专利名称：番鸭肝白点病活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及番鸭一种病毒性传染病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。
1997年以来，在福建省莆田、福州、福清和浙江金华、广东佛山等地番鸭饲养区发生一种临床上以软脚为主要症状，以肝脾表面有多量白点、肾脏肿大、出血、表面有黄白条斑为主要病理变化的传染病，俗称番鸭肝白点病。因病死率高，病因不明，防治无法，给番鸭业造成很大经济损失。为了有效防治番鸭肝白点病。
经本发明人研究结果发现，该病是由一种RNA病毒(本发明人命名为MW9710株)引起。该病毒经适应后能在番鸭胚成纤维细胞中增殖并传代，产生细胞病变。雏番鸭经人工感染后出现与自然发病鸭相同的临床症状和病理变化，并回收到病毒。经电镜观察，病毒呈球形，正二十面体、立体对称，无囊膜，有双层衣壳，直径为60nm左右。病毒粒子在胞浆中增殖，可见到胞浆包涵体。病毒对胰蛋白酶、氯仿和50℃处理1h不敏感，对紫外线、pH3，60℃处理1h、70℃处理1h、80℃处理1h敏感，病毒核酸型为RNA；病毒对鸡、鸭、鸽和人O型红细胞均无凝集作用；该病毒只能使番鸭发病；经尿囊腔接种不能致死鸡胚。证实该病毒是番鸭肝白点病的病原，是呼肠病毒科(Reoviridae)下一种分类地位尚未确定的病毒(胡奇林等.福建畜牧兽医，2000，22(6)1-3)。
本发明的目的是为研制出安全、高效的“番鸭肝白点病疫苗”，用于预防番鸭肝白点病。
本发明的关键技术是以用自番鸭肝白点病患病番鸭分离到的强毒株经过不同的诱变方法进行诱变处理，使其对健康番鸭致病性减弱或无致病性，接种后并能使番鸭产生良好的免疫反应，从而抵御强毒的攻击。本发明的具体描述1番鸭肝白点病番鸭胚成纤维细胞人工致弱毒株(该病毒株已于2001年12月18日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC0666)选育1.1MDEF细胞制备和CEF细胞制备MDEF细胞制备按程由铨方法制备(病毒学报，1993，9(3)228-235.)；CEF细胞常规方法制备(殷震，刘景华主编，动物病毒学(第二版)，科学出版社，1997，223-224)。1.2番鸭肝白点病番鸭胚成纤维细胞(MDEF细胞)人工致弱毒株选育以MW9710株病毒的番鸭胚液毒接种MDEF细胞，25ml细胞瓶，加入维持液4ml，接毒量0.2ml/瓶×3瓶，前2代未见细胞病变，至第4代时于第5天出现CPE(细胞颗粒变性、崩解、脱落)，至第9代(MWC9)时，病变和滴度稳定，接毒后第3天细胞圆缩，变性，崩解成颗粒状，第5天病变达75％左右，TCID50≥10-6/0.1ml，对1日龄雏番鸭的致病力为LD50＝0.1ml原液，传至第30代(MWC30)时，以0.1ml/羽经腿部肌注1日龄雏番鸭，雏番鸭不致病。传至40代时，测定其免疫原性，方法如下34羽番鸭不做任何处理作对照组，15羽1日龄试验鸭腿部肌肉注射MWC40，0.2ml/羽，7天时取6羽对照鸭和5羽试验鸭分别腿肌注射MWC12，0.1ml/羽，结果对照组鸭的发病率和死亡率分别为100％(发病动物数/接种动物数＝6/6)和50％(死亡动物数/接种动物数＝3/6)(以下同)，而试验组的发病率和死亡率分别为40％(2/5)和20％(1/5)，12天时，发病率和死亡率分别为40％(2/5)和20％(1/5)。至第50代时，测定其免疫原性，10羽鸭不做任何处理作对照，7羽1日龄试验鸭腿部肌肉注射MWC50，0.2ml/羽，12天时，2组鸭均用MWC12腿肌注射MWC12，0.6ml/羽，结果对照组鸭的发病率和病死率分别为100％和90％，试验组鸭的发病率和死亡率分别为14.3％和0，至此已育成MDEF细胞弱毒株，命名为MWA，再连续在MDEF上传代，记为MWA1、MWA2…。