专利名称：一种新型dna肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属生物工程领域，具体涉及一种新型DNA肿瘤疫苗及其制备方法将HER2/neu基因特定片断的表达载体转染多种细胞系，用ELISA和流式细胞仪(FACS)检测发现该基因体外表达良好。将pcDNA3-rSIDD DNA注射在小鼠肌肉，经免疫组化染色证实注射部位的肌肉组织有HER2/neu的有效表达。二检测HER2/neu特定基因片断的免疫原性完整的HER2/neu作为胚胎组织和肿瘤表达的“自身”抗原，机体对其有一定的免疫耐受性。上述特定基因片断并非天然的HER2/neu完整蛋白，但其中含有多个抗原表位，通过适当的免疫方案可以诱导机体产生相应的免疫应答。
本发明将pcNDA3-rSIDD免疫小鼠，用ELISA方法检测到抗HER2/neu抗体，且可持续数天时间，证明rSIDD可以引起体液免疫应答；用特异性杀伤实验证明pcDNA3-rSIDD DNA免疫的小鼠脾细胞对表达PCDNA3-rSIDD转染的肿瘤靶细胞有杀伤作用，若对该脾细胞在体外进行加强刺激，其对靶细胞的杀伤作用则明显加强，同时脾细胞表型出现明显变化，表现在T细胞明显加强，主要是CD8+T细胞明显加强，而CD4+T细胞比例无明显变化。说明rSIDD DNA免疫小鼠，可以诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答。
同样，通过DNA免疫技术，将人hSIDD DNA免疫小鼠，也可以诱导出相应的抗体和细胞免疫应答。经过肿瘤细胞的再刺激后，hSIDD DNA免疫小鼠脾细胞对人pcDNA3-hSIDD转染的肿瘤靶细胞表现出特异细胞毒作用，脾细胞中CD8+T细胞的增加可能与此有关。说明hSIDD免疫小鼠，也可以诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答。
另外，本发明证明了这种免疫应答与HER2/neu蛋白的种属差异无关，而且能诱导针对外来抗原的免疫应答。通过交叉反应，即将人hSIDD DNA免疫小鼠，以大鼠rSIDD转染的肿瘤细胞作为靶细胞进行细胞毒试验，结果出现针对诱导抗原的免疫应答。
三、制备新型DNA肿瘤疫苗本发明采用RT-PCR法克隆人HER-2/neu的特定片断hSIDD，利用NotI/XhoI双酶切定向插入到pcDNA3质粒中，构建人HER-2/neu基因真核表达载体pcDNA3-hSIDD。经测序证实该载体中插入的序列为所需的特定片断。将pcDNA3-hSIDD转化大肠杆菌，用QIAGEN的试剂盒大量抽提质粒。将pcDNA3-hICDD以1μg/μl的浓度溶于生理盐水中，即得人新型DNA肿瘤疫苗。
利用大鼠HER-2/neu基因的限制性内切酶位点(Hind III/XbalI)，从质粒pSV2-neu中分离纯化了大鼠HER-2/neu基因特定片段，并插入到质粒pCDNA3中(Hind III/Xbal I)，构建成大鼠HER-2/neu特定片段的真核表达载体pcDNA3-rSIDD。测序证实该载体中插入的序列为所需的特定片断。将pCDNA3-rICDD转化大肠杆菌，用QIAGEN的试剂盒大量抽提质粒。将pCDNA3-rICDD以1μg/μl的浓度溶于生理盐水中，即得大鼠新型DNA肿瘤疫苗。
本发明新型DNA肿瘤疫苗及其制备方法的特点是选择、分离及克隆能超越机体免疫耐受的HER-2/neu特定基因片断。
以上实验证明rSIDD或hSIDD基因免疫可以诱导小鼠产生相应的抗体和细胞应答，可以打破机体对HER-2/neu的免疫耐受，可用作HER2/neu阳性肿瘤防治的新型肿瘤疫苗。本发明证实了1.用小鼠流产模型验证rSIDD\hSIDD DNA免疫对体内的效应。已知胚胎组织中高表达HER2/neu蛋白。以rSIDD\hSIDD基因免疫孕鼠后均可导致小鼠平均产仔数降低，并可发现流产结节和坏死组织，表明通过SIDD基因免疫，可以打破机体对HER-2/neu自身产物的免疫耐受，清除HER2/neu阳性的胚胎组织。
2.在HER2/neu阳性肿瘤模型中证实PCDNA3rSIDD\hSIDD疫苗的抗肿瘤效应，证明hSIDD免疫小鼠诱导的免疫应答对肿瘤攻击的保护作用。用hSIDD DNA免疫的小鼠对HER/neu阳性肿瘤细胞生长由明显的抑制作用，机体生存时间延长。
本发明克隆了人和大鼠的HER-2/neu基因中强免疫原性片段，制备出DNA形式的肿瘤疫苗。动物实验证明，该疫苗能诱导机体产生针对HER-2/neu阳性的肿瘤细胞的细胞免疫和体液免疫，并具有良好的抗瘤效应。
