专利名称：一种促进血管再生的生物可降解性复合材料及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种血管再生引导系统，且特别涉及一种促进血管再生的生物可降解性复合材料及其制造方法。
体内血管再生必须经由一连串相当复杂的程序，其中包括细胞与细胞的间的作用、生长因子的影响及细胞外间质的作用，受伤或病变的组织首先会释放再生血管生长因子(angiogenic growth factors)在受伤的组织周围，而这些再生血管的生长因子在与血管内皮细胞(endothelial cells)上的受体(receptor)结合后，便会活化细胞而分泌一些特定的酶及生长因子，而这些特定的酶及生长因子会分解原来血管的基底膜，使得血管内皮细胞能迁移到受损的组织，产生血管修补或再生血管的机制。这种血管再生或抑制的调控在疾病的治疗上展现了惊人的潜力。在血管的再生过程中，再生血管的生长因子具有一重要的调控功能，因此，近年来有许多尖端的研究群(包括大学与不少大、小公司)，积极投入大量的人力与物力，来找寻适当的再生血管生长因子及药物，尝试在体外组织培养的方法，来进行再生血管的制备。另外，也有研究群尝试将再生血管生长因子加在伤口敷料上，来促进伤口的愈合。
开发器官再生技术，血管是不可少的部分。为了使组织工程所得培养器官(如胰脏、肝脏、肝、肾)得到大量血液流入，促进血管增生(angiogenesis)是一关键，如何架构适当的血管再生材料，使血管再生得以加速并顺利进行，是组织工程技术的重要目标。目前常用于促进血管再生的材质，通常以化学高分子聚合物为基质使细胞贴附，并添加促进血管再生的生长因子促进细胞生长。以化学高分子聚合物为基质须考虑生物相容性等，而加入促进血管再生的生长因子则须考虑到分子扩散，加工过程中可能使蛋白质变性失去活性，保存不易及价格昂贵等问题。因此开发高生物相容性，低成本，高效率的天然生物高分子复合材料，将有助于推动此项技术的进行。
已有一些基础的研究结果，通常是使用生长因子来刺激血管再生作用，虽然生长因子可以刺激细胞的分裂，促进细胞的移动以及形成管状构造，但是却有下述缺陷1.分子量过大，减缓扩散的速率一般的生长因子(例如bFGF以及VEGF)其分子量大多分布在1～2万之间，如此大的分子量在组织间质中无法有效扩散，不易形成一个生长因子的浓度梯度。由于这种缺陷使其无法有效引导细胞生长的方向；2.可能变成免疫系统攻击的目标生长因子在异种生物体中可能会诱发免疫反应，轻则只是消弱生长因子的功效，重则造成过敏反应导致生物体死亡；3.易变性大多数的生长因子都是由蛋白质构成，由于其结构及作用复杂，所以在物理或化学环境改变时(例如加工的过程)容易发生变性，导致活性的丧失；4.价格高昂生长因子大多是由基因重组的方式制造而成，所以价格高昂。
本发明另一目的在于提供一种促进血管再生的生物可降解复合材料的制法。
为达上述目的，本发明所提供的血管再生引导系统为一包括磷脂的生物可降解性基材，可具有有效增进血管再生的效能。由于磷脂的衍生物能够克服一般生长因子等大分子无法克服的先天性扩散上的困难，且具有化学诱导(chemo-attraction)功能，可以有效借动态的向化性诱导机制引导内皮细胞渗透至此系统，且其所引发的胞内讯号传递途径与一般生长因子不同，此包括磷脂的生物可降解性基材具有可与生长因子搭配组合增进血管再生的效能。本发明的优越性在于(1)载体内活性磷脂的添加可促进血管再生的效果；(2)活性磷脂以微脂粒型态添加于生物可降解性基材，以制备成具促进血管再生效能的系统，该方式简便，加工容易且系统的效能稳定；(3)由于磷脂为双极性分子，可同时与亲水性及疏水性基材结合，这样的特性可以增加应用的多样性；(4)由于磷脂为双极性分子以及他们特殊的临界微脂粒浓度(critical micelle concentration；CMC)，当他们以微脂粒型态存在于基材时可以达到持续释放的效果，并可借由基材的加工及改性来改变其释放曲线以符合各种临床上的需求。
本发明涉及一种促进血管再生的生物可降解性复合材料，其包括(a)一生物可降解性材料，以及(b)一磷脂，以微脂粒的型态分布于上述生物可降解性材料中。
本发明所使用磷脂的性质较生长因子稳定，并可稳定地单独存在，且其分子量小，大约只有300～400之间，在组织间质中的扩散速率较快。事实上，这些磷脂在血小板活化时由血小板分泌，可以吸引内皮细胞移动及刺激生长，同时还可以抑制平滑肌细胞及纤维母细胞的生长以防止组织纤维化的发生。此外，磷脂为细胞膜的主要成分也是细胞内重要的讯号传递者，几乎在所有的高等动物细胞中的讯号传递途径及讯号传递者都是相同的，由于其普遍性以及分子量小，使其不会发生免疫相容性的问题。
