引物4对370片段进行第二次PCR扩增，回收270bp片段，应用EcoR I+BamH I对酶切，将该基因插入pUC19载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下gaattcgcgg ccgcagatct cacagacgcc caggaccgcg cttcccacgtggcggaggga ctggggaccc gggcacccgt cctgcccctt caccttccagctccgcctcc tccgcgcgga ccccgccccg tcccgacccc tcccgggtccccggcccagc cccctccggg ccctcccagc ccctcccctt cctttccgcggccccgccct ctcctcgcgg cgcgagtttc aggcagcgct gcgtcctgctgcgcacgtgg gaagccctgg ccccggccaa tttaaatgga tcc结果表明端粒酶催化亚基基因启动子正确，将其命名为pUC-hTERTp。
例2可携带抗癌基因的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的减毒增殖腺病毒载体的构建。
pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在该载体中552bp处创立7个新的、唯一的酶切位点，分别为Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I，该位点位于E1A起始密码前12bp，其方法采用定位突变双次PCR技术(方法参见前述文献1)。其引物分别为引物55’-引物(含有EcoR I酶切位点)TTC AAG AAT TCT CAT GTTTG引物63’-引物(在5’端加入ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAGTGC GGC CGC TTC GAA CCG GT)ATT TAA ATC TCG AGT CGA CAC TAG TGCGGC CGC TTC GAA CCG GTG TCG GAG CGG CTC GGA
引物75’-引物(在5’端加入ACC GGT TCG AAG CGG CCG CAC TAGTGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG)ACC GGT TCG AAG CGG CCG CACTAG TGT CGA CTC GAG ATT TAA ATC CGG TGA CTG AAA ATG AGA CAT ATTA引物83’-引物(含有Xba I酶切位点)TTC TCT AGA CAC AGG TGATG采用定位突变双次PCR技术，PCR产物片段插入pGEM-T-easy载体中(方法参见Promega公司操作说明书)，命名为pGEM-T-Ela。将该片段进行DNA测序，其测序结果显示在pXC.1质粒bp552位点中插入TTC GAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCGGT，从而产生7个新的Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、XhoI和Swa I酶切位点，其它序列与pXC.1相同。应用EcoR I与Xba I双酶切pGEM-T-E1A及pXC.1质粒，将pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1质粒中EcoR I及Xba I位点中，使pXC.1中552插入一个TTCGAA GCG GCC GCA CTA GTG TCG ACT CGA GAT TTA AAT CCG GT，从而产生7个Age I、Bst BI、Not I、Spe I、Sal I、Xho I和Swa I酶切位点，该位点位于E1A起始密码前12bp，将该质粒命名为pQW1。
pUC-hTERTp分别用Not I+Swa I酶切，其酶切片段分别插入pQW1质粒中Not I+Swa I酶切位点中，分别应用引物4及5进行PCR扩增，扩出1310bp，这表明端粒酶催化亚基基因启动子已正向插入pQW1质粒Not I+Swa I位点，即腺病毒5型E1A起始密码子上游区12bp处，命名为pQW-hTERTp。
例3.携带人内皮抑素(endostatin)基因的E1区缺失的腺载体的构建pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信号。应用多聚酶链反应(PCR)技术人内皮抑素(endostatin)基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应，在扩增人内皮抑素(endostatin)基因，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见文献1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信号肽及信号肽前、基因结尾引入EcoR I和XbaI两个酶切位点。
引物9GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG AGG ACGCTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC引物10CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA AGCATG GCG AGC CAC CGC GAC TTC CAG引物11GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG CTGTTC TCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TG引物10与引物11进行第一次PCR扩增，回收615bp片段，再用引物9与引物11对615bp片段进行第二次PCR扩增，回收647bp片段，应用EcoR I+Xba I对酶切，将该基因插入pbluescript IIKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG将其EcoR I+Xba I切下，定向插入pCA13载体EcoR I+Xba I中，命名pCA13-human endostatin。
例4、携带血管生成抑素(angiostatin)基因的E1区缺失的腺载体的构建应用多聚酶链反应(PCR)技术血管生成抑素(angiostatin)基因，自新鲜的正常人肝组织中抽提总RNA，以随机引物作逆转录反应后进行第一轮PCR，并用两次多聚酶链反应(PCR)技术(方法参见文献1)在基因结尾引入EcoR I和Xho I两个酶切位点，引物125’-AGCGAATTCCAAAATGGAACATAAGG-3’EcoR I血浆纤维蛋白溶酶原49-67引物135’-ACACTTTTCCTTGACCTGATTTCAG-3’血浆纤维蛋白溶酶原348-343+111-94
引物145’-CTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGC-3’血浆纤维蛋白溶酶原94-111+343-363引物155’-AGCCTCGAGCTATTACGCTTCTGTTCCTGAG-3’Xho I(2 Stop)血浆纤维蛋白溶酶原1431-1416引物12与引物13、引物14与引物15分别进行第一次PCR反应，将其反应产物混合，用引物12与引物15进行再次PCR反应，回收1168bp片段。应用EcoR I+Xho I对酶切，将该基因插入pbluescript IIKS(+)载体(购于美国ATCC公司)中进行测序，其测序结果见下GAATTCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGTAATAGCTCGAG将其EcoR I+Xho I切下，定向插入pCA13载体EcoR I+Xho I中，命名pCA13-human angiostatin。
