Pluraflavin和其衍生物,及它们的制备方法和用途的制作方法

专利名称：Pluraflavin和其衍生物,及它们的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及式I新化合物 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、R10和n的定义如下。式I化合物抑制转录酶、具有抑制细胞的作用、并尤其适用于治疗肿瘤。式I化合物可以通过在培养基中培养放线菌目(Actinomycetales)物种HAG003959，DSM 12931获得。因此，本发明涉及制备式I化合物的方法、这些化合物在制备用于治疗恶性疾病和可以通过抑制转录酶治疗的疾病的药物中的用途、以及包含至少一种式I化合物的药物制剂。
除了手术除去肿瘤的极端方法外，治疗恶性肿瘤的选择方案包括用X射线、α-、β-、γ-射线放疗、免疫疗法和化疗。目前免疫疗法的使用仍受到限制。肿瘤的化疗应理解为是指施用细胞毒素(细胞抑制剂(cytostatics))以治疗肿瘤和通常在局部手术治疗或放射后治疗剩余的肿瘤细胞。这些物质特异地干扰细胞分裂的某些过程，以致具有高比例分裂细胞的组织如快速生长的肿瘤组织会有敏感反应。所用药剂有烷基化化合物如环磷酰胺(The Merck Index，第12版，第463页)、抗代谢物如氨甲蝶呤(The Merck Index，第12版，第1025页)、生物碱如长春新碱(The Merck Index，第12版，第1704页)、和抗生素如柔红霉素(The Merck Index，第12版，第479页)和阿霉素(TheMerck Index，第12版，第581-582页)。然而，由于巨大的副作用，所有这些药剂均有显著的缺点，以致在许多情况下仅是延迟而非阻止患者死亡。而且，变性的(癌)细胞对所用药剂具有抗性；在此情况下，常规药物不再具有任何抑制细胞的作用，但由于副作用它们是有毒的。而且，已经发现，细胞抑制剂的组合和/或相继使用超过单个细胞抑制剂(单一治疗)的作用，因此多化疗中的相当多副作用可以不发生累加。鉴于所有这些原因，亟需新的化疗剂并在全球范围对其进行研究。
因此，本发明涉及式(I)化合物的所有立体化学形式和这些形式的任何比例混合物及它们的生理可接受盐， 其中R1是糖基，R2是-COOH或-CH2-O-(R7)m，其中R7是糖基，且R3选自包含环氧化物的基团、C1-C6烷基、和C2-C6链烯基，其中所述烷基和链烯基任选地被至少一个OH基团取代，R5选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基和C2-C6炔基，R4、R6、R8和R10彼此独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、-X2H和-X2R12，或R4和R6一起和/或R8和R10一起是＝X2，X2是O、NH、N-C1-C6烷基、N-C2-C6链烯基、N-C2-C6炔基或S，R12是C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、芳基或酰基，且m和n彼此独立地是1或2。
在式(I)中
C1-C6烷基是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基和己基。
C2-C6链烯基是具有2至6个碳原子的直链或支链链烯基，例如丙烯基、丁烯基和戊烯基。
C2-C6炔基是具有2至6个碳原子的直链或支链链炔基，例如丙炔基、丁炔基和戊炔基。
芳基是芳香环结构，例如苯基、苄基或1-或2-萘基。芳基可以任选地被例如卤素如氯、溴、氟、被具有1-4个碳原子的烷基如甲基、被羟基、被具有1-4个碳原子的烷氧基例如甲氧基、和/或被三氟甲基取代。
酰基可以是脂肪族或芳香族酰基。脂肪族酰基具有1-7个碳原子，优选1-4个碳原子，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、己酰基、丙烯酰基、丁烯酰基、丙炔酰基，它还可以被例如卤素如氯、溴、氟、被氨基、和/或被具有1-4个碳原子的烷基氨基如甲基或乙基氨基基团取代。芳香族酰基可以例如是苯甲酰基或萘甲酰基，它还可以进一步被例如卤素如氯、溴、氟、被具有1-4个碳原子的烷基如甲基、被羟基、被氨基基团如例如乙基氨基、或被具有1-7个碳原子如1-4个碳原子的烷氧基如甲氧基取代。
