专利名称：Rel蛋白和类固醇受体对调节元件的协同激活作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定在最近揭示出的由类固醇受体和Rel蛋白协同作用激活调节元件的新机制中起调节作用的化合物的方法。本发明还涉及用核酸转染的细胞，和这些细胞在鉴定能调节在调节元件控制下的基因表达水平的化合物的分析中的应用，以及由上述分析鉴定出的化合物的医药用途。
转录激活蛋白核因子-κB(NF-κB)/Rel家族的成员与其抑制蛋白(I-κB)密切相关，并驻留于细胞质中。它们可以由促炎细胞因子诱导，并在免疫和炎症过程中起重要作用，因为它们指导化学引诱物、细胞因子(包括NF-κB诱导的细胞因子本身)、细胞因子受体和细胞粘附分子的转录。诱导时，rel蛋白二聚体化、迁移到核，并在那里它们通过其靶基因启动子中的NF-κB结合基元激活这些基因。对不同NF-κB二聚体识别的DNA序列的检测显示对于现有的rel蛋白二聚体结合物优选的靶位点略有不同(Chen et al.，-Nature Struct.Biol.567-73，1998；Kunsch et al.，Mol.Cell Biol.124412-4421，1992；Parry和Mackman，J.Biol.Chem.26920823-20825，‘94)，也解释了在多种启动子中鉴定出的NFκB应答元件的广泛变异。
Rel蛋白的二聚体化和核转位受许多试剂的诱导，包括细菌和病毒病原体，免疫和炎症细胞因子和多种可损害细胞的试剂。已发现这一转录因子家族与类固醇受体，如雌激素和糖皮质激素相互作用导致靶基因的抑制，因此甚至更多的基因呈现为Rel蛋白激活作用的靶子。
雌激素和其他类固醇激素对中枢神经系统有强烈的作用(1)。具体地说，雌激素调节脑5-羟色胺系统的能力表明雌激素在与抑郁及其治疗相关的机制中起作用(2，3)。但是，由于ER表达分布广泛，雌激素还具有几种其他的有益作用，包括防止动脉粥样硬化、早老性痴呆和骨质疏松并不令人奇怪。为了限制副作用，如用雌激素进行治疗提高了患乳腺和子宫内膜癌的危险性，人们投入了相当的努力去寻找组织选择性的ER-结合化合物。
除了雌激素，人们对于其他类固醇受体的组织选择性作用同样感兴趣。同样对那些类固醇受体，对于唯一靶向一组组织或器官(如脑，对精神病)的化合物的研究由于大多数类固醇受体广泛的组织分布而受到阻碍。因此，人们对以组织选择性的方式筛选类固醇受体-介导的作用的试验相当感兴趣。
已知雌激素作用是由两个属于核激素受体超家族的雌激素受体(ERα和β)介导的(15-18)。这两个ERs共有一种非常保守的模块化的结构。虽然DNA结合结构域在ERα和β之间是非常保守的(96％同一性)，且配体结合结构域相对也很保守(58％同一性)，但上述两受体的A/B区域之间保守性很低(20％同一性)。配体结合时，经激活的受体二聚体化并与定位于靶基因调节区的称为雌激素应答元件(EREs)的特定DNA序列相互作用。所述的DNA结合受体即可对转录进行正或负的调节。已知对于ERα，所述的转录调节是通过两个反式激活区域定位于A/B结构域的AF-1和定位于配体结合结构域的AF-2介导的。上述两个反式激活区域根据细胞和启动子邻近序列的不同可以独立地或协同地行使功能(19，20)。最近发现了一些雌激素调节靶基因的其它机制。这包括利用调节元件作为ER作用靶序列的基因(21)，或ER通过与相结于它们各自的DNA结合位点，如AP-1和Sp 1的其它转录因子相互作用进行调节的基因(22-23，36-38)。
我们在这里报道所发现的一种机制，其中NF-κB和类固醇受体家族的成员通过与多种调节元件相互作用协同激活基因表达。这种协同激活到目前尚未见报道，但是有许多报道涉及Rel蛋白和类固醇受体的相互抑制作用。这一新发现的机制为研究调控调节元件表达的化合物提供了必要的工具。取决于所述的调节元件，此种化合物可以通过普遍存在的类固醇受体发挥作用，以及提供一种组织选择性的应答。
作为第一个实例，我们研究了雌激素调节5-羟色胺系统的分子机制。更具体地说，我们研究了雌激素对5-HT1A受体基因的作用。5-羟色胺(5-羟色胺，5-HT)参与对多种行为的控制作用(4)。据认为5-羟色胺系统的调节异常在神经精神病，如忧郁和焦虑中起重要作用(5，6)。5-羟色胺的复杂活动是由相关受体大家族介导的(7)。其中特别的关注集中于5-HT1A受体，其是一种对腺苷酸环化酶进行负调节的G蛋白偶联受体(8)。所述的5-HT1A受体以限制性的方式在脑中表达，在脑的边缘区、小脑皮层和核缝区域观察到了高水平的受体(9-11)。这里我们示出ERα与NF-κB协同作用激活5-HTA受体启动子。此种激活在无激素存在下已经存在，可进一步通过添加17β-雌二醇(E2)或4-羟三苯氧胺(OH-T)进行诱导，但ICI 164384不起作用。ERβ也能够介导这种作用，但在这一实例中ERα的作用更为突出。而且我们发现这种协同激活依靠NF-κB的p65亚基的反式激活结构域和ERα包含AF-1的A/B结构域。我们的发现表明雌激素可以通过包括NF-κB与ER协同激活作用的新机制调节5-HT1A受体的表达。
令人惊讶的是发现了，相同的协同作用在由NF-κB和类固醇受体例如盐皮质激素受体(MR)对E-selectin启动子的激活作用中起重要作用。这在图7和下文中进行详细描述。鉴于与NF-κB通过调节元件的协同作用并不仅限于ER，对于MR也观察到了类似的作用，则可以预期对于其它类固醇受体也有相似的结果。