例5携带内皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒载体的构建应用Bgl II分别酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分别回收1237bp(含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40poly A加尾信号)及1758bp(人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信号)，将其插入pUC-hTERTp中Bgl II酶切位点，应用PCR技术分别验证其插入的反方向其端粒酶催化亚基基因启动子3’-端引物引物16TGG CCG GGG CCA GGG CTT C引物17人内皮抑素3’-引物(位于M-成瘤蛋白信号肽及人内皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C引物18人血管生成抑素3’-引物(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其引物16与引物17能扩增到1280bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号反向插入pUC-hTERTp Bgl II酶切位点。命名为pUC-hTERTp-endostatin。
其引物16与引物18能扩增到1520bp，表明含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信号反向插入pUC-hTERTp Bgl II酶切位点，命名为pUC-hTERTp-angiostatin。
应用Not I和Swa I双酶切pUC-hTERTp-endostatin及pUC-hTERTp-angiostatin，回收片段，分别插入pQW-hTERTp中Not I和Swa I酶切位点，分别命名为pQW-hTERTp-endostatin及pQW-hTERTp-angiostatin。
例6携带内皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒的重组。
293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pQW-hTERTp-endostatin与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine共转染至293细株，pQW-hTERTp-angiostatin与含有5型腺病毒右臂的质粒pBGH10通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pBGHE3及pBHG10购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBGHE3含有5型腺病毒右臂，含有E3区；pBGH10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得E1A受端粒酶催化亚基基因启动子控制的腺病毒，并携带人内皮抑素或血管生成抑素，分别命名为Adv-hTERTp Ela-endostatin及Adv-hTERTp Ela-angiostatin，分别记为QW1-endostatin及QW1-angiostatin。
由上述方法构建的重组病毒的列表如下病毒 名称 含Ad5左臂质粒 含Ad5右臂质粒Adv-hTERTp E1a-QW1- pQW-hTERTp-PBHGE3endostatin endostatin endostatinAdv-hTERTp E1a-QW1- pQW-hTERTp-PBHG10angiostatinangiostatinangiostatin腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见前述文献2出版)。Adv-hTERTp Ela-endostatin(QW1-endostatin)为5型腺病毒，在E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子，并在端粒酶催化亚基基因启动子上游区新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信号肽的人内皮抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
Adv-hTERTp E1a-angioststin(QW1-angiostatin)为5型腺病毒，在E1A转录起始位点与编码起始位点之间插入端粒酶催化亚基基因启动子，并在端粒酶催化亚基基因启动子上游区新建一个Bgl II酶切位点，在该酶切位点中反向插入含有人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299--+72)、含有人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信号基因序列，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)缺失，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。
例7携带内皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒的的体外在具有端粒酶活性的肿瘤细胞增殖、复制及高效表达人内皮抑素或人血管生成抑素因子并特异性杀灭肿瘤细胞。
将QW1-endostatin及QW1-angiostatin分别感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞株Hep 3B、293及正常人成纤维细胞，细胞按2×105/孔接种6孔板，分别感染重组腺病毒QW1-endostatin、QW1-angiostatin及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小时后应用293细胞株测定其病毒滴度，具体方法参见前述文献2，结果为293 Hep 3B正常成纤维细胞野生型5型腺病毒1×1056×1044×104QW1-endostat in1×1055×1052×10QW1-angiststin 1×1053×1055×10将感染EB病毒感染的肿瘤细胞株Hep 3B及正常人成纤维细胞分别感染重组腺病毒QW1-endostatin及QW1-angiostatin，MOI为1，37℃孵育1小时，感染后7天收集细胞，应用QIAamp DNA Bloodmini kit(德国QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法参见QIAGEN公司操作说明。将上述QW1-endostatin提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人内皮抑素cDNA片段(EcoR I与Xba I双酶切pCA13-human endostatin，回收637bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-humanendostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见文献2)，QW1-endostatin在肿瘤细胞株Hep 3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为2×104及＜10。