适用于本发明的磷脂包括(但不限于此)神经鞘胺醇-1-磷酯(S-1-P；Sphingosine-1-Phosphate)、溶血磷酯酸(L-P-A；lysophosphatidic acid)或其它由血小板或细胞膜分离出的磷酯，其中又以神经鞘胺醇-1-磷酯(S-1-P)较佳。由于神经鞘胺醇-1-磷酯(S-1-P)为双极性分子以及其较高的临界微脂粒浓度，在复合材料中以单层微脂粒的型态存在并且可以持续释放出S-1-P单体并且快速扩散至组织中。因此，此复合物持续地吸引内皮细胞移动促进局部血管的生长及伤口的愈合。另外，S-1-P受体(S-1-P receptor)是G-蛋白偶合受体(G-protein-coupled receptor)，它借着活化各种不同类型的G-蛋白来活化细胞与传递讯号；相对的，一般蛋白质类生长因子的活化途径则是以受体酪氨酸激酶(RTK，ReceptorTyrosine Kinase)为主。这两种途径分别独立但可能存在某些相互影响的机制，因此本发明的复合材料除了磷脂之外，亦可依不同需要加入适当的生长因子，借由磷脂衍生物刺激内皮细胞的分化，可以与单一的生长因子作用产生加乘的作用，更有效增强血管再生的效果。
适用于本发明的生物可降解性材料包括(但不限于此)明胶(Gelatin)、胶原蛋白(Collagen)、几丁质(Chitin)、去乙酰壳多糖(Chitosan)、氨基葡糖聚糖(Glucosaminoglycans)、硫酸软骨素(Chondroitin sulfates)、透明质酸(Hyaluronic acid)或其它蛋白质类类细胞外基质(ECM proteins)、藻酸盐(Alginates)、淀粉/改性淀粉(Starch/modified starch)、褐藻酸(Carragenam)/盐、果胶(Pectins)、其它多糖类类细胞外基质(ECM polysaccharides)、聚交酯-乙交酯酸(PLGA；polylactide glycolide acid)及取自生物体组织的材料。较佳者，可使用天然高分子复合材料，其具有低毒性、生物可降解、生物相容性高等生物医学应用上的优势。
在本发明的较佳实施方案中，系使用胶原蛋白以及多糖类化合物作为生物可降解性材料，具有双重细胞受体，特殊细胞亲合配基(cellaffinity ligand)，双重不同的酶分解途径和分解速率，所以可延长分解时间，并可吸引某些细胞贴附。再者，胶原蛋白/多糖类化合物复合材料构成的系统与S-1-P微脂粒的相容性很高，S-1-P可以非常均匀的方式分布在材料中。另外，胶原蛋白/多糖类化合物复合材料具有多种亲水性(hydrophilic)官能基，能捕捉大量的水分子，在成胶时不会造成脱水缩合现象，可以防止S-1-P与生长因子因脱水缩合而被快速排出。
本发明的制造方法，系先溶解磷脂并以极大面积的涂布方式涂布在容器壁，然后以相分离的方式利用温差及超音波震荡制备成磷脂的微脂粒，最后混和此磷脂的微脂粒与生物可降解性复合材料，共同制备成促进血管再生的生物可降解性复合材料或基材元件。详细步骤包括(a)以溶剂溶解磷脂，将其置于容器中；(b)以减压蒸馏方式去除溶剂，使磷脂附着于容器的器壁；(c)于容器中加入磷酸缓冲盐液(PBS；Phosphate BufferedSaline)，并将其急速冷冻；(d)以超音波震荡容器，使磷脂于磷酸缓冲盐液中形成微脂粒；以及(e)将磷脂的微脂粒与生物可降解性材料混合，以形成促进血管再生的生物可降解性复合材料。
步骤(a)所使用的溶剂为一极性有机溶剂，通常为醇类，例如甲醇或乙醇。步骤(c)较佳可使用液态氮将其冷却。在步骤(e)中，可先将生物可降解性材料加工制成水胶、多孔性块状基材、薄膜基材、纤维基材、管状基材、膏状基材等各种型态的基材后，再与磷脂混和添加使用。或者，亦可先将磷脂混和添加于可分解性材质中，再加工成上述各种型态，例如可事先将S-1-P的微脂粒与胶原蛋白溶液(0.6-1.0w/v，于1％醋酸或乳酸等1％有机酸溶剂)混合后，再以冷冻干燥的方式制成多孔性复合材料。水胶型态的复合材料可用皮下注射的方式植入动物体内，其它型态如多孔性基材，可采用手术方式将其移植在真皮层及皮下组织。
此外，本发明的复合材料亦可加入其它蛋白质类的生长因子、抑制因子或刺激因子(cytokines)合并使用。常用生长因子包括(但不限于此)纤维组织生长因子(FGF；fibroblast growth factor)、胎盘生长因子(Placental growth factor)、变性生长因子(Transforming growthfactor)、血管生长素(Angiogenin)、白细胞介素-8(Interleukin-8)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor)、有粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor)、血小板来源内皮细胞生长因子(Platelet-derived endothelial cell growth factor)等。常用抑制因子包括(但不限于此)干扰素α(Interferonα)、转形生长因子(Transforming growth factor β)、血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1)、制管张素(Angiostatin)、胎盘增生相关血小板因子4(Placental proliferin-related，Platelet factor 4)、血小板因子4(Platelet factor 4)、染料木黄酮(Genistein)、金属蛋白酶抑制因子(Metallo-proteinase inhibitor)、催乳素16-kd片段(Prolactin 16-kd fragment)等。