糖(R1/R7)是单糖(n＝1)或二糖(n＝2)，其中两个单糖通过糖苷键连接。单糖可以是己糖(C6H12O6)，例如己醛醣如D-(+)-葡萄糖、D-(+)-甘露糖或D-(+)-半乳糖。单糖可以是彼此独立地被H、OH、NH2、NH(烷基)、N(烷基)2、烷基和烷氧基进行了单-、二-、或三-取代的，其中单糖的H和/或OH可以任选地被取代基代替。术语“糖”在本文中包括氨基糖。氨基糖是任选地按所述取代的单糖或二糖，其中该单糖或二糖的至少一个OH-或H-基团被氨基基团如NH2、NH(烷基)或N(烷基)2代替。
在一个实施方案中，m是1。
R7可以是式(II)的氨基糖基团 其中R13、R14、R16、R18、R20、R22、R24、R26和R28彼此独立地选自H、OH、NH2、NH烷基、N(烷基)2和烷氧基，其中烷基和烷氧基具有1至4个碳原子。
C1-C4烷基的例子有例如甲基、乙基、丙基、异丁基和丁基，尤其是甲基，C1-C4烷氧基的例子有例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基或丁氧基，尤其是甲氧基。
R7可以是式(IIA)的氨基糖 R1也可以是氨基糖。在一个实施方案中，n是2。
R1可以是式(III)的基团 其中R30至R60彼此独立地是H、OH、NH2、NH烷基、N(烷基)2、或O-烷基，其中烷基是C1-C4基团如甲基、乙基、丙基、异丁基和丁基，尤其是甲基，O-烷基是C1-C4烷氧基如甲氧基、乙氧基、异丙氧基或丁氧基，尤其是甲氧基。
R1在一个实施方案中具有式(IIIA) R3可以是包含环氧化物的基团。该包含环氧化物的基团可以是具有2至12个碳原子如2至6个碳原子的直链或支链烷基或烯基，其包含一或两个环氧环(环氧环(oxiranes))。可能的例子是 和 除了包含环氧化物的基团外，R3可以是具有1至12个碳原子如1至6个碳原子的直链或支链烷基例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、己基、及例如辛基、十二烷基，或具有2至12个碳原子如2至6个碳原子的直链或支链链烯基如丙烯基、丁烯基、戊烯基及十二碳烯基，其中这些烷基或链烯基还可以是单或多取代的，例如二或三取代的，如被羟基取代。
因此，本发明涉及式(IA)的pluraflavin A， 式(IB)的pluraflavin B， 和式(IE)的pluraflavin E 其中己糖I是2，6-二脱氧己醛糖，己糖II是2，3，6-三脱氧-3-二甲基氨基己糖和，且己糖III是2，3，6-三脱氧-3-氨基-3-甲基己醛糖；其所有立体化学形式和这些形式的任何比例的混合物，和它们的生理可接受盐。
在一个实施方案中，这些化合物选自式(IA)、(IB)和(IE)，其中己糖I是oliose，己糖II是紫红霉胺(rhodosamine)且己糖III是3-表万古胺(3-epi-vancosamine)。
根据本发明，式I化合物可以通过在适当条件下于培养基中培养(如发酵)放线菌目物种HAG 003959(DSM 12931)、或其变体或突变株，直到该培养基中存在至少一种式(IA)、(IB)和/或(IE)的pluraflavin来获得。随后可以从培养基中分离出这些pluraflavin并对其进行纯化，而且如果适当的话转化为化学衍生物和/或转化为它们的生理可接受盐。
本发明还涉及制备式I化合物的方法，其包含在适当条件下于培养基中培养(例如发酵)微生物放线菌目种HAG 003959(DSM 12931)、或其变体或突变株，直到培养基中存在至少一种式(IA)、(IB)和/或(IE)的pluraflavin；从培养基中分离出这些pluraflavin中的至少一种；和如果适当的话，转化为化学衍生物和/或生理可接受盐。
在一个实施方案中，菌株HAG 003959(DSM 12931)、其突变株和/或变体被培养在包含至少一种碳原子来源和至少一种氮原子来源及通常的无机盐的营养液(也称作培养基)中，直到培养基中出现至少一种新的pluraflavin；随后可以从培养基中分离出这些pluraflavin，并且如果适当的话，分离成单个活性成分。
培养可以在有氧条件下进行。培养可以在18至35℃范围的温度和在6至8范围的pH下进行。
在文献中，已描述了大量用于醌的化学衍生的反应。因此，本发明化合物的醌形式可以使用本身已知的化学反应来衍生。例如可以使用氢或使用金属氢化物如氢化铝或氢化硼催化还原成化合物的氢醌形式。再一个适当的例子是用羟胺或用其衍生物将醌转化成肟，而肟又可以进一步被化学转化。