2番鸭肝白点病鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)人工致弱毒株(该病毒株已于2001年12月18日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC0667)选育将MWC9接种已长成单层的CEF细胞，0.1ml/瓶×3瓶(25ml/瓶)，37℃，培养，每天观察细胞病变(CPE)2次，至第3、4天时，CEF细胞培养液变酸呈黄色，以5.6％NaHCO3调pH至中性，继续培养观察，第6天收获细胞培养液，记号为MWC9E1，冻于-20℃冰箱。将MWC9E1细胞培养液于-20℃反复冻融3次后，接种MDEF细胞(25ml瓶，0.1ml/瓶×3瓶)37℃，培养，每天观察病变2次，第4天出现病变，第6、7天病变达75％～80％，收获细胞培养液，记号为MWC10E1，冻于-20℃，用于接种CEF细胞，如此在MDEF和CEF细胞上交替传代，交替传代3次(病毒代号MWC11E3)，病毒在CEF细胞上第5天开始出现细胞病变，第6、7天时CPE达10％左右，至此病毒(MWC11E3)一直在CEF细胞上传代，至第7代(MWC11E10)时，病毒在CEF细胞上第2、3天开始病变，第4天CPE达75％～80％，第8代(MWC11E11)时，病毒的细胞半数感染量(TCID50)为100/0.1ml，第13代(MWC11E16)TCID50为10-4.25/0.1ml，第20代后，TCID50稳定在10-5.5～10-6.25/0.1ml，在CEF上传至第27代(MWC11E30)时，以CEF细胞培养液经腿肌接种1日龄番鸭20羽，0.2ml/羽，同时取20羽鸭不做任何处理作对照，隔离饲养，观察25天。至第8天时对照组和试验组分别取7羽和8羽鸭用强毒(MWC9)腿肌注射，0.2ml/羽，第11天对照组和试验组各取8羽用MWC9腿肌注，0.6ml/羽，其余4羽对照鸭继续观察，隔离饲养，观察25天。结果只注射MWC11E30的4羽鸭和对照组5羽鸭均健活，8天攻毒的对照组鸭发病率和死亡率均为100％，试验组发病率和死亡率分别为86.3％和37.5％，11天攻毒的对照组鸭发病率和死亡率分别为100％和43％，而试验组的发病率和死亡率分别为75％和12.5％；MWC11E3在CEF细胞传至39代时(记为MWC11E42)，测定其免疫原性，方法如下对照组15羽番鸭，不做任何处理，试验组20羽鸭，于1日龄时腿部注射MWC11E42，0.2ml/羽，于7天分别取对照组鸭6羽和试验组鸭8羽腿部肌肉注射MWC10，0.1ml/羽，于10天分别取照组鸭6羽和试验组鸭8羽腿部肌肉注射MWC10，0.6ml/羽，结果7天时攻毒；对照组鸭发病率和死亡率均为50％，而试验组发病率为12.5％死亡率为0，10天时攻毒；对照鸭的发病率和死亡率分别为50％和33.3％，而试验组鸭的发病率为和死亡率分别为12.5％和0，至此，已选育成MW CEF细胞弱毒株，命名为MWCA。再连续在CEF细胞上传代，记号为MWCA1，MWCA2……。MWCA在CEF上传45代(MWCA5)时，测定其免疫原性，方法同第39代时，结果7天时，对照组6羽攻毒鸭的发病率和死亡率分别为83％(5/6)和50％(3/6)，而试验组的发病率为25％，死亡率为0，12天时攻毒对照组6羽鸭的发病率和死亡率分别为(4/6)66.7％和(3/6)50％，而试验组的发病率为12.5％，死亡率均为0。3弱毒株的生物学特性3.1MWA株的生物学特性3.1.1安全测定以MWA10(TCID50为10-5.75/0.1ml)、MWA15(TCID50为10-6/0.1ml)细胞培养毒2ml分别肌肉注射1天番鸭7羽和10羽，同时设不做处理对照组鸭4羽，隔离饲养，观察25天，结果MWA10和MWA15两次试验的对照鸭和试验鸭均无不良反应。3.1.2毒力返强试验取弱毒株MWA10(TCID50为10-5.75/0.1ml)和MWA15(TCID50为10-6/0.1ml)分别接种1天番鸭5羽，每肌腿肌接种0.5ml，5天后剖杀2羽，取肝、脾等组织制成匀浆，冻融3次后，取上清液接种1天番鸭5羽，另3羽鸭观察20天，如此连续5次在雏番鸭体内传5代，未见毒力返强现象。