本发明为设计用于鉴定对新发现的机制具有调节作用的化合物的筛选试验提供了可能。例如，由于5HT1A受体仅存在于脑组织，E-Selectin仅由内皮细胞表达，在这些试验中所发现的配体可特定性地用于治疗CNS疾病和/或心血管疾病，而且允许对以组织选择性的方式起作用化合物进行鉴定。除去那些靶向其它组织的配体的试验是本领域技术人员已知的。
在本研究中，我们还显示出5-HT1A受体的顺式调节区含两个推定的NF-κB结合位点并且NF-κB蛋白的存在是通过ER协同诱导所必须的。这表明NF-κB复合物与ER一起协同调节5-HT1A受体基因表达。在到目前为止所研究的大多数系统中，雌激素和NF-κB信号途径是相互拮抗的。例如，IL-6启动子的调节已被详细研究过，雌激素可以明显地抑制由NF-κB-诱导的这一基因的激活(33，34)。与这些发现一致，我们已经示出雌激素在人工的NF-κB报道构建体和E-selectin启动子上(图7)抑制NF-κB活性。但是在5-HT1A受体启动子上雌激素进一步提高NF-κB诱导的活性，表明雌激素的正负调节依启动子邻近序列的不同而不同。
ERα和ERβ的DNA结合结构域表现出很高的同源性，两者的配体-结合结构域具有中等程度的同源性，而这两个受体的A/B区域间同源性很低。通过几种不同方法的研究表明，NF-κB和ER对5-HT1A受体启动子的协同激活作用依赖于ERα包含AF-1的N-末端区域。首先用ERα的A/B区域替代ERβ的A/B区域(ERα/β)形成嵌合受体，其比野生型的ERα对5-HT1A受体启动子的激活作用更强。但是用ERβ的A/B区域替代ERα的A/B区域(ERβ/α)几乎完全破坏了上述受体对启动子的协同激活能力。第二，将ERα1-339(一种AF-2缺陷突变体)的协同激活作用可与野生型的ERα相比，同时将ERα121-599(一种AF-1缺陷突变体)的作用可与野生型ERβ相比较。第三，与ERα相比，ERβ介导这种协同作用的效果要小得多。第四，仅封闭AF-2的部分抗-雌激素OH-T与E2在对5-HT1A受体启动子的激活能力相同。最近报道AF-1-介导的抗-雌激素拮抗作用是由ERα的A/B区域而非ERβ的A/B区域介导的(28)。ERα和ERβ的这些差异表明这两种ER亚型的调节功能是不同的。总的看来，这些资料表明显然是ERαAF-1参与5-HT1A受体启动子的调节作用。
我们的发现清楚地表明NF-κB复合物和NF-κB结合位点在由ER对5-HT1A受体启动子协同激活中的关键作用。但是，所述的两NF-κB元件在-901luc构建体中的突变破坏了NF-κB的作用而ER的作用仍然存在。一种可能的解释是NF-κB蛋白以单体的形式与这些突变的κB元件相结合。这一NF-κB-DNA复合物以此种构象不能激活转录，该复合物可能被ER稳定，并可能是与其它在5-HT1A受体基因启动子中的有关基因序列一起进一步导致激活作用。而且，通过使用突变体和嵌合体说明，尽管需要ERα的功能性的DNA结合结构域，ERα对ERE报告基因和5-HT1A受体启动子的活性之间并没有明显的相关性。因此，对5-HT1A受体启动子的协同激活作用最有可能的解释是ER对这一启动子的激活并不是通过直接与DNA相结合，而是通过蛋白-蛋白之间的相互作用进行的。这一模型得到下述事实的支持协同激活作用既需要ERα的DNA-结合结构域，同时也需要p65完整的RHD，由于如上所述ERα直接与p65相互作用，涉及ERα的DNA-结合结构域和p65的RHD(34)。而且，p65的反式激活结构域和ERα的AF-1对于这一应答都是至关重要的。因此，这一结果表明ER与NF-κB复合物协作通过AF-1将共同激活剂补充到复合物中，进而协同激活5-HT1A受体启动子。
除了这种经典的激素激活途径之外，也有报道其他信号转导途径对多种类固醇受体，包括ERα，进行调节而不依赖于激素配体。已显示核受体通过磷酸化作用被非类固醇试剂如，多巴胺，生长因子和PKA激活剂所激活(39)。ERα的磷酸化作用可以提高受体的活性，主要的磷酸化位点位于受体的A/B区域(40，41)。最近证明ERB AF-1的磷酸化作用调节辅因子的募集和通过非类固醇激活剂对基因的激活作用(42)，过氧化物酶体增殖剂激活的受体γA/B结构域的磷酸化作用降低了其转录活性(43)。在ERα和ERβ的A/B区域内的几个激酶位点的存在表明由不同的激活剂对AF-1结构域的不同磷酸化作用可能引起多种的受体应答。该附加途径的存在强调了AF-1在不依赖激素的受体激活作用中的重要性。
几项证据表明雌激素还可能在CNS中调节5-HT1A受体的表达。例如，分娩前和绝经开始时雌激素的下降与负作用相关(44)，有时雌激素的替代治疗可减轻妇女的忧郁和焦虑(45，46)。而且卵巢切除术引起5-HT结合和5-HT转运蛋白结合位点的减少(12-14)，而对卵巢切除的大鼠补充雌激素可以逆转这种下降。在脑的多个区域包括皮层，海马和缝核检测到了ERα和ERβ(47)。另外，已有NF-κB在脑，特别是皮层和海马中具有活性的描述(48)。同时有证据表明NF-κB不仅在免疫细胞中有功能，在如神经原塑性，神经变性和神经发育过程中也有独特的作用(49)。因此，这些转录因子和途径在调节脑中5-HT1A受体基因表达起重要作用。雌激素调节5-羟色胺受体功能的能力至少部分构成该激素对心境和精神状态的突出作用的基础。
对于E-selectin启动子也发现了类固醇受体和Rel蛋白之间的协同激活作用。为确定盐皮质激素对E-selectin启动子活性的作用，我们用含部分E-selectin启动子的虫荧光素酶报告基因构建体和编码MR的表达载体瞬时转染U-2 OS细胞。如图7A所示，IL-1β诱导的启动子活性由MR以协同的方式激活。这一在MR存在下由NF-κB诱导的E-selectin启动子活性可通过添加醛固酮(aldosteron)进一步加强。用不含E-selectin启动子的虫荧光素酶载体进行重复实验证明了这一机制的选择性。没有观察到IL-1β和/或MR的作用(图7B)。