将上述QW1-angiostatin提取的DNA分别应用Bgl II酶切，用1％的琼脂糖电泳，将其转至尼龙膜，用32P分别标记人血管生成抑素cDNA片段(EcoR I与Xba I双酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作为探针，进行souther blot杂交，以pCA13-humanangiostatin作为病毒拷贝数对照(方法参见文献2)，QW1-angiostatin在肿瘤细胞株Hep 3B及正常人成纤维细胞的每个细胞病毒拷贝数分别为3×104及＜10。
例8携带内皮抑素或血管生成抑素的端粒酶催化亚基基因启动子控制E1A表达的腺病毒在裸鼠体内治疗移植肿瘤将4-5周龄的裸鼠皮下接种细胞株Jijoye细胞5×107，两周后给予每次2×108pfu，共5次，增殖型重组腺病毒QW1-endostatin或QW1-angiostatin治疗或用相同剂量的对照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治疗组及对照腺病毒治疗组4周后肿瘤体增加3倍以上，而治疗组则肿瘤明显缩小。
权利要求
1.一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于由病毒增殖必需基因的转录起始点与编码起始位点之间区域插入有某种顺式作用元件，该顺式作用元件至少含有以下顺序之一端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。
2.根据权利要求1所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于所述该增殖型重组病毒为腺病毒，该腺病毒增殖必需基因至少含有以下一个腺病毒的早期表达基因E1A，E1B，E2，E4。
3.根据权利要求1所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于其修饰病毒基因组中非增殖必需区域插入有目的基因，该目的基因可以是下述任一种抑癌基因，血管抑制基因，细胞因子基因，前药转换酶基因，细胞凋亡基因。
4.根据权利要求3所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于所述的抑癌基因可以是下述任一种P53，P21，Rb，NF1，VHL，APC。
5.根据权利要求3所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于所述的血管抑制基因可以是下述任一种胶原蛋白X VIII的C-末端片段的内皮抑素基因，血管生成抑素基因为血浆纤维蛋白溶酶原中Kringle1-4结构，Kringle1-5结构，Kringle1-3结构及Kringle1-3加上Kringle5结构，血小板反应蛋白基因，血小板因子4基因，纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)基因，胶原蛋白XV的C-末端片段的内皮抑素，干扰素诱生蛋白10，干扰素-γ诱生的单核因子，可溶性血管生长因子受体1，可溶性血管生长因子受体2，血管内皮细胞生长抑制因子，抗凝血酶III，尿激酶N末端片段基因，纤维结合素基因。6.根据权利要求3所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于所述的血管抑制基因血管抑制基因中含有编码分泌型信号肽。该分泌型信号肽可以是下述中的任何一种血管生成抑制因子自身信号肽，M-成瘤蛋白信号肽，免疫球蛋白K链信号肽。
7.根据权利要求3所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于所述的细胞因子基因可以是下述任一种白细胞介素2，白细胞介素12，粒-单集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，Light，Flt3配体。
8.根据权利要求3所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒，其特征在于所述的前药转换酶基因可以是下述任一种单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶，水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶，大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶。
9.根据权利要求3所述的重组病毒，其特征在于所述的细胞凋亡基因可以是下述任一种ICE，capase-3，capase-8，capase-9。
10.一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒载体的构建方法，其特征在于将两个分别含有腺病毒左臂及右臂的载体共转染给会产生重组腺病毒的细胞，这两个腺病毒载体中至少有一个载体中腺病毒非增殖必需区插入目的基因，同时这两个腺病毒载体中至少有一个载体中腺病毒早期基因E1A、E1B、E2、E4区转录起始位点与编码起始位点之间表达区域插入顺式作用元件，该顺式作用元件至少含有以下顺序之一端粒酶催化亚基基因启动子，端粒酶RNA组份基因启动子。
11.根据权利要求1 0所述的一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒的构建方法，其特征在于通过聚合酶链式反应技术在腺病毒早期基因转录起始位点与编码起始位点之间区域做一个酶切位点，通过酶切，将将上述顺式作用元件插入该位点，使腺病毒早期基因受控于端粒酶催化亚基基因启动子或端粒酶RNA组份基因启动子。
12.一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒的增殖方法，其特征在于将重组病毒体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，从而在具有端粒酶活性的细胞内增殖。
13.一种如权利要求1所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒载体的应用，其特征在于将该重组病毒用于体外感染具有端粒酶活性的肿瘤细胞，导致具有端粒酶活性的肿瘤细胞毒性。
14.一种如权利要求1所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒载体的应用，其特征在于将该重组病毒用于抑制具有端粒酶活性的肿瘤细胞的生长。
15.一种如权利要求1所述的在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒载体的应用，其特征在于将该重组病毒用于体内选择性地杀灭具有端粒酶活性的肿瘤细胞。
16.一种抗肿瘤药物，其特征在于该药物由如权利要1所述的能特异性杀灭肿瘤的增殖型重组病毒与化疗药物组成的复合物。
17.根据权利要求16所述的抗肿瘤药物，其特征在于所说的化学治疗药物可以是下述任一种顺铂，5-氟脲嘧啶，丝裂霉素C，碳铂，环磷酰胺。
全文摘要
本发明提供一类在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒及其构建方法。通过在病毒早期基因上游区插入端粒酶启动子,使该重组病毒选择性地在具有端粒酶活性的肿瘤细胞内增殖,而在无端粒酶活性的正常细胞内基本不增殖,同时将抗癌基因插入肿瘤细胞内增殖的病毒基因组中非增殖必需区域,使抗癌基因在肿瘤细胞高效表达,从而特异性杀灭具有端粒酶活性的肿瘤细胞。这种重组病毒可用于治疗多种肿瘤。
文档编号A61K39/12GK1339584SQ0112611
公开日2002年3月13日 申请日期2001年7月12日 优先权日2001年7月12日
发明者钱其军, 吴孟超 申请人:钱其军