表一人pcDNA3-hSIDD的插入序列cDNAtcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcg agggcgcgcgcccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgg gtccagccggagccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atggagctgg cggccttgtg ccgctgggggctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagacatgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccg ccacctctaccagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccac caatgccagcctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaagtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg attgtgcgag gcacccagct ctttgaggacaactatgccc tggccgtgct agacaatgga gacccgctga acaataccac ccctgtcacaggggcctccc caggaggcct gcgggagctg cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaaggaggggtct tgatccagcg gaacccccag ctctgctacc aggacacgat tttgtggaaggacatcttcc acaagaacaa ccagctggct ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgggcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag ggctcccgct gctggggaga gagttctgaggattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt gccggtggct gtgcccgctg caaggggccactgcccactg actgctgcca tgagcagtgt gctgccggct gcacgggccc caagcactctgactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac agtggcatct gtgagctgca ctgcccagccctggtcacct acaacacaga cacgtttgag tccatgccca atcccgaggg ccggtatacattcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc tacaactacc tttctacgga cgtgggatcctgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa gaggtgacag cagaggatgg aacacagcggtgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttgcgagaggtga gggcagttac cagtgccaat atccaggagt ttgctggctg caagaagatctttgggagcc tggcatttct gccggagagc tttgatgggg acccagcctc caacactgccccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt gagactctgg aagagatcac aggttacctatacatctcag catggccgga cagcctgcct gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagtaatccggggac gaattctgca caatggcgcc tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatcaacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac表2.是HER-2/neu基因特定片断DNA免疫的小鼠脾细胞经体外再刺激后对不同靶细胞的杀伤百分率(％) 表3.是pCDNA3空白对照质粒免疫的小鼠脾细胞经体外再刺激后对不同靶细胞的杀伤百分率(％) 表中所有杀伤数据均经转换符合方差齐，经方差分析发现，两组小鼠脾细胞对EL-4rSIDD和EL-4neu细胞杀伤有明显差异(n＝4，P＜0.01)，而对EL-4和EL-4p细胞无明显差异(P＞0.05)表4.是人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠和对照质粒免疫小鼠新鲜脾细胞经体外再刺激后对不同靶细胞的杀伤百分率(％) 表中所有杀伤数据经转换符合方差齐，方差分析发现两组小鼠脾细胞对EL-4hSIDD细胞杀伤有明显差异(n＝4，p＜0.05)，而对EL-4p细胞无明显差异。
图2.是大鼠HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠后不同时间血清中抗HER-2/neu抗体水平，高为rSIDD组，底为对照组。