因此，本发明涉及式(IV)的化合物的所有立体化学形式和这些形式的任何比例混合物；和它的生理可接受盐 其中R1、R2、R3和n的定义同上。
式(IVA)、(IVB)和(IVE)(见下)的pluraflavin衍生物分别来源于式(IA)、(IB)和(IE)，并且它们也形成本发明的一部分。
本发明还涉及式(IVA)的化合物 式(IVB)的化合物 和式(IVE)的化合物 的所有立体化学形式和这些形式的任何比例混合物，以及它们的生理可接受盐。
以下，例如在至少一个实施方案中，对本发明进行详细描述。
根据本发明的pluraflavin是由放线菌目物种，在一个实施方案中由放线菌目HAG 003959(DSM 12931)制备的。放线菌目种HAG 003959(DSM 12931)具有浅红色菌丝体并可以通过放线菌目所典型的分生孢子来鉴定。
微生物放线菌目种HAG 003959(DSM 12931)的分类学检查产生如下确定该菌株的结果通过气相色谱对重要脂肪酸进行的诊断性分析显示高比例的反异15∶0脂肪酸，异16∶0脂肪酸(异棕榈酸)，异17∶0脂肪酸(异十七酸)，反异17∶0脂肪酸(反异十七酸)和顺[9]18∶1脂肪酸(油酸)；和较低浓度的其它脂肪酸。该脂肪酸组成分布图使得放线菌目HAG 003959(DSM 12931)在分类学上被指定为Saccharothrix属。
该微生物的分离菌根据布达佩斯条约的规定于1999年7月16日保藏在德意志微生物保藏中心(Deutschen Sammlung vonMikorrorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascherorder Weg 1B，D 38124 Braunschweig，德国)，编号如下放线菌目种HAG 003959，DSM 12931。
代替菌株放线菌目种HAG 003959，DSM 12931，也可以使用可以合成至少一种根据本发明的pluraflavin化合物的其突变株和变体。这些突变株可以按本身已知的方式通过物理手段如用紫外线或X射线放射、或化学诱变剂如甲基磺酸乙酯(EMS)、2-羟基-4-甲氧基二苯酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)来产生。
根据本发明的方法可以用于实验室规模(毫升至升范围)或工业规模(立方米规模)的发酵。除非另行指出，所有的百分数均是以重量为基础。对于液体，除非另行说明，混合比例是以体积为基础。
在一个实施方案中，用于有氧发酵的碳原子来源是可同化的糖和糖醇，如葡萄糖、乳糖、蔗糖或D-甘露糖醇，和包含烃的天然产物如麦芽汁。用于培养的适当氮原子来源是氨基酸、肽和蛋白质及它们的降解产物如胨或胰蛋白胨、以及肉膏、酵母提取物、磨碎的种子如玉米、小麦、菜豆、大豆或棉花的种子、醇产物的蒸馏残余物、肉粉或酵母提取物、和铵盐和硝酸盐。包含在营养液中的无机盐可以例如是碱金属或碱土金属、铁、锌、钴和镁的氯化物、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐。
根据本发明的pluraflayin在如下培养基中形成，所述培养基包含约0.1至5％(如0.3至2％)葡萄糖以及0.2至5％(如0.5至3％)大豆粉和0.05％至2％(如0.2至1.0g/l)玉米浆和0.05至1.0g/l(如0.1至0.5％)碳酸钙和0.05至1.0g/l(如0.1至1.0g/l)氯化钠。在所有情况下百分数均是以整个培养基的重量为基础。
在此培养基中，放线菌目种HAG 003959(DSM 12931)产生pluraflavin的混合物。根据培养基的组成，至少一种根据本发明的pluraflavin的比例是可以改变的。而且，通过培养基的组成，可以控制各个pluraflavin的合成，以便微生物根本不产生其中的一种或多种pluraflavin，或产生的量低于检测界限。
在一个实施方案中，该培养物包含一种可检测的pluraflavin。在其它实施方案中，形成pluraflavin A、B或E。
除了pluraflavin A、B和E(分别是式(IA)、(IB)和(IE)的化合物)、其它相关化合物(由于其不同的糖基化而与式(IA)、(IB)和(IE)所代表的化合物不同)也可以在放线菌目种HAG 003959(DSM 12931)的培养基中形成。因此，检测到作为副产物的具有974Da分子量的其它pluraflavin(pluraflavin C)和692.77分子量的pluraflavin A降解产物C37H44N2O11。在后一化合物中，丢失己糖I；在酸性条件下，2，6-二脱氧己醛糖可以从pluraflavinA上通过水解被切除。