综上所述，本发明所开发的促进血管再生的复合材料具有生物医学材料应用上所需的特性与优点1.此复合材料具有低毒性、高生物可降解、生物相容性等，具有生物医学应用上的优势；2.此复合材料构成的水胶系统具有类细胞外基质(ExtracellularMatrix-like)结构，适合细胞贴附与生长；3.此复合材料具有促进血管再生的功能；4.此复合材料保存方便，配制简单，可降低在加工过程中对于载体生物活性的破坏和影响程度；5.所述磷脂为双极性分子，可同时与亲水性及疏水性基材结合，这种特性可以增加应用的多样性；6.可再另外加入生物活性因子(包含生长因子及药物)，而应用于所属的药物释放、组织工程等应用中。
具体实施例方式
实施例1水胶系统，无胶原蛋白本实施例的复合材料包括聚多糖体(几丁质)及磷脂S-1-P等生物可降解性的天然高分子复合物，其制法如下首先，将S-1-P以甲醇溶解并倒入圆底烧瓶中，然后以减压蒸馏装置将S-1-P涂布在烧瓶内表面并且抽至完全干燥。接着，加入适量的PBS，并以液态氮急速冷冻。在室温以超音波震荡处理，使烧瓶壁上的S-1-P溶解(形成微脂粒)。最后，将S-1-P的微脂粒与几丁聚糖水胶混合，并将生长因子bFGF加入复合材料中。将所得的复合材料以皮下注射的方式植入老鼠体内。
图1为组织切片加上HE染色后的结果。老鼠在皮下注射水胶后第15天处死，取出植入物后经过固定，包埋，切片，染色后在200倍的视野下观察血管的大小及型态。(a)为bFGF与S-1-P合并使用，可发现血管的半径以及数量都比bFGF单独使用(b)以及对照实验组(c)明显增加，箭头处为血管所在位置。图2为组织切片上的平均血管计数，血管数量依序为bFGF/S-1-P＞bFGF＞PBS，与图1的观察结果一致。
实施例2水胶系统，有胶原蛋白本实施例的复合材料包括蛋白质(胶原蛋白)，聚多糖体(几丁质)及磷脂S-1-P等生物可降解性的天然高分子复合物。
首先，将S-1-P以甲醇溶解并倒入圆底烧瓶中。然后，以减压蒸馏装置将S-1-P涂布在烧瓶内表面并且抽至完全干燥。接着，加入适量的PBS，并以液态氮急速冷冻。于室温以超音波震荡处理，使管壁上的S-1-P溶解(形成微脂粒)。最后，将S-1-P的微脂粒与几丁聚糖-胶原蛋白热敏感复合水胶混合，得到含有胶原蛋白、几丁质及磷脂S-1-P的复合材料。
实施例3多孔性基材本实施例的复合材料包括多孔状胶原蛋白，磷脂S-1-P等生物可降解性的天然高分子复合物。
首先，将S-1-P以甲醇溶解并倒入圆底烧瓶中，然后以减压蒸馏装置将S-1-P涂布在烧瓶内表面并且抽至完全干燥。接着，加入适量的PBS，并以液态氮急速冷冻。于室温以超音波震荡处理，使管壁上的S-1-P溶解(形成微脂粒)。最后，将S-1-P的微脂粒加入多孔状胶原蛋白(collagenporous sponge)的复合材料混合。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域熟练的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，所作出的更动与润饰，均应包含在本发明的范围内。
权利要求
1.一种促进血管再生的生物可降解性复合材料，其包括一生物可降解性材料；以及一磷脂，以微脂粒的型态分布于上述生物可降解性材料中。
2.如权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的生物可降解性材料选自明胶、胶原蛋白、多糖类化合物、几丁质、去乙酰壳多糖、氨基葡糖聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、藻酸盐、淀粉/改性淀粉、褐藻酸/盐、果胶、聚交酯-乙交酯酸及其混和物。
3.如权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的生物可降解性材料为胶原蛋白和多糖类化合物。
4.如权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的磷脂为神经鞘胺醇-1-磷酯。
5.如权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的磷脂为溶血磷酯酸。
6.如权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的磷脂是由血小板或细胞膜分离出的磷酯。