图3是.DNA免疫小鼠新鲜脾细胞对不同靶细胞的杀伤柱1，3，5表示效应细胞来源于HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠脾细胞，柱2，4，6表示效应细胞来源于pCDNA3空白对照质粒DNA免疫小鼠脾细胞，柱1，2表示的靶细胞为EL-4-p，柱3，4表示的靶细胞为EL-4-neu，柱5，6表示的靶细胞为EL-4-rSIDD图4.是DNA免疫的小鼠脾细胞经体外再刺激后对不同靶细胞的杀伤图例中柱1，3，5，7表示脾细胞来源于HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠，柱2，4，6，8表示脾细胞来自pCDNA3对照质粒免疫小鼠；柱1，2表示的靶细胞为EL-4-rSIDD，柱3，4表示的靶细胞为EL-4-neu，柱5，6表示的靶细胞为EL-4-p，柱7，8表示的靶细胞为EL-4细胞图5.是HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠脾细胞体外刺激前后细胞表型的变化图中左栏为新鲜脾细胞表型检测，右栏为体外再刺激后脾细胞表型图6.是pCDNA3对照质粒免疫小鼠脾细胞体外刺激前后细胞表型的变化图中左栏为新鲜脾细胞表型，右栏为体外再刺激后脾细胞表型图7.是细胞ELISA法检测人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠血清抗HER-2/neu抗体图8.是DNA免疫C57 BL/6小鼠新鲜脾细胞对不同靶细胞的杀伤百分率图例中柱1，3表示效应细胞来自人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠，柱2，4表示效应细胞来自pCDNA3对照质粒免疫小鼠；柱1，2表示的靶细胞为EL-4-hSIDD，柱3，4表示的靶细胞为EL-4p细胞图9.是人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠脾细胞经体外再刺激后对不同靶细胞的杀伤作用图例中柱1，2，3表示效应细胞来自人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠，柱4，5，6表示效应细胞来自pcDNA3对照质粒免疫小鼠；柱1，4表示的靶细胞为EL-4 rSIDD，柱2，5表示的靶细胞为EL-4细胞，柱3，6表示的靶细胞为EL-4p细胞
图10.是人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠脾细胞表型在体外再刺激前后的变化图中左栏为新鲜小鼠脾细胞表型，右栏为体外再刺激后脾细胞表型图11.pCDNA3对照质粒免疫小鼠脾细胞在体外再刺激前后细胞表型的变化图中左栏为新鲜脾细胞表型，右栏为体外再刺激后脾细胞表型图12.HER-2/neu特定片断基因免疫Balb/C小鼠血清抗HER-2/reu抗体检测图13.HER-2/neu特定片断基因免疫诱导小鼠流产子宫图14.人HER-2/neu特定片段DNA免疫抑制HER-2/neu阳性肿瘤细胞生长的体内实验图15.人HER-2/neu特定片断免疫对肿瘤接种小鼠的保护作用图例中 为SP2/0neu细胞接种于人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠 实际存活时间＞120天 为SP2/0neu细胞接种于pCDNA3质粒免疫小鼠，为SP2/0p细胞接种于人HER-2/neu特定片断基因免疫小鼠
权利要求
1.一种新型DNA肿瘤疫苗，其特征在于采用克隆人HER-2/neu的特定片断hSIDD，利用NotI/XhoI双酶切定向插入pcDNA3质粒中，构建人HER-2/neu基因真核表达载体pcDNA3-hSIDD，将pcDNA3-hSIDD转化大肠杆菌后，抽提质粒，将pcDNA3-hICDD溶于生理盐水中，得DNA肿瘤疫苗。
2.按权利要求1所述的新型DNA肿瘤疫苗，其特征在于所述的克隆人HER-2/neu的特定片断hSIDD，是从HER2/neu高表达的细胞株SKBR3克隆出的。
3.按权利要求1所述的新型DNA肿瘤疫苗，其特征在于所述的将pcDNA3-hICDD溶于生理盐水的浓度是1μg/μl。
全文摘要
本发明属生物工程领域,具体涉及一种新型DNA肿瘤疫苗及其制备方法,本发明采用克隆人HER－2/neu的特定片断hSIDD,利用NotI/XhoI双酶切定向插入pcDNA3质粒中,构建人HER－2/neu基因真核表达载体pcDNA3－hSIDD,将pcDNA3－hSIDD转化大肠杆菌后,抽提质粒,将pcDNA3－hICDD溶于生理盐水中,得DNA肿瘤疫苗,动物实验证明,该疫苗能诱导机体产生针对HER－2/neu阳性的肿瘤细胞的细胞免疫和体液免疫,并具有良好的抗瘤效应。
文档编号A61K48/00GK1380107SQ01126890
公开日2002年11月20日 申请日期2001年9月27日 优先权日2001年9月27日
发明者何球藻, 王缨, 张跃建, 秦慧莲, 熊思东 申请人:复旦大学