有氧培养该培养物，即例如将其浸没在摇瓶或发酵罐中进行摇动或搅拌，如果适当的话引入空气或氧。该微生物的培养可以在约18至35℃如约25至32℃(包括27至30℃)的温度范围中进行。pH通常应在6至8如6.5至7.5的范围。在这些条件下，该微生物一般培养24至300个小时如36至140个小时。
培养有利地在几个阶段进行，即首先在液体营养培养基中制备至少一个预培养物，然后将它例如以1∶10的体积比接种在实际的生产培养基即主培养基中。例如，可以通过将菌丝体接种在营养液中并允许其生长约36至120个小时如48至96个小时，获得该预培养物。菌丝体可以例如通过允许菌株在固体或液体营养培养基上如麦芽-酵母琼脂或燕麦粉琼脂上生长约3至40天如4至10天来获得。
发酵过程可以通过培养物的pH或菌丝体的体积、以及通过层析方法如薄层层析或高压液相色谱、或通过检测生物学活性来监测。在菌丝体和培养物的过滤物中均可以发现根据本发明的pluraflavin。该分离方法如下，一般用来纯化根据本发明的pluraflavin，例如纯化pluraflavin A、B和E。
从培养基中分离和/或纯化根据本发明的pluraflavin可以在考虑这些天然产物的化学、物理和生物学性质的情况下通过已知方法进行。为了测试培养基中或各个分离阶段中pluraflavin的浓度，可以使用薄层层析(例如使用氯仿/甲烷/冰醋酸/水混合物(如8∶1∶1∶0.2的比例)作为移动相在硅胶上进行的薄层层析)、或HPLC。在薄层层析分离过程中，可以例如使用染色试剂如α-萘酚/硫酸来进行检测，其中可以将形成的物质的量方便地与标准溶液比较。
根据本发明，pluraflavin可以从菌丝体或培养基分离。一般地，菌丝体通过常规方法最先从培养基中分离出来，随后使用任选地水可互溶的有机溶剂从细胞材料中提取出pluraflavin。有机溶剂相含有根据本发明的pluraflavin；如果适当的话，在减压下对它们进行浓缩和进一步纯化，见下述。
如果适当，将培养物滤液与菌丝体提取物的浓缩物混合，用适当水不混溶的有机溶剂如正丁醇提取。然后分离有机相，适当地，在减压下浓缩。为了使目的产品脱脂，将浓缩笏用本发明pluraflavin仅少量可溶的非极性溶剂如己烷、石油醚、二乙醚稀释。这造成pluraflavin沉淀，亲脂性杂质保持不溶，并通过常规固-液相分离除去。含有所有待分离pluraflavin的沉淀溶解于原体积1/30的水/甲醇。将沉淀完全溶解，并冻干。冻干物(以下称作粗产品)包含0.5-50％pluraflavin，用于进一步分离。
根据本发明的一或多种pluraflavin的进一步纯化通过在适当材料上，如在分子筛上，在正要载体如硅胶、氧化铝上，在离子交换树脂上或在吸附树脂上和/或反相介质(RP)上经层析进行。借助该层析，分离pluraflavin。pluraflavin的层析采用缓冲的水溶液或水溶液和有机溶液的混合物进行。
水溶液或有机溶液的混合物理解为浓度为10-80％溶剂，如40-60％溶剂的所有水互溶的有机溶剂如甲醇、丙醇和乙腈，或可与有机溶剂互溶的其它所有缓冲水溶液。可使用的缓冲剂可以是和如上所述的相同。
基于不同极性的pluralavin的分离可以借助反相层析，如在MCI(吸附树脂，来自Mitsubishi，日本)或Amberlit XAD(TOSOHAAS)上，在其它疏水材料上，如在RP-8或RP-18相上进行。而且，分离可借助正相层析例如在硅胶、氧化铝等上进行。
pluraflavin的层析可以使用缓冲的或酸化的含水溶液或含水溶液与乙醇或其它水可互溶有机溶剂的混合物进行。所有有机溶剂可以是丙醇和乙腈。
缓冲的或酸化的含水溶液应理解为是指例如水、磷酸缓冲液、乙酸铵、柠檬酸缓冲液，浓度从lmM至0.5M，以及甲酸、乙酸、三氟乙酸或本领域技术人员已知的所有商品酸，例如浓度从0.01至3％如从0.1％起。
层析可以使用起始于100％的含水缓冲液并终止于100％的溶剂的梯度进行；例如使用10-50％的2-丙醇或乙腈线性梯度。
或者，还可以在疏水相上进行凝胶层析或层析。
凝胶层析可以在聚丙烯酰胺或混合的聚合物凝胶上进行，例如Biogel-P2(Biorad)、Fractogel TSK HW40(Merck，德国或TosoHaas，美国)或在Sephadex(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上进行。