7.如权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的生物可降解性复合材料具有下列其中一种型态水胶、多孔性块状基材、薄膜基材、纤维基材、管状基材或膏状基材。
8.如权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其进一步包括生长因子、抑制因子或刺激因子。
9.如权利要求8所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的生长因子选自纤维组织生长因子、胎盘生长因子、变性生长因子、血管生长素、白细胞介素-8、肝细胞生长因子、有粒细胞集落刺激因子以及血小板来源内皮细胞生长因子。
10.如权利要求8所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料，其中所述的抑制因子选自干扰素α、转形生长因子、血小板反应蛋白-1、制管张素、胎盘增生相关血小板因子4、血小板因子4、染料木黄酮、金属蛋白酶抑制因子以及催乳素16-kd片段。
11.一种权利要求1所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其包括下列步骤(a)以溶剂溶解磷脂，将其置于容器中；(b)以减压蒸馏方式去除该溶剂，使该磷脂附着于该容器的器壁；(c)于该容器中加入磷酸缓冲盐液，并将其急速冷冻；(d)以超音波震荡该容器，使该磷脂于该磷酸缓冲盐液中形成微脂粒；以及(e)将该磷脂的微脂粒与生物可降解性材料混合，以形成促进血管再生的生物可降解性复合材料。
12.如权利要求11所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的溶剂为极性有机溶剂。
13.如权利要求12所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的溶剂为醇类。
14.如权利要求11所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的磷脂为神经鞘胺醇-1-磷酯、溶血磷酯酸或由血小板或细胞膜分离出的磷酯。
15.如权利要求11所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中步骤(c)中所述的急速冷冻是使用液态氮。
16.如权利要求11所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的生物可降解性材料选自明胶、胶原蛋白、多糖类化合物、几丁质、去乙酰壳多糖、氨基葡糖聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、藻酸盐、淀粉/改性淀粉、褐藻酸/盐、果胶、聚交酯-乙交酯酸及其混和物。
17.如权利要求16所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的生物可降解性材料为胶原蛋白、多糖类化合物。
18.如权利要求11所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的生物可降解性复合材料具有下列其中一种型态水胶、多孔性块状基材、薄膜基材、纤维基材、管状基材或膏状基材。
19.如权利要求11所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中步骤(e)进一步包括加入生长因子、抑制因子或刺激因子于该生物可降解性材料中。
20.如权利要求19所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的生长因子选自纤维组织生长因子、胎盘生长因子、变性生长因子、血管生长素、白细胞介素-8、肝细胞生长因子、有粒细胞集落刺激因子以及血小板来源内皮细胞生长因子。
21.如权利要求19所述的促进血管再生的生物可降解性复合材料的制造方法，其中所述的抑制因子选自干扰素α、转形生长因子、血小板反应蛋白-1、制管张素、胎盘增生相关血小板因子4、血小板因子4、染料木黄酮、金属蛋白酶抑制因子以及催乳素16-kd片段。
全文摘要
本发明涉及一种促进血管再生的生物可降解性复合材料及其制造方法，所述生物可降解复合材料主要包括(a)一生物可降解性材料，以及(b)一磷脂，以微脂粒的型态分布于上述生物可降解性材料中。由于磷脂的衍生物能够克服一般生长因子等大分子无法克服的先天性扩散上的困难，且具有化学诱导(chemo－attraction)功能，可以有效借动态的向化性诱导机制引导内皮细胞转移至此系统中，且其所引发的胞内讯号传递途径与一般生长因子不同，可与生长因子搭配组合增进血管再生的效能。
文档编号A61L27/00GK1429628SQ0114529
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月31日 优先权日2001年12月31日
发明者陈大勇, 赖惠敏, 陈元汉, 高荣骏 申请人:财团法人工业技术研究院