有趣的是，如果用ERα代替MR进行共转染则没有观察到任何对E-selectin启动子活性的协同作用。相反，在这样的条件下，配体不存在时IL-1β诱导的启动子活性受到ERα的抑制，添加17β-雌二醇可进一步加强这种作用(图7C)。这一结果再次表明配体激活的类固醇受体与NF-κB’s的协同作用依赖特定的启动子邻近序列和特定的类固醇受体-启动子组合的选择性。
所述的E-selectin启动子包含多个NF-κB共有位点(Collins，T.，Williams，A.，Johnston，G.I.，Kim，J.，Eddy，R.，Shows，T.，Gimbrone，M.A.，Bevilacqua，M.P.(1991)J.Biol. Chem.2662466-2473)，其很有可能负责盐皮质激素对E-selectin启动子的协同作用。NF-κB在与MR的上述协同作用中所起的作用通过下述实验得到确证，在该实验中用3*NF-κB-TK报告基因，一种在TK启动子前包含3个拷贝的共有NF-κB结合位点的合成构建体，检测了盐皮质激素的作用(图7D)。图7D中所示的数值范围表明合成的3*NF-κB-TK报告基因对IL-1β的刺激和MR的协同作用都更为敏感。由于这一报告基因包含多个重复的NF-κB应答元件所以这一结果并不令人惊讶。rel蛋白和MR的协同作用并没有通过添加醛固酮(aldosteron)而进一步加强，这可能是由于在缺乏醛固酮(aldosteron)时IL-1β和MR之间存在大的协同作用。在缺乏IL-1β时MR和ER能够诱导或抑制启动子活性的发现(参见图7A，C和D第三和第四杠)表明U-2 OS细胞在缺乏细胞因子时具有组成型的NF-固κB活性。或者，U-2 OS可能自身产生细胞因子或在细胞生长的血清中得到细胞因子活性。尽管不能排除还有其他类型的转录因子参与E-selectin启动子和3*NF-κB-tk报告基因的调节(Kaszubska，W.，Hooft van Huijsduijnen，R.，Ghersa，P.，DeRaemy-Schenk，A.-M.，Chen，B.P.，Hai，T.，Delamarter，J.F.，Whelan，J.Mol.Cell.Biol.137180-7190)，上述结果至少表明NF-κB’s通过盐皮质激素对这些启动子-报告基因的激活起着至关重要的作用。如上所述的ERα和MR之间对IL-1β诱导的Rel蛋白协同或拮抗作用的区别，可能是由于包含ERα或MR和不同类型的NF-κB’s的复合物的差异活性造成的。另外，本研究表明不同类型的核受体可与NF-κB’s一起对NF-κB应答启动子起协同作用。这一作用的确切本质明显依赖于类固醇受体类型和启动子性质的组合。
描述了本发明几种特定的实施方式后，显然本领域的技术人员能够选择其它可由Rel蛋白和类固醇受体协同激活的调节元件。简要地说这最好是通过下述方式进行将待研究的特定的调节元件与报告基因功能性偶联，与编码Rel蛋白和类固醇受体的表达载体共转染。具体说来，编码NF-κB和类固醇受体的表达载体适用于这一目的。所述的类固醇受体可以是ERα或MR，也可以是ERβ或ERα和ERβ的组合。所述的实施例提供了进一步筛选能够依照本发明协同激活的调节元件的必要工具。
Rel蛋白和类固醇受体相互作用以协同激活调节元件的新机制的发现，为筛选与这一新机制相互作用的化合物提供了可能。本发明的一个方面涉及鉴定能够调节类固醇受体和Rel蛋白对调节元件协同作用的化合物的方法，该方法包括下述步骤提供含能被类固醇受体和Rel蛋白协同激活的调节元件的细胞，所述的细胞另外含有足够水平的所述类固醇受体和所述Rel蛋白或其功能等价物使调节元件的协同激活作用得以进行，
将所述细胞与至少一种化合物接触，确定是否所述调节元件的激活作用受该化合物的调节。
能够调节类固醇受体和Rel蛋白协同作用的化合物可以是刺激或抑制这一作用的化合物。在实施例部分给出了能够刺激某些类固醇受体和Rel蛋白对5-羟色胺1A受体启动子或E-selectin启动子协同作用的已知化合物的例子。
在这一方面，Rel蛋白的功能等价物理解为Rel结构域具有同源性且参与基因调节作用的Rel家族蛋白复合物(Liou和Baltimore，Current Opinion in Cell Biology，5477-487，1993)，它们包括但不限于NF-κB1，Lyt-10，cRel RelA和RelB。还包括NF-κB的功能等价物，其保留特定的生物学功能，优选至少含反式激活结构域及NF-κB的DNA结合结构域的片段。
“调节元件”或“启动子”是指在细胞中能直接或间接与RNA聚合酶相结合并起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA序列。
启动子可以与能够显示调节元件激活的异源报告基因相连接。在这样的构建体中启动子影响自异源基因的转录。合适的报告基因例如虫荧光素酶，氯霉素乙酰转移酶，β半乳糖苷酶和分泌的胎盘碱性磷酸酶。
在此方面ER的功能等价物理解为至少含ERα的AF-1反式激活区域与ERα的DNA结合结构域的ER片段。
所用术语“功能等价物”一般理解为能够行使与所述分子相同生物学功能的分子。
细胞中类固醇受体和Rel蛋白的水平要足以执行对调节元件的协同激活作用。这可以通过选择能够组成型表达足够水平的类固醇受体和Rel蛋白，或在其中通过添加合适的因子诱导类固醇受体和Rel蛋白表达的合适细胞实现。或者，所述的类固醇受体和Rel蛋白可以用合适的重组DNA载体和本领域已知的方法转染到所述细胞中。
