专利名称：表达人内皮细胞抑制素重组益生菌菌株的构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有人内皮细胞抑制素基因的表达载体构建、用该载体转化的重组益生菌菌株及其应用。
内皮细胞抑制素(Endostatin)是一种抑制血管生成的蛋白质，可用于制备抗肿瘤药物。它含有183个氨基酸残基，分子量为18494D，是胶原蛋白XVIII的C端片段。内皮细胞抑制素具有选择性地抑制内皮细胞分裂增殖和迁移的功能，能抑制新生血管的形成从而抑制原发瘤和转移瘤的生长[Folkman J.et al.Cell，1997；88277-285.]。应用内皮细胞抑制素治疗肿瘤具有无耐药性和毒副作用少等优点，可与放疗和化疗联合使用，加强和巩固治疗效果[Thomas B..Nature，1997；390(6658)404]。
目前国外已经开始利用大肠杆菌或酵母菌发酵生产内皮细胞抑制素，经提取纯化后皮下或静脉注射治疗肿瘤。但是应用体外重组的内皮细胞抑制素治疗肿瘤存在一些问题1)有效剂量很大，成本高；2)治疗周期长，大剂量的长期反复给药会引起过敏反应等。因此有必要开发给药方便、特异性强、作用时间长的治疗方法。
我们通过反复实验，发明了在体内传递有活性的人内皮细胞抑制素，并用于治疗人体胃肠道和其它实体瘤的方法。
本发明的方法是首先将人内皮细胞抑制素基因克隆到益生菌的表达载体上，用电转化方法获得转人内皮细胞抑制素基因的重组益生菌。通过蛋白杂交及细胞活性测定，证明得到的重组菌株确实能够产生有活性的人内皮细胞抑制素蛋白。然后通过口服这种重组益生菌，使益生菌在肠道内持续表达人内皮细胞抑制素蛋白，抑制人体肠道和其它实体瘤血管的生成，从而达到治疗人体实体瘤的目的。
目前国内外还没有利用乳酸菌自身载体在乳酸菌里表达人内皮细胞抑制素基因，获得稳定、高效的重组乳酸菌并用于肿瘤治疗的报道。本发明方法包括以下步骤1.构建带有人内皮细胞抑制素基因的乳酸菌表达载体。
1)质粒pLA136上有colE1和pAMβ1复制子，在大肠杆菌和乳酸菌中都能复制，带有乳球菌P59启动子和乳球菌Usp45信号肽，将人内皮细胞抑制素基因接入启动子和信号肽后的相应酶切位点，构建带有人内皮细胞抑制素基因的重组表达载体pLA147，并将之转入到乳酸乳球菌MG1363中，该重组乳酸菌可持续表达分泌到胞外的人内皮细胞抑制素
2)质粒pLA133上有colE1和pWV01复制子，在大肠杆菌和乳酸菌中都能复制，带有乳球菌NisA启动子和乳球菌Usp45信号肽。将人内皮细胞抑制素基因接入启动子和信号肽后的相应酶切位点，构建带有人内皮细胞抑制素基因的重组表达载体pLA148。该载体在乳酸菌中经诱导可表达人内皮细胞抑制素基因，生成的人内皮细胞抑制素能够分泌到胞外。
3)质粒pLA1512上有colE1和pWV01复制子，可以在大肠杆菌和乳酸菌中复制，带有乳球菌NisA启动子，在Nisin诱导下可启动下游基因的表达。将通过PCR方法得到的人内皮细胞抑制素基因接入该质粒启动子后的相应酶切位点，构建出经诱导可在乳酸菌细胞内表达人内皮细胞抑制素基因的重组表达载体pLA175。
4)质粒pNuc7上有pAMβ1复制子，可以在乳酸菌中复制，带有P59启动子和Nuclease信号肽。将通过PCR方法得到的人内皮细胞抑制素基因接入该质粒启动子和信号肽后的相应酶切位点，构建出可在乳酸菌中表达人内皮细胞抑制素基因的重组表达载体pLA191。由于所构建的重组载体中外源基因前面带有信号肽，因此表达的人内皮细胞抑制素可以分泌到胞外。
5)质粒pFUN带有colE1和pAMβ1复制子，可在大肠杆菌和乳酸菌中复制，带有乳球菌Usp45启动子和Usp45信号肽，在信号肽后接入人内皮细胞抑制素基因，构建重组表达载体pLA195。该载体在乳酸菌中可持续表达人内皮细胞抑制素基因，表达的人内皮细胞抑制素蛋白可分泌至胞外。2.获得稳定、高效表达人内皮细胞抑制素的重组菌株。
将上述含有人内皮细胞抑制素基因的相应表达载体，通过电转化的方法，分别转入乳球菌、乳杆菌、链球菌、肠球菌和葡萄球菌中，收集重组菌菌体及上清液，通过蛋白杂交、细胞生长抑制实验检测蛋白表达情况及其生物活性。3.提供了生产带有人内皮细胞抑制素基因的重组乳球菌、乳杆菌、链球菌、肠球菌和葡萄球菌的方法及其应用。
重组乳球菌和乳杆菌分别用GM17和MRS培养基静置培养，对带有NisA启动子的重组菌株，待其达到生长对数期O.D.值为0.5左右时，加入诱导剂Nisin，诱导2-3个小时，收获菌体。对非诱导的重组菌株，待其生长到达平台期时收获。得到的细菌可直接制备成口服液或将菌体冻干制成胶囊。本发明具有以下优点1.采用益生菌自身表达载体，可以稳定高效表达外源基因。