上述层析的顺序可以是反相的。
对于pluraflavin，另一个高效纯化步骤是结晶。pluraflavin可以在有机溶剂中从溶液中和从水和有机溶剂的混合物中结晶。可以以本身已知的方式，例如浓缩或冷却饱和的pluraflavin溶液，进行结晶。
根据本发明的pluraflavin在固体状态和具有3-8的pH的溶液(例如pH4至6)中是稳定的，并且由此可以将它们并入常规药物制剂中。
式(I)的pluraflavin和其化学衍生物可以通过本领域已知的方法转化成相应的生理可接受盐。
式(I)化合物的生理可接受盐应理解为是指它们的有机和无机盐，例如Remington氏药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第17版，第1418页(1985))中描述的那些。基于物理和化学稳定性及溶解性，钠、钾和铵盐尤其是酸性基团的可能实施方案；盐酸、硫酸、磷酸盐，或羧酸或磺酸盐如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸和对甲苯磺酸的盐尤其是碱性基团的可能实施方案。
本发明还包括式(I)化合物的如下明显化学对应物(本文又称作衍生物’)，它们具有轻微的化学差异，即具有相同的活性或可以在温和条件下被转化成根据本发明的化合物。所述对应物包括例如根据本发明的化合物的酯和醚、络合物及还原产物。
酯和醚衍生物以及还原产物可以通过文献，例如高等有机合成(Advanced Organic Synthesis)，第4版，J.March，John Wiley&Sons，1992中的描述方法来制备。例如，式(I)化合物的羧基基团(式IE，IVE)和羟基基团可以被转化成酯基或醚基。这些酯包括例如(C1-C4)烷基酯。这些醚包括例如该羟基基团的缩醛和酮。
式(I)化合物的稳定络合物可以使用生理可接受无机阳离子如钙或镁形成。
本发明包括式(I)化合物的所有立体异构形式。式(IA)、(IB)和(IE)化合物的不对称中心在所有的情况下可以彼此独立地具有S构型或R构型。包含环氧化物的基团的环氧可以在任何位置；例如并入碳原子2’和3’的环氧。本发明包括所有可能的对映体和非对映体，以及至少两种立体异构形式的任何比例混合物，例如对映体和/或非对映体的混合物。因此，本发明提供对映体纯形式、左旋和右旋对映体形式、R和S构型、外消旋物形式和两种对映体的任何比例混合物形式的对映体。如果有顺/反异构，本发明提供顺式形式和反式形式以及这些形式的任何比例混合物。
由于其有用的药学性质，根据本发明的化合物适合用作人类药物和/或兽药。它们具有抗生素活性，以及抗细菌作用、抗真菌即抑制真菌(包括植物致病真菌)的作用、抗原生动物和抗寄生虫性质。
根据本发明的化合物可以用于癌症，例如用作化疗剂。由于其抑制细胞的性质，例如其有利的抗肿瘤活性和抗微生物作用，它们可以用作例如动物和人类中恶性变性的细胞抑制剂。
对于发展出对常规药剂具有抗性的肿瘤细胞，仅新药剂具有治疗上足够的作用。因此，根据本发明的式(I)pluraflavin和其衍生物具有潜在的优良活性，甚至对于这些成问题的细胞类型也是如此。
本发明还涉及包含根据本发明的至少一种pluraflavin和/或其衍生物的药物制剂。pluraflavin可以和至少一种适合的辅助剂或赋形剂一起在混合物中使用。用于人类的赋形剂可以是所有可药用赋形剂和/或辅助剂。
本发明还涉及制备根据本发明的药物的方法，包括使用药学适合的和生理可接受的赋形剂以及如果适当的话还有适当的活性化合物、添加剂或辅助剂，将根据本发明的至少一种化合物制成适当的给药形式。
根据本发明的药物一般口服、局部或肠胃外给药，但也可以直肠给药。适合的固体或液体药物制剂形式有例如颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、悬浮液、气雾剂、滴剂或一次用量形式的针剂、和具有活性化合物缓释性质的制剂、在此制剂中赋形剂和添加剂和/或辅助剂，如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、助流剂或润滑剂、调味剂、增甜剂或稳定剂是常规使用的。可以提及的常用赋形剂或辅助剂有例如碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露糖醇和其它糖、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素和其衍生物、动物或植物油、聚乙二醇和溶剂如无菌水、乙醇、甘油和多元醇。