在一优选的实施方式中，本发明涉及上述的方法，其中，所述的类固醇受体选自雌激素受体α，雌激素受体β和/或盐皮质激素受体或其功能等价物。
在另一优选的实施方式中，本发明涉及上述的方法，其中，所述的Rel蛋白选自NF-κB，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等价物。
在另一优选的实施方式中，本发明涉及上述的方法，其中，所述的调节元件是5HT1-A受体基因的启动子或其功能等价物。
在再一优选的实施方式中，本发明涉及上述的方法，其中，所述的调节元件是E-selectin基因的启动子或其功能等价物。
在又一优选的实施方式中，本发明涉及上述方法，其中，所述的细胞被能够显示调节元件激活的报告基因转染。
本发明还涉及被含5HT1A受体基因启动子的核酸或其功能等价物转染的细胞，所述细胞进一步包括能够在所述细胞中功能性表达类固醇受体或其功能等价物的编码类固醇受体的核酸，还包含能在所述细胞中功能性表达所述Rel蛋白的编码Rel蛋白或功能等价物的核酸。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中，所述的类固醇受体选自雌激素受体α，雌激素受体β和/或盐皮质激素受体或其功能等价物。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中，所述的Rel蛋白选自NF-κB，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等价物。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中，所述的细胞被能够显示5HT1A受体基因启动子激活的报告基因转染。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中，所述细胞被含5HT1A受体基因启动子的核酸和/或编码类固醇受体的核酸和/或编码Rel蛋白的核酸或其功能等价物所转染。
本发明进一步涉及被含E-selectin基因启动子的核酸或其功能等价物转染的细胞，所述的细胞进一步包含能够在所述细胞中功能性表达所述类固醇受体或其功能等价物的编码类固醇受体的核酸，还包含能在所述细胞中功能性表达Rel蛋白的编码Rel蛋白或功能等价物的核酸。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中，所述的类固醇受体选自雌激素受体α，雌激素受体β和/或盐皮质激素受体或其功能等价物。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中所述的Rel蛋白选自NF-κB，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等价物。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中，所述的细胞被能够显示E-selectin基因受体启动子激活的报告基因转染。
本发明进一步涉及依照本发明产生的细胞，其中，所述细胞被含E-selectin基因启动子的核酸和/或编码类固醇受体的核酸和/或编码Rel蛋白的核酸或其功能等价物所转染。
本发明进一步涉及上述细胞在鉴定在脑中调节5-羟色胺受体水平的化合物中的应用。本发明还涉及用上述方法鉴定的化合物用作药物。
本发明还涉及用上述方法鉴定的化合物在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
在一优选的实施方式中，调节类固醇受体和Rel协同作用的化合物不影响那些Rel蛋白或类固醇受体独立影响调节元件的机制。这些化合物提供了一种选择性，这种选择性是所述化合物在临床应用中非常希望的。
图2.κB元件在由NF-κB和人ERα对5-HT1A受体启动子的调节中的重要性。(A)图解表示所用的含大鼠5-HT1A受体(5-HT1AR)启动子缺失的虫荧光素酶(luc)报告基因构建体。两个空心的圆圈(0)代表NF-κB结合位点。(B)用所示的不同报告基因构建体连同空表达载体或编码NF-κB p50和p65亚基的表达载体(白杠)混和编码ERα的表达载体(阴影杠)瞬时转染COS-1细胞并用10-8M E2处理24小时(黑杠)。描述了由NF-κB对用空表达载体转染的细胞引起虫荧光素酶活性的诱导。杠代表至少三次独立实验的平均值±S.D。
图3.OH-T，而非ICI能够通过NF-κB和人ERα提高5-HT1A受体启动子的活性。(A)用-901luc报告基因构建体连同空表达载体或编码NF-κB p50和p65亚基的表达载体混和编码ERα的表达载体瞬时转染COS-1细胞，并用E2、OH-T或ICI处理细胞24h。描述了由NF-κB对用空表达载体转染的细胞引起虫荧光素酶活性的诱导。杠代表至少三次独立实验的平均值±S.D。
图4.由NF-κB和人ERα对5-HT1A受体启动子的协同激活作用需要p65的反式激活功能。用-901luc报告基因构建体连同空表达载体或如所示编码p50，p65，p65RHD或p65Nsi的表达载体(白杠)混和编码ERα的表达载体(阴影杠)瞬时转染COS-1细胞，并用10-8M E2处理24小时的(黑杠)。描述了由NF-κB亚基对用空表达载体转染的细胞引起虫荧光素酶活性的诱导。杠代表至少三次独立实验的平均值±S.D。