2.所用的益生菌如乳球菌和乳杆菌本身无内外毒素，对人体很安全。
3.直接口服能够表达人内皮细胞抑制素的基因工程菌，不需经过蛋白纯化，此产品生产工艺简单，成本低。
4.乳酸菌可以在人体肠道中，在一定时期内持续表达内皮细胞抑制素，直接在肿瘤局部产生抗血管生成介质，具有较高的特异性。以下通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明
图1是重组表达载体pLA147的构建过程。其中P59为启动子、SPusp45为信号肽序列。图2是重组表达载体pLA148的构建过程。其中PnisA为启动子、SPusp45为信号肽序列。图3是重组表达载体pLA175的构建过程。其中PnisA为启动子。图4是重组表达载体pLA191的构建过程。其中P59为启动子、SPnuc为信号肽序列。图5是重组表达载体pLA195的构建过程。其中usp45 promoter为启动子和信号肽序列、usp-Terminator为转录终止子。
实施例1重组表达载体pLA147的构建根据已发表的人胶原蛋白XVIII cDNA序列，设计合成两段引物上游5’CATATGCATCTCACAGCCACCGCGACTTC 3’(29碱基)下游5’GGCATGCATTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT 3’(32碱基)在两段引物中分别引入NsiI位点，以人胶原蛋白XVIII cDNA为模板，PCR扩增人内皮细胞抑制素。
反应条件为94℃变性5分钟，以下循环94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环。
将PCR产物平端直接连接入pUC18质粒，转化大肠杆菌，蓝白斑筛选插入外源片段的转化子，提取质粒，得到pUC18-Endostatin质粒。
用限制性内切酶NsiI消化pUC18-Endostatin，将得到的Endostatin片段连接到pLA136质粒的NsiI位点，电转化乳酸乳球菌MG1363，筛选红霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明Endostatin已插入pLA136，序列正确，重组质粒命名为pLA147。
具体过程见图1实施例2重组表达载体pLA148的构建用限制性内切酶NsiI消化pUC18-endostatin，将得到的Endostatin片段连接到pLA133质粒的NsiI位点，电转化乳酸乳球菌NZ9000，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，
经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明Endostatin已插入pLA133，序列正确，重组质粒命名为pLA148。
具体过程见图2实施例3重组表达载体pLA175的构建根据人胶原蛋白XVIII cDNA序列，设计合成两段引物上游5’CATATGCATCACAGCCACCGCGACTTC 3’(27碱基)下游5’GGCGAATTCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT 3’(32碱基)在两段引物中分别引入NsiI位点和EcoRI位点，以pUC18-endostatin为模板，PCR扩增Endostatin。
反应条件为94℃变性5分钟，以下循环94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环。
将PCR产物与AT载体连接，转化大肠杆菌，蓝白斑筛选插入外源片段的转化子，提取质粒，用限制性内切酶NsiI和EcoRI消化，将得到的Endostatin片段与同样酶切的pLA1512质粒连接，电转化乳酸乳球菌NZ9000，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明Endostatin正确插入pLA1512，重组质粒命名为pLA175。
具体过程见图3实施例4重组表达载体pLA191的构建用限制性内切酶NsiI消化pUC18-endostatin，将得到的Endostatin片段连接到pNuc7质粒的NsiI位点，电转化乳球菌MG1363，筛选红霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定及测序，证明Endostatin已插入pNuc7，重组质粒命名为pLA191。
具体过程见图4实施例5重组表达载体p LA195的构建用PCR方法扩增乳球菌MG1363的Usp45启动子、信号肽和终止子。