如果适当的话，可以将剂量单位微囊化用于口服给药以延缓释放或延长释放经过一个相对长的时间，例如通过将特定的活性化合物包被在或植入适合的聚合物，蜡等内。
药物制剂可以以剂量单位制成和给药，每个单位包含一定剂量的根据本发明至少一种pluraflavin化合物和/或其化学衍生物作为活性成分。每天，对于固体剂量单位如片剂、胶囊和栓剂，该剂量可以高达约200mg，但可以为约0.1至100mg，而对于一次用量形式的针剂溶液可以高达约200mg，但可以为约0.1至100mg。
给药的日剂量取决于哺乳动物患者的体重、年龄、性别和情况。然而，可能也需要较高或较低的日剂量。日剂量可以通过以单剂量单位或几个较小剂量单位的形式一次给药，或以细分的剂量形式按预定的间隔几次给药。
本发明在以下实施例中进一步举例说明。除非另行说明，百分数以重量为基础。对于液体，混合比例以体积为基础。
以下是本发明的举例说明性实施例，但不是对本发明范围的限制。
对于己糖II，所观察到的NOE效应利于手性中心1”、3”、4”、5”的相对立体化学RSSS或SRRR(见H-II)。相对立体化学 H-II.己糖II的相对立体化学对于不对称碳原子1、3、4、5，相同的相对立体化学(RSSS，SRRR)与检测到的己糖I的NOE是一致的(见H-I)。
相对立体化学 H-I.己糖I的相对立体化学
pluraflavin A的IC50≤50nM；pluraflavin B的IC50≤50nM；(b)pluraflavin A和flavopiridol对于所选肿瘤细胞系的抗增殖作用在溶解时通过活性线粒体中脱氢酶切割四唑环，MTT，一种水溶性四唑盐，会被转化成不溶性紫色甲。死细胞不能引起此改变。该方法被用于对增殖进行定量，以便确定潜在的化疗化合物的活性。
所有的细胞都维持在含有10％加热灭活的胎牛血清、青霉素/链霉素并补加有L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中。将细胞以下列密度接种在96孔组织培养板中胸 2500个细胞/孔前列腺 2500个细胞/孔结肠 1000个细胞/孔肺 1000个细胞/孔37℃、5％CO2下使细胞过夜贴壁。将pluraflavin A稀释在培养基中，具有以下最终浓度50.0，16.67，5.56，1.85，0.617，0.206，0.069，0.023μM。将flavopiridol稀释为2.0，0.667，0.222，0.074，0.025，0.008，0.003，0.001μM。两种化合物均在所有的浓度下测试三次。用新鲜培养基洗涤细胞并将化合物100μl终体积加入细胞中。使细胞与化合物一起37℃、5％CO2下孵育近72小时。在期望的时间点上，向每孔加入25μl MTT(10mg/ml，在HBSS中)。37℃孵育板子2-4小时。除去MTT和培养基，向每孔加入200μl DMSO。在570nM下读取数值。结果如下细胞pluraflavin A IC50flavopiridol IC50胸 ＜23nM 90nM前列腺 10nM 80nM结肠0.35nM 30nM肺 3.0nM90nM在软琼脂分析中，对白血病细胞测试pluraflavin A和flavopiridol。IC50结果是60nM(plufaflavin A)和0.5、0.6μM(flavopiridol)。
权利要求
1.所有立体化学形式和这些形式的任何比例混合物的式I化合物，以及其生理可接受盐和衍生物， 其中R1是糖基；R2是-COOH或-CH2-O-(R7)m，其中R7是糖基；R3选自包含环氧化物的基团、C1-C6烷基和C2-C6链烯基，其中所述烷基和链烯基任选地被至少一个OH基团取代；R5选自H原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基和C2-C6炔基；R4、R6、R8和R10彼此独立地选自H原子，C1-C6烷基，C2-C6链烯基，C2-C6炔基，-X2H基团，其中H直接与X2的第一个原子键合，和-X2R12，其中R42直接与X2的第一个原子键合，并且任选地R4和R6一起是双键-X2基团，任选地R8和R10一起是双键-X2基团，其中所有的X2均独立地选自氧原子、-NH基团、-N-C1-C6烷基、-N-C2-C6链烯基、-N-C2-C6炔基和硫原子，其中所有的R12均独立地选自C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、芳基和酰基；且m和n彼此独立地选自1和2。