图5.由小鼠ERα对5-HT1A受体启动子的协同激活作用以不依赖AF-2的方式出现。(A)用-901luc报告基因构建体连同空表达载体或编码NF-κB p50和p65亚基的表达载体混合编码小鼠ERα，ERβ，ERα121-599，ERα 1-339或ERα C241/244A的表达载体瞬时转染COS-1细胞。所述细胞或未经处理(阴影杠)或由10-8M E2处理24小时(黑杠)。描述了由NF-κB对用空表达载体转染的细胞引起虫荧光素酶活性的诱导。杠代表至少三次独立实验的平均值±S.D。(B)用3xERE-TATAluc连同空表达载体或编码小鼠ERα，ERβ，ERα 121-599，ERα 1-339或ERα C241/244A的表达载体瞬时转染COS-1细胞。所述细胞或未经处理(阴影杠)或由10-8M E2处理24小时(黑杠)。描述了由ER对用空表达载体转染的细胞引起虫荧光素酶活性的诱导。杠代表至少三次独立实验的平均值±S.D。
图6.ERα的A/B结构域对5-HT1A受体启动子的协同激活至关重要。(A)用-901luc报告基因构建体连同空表达载体或编码NF-κB p50和p65亚基的表达载体混和编码人ERα，ERβ，ERα/β或ERβ/α的表达载体瞬时转染COS-1细胞。所述细胞或未经处理(阴影杠)或由10-8M E2处理24小时(黑杠)。描述了由NF-κB对用空表达载体转染的细胞引起虫荧光素酶活性的诱导。杠代表至少三次独立实验的平均值±S.D。(B)用3xERE-TATAluc混合空表达载体或编码人ERα，ERβ，ERα/β或ERβ/α的表达载体瞬时转染COS-1细胞。所述细胞或未经处理(阴影杠)或由10-8M E2处理24小时(黑杠)。描述了由ER对用空表达载体转染的细胞引起虫荧光素酶活性的诱导。杠代表至少三次独立实验的平均值±S.D。
图7由NF-κB’s分别与MR或ERα协同激活或反式抑制E-selectin启动子。(A)用E-selectin启动子-报告基因瞬时共转染U-2 OS细胞，并测定了IL-1β，共转染MR或IL-1β与MR的结合在0.1μM醛固酮(aldosteron)存在或不存在时的效果。(B)用不含ELAM启动子的虫荧光素酶-报告基因瞬时转染U-2 OS细胞，并测定了IL-1β，共表达MR或IL-1β与MR的结合在0.1μM醛固酮(aldosteron)存在或不存在时的效果。(C)用E-selectin启动子-报告基因瞬时转染U-2 OS细胞，并测定了IL-1β，共转染ERα或IL-1β与ERα的结合在0.1μM 17β-雌二醇存在或不存在时的效果。(D)用合成的3*NF-κB-tk启动子报告基因瞬时共转染U-2 OS细胞，并测定了IL-1β，共转染MR或IL-1β与MR的结合在0.1μM醛固酮(aldosteron)存在或不存在时的效果。结果用与未经处理的细胞(每图中的第一杠)相比的诱导倍数表示。所有的值用二次重复±S.D表示。注意A，B，C与D相比标度上的区别。
细胞培养物。猴COS-1细胞和人293胚胎肾细胞得自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，MD)用以1∶1混合的DMEM和Ham’sF-12培养基(DF；Life Technologies Inc.)培养，所述培养基用碳酸氢盐缓冲并添加了7.5％FCS。如先前所述，用葡聚糖包被的炭处理FCS去除类固醇以制备葡聚糖包被的炭(DCC)-FCS(25)。
质粒。-901luc是通过下述步骤获得的用StyI部分酶切由Dr.O.Meijer(Leiden，the Netherlands)惠赠的-1588luc，补平并连接到用SmaI消化的pGL3中，用HindIII再消化并再连接；-81luc是通过下述方式获得的用StyI部分酶切-1588luc，补平，再用BglII消化后连接到用SmaI/BglII消化的pGL3中；-901 365Mluc和-90164Mluc是通过向原始的启动子构建体中通过分别用寡核苷酸5’-gagccgaattctacagactaa-3’和5’-aactgcaaggagatctacatcgcccctcg-3’进行定点诱变引入点突变构建的。-901 365/64Mluc是通过用SacII/HindIII消化-901 64Mluc再连接到用SacII/HindIII消化的-901 365Mluc中而构建的；-81 64Mluc是通过用StyI部分酶切-90164Mluc后再连接构建的。CMV4表达载体包含编码人p65(RelA)，p50(NF-κB)和p65RHD(1-305)，p65Nsi(1-551E39I)的全长cDNAs，先前已有描述(26，27)。编码人ERα(pSG5-HEGO)和人ERβ(pSG5-ERβ530)的表达载体分别由Dr.Chambon(Strasbourg，法国)和Dr.Gustafsson(Stockholm，瑞典)惠赠。嵌合的人ERα/ERβ和ERβ/ERα受体已有描述(28)，在ERα/ERβ嵌合体中含ERα的A/B结构域和ERβ的结构域C，D，E，F，在ERβ/ERα嵌合体中含ERβ的A/B结构域和ERα的结构域C，D，E，F。小鼠ERα(pMT2MOR)，ERα 1-339，ERα 121-599和ERα C241/244A(29)是由Dr.Parker(Londen，UK)惠赠的。所用的报告基因质粒4xNF-κB(HIV)tkluc和3xERE-TATA-luc原先已有描述(30，31)。