3.1.3免疫原性测定将MWA10和MWA15分别用Hank’s液稀释成1∶10和1∶30，各接种1天番鸭5羽，同时取8羽1天鸭不做任何处理作对照，于12天时，用MWC11腿肌注射各组试验鸭8羽和对照鸭4羽，0.1ml/羽，结果12天时对照鸭发病率和死亡率分别为100％和90％，而试验组鸭的发病率和死亡率分别为14.3％、0(MWA10)和12.5％、0(MWA15)。3.2 MWCA株的生物学特性3.2.1安全性测定取MWCA10(TCID50为10-5.25/0.1ml)和MWCA15(TCID50为10-5.75/0.1ml)细胞培养毒1.5ml、2ml分别腿肌注射1天番鸭6羽和10羽，同时设不做处理的对照鸭4羽，隔离饲养，观察25天，结果对照鸭和试验鸭均健活。3.2.2毒力返强试验取弱毒株MWCA10、和MWCA15进行试验，方法同3.1.2结果未见毒力返强现象。3.2.3免疫原性测定将MWCA10、MWCA15分别用Hank′s液稀释成1∶10、1∶30，各接种1天番鸭10羽，同时取12羽1天鸭不做处理作对照，于7天、12天用MWC11腿肌注射各组试验鸭5羽和对照鸭4羽，剂量分别为0.1ml/羽和0.6ml/羽，结果7天时，对照组的发病率和死亡率为100％和75％，MWCA10、试验组鸭的发病率为20％，死亡率为0，MWCA15、试验组鸭的发病率和死亡率均为0；12天时，对照组的发病率和死率为50％和50％，MWCA10和MWCA15试验组的发病率和死亡率均为0。4番鸭肝白点病弱毒活疫苗制备4.1番鸭肝白点病MDEF细胞苗(简称MWA株疫苗)制备以MWA株接种MDEF单层细胞，37℃培养，待细胞病变达75％～80％时，收获细胞培养液并测定病毒滴度(TCID50)以TCID50≥10-5为合格，按比例加入Hanks液，充分混合后分装成液体活苗；在收获病毒细胞培养液并测定病毒滴度(TCID50)以TCID50≥10-5为合格后加入常用的冻干保护剂，蔗糖脱脂牛奶、蔗糖明胶等，充分混合后分装后经冷冻干燥而制成冻干活疫苗。4.2番鸭肝白点病CEF细胞苗(简称MWCA株疫苗)制备以MWCA株病毒接种CEF单层细胞，余同4.1。5疫苗安全性测定5.1 MWA株疫苗取批号为0106和0107的疫苗各0.2ml(含20个使用剂量)，腿部肌肉接种1天番鸭各8羽，观察25天，均未见不良反应。5.2MWCA株疫苗取批号为00105、00106、00107和00108的疫苗各0.2ml(含20个使用剂量)腿肌接种1天番鸭各8羽，观察25天，均无不良反应。6疫免疫效力测定6.1MWA疫苗取0106和0107批号疫苗分别接种1日龄番鸭25羽，同时设不做处理的对照鸭31羽，于免疫后7天、12天时各取10羽鸭分别用MWC12腿肌注射0.1/ml、0.6/ml，隔离饲养，观察25试验组另5羽鸭继续观察25天，结果免疫后7天攻毒，对照组鸭的发病率和死亡率均为100％，0106批疫苗组的发病率和死亡率分别为20％和10％，0107批疫苗疫苗组的发病率和死亡率分别为10％和10％；免疫后12天攻毒，对照组的发病率和死亡率分别为100％和90％，0106批和0107批疫苗组的发病率和死亡率均分别为12.5％和0。5.6.2MWCA疫苗取批号为00105、00106、00107和00108疫苗分别接种1日龄番鸭20羽，同时设不做任何处理鸭15羽作对照，于7天、10天时对照组鸭取6羽、各试验组各取8羽均用MWC10腿肌注射，剂量分别为0.1ml/羽，0.6ml/羽，结果为免疫后7天攻毒时，对照组鸭发病率和死亡率分别为50％(3/6)和50％(3/6)，00105批组鸭发病率和死亡率分别为16.7％(1/6)和0，00106、00107、00108批组的发病率和死亡率分别为25％和12.5％，12.5％和0，12.5％和0，免疫后12天攻毒时，对照组发病率为50％，死亡率为33.3％，00105、00106、00107和00108批试验组的发病率分别为12.5％和0，12.5％和0，0和0，12.5％和0。