2.根据权利要求1的化合物，其中R7是氨基糖。
3.根据权利要求1或2的化合物，其中R7具有下式
4.根据权利要求1-3之任一项的化合物，其中n是2。
5.根据权利要求1-4之任一项的化合物，其中R1是氨基糖。
6.根据权利要求1-5之任一项的化合物，其中R1具有下式
7.根据权利要求1-6之任一项的化合物，其中R3选自以下基团 和
8.具有式(IA)的根据权利要求1的所有立体化学形式和这些形式任何比例混合物的化合物，以及其生理可接受盐和衍生物
9.具有式(IB)的根据权利要求1的所有立体化学形式和这些形式任何比例混合物的化合物，以及其生理可接受盐和衍生物
10.具有式(IE)的根据权利要求1的所有立体化学形式和这些形式任何比例混合物的化合物，以及其生理可接受盐和衍生物
11.权利要求1-10之任一项的式(I)化合物，其可以通过以下方式获得在适当条件在培养基中培养放线菌目物种HAG 003959，DSM12931，或其一种变体或突变株，直到培养基中存在至少一种式(I)化合物，随后分离该化合物。
12.根据权利要求11的化合物，其中所述分离的化合物进一步转化成选自衍生物和生理可接受盐的至少一种化合物。
13.组合物，其包含至少一种根据权利要求1-12之任一项的式(I)化合物、或生理可接受盐或衍生物，以及可接受载体。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述可接受载体是可药用载体。
15.制备至少一种权利要求1-10之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐的方法，包括在适当条件在培养基中培养微生物放线菌目物种HAG 003959，DSM 12931，或其一种变体或突变株，直到培养基中存在至少一种式(I)化合物，随后分离该化合物。
16.根据权利要求15的方法，其中所述分离的化合物进一步转化成选自衍生物和生理可接受盐的至少一种化合物。
17.根据权利要求15或16的方法，其中培养在有氧条件下在18至35℃之间的温度下在6至8的pH下进行。
18.根据权利要求15-17之任一项的方法，其中使用还原剂将式(I)化合物转化成衍生物。
19.根据权利要求1-12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物，用于抑制至少一种双链核酸转录。
20.根据权利要求1-12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物在制备细胞抑制剂中的用途。
21.根据权利要求1至12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物在制备治疗结肠肿瘤的药物中的用途。
22.根据权利要求1至12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物在制备治疗乳腺(乳房)肿瘤的药物中的用途。
23.根据权利要求1至12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物在制备治疗肺肿瘤的药物中的用途。
24.根据权利要求1至12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物在制备治疗前列腺肿瘤的药物中的用途。
25.根据权利要求1至12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物在制备治疗白血病的药物中的用途。
26.根据权利要求1至12之任一项的式(I)化合物或其生理可接受盐或衍生物在制备治疗微生物感染的药物中的用途。
27.放线菌目物种(Actinomycetales species)HAG 003959(DSM12931)
全文摘要
本发明涉及式(I)化合物和其生理可接受盐，其中R
文档编号A61P11/00GK1404484SQ01805207
公开日2003年3月19日 申请日期2001年2月15日 优先权日2000年2月18日
发明者L·弗泰斯, K·埃利希, M·克瑙夫, J·温克, F·P·巴伯纳, E·A·鲍尔斯, E·A·卡什曼 申请人:阿文蒂斯药物德国有限公司