瞬时转染。在24-孔培养板中添加了5％DCC-FCS的DF+中培养COS-1细胞和293细胞以进行瞬时转染。0.4ug虫荧光素酶报告基因，0.6ug PDMlacZ和0.2ug指明的表达质粒与磷酸钙共沉淀对细胞进行转染。添加pBluescript SK-达到总量1.8ug DNA/孔。16小时后，更新培养基并添加指示激素。24小时后收获细胞，依生产商提供的方法用Luclite虫荧光素酶报告基因基因分析试剂盒(PackardInstruments，CT)和Topcount液闪记数器(Packard Instruments，CT)分析虫荧光素酶活性。通过测定β-半乳糖苷酶活性校正数值确定转染效率(32)。
实施例2由NF-κB和ER对5-HT1A受体启动子的协同激活作用。
为确定雌激素对5-HT1A受体启动子活性的作用，我们用含5-HT1A受体启动子的报告基因构建体混合编码ERα或ERβ的表达载体瞬时转染COS-1细胞。如
图1A所示，ERα或ERβ的共转染和用17β-雌二醇(E2)处理细胞都几乎对5-HT1A启动子的活性不起作用。但是，除了直接调节之外，还可以通过ER与其它转录因子的相互作用对ER靶基因进行间接调节。已表明推定的NF-κB结合位点存在于-901luc 5-HT1A受体启动子构建体中(参见图2A)，且用这一报告基因构建体与编码NF-κB的p50和p65亚基的表达载体转染可导致该报告基因10倍的诱导。有趣的是，ERα混合NF-κB的共转染目前导致启动子活性很大程度的诱导，且可以通过添加E2进一步提高(图1A)。与ERα相反，当ERβ与NF-κB共转染时表现很小的诱导性，且没有观察到任何E2的作用。虽然与COS-1细胞相比由ERα的激活水平略低，但对293细胞也观察到了类似的结果(结果未示出)。这些结果表明5-HT1A受体启动子可由NF-κB和ER协同激活。过去已有几个研究组报道了雌激素对NE-κB活性的抑制作用(33-35)。因此我们也研究了雌激素对包含在与虫荧光素酶偶联的胸苷激酶启动子前的四个来自HIV-LTR的NF-κB元件的报告基因构建体混合编码ERα或ERβ及NF-κB p50和p65亚基的表达构建体的作用。对于这一报告基因构建体，在已缺乏激素的情况下，ERα的共转染导致NF-κB转录活性的抑制，而添加激素导致进一步地抑制(图1B)。ERβ的共转染也表现出对NF-κB活性一定程度的抑制。在293细胞中也观察到类似的结果(结果未示出)。这些结果表明ER在基于ICAM启动子的共有应答元件的合成的NF-κB报告基因构建体上作为NF-κB的转录抑制剂，而ER与NF-κB作为5-HT1A受体启动子的激活剂。
实施例3NF-κB元件参与NF-κB和ER对5-HT1A受体启动子的调节为对ER对5-HT1A受体启动子的作用进行定位，使用了几种启动子缺失构建体(图2A)。
两种NF-κB元件(-901 365/64Mluc)的突变完全破坏了NF-κB对5-HT1A受体启动子的作用(图2B)。但是ERα仅与NF-κB结合时仍能与以对野生型启动子(-901luc)一样的效率诱导启动子的活性。同样，尽管启动子构建体-81luc仍含有一个NF-κB元件也不能被NF-κB诱导。但是，也是在这一启动子上，保留了ERα与NF-κB的作用。当这一单个存在于-81luc构建体上的NF-κB元件突变后(-81 64Mluc)，ERα的作用几乎被完全破坏了。
因此，5-HT1A受体启动子的协同激活涉及NF-κB结合位点，尽管由NF-κB本身对该启动子的激活似乎不是ER的作用所需要的。这些结果表明ER的协同启动子激活作用不依赖于DNA结合，而涉及蛋白-蛋白相互作用。
实施例4抗-雌激素对5-HT1A受体启动子的作用已描述了抗-雌激素依启动子邻近序列和受体亚型的不同有着不同的作用。在反式激活实验中，OH-T抑制通过典型的ERE调节的基因的转录，但象E2一样，其激活受AP-1元件与ERα控制的基因的转录(22)。我们用可以封闭AF-2的部分拮抗剂OH-T和可封闭AF-1和AF-2的“纯”拮抗剂ICI 164384(ICI)检测了抗-雌激素对5-HT1A受体启动子的作用。如图3所示，ICI的处理没有加强ERα和NF-κB对5-HT1A受体启动子的活性，而OH-T与E2一样在转录激活方面有效。这些数据表明部分拮抗剂OH-T仍能激活AF-1，与E2一样在ERα对5-HT1A受体启动子协同激活方面有效。
实施例5在对5-HT1A受体启动子的协同激活作用中涉及的NF-κB和ER的结构域为确定NF-κB的反式激活功能的重要性，我们检测了缺失NF-κB的p65亚基的反式激活结构域或损坏DNA-结合功能，对其与ER在瞬时转染实验中对5-HT1A受体启动子协同激活能力的影响。p50和p65或单独的p65混和ERα和E2共转染可强烈地激活启动子，而单独的没有反式激活功能的p50共转染，几乎没有什么作用。p65反式激活结构域的缺失形成仅包含Rel同源结构域的构建体(p65RHD)。P65RHD仍能与DNA结合(27)，但无论ERα和E2存在或不存在均不能激活该启动子。DNA-结合缺失突变体(p65Nsi)仍包含完整的反式激活结构域，但也不能协同激活该启动子。综合起来看，这些数据表明p65的反式激活功能和DNA结合功能对于ER协同激活5-HT1A受体启动子均是至关重要的。