首先以乳球菌MG1363基因组DNA为模板，根据已知的Usp45基因启动子和信号肽序列设计引物，在上游引物和下游引物中分别引入限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切位点。
上游引物5’GAGAATTCTAATGTATAGTGTCACTCAGCACAGGC 3’(35碱基)下游引物5’AAGGGTACCTCAGCGTAAACACCTGACAACCGGGCTG 3’(37碱基)PCR反应条件为94℃变性5分钟，以下循环94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环。扩增得到Usp45启动子和信号肽片段。再以乳球菌MG1363基因组DNA为模板，根据已知的Usp45基因终止子序列设计引物，在上游引物和下游引物中分别引入限制性内切酶BamHI和XbaI酶切位点。上游引物5’CTGGATCCAAAAAAGTCTTAATAAATAAAAAATAG 3’(35碱基)下游引物5’AGTCTAGATATCATTTTTCCTTATTATTATACCAC 3’(35碱基)反应条件为94℃变性5分钟，以下循环94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环。扩增得到Usp45终止子片段。先将得到的Usp45启动子和信号肽片段用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切，与同样酶切的pUC18连接。转化大肠杆菌，筛选带有氨苄青霉素抗性的转化子，提取质粒鉴定，确认得到pUC18-usp45质粒。将经限制性内切酶KpnI和BamHI酶切的Endostatin片段，连接到质粒pUC18-usp45的相应酶切位点，转化大肠杆菌，筛选带有氨苄青霉素抗性的转化子，提取质粒，酶切鉴定，确认得到质粒pUC18-usp45-endostatin。用限制性内切酶EcoRI和BamHI将Usp45启动子和Endostatin片段从质粒pUC18-usp45-endostatin上切下，连接入同样酶切的质粒pFUN，转化大肠杆菌，筛选带有氨苄抗性的转化子，提取质粒，酶切鉴定，确认得到pFun-usp-endostatin。将PCR方法得到的Usp45终止子片段用内切酶BamHI和XbaI酶切，与同样酶切的pFun-usp-endostatin连接，转化大肠杆菌，筛选带有氨苄抗性的转化子，提取质粒，酶切鉴定，确认得到重组质粒pFun-usp45 promoter-endostatin-usp45 terminator，命名为pLA195。
具体过程见图5实施例6采用电转化法，将上述几种重组质粒分别转入乳球菌中。
将重组表达载体pLA147、pLA191、pLA195分别与乳酸乳球菌MG1363感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含红霉素的培养基上，筛选转入重组质粒的菌株。乳酸乳球菌NZ9000是将Nisin抗性基因转入MG1363染色体中得到的工程菌，可在Nisin存在的条件下正常生长，将带有PnisA启动子的重组质粒转入NZ9000中，可加入Nisin诱导质粒表达外源基因。分别将重组表达载体pLA148、pLA175与乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含氯霉素的培养基上，筛选转入重组质粒的菌株。实施例7采用电转化法，将上述几种重组质粒分别转入乳杆菌中。
将重组表达载体pLA147、pLA191、pLA195分别与干酪乳杆菌感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含红霉素的MRS培养基上，在厌氧箱中培养，筛选转入重组质粒的菌株。
干酪乳杆菌NY1000是将Nisin抗性基因转入干酪乳杆菌染色体中得到的工程菌，可在Nisin存在的条件下正常生长，将带有Pnis启动子的重组质粒转入NY1000中，可加入Nisin诱导质粒表达外源基因。分别将重组表达载体pLA148、pLA175与干酪乳杆菌NY1000感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含氯霉素的培养基上，在厌氧箱中培养，筛选转入重组质粒的菌株。实施例8检测人内皮细胞抑制素基因在重组菌株中的表达将得到的重组乳球菌、乳杆菌分别在含有对应抗生素的GM17和MRS培养基中静置培养。对带有NisA启动子的重组菌株，待其达到生长对数期O.D.值为0.5左右时，加入诱导剂Nisin，诱导2-3个小时，收获菌体。对非诱导的重组菌株，待其生长到平台期时收获。样品经常规处理后，进行蛋白杂交验证人内皮细胞抑制素的表达首先进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜，与兔抗人内皮细胞抑制素抗体杂交。