5.7番鸭肝白点病活疫苗田间试验5.7.1MWA疫苗田间试验田间试验，共免疫注射35200羽番鸭，对照组3600余羽，其中2批试验鸭发病，对照组发病率92％，病死率91％，而试验组鸭平均发病率7％，病死率4.3％，免疫保护率90％以上，其余批次试验对照组和试验组均不发病。5.7.2MWCA疫苗田间试验共免疫注射115200余羽鸭，其中5批试验鸭发病，对照组平均发病率90.3％，病死率89.7％，试验组平均发病率14.3％，病死率20％，其余批次鸭不发病。本发明的优点本发明人试制了2批MWC9的灭活苗用于预防本病，1日龄时腿肌注射，0.2ml/羽，免疫后7天、12天时用MWC9攻毒，结果保护率均低于60％，因此，番鸭肝白点病活疫苗与灭活苗比较，具有以下优点①免疫力产生快，免疫后7天时攻毒，保护率可达88％以上，而灭活苗免疫后7天时，保护率＜30％；②免疫效果可靠，免疫后7天时攻毒，保护率可达88％以上，免疫后12天攻毒时保护率为95％以上；③生产成本低廉，约为灭活苗的1/10；④疫苗保存期长，灭活苗保存期为4℃，6个羽，而活疫苗-20℃保存期可达1年；⑤制成冻干苗后，体积小、便于运输。
权利要求
1.一种用于预防番鸭肝白点病的活疫苗，其特征是用由患病番鸭分离到强毒株经过人工诱变处理获得的两株致弱毒株(该两病毒株已于2001年12月18日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号MWA株为CGMCC0666、MWCA株为CGMCC0667)，通过接种细胞单层细胞，37℃培养，待细胞病变达75％～80％时，收获病毒细胞培养液并测定病毒滴度(TCID50)以TCID50≥10-5为合格，按比例加入Hanks液，充分混合后分装成液体活苗；在收获病毒细胞培养液并测定病毒滴度(TCID50)以TCID50≥10-5为合格后加入常用的冻干保护剂，蔗糖脱脂牛奶、蔗糖明胶等，充分混合后分装后经冷冻干燥而制成冻干活疫苗。
2.权利要求1所述的番鸭肝白点病的活疫苗，其特征是制备疫苗所用人工诱变处理获得的致弱的MWA毒株(该两病毒株已于2001年12月18日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC0666)是通过在番鸭胚成纤维连续传代育成MDEF细胞弱毒株，命名为MWA。
3.权利要求1所述的番鸭肝白点病的活疫苗，其特征是制备疫苗所用人工诱变处理获得的致弱的MWCA毒株(该两病毒株已于2001年12月18日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC0667)是通过在番鸭胚成纤维细胞(MDEF细胞)和鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)上交替传代连续传代选育成MW CEF细胞弱毒株，命名为MWCA。
全文摘要
本发明涉及用自番鸭肝白点病患病鸭分离到的强毒株经过人工诱变处理获得两株弱毒病毒株，分别用番鸭胚和鸡胚成纤维细胞制成预防番鸭肝白点病活疫苗，这两种活疫苗具有以下优点即免疫力产生快，免疫后7天时攻毒，保护率可达88％以上，而灭活苗免疫后7天时，保护率＜30％；免疫效果可靠，免疫后7天时攻毒，保护率可达88％以上，免疫后12天攻毒时保护率为95％以上；疫苗保存期长，灭活苗保存期为4℃，6个羽，而活疫苗－20℃保存期可达1年。
文档编号A61P31/00GK1426814SQ0114448
公开日2003年7月2日 申请日期2001年12月19日 优先权日2001年12月19日
发明者胡奇林, 陈少莺, 程晓霞, 林天龙, 程由铨 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所