为鉴定ERα参与激活5-HT1A受体启动子的区域，使用了缺少部分A/B区域而包含AF-1的或缺失部分配体结合区域而包含AF-2的小鼠ERα缺失构建体。缺失了A/B区域(ERα 121-599)即完全破坏了对该启动子的协同激活功能，而配体结合结构域(ERα 1-339)的缺失形成了一种至少与野生型的ERα具有同等活性的受体(图5A)。ERα DNA结合缺失突变体(ERα C241/244A)不能激活5-HT1A受体启动子，可能是由于对与NF-κB的相互作用而言，需要功能性的DNA结合结构域(34)。值得注意的是与人ERα不同，小鼠ERα在对5-HT1A受体启动子协同激活作用中没有观察到对配体依赖性。尽管在NF-κB不存在时，对于ERα 1-339可以观察到对启动子弱的激活作用，一般这一ERα对启动子的协同激活作用只有在与NF-κB相结合时才能观察到(数据未显示)。在对照实验中，ERα，ERβ和缺失突变体与含三个拷贝共有ERE及与虫荧光素酶偶联的TATA框的报告基因构建体共转染，以确定其激活从典型的ERE起始的转录能力。如图5B所示，尽管先前已描述这一现象ERβ的转录活性显著低于ERα，但ERα和ERβ都刺激从3xERE-TATA-luc的转录(28)。尽管比野生型的ERα弱得多，缺少AF-1或AF-2的缺失突变体也刺激转录，这表明所述的反式激活结构域能够对这一启动子构建体起协同作用。而且显示，ERα 1-339在配体不存在时已被最大限度地激活，这清楚地表明了AF-1活性的配体非依赖性。正如所预料的，DNA结合缺失突变体，ERα C241/244A不能激活这一报告基因构建体。
由于观察到ERα和ERβ激活5-HT1A受体启动子效力的不同，ERα和ERβ的嵌合构建体用于进一步鉴定ERα和ERβ中涉及这一激活作用的区域。用ERα的A/B区域替代ERβ的A/B区域(ERα/β)，形成对5-HT1A受体启动子的激活能力比野生型ERα更强的嵌合受体(图6A)。但是，用ERβ的A/B区域替代ERα的A/B区域(ERβ/α)几乎完全破坏了该受体对所述启动子的协同激活作用。同样，尽管在NF-κB不存在时也可以观察到ERα/β对该启动子弱的非配体依赖性的激活作用，一般这一ERα和ERα/β对启动子的协同激活作用只有在与NF-κB结合时才能观察到(结果未示出)。在对照实验中，两种嵌合构建体都能够以与野生型ERα等同的效率激活从3xERE-TATA-luc转录，而非配体依赖性的一些活性只能在ERα/β中观察到(图6B)。这些结果表明由ERα和NF-κB对5-HT1A受体启动子的协同激活依赖于DNA结合结构域和ERα包含AF-1的A/B区域。总之，雌激素对情绪和精神状态起着非常重要的作用。雌激素调节5-羟色胺功能的能力提高了其在与抑郁及其治疗相关的机制中起重要作用的可能性。一种雌激素影响情绪的细胞机制可能是通过在不同5-羟色胺系统水平有关基因的调节进行的。这里我们报道了雌激素能够通过一种包括NF-κB与雌激素受体协同激活的新机制上调5-羟色胺-1A受体的表达。所述的部分抗雌激素4-羟三苯氧胺与雌激素有相同的作用。另外，突变分析表明p65的反式激活和雌激素受体α激活功能1对于协同调节均至关重要。因此，我们提出NF-κB复合物与雌激素受体共同作用以补充辅因子到复合物中，并由此通过非典型的雌激素应答元件，以一种不涉及受体与DNA直接结合的机制协同激活5-羟色胺-1A受体启动子。
实施例6材料和方法特殊试剂。醛固酮(aldosteron)(N.V.Organon)以0.1μM的浓度使用。重组人IL-1β购自Genzyme，使用浓度为100u/ml。
细胞培养。人骨肉瘤U-2 OS细胞由美国典型培养物保藏中心获得(ATCC；Rockville，MD)和在一种将无酚红的DMEM(DF；LifeTechnologies Inc.)和Ham’s F-12培养基以1∶1相混合的培养基M505中培养，添加10％FCS，用重碳酸盐缓冲。
质粒。
pGL3-ELAM是通过克隆部分E-Selectin启动子到pGL3-basic(Promega)的Sac I和Xho I位点构建的。所述的E-selectin启动子区域是通过用寡核苷酸引物5’-ctgcagatctgagtttctgacatcattgta-3’和5’-atcattcgaagaagtcagccaagaacagct-3’对人基因组DNA进行PCR而获得的。所述的PCR产物亚克隆到pCRTM2.1(TA-Cloning kit，Invitrogen)中，用Sac I和Xho I消化，接下来连接到pGL3-basic中。
所述的虫荧光素酶报告基因质粒3*NF-κB-TK是通过在单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子前插入来自ICAM启动子的三个重复的NF-κB结合位点(van de Stolpe，A.，Caldenhoven，E.，Stade，B.G.，Koendermans，L.，Raaijmakers，J.A.M.，Johnson，J.P.& van derSaag，P.T.(1994)J.Biol.Chem.2696185-6192.)而构建的。所述的TK启动子克隆到pGL3-basic(Promega)的Bgl II-位点。所述的NF-κB结合位点三重重复是通过由引物5’-catacggtaagcttggggtcatcgccctgccaccgccgcccgattgctttagcttggaaattccgga-3’和5’-gtatgccaaagcttctccggaatttccaagctccggaatttccaagctccggaatttccaagctaaa-3’退火，接下来进行PRC扩增并亚克隆到pCRTM2.1载体中而构建的。所述的插入片段利用HindIII消化，Klenow DNA聚合酶补平、再连接到pGL3-tk-luc的SmaI位点。
pNGV1-hMR表达载体包含在SV40启动子控制下的野生型人MR，PKCRE-ERα表达载体包含在SV40启动子控制下的野生型人MR。