结果见图6。实施例9重组益生菌中表达的人内皮细胞抑制素生物活性的测定采用人脐静脉血管内皮细胞，培养至96孔培养板上，细胞浓度为每毫升25000个细胞，每孔加入1ng VEGF和0.008ug至1ug不同浓度的重组人内皮细胞抑制素蛋白，培养3天后通过细胞计数来测量抑制血管内皮细胞增殖的活性。
结果见图7。实施例10重组菌株的应用。
重组乳球菌、乳杆菌分别用GM17和MRS培养基静置培养，得到的发酵液可直接制备口服液；或加入保护剂制成冻干粉，然后制成胶囊或片剂；提供给肿瘤病人，抑制肿瘤的生长。
权利要求
1.一种用益生菌表达人内皮细胞抑制素基因的方法，该方法的特征是将人内皮细胞抑制素基因克隆到益生菌自身的表达载体上，然后转入益生菌中获得稳定表达人内皮细胞抑制素的重组益生菌菌株。
2.权利要求1中所述益生菌，其中包括葡萄球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属和肠球菌属。
3.权利要求2中所述的乳球菌属，其中包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
4.权利要求2中所述的乳杆菌属，其中包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
5.权利要求1中所述的表达载体，其中全部或部分地包括下列从5’到3’连接的组成部分a.启动子b.信号肽c.人内皮细胞抑制素基因d.转录终止子e.复制起始子
6.权利要求5所述启动子，其中包括选自乳球菌NisA基因、乳球菌P59或乳球菌Usp45启动子。
7.权利要求5所述信号肽，其中包括选自链球菌核酸酶(Nuclease)基因或乳球菌Usp45基因的信号肽。
8.权利要求5所述终止子，其中包括选自人乳头瘤病毒E7基因或乳球菌Usp45基因的终止子。
9.权利要求5所述复制起始子，其中包括选自乳酸菌pWV01或pAMβ1复制起始子。
10.权利要求1中所述的表达载体，其中包括质粒pLA147，pLA148，pLA175，pLA191，和pLA195。
11.权利要求10中所述质粒pLA147，其特征为包括下列组成部分a.P59启动子b.Usp45信号肽c.人内皮细胞抑制素基因d.乳酸菌复制子pAMβ1
12.权利要求10所述质粒pLA148，其特征为包括下列组成部分a.NisA启动子b.Usp45信号肽c.人内皮细胞抑制素基因d.乳酸菌复制子pWV01
13.权利要求10中所述质粒pLA175，其特征为包括下列组成部分a.NisA启动子b.人内皮细胞抑制素基因c.乳酸菌复制子pWV01d.E7转录终止子
14.权利要求10中所述质粒pLA191，其特征为包括下列组成部分a.P59启动子b.Nuclease信号肽c.人内皮细胞抑制素基因d.乳酸菌复制子pAMβ1e.Nuclease转录终止子
15.权利要求10中所述质粒pLA195，其特征为包括下列组成部分a.Usp45启动子b.Usp45信号肽c.人内皮细胞抑制素基因d.乳酸菌复制子pAMβ1e.Usp45转录终止子
16.用权利要求1所述方法获得的重组益生菌菌株，其中包括CGMCC NO.0614、CGMCC NO.0615、CGMCC NO.0616、CGMCC NO.0617、CGMCC NO.0618。
17.权利要求16中所述的一种或多种益生菌经发酵处理后，可作为口服制剂，通过口服，在体内表达有活性的人内皮细胞抑制素，用于作为抗胃肠道及其它实体瘤血管生成的药物，可以抑制肿瘤血管的生长。
全文摘要
本发明阐述用分子生物学技术构建含有人内皮细胞抑制素(Endostatin)基因的表达载体,并通过电转化法转入益生菌中,得到稳定表达人内皮细胞抑制素基因的重组益生菌菌株。一种或多种重组菌株经发酵处理后作为口服制剂,通过口服,在体内表达有活性的人内皮细胞抑制素。所表达的人内皮细胞抑制素能够抑制血管内皮细胞的增殖,从而抑制肿瘤血管的生长,可用于发展抗胃肠道及其它实体瘤血管生成的药物。
文档编号A61P35/00GK1361286SQ0113083
公开日2002年7月31日 申请日期2001年8月27日 优先权日2000年9月15日
发明者王春香, 胡放, 孙克菲, GRUSS) 亚历山德拉·顾丽丝(Alexandra, LANGELLA) 菲力普·郎日拉(Philippe 申请人:北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司