瞬时转染为了瞬时转染，将U-2OS细胞接种在6-孔培养板上。2或3天后用报告基因，表达载体和β-半乳糖苷酶对照载体转染所述细胞。使用两种不同的实验设置。为检验MR与IL-1β的协同作用，用1μgpGL3-ELAM或3*NF-κB-TK，1μg pNGV1-hMR或1μg的PKCRE-ERα和0.25μg的β-半乳糖苷酶对照质粒转染细胞。根据没有插入物的表达载体修正不同的转染DNA的量。瞬时转染是利用lipofetin进行的(Life Technologies)。依照制造商的建议进行lipofetin瞬时转染，仅有微小的改变。每μg转染DNA，使用5μl lipofetin和将细胞和转染混合物一起培养5小时，此后，吸出转染混合物替换为M505+10％DCC-FCS。在细胞裂解前将经转染的细胞与测试化合物(例如，IL-1β，地塞米松(dexamethason)和醛固酮(aldosteron)的不同组合)培养过夜。分别用虫荧光素酶试验系统(Promega)和Galacto-lightplus(Tropix)依制造商的建议进行虫荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性的检测，在Victor 1420多重标记计数器(multilabel counter)，Wallac上进行测定。检测β-半乳糖苷酶活性用作转染效率的对照。
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权利要求
1.一种鉴定能够调节类固醇受体和Rel蛋白对调节元件协同作用的化合物的方法，该方法包括-提供含有能被类固醇受体和Rel蛋白协同激活的调节元件的细胞，所述细胞还含有足够协同激活所述调节元件的水平的所述类固醇受体和所述Rel蛋白或其功能等价物，-将所述细胞与至少一种化合物相接触，-检测所述调节元件的激活是否受该化合物调节。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的类固醇受体选自雌激素受体α，雌激素受体β和盐皮质激素受体或其功能等价物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述的Rel蛋白选自NF-κB1，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等价物。
4.如权利要求1到3所述的方法，其中，所述的调节元件是5HT1-A受体基因启动子或其功能等价物。
5.如权利要求1到3所述的方法，其中，所述的调节元件是E-selectin基因启动子或其功能等价物。
6.如权利要求1到5所述的方法，其中，所述的细胞被能够显示所述调节元件激活的报告基因转染。
7.被含5HT1A受体基因启动子或其功能等价物的核酸转染的细胞，所述细胞进一步包括-能够在所述细胞内功能性表达类固醇受体的编码类固醇受体或其功能等价物的核酸，还包括-能够在所述细胞内功能性表达Rel蛋白的编码Rel蛋白或其功能等价物的核酸。
8.如权利要求7所述的细胞，其中，所述的类固醇受体选自雌激素受体α，雌激素受体β和/或盐皮质激素受体或其功能等价物。
9.如权利要求7或8所述的细胞，其中，所述的Rel蛋白选自NF-κB1，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等价物。
10.如权利要求7到9所述的细胞，其中，所述的细胞被能够显示所述5HT1A受体基因启动子激活的报告基因转染。
11.如权利要求7到10所述的细胞，其中，所述包含5HT1A受体基因启动子的核酸和/或编码类固醇受体的核酸和/或编码Rel蛋白的核酸或其功能等价物转染到所述细胞中。
12.被含E-selectin基因启动子或其功能等价物的核酸转染的细胞，所述的细胞进一步包括-能够在所述细胞内功能性表达类固醇受体的编码类固醇受体或其功能等价物的核酸，还包括-能够在所述细胞内功能性表达Rel蛋白的编码Rel蛋白或其功能等价物的核酸。
13.如权利要求12所述的细胞，其中，所述的类固醇受体选自雌激素受体α，雌激素受体β和/或盐皮质激素受体或其功能等价物。
14.如权利要求12或13所述的细胞，其中，所述的Rel蛋白选自NF-κB1，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等价物。
15.如权利要求12到14所述的细胞，其中，所述的细胞被能够显示所述E-selectin基因启动子激活的报告基因转染。
16.如权利要求12到15所述的细胞，其中，所述包含E-selectin基因启动子的核酸和/或编码类固醇受体的核酸和/或编码Rel蛋白的核酸或其功能等价物转染到所述细胞中。
17.如权利要求7到16所述的细胞在鉴定可在脑中调节5-羟色胺受体水平的化合物中的应用。
18.如权利要求1到6所述的方法鉴定出的化合物用作药物。
19.如权利要求1到4和6中的方法所鉴定出的化合物在制备治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。
20.如权利要求1到3，5或6中的方法所鉴定出的化合物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
全文摘要
已知Rel蛋白和类固醇受体的相互作用能够导致靶基因的抑制。这里公开了一种我们发现的新机制，其中，Rel蛋白和类固醇受体协同激活调节元件。研究表明这一机制影响脑－特异的5HT1A受体的表达，其中雌激素受体与核因子－
文档编号A61P9/00GK1411556SQ01806130
公开日2003年4月16日 申请日期2001年3月6日 优先权日2000年3月8日
发明者C·J·C·伯尔斯玛, P·T·M·范德萨格, S·维辛克, B·范德伯格 申请人:阿克佐诺贝尔公司