专利名称：基于狭窄性血管病变的疾病治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防剂。
更详细地说，涉及含有具有基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase)抑制活性的通式(I)表示的异羟肟酸衍生物或其非毒性盐作为有效成分的基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防剂。 (式中，所有符号表示与下述相同的含义。)
MMP通过在生理状况下分解胶原、层粘连蛋白、蛋白聚糖、纤连蛋白、弹性蛋白、明胶等，对关节组织、骨组织、结缔组织等的成长和组织重建等发挥作用。但是，病态下对各种组织的破坏认为是由于MMP的调节功能出现故障，因而MMP的表达或活性异常上升而引起的。
另一方面，血管的狭窄认为是血管内皮损伤后形成血栓或者形成新的内膜引起的。更详细地说，认为由于血管内皮损伤，因而血小板粘附在血管壁上，形成血栓，或者产生生长因子，引起平滑肌细胞的游走和增殖，形成新的内膜，结果，血管变得狭窄。
基于狭窄性血管病变的疾病各种各样，可以例举PTCA(percutaneous transluminal coronary angioplasty经皮经腔冠状动脉成形术)等引起的血管障碍后的再狭窄、不稳定心绞痛、急性心肌梗塞、一时性脑缺血发作或慢性动脉闭塞症等。
多数心绞痛是基于冠状动脉的粥样硬化病，心肌中氧的需要量和供给量不平衡，出现局部缺血状态引起的。根据其发作形式，分为稳定性心绞痛和不稳定心绞痛，不稳定心绞痛是指6个月以上的无症状期间后再次发作的心绞痛、在3～4周以内新发病的劳动性心绞痛等。另外，据说其中的50～80％会转变为急性心肌梗塞。
急性心肌梗塞是心绞痛的病症进一步发展，堵塞血管内腔，血流中断，氧和营养不能到达心肌，引起其部分坏死的状态。
一时性脑缺血发作呈现与脑梗塞相同的症状，但其状态是暂时性的。其中，在内颈动脉区域发生的一时性脑缺血发作，认为原因在于在粥样硬化部分产生的血小板血栓部分脱落而生成的微小塞栓。
作为慢性动脉闭塞症的代表性疾病，有闭塞性动脉硬化症(ASOarteriosclerosis obliterans)。其发病基于动脉硬化，伴随动脉狭窄或闭塞导致的血流减少，呈现缺血症状。
近年来，对于重度狭窄性血管病变，作为成功率高的治疗方法确立了PTCA，并被广泛使用。其是用气囊导管(balloon catheter)使心绞痛或心肌梗塞等中的狭窄血管膨胀，从而将血管扩张的治疗方法。但是，最大的问题在于确认PTCA成功例的30～40％出现再次狭窄。认为该再狭窄是下述原因引起的，继气囊导致血管损伤之后，形成血栓，然后，由于平滑肌细胞的游走和增殖，产生作为细胞外质的胶原、蛋白聚糖等，从而血管变得肥厚。另外，最近，也已明确用气囊一次扩张的血管会慢性收缩。但是，该重大问题尚未解决，其治疗和/或预防方法还未确立。
最近，MMP和动脉硬化以及血管肥厚的关系正在逐步明确。例如，报道了MMP-1、2、3和9在人体的动脉粥样硬化血小板中表达[J.Clin.Invest.，94(69)，2493-503(1994)；Pro.Nat.Acad.Sci.，88(18)，8154-8(1991)；Circulation.91(8)，2125-31(1995)]，并在使用负载胆固醇饲料的兔动脉的研究中，确认MMP-12在动脉硬化病灶中超量表达[Am.J.Pathol，153(1)，109-119(1998)]。另外，也报道了MMP-2、9的表达和活性上升与血管损伤后的平滑肌细胞的游走和增殖有关[Cir.Res.，75(3)，539-45(1994)]。
而且，对于与MMP抑制剂的关系也有几处报道。例如，报道了GM6001[3-(N-羟基氨基甲酰基)-2(S)-异丁基丙酰基-L-色氨酸甲酰胺]抑制平滑肌细胞的游走[Circ Res.78，38-43(1996)]，BB94[Batimastat；3(S)-(N-羟基氨基甲酰基)-2(R)-异丁基-4-(2-噻吩基硫)丁炔基-L-苯基苯胺甲酰胺]用量依存性地抑制平滑肌细胞的游走、增殖，这提示BB94抑制动脉损伤后的内膜肥厚[Arterioscler Thromb Vasc Biol，78，38-43(1996)]。
在上述状况下，本发明人进行了悉心研究，结果初次发现通式(I)表示的异羟肟酸衍生物或其非毒性盐对基于狭窄性血管病变的疾病有效，从而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及一种基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防剂，其含有通式(I)表示的异羟肟酸衍生物或其非毒性盐作为有效成分。 (式中，R1表示氢原子、C1～8烷基或-OR2取代的C1～8烷基，R2表示氢原子或C1～8烷基。)
通式(I)表示的异羟肟酸衍生物作为具有MMP抑制作用的化合物，是在WO99/19296号说明书中记载的化合物。
在该说明书中记载了下述内容，即包括通式(I)表示的化合物的氨基丁酸衍生物具有MMP抑制活性，因此对风湿、骨关节炎、病理性骨吸收、骨质疏松、牙周病、间质性肾炎、动脉硬化、肺气肿、肝硬化、角膜损伤、癌细胞的转移浸润或增殖的疾病、自身免疫疾病(克罗恩氏(Crohn)病、斯耶格伦氏(Sjogren)病等)、白细胞类细胞的血管渗出或浸润引起的疾病、血管形成、多发性硬化症、大动脉瘤、子宫内膜病等有效。但是，并未记载通式(I)表示的化合物对基于狭窄性血管病变的疾病有效。
根据MMP-2和9与血管平滑肌细胞的游走和增殖有关的报道，期待对MMP-2和/或MMP-9具有抑制活性的化合物抑制血管肥厚，根据MMP-12在动脉硬化病灶中超量表达的报道，期待具有MMP-12抑制活性的化合物抑制动脉硬化。但是，是否真正显示有效性，只有用对象疾病的病态模型进行试验才能判断。
本发明人将几种MMP抑制剂施用于高负载胆固醇饲料仓鼠血管狭窄模型。结果，只有通式(I)表示的化合物抑制平滑肌细胞的游走和增殖，并且抑制血管肥厚。这是此次初次发现的事实。
由该试验模型的有效结果认为，通式(I)表示的本发明的化合物对于基于狭窄性血管病变的疾病，具体地说，以PTCA等引起的血管损伤后的再狭窄为主，对于不稳定心绞痛、急性心肌梗塞、一时性脑缺血发作或者慢性动脉闭塞症等的治疗和/或预防有效，更优选对PTCA后的再狭窄的治疗和/或预防有效。
图2是表示投予本发明的活性成分时抑制平滑肌细胞增殖的结果的图。
图3是表示投予本发明的活性成分时抑制平滑肌细胞游走的结果的图。
发明的详细说明本发明中，使用通式(I)表示的异羟肟酸衍生物或其非毒性盐。 (式中，R1表示氢原子、C1～8烷基或-OR2取代的C1～8烷基，R2表示氢原子、C1～8烷基、苯甲基或者C1～8烷氧基取代的C1～8烷基。)通式(I)表示的化合物可以通过WO99/19296号说明书中记载的方法进行制备。
本发明中，C1～8烷基是指甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基以及它们的异构体。
本发明中，-OR2取代的C1～8烷基是指1个-OR2取代的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基以及它们的异构体。
本发明中，C1～8烷氧基取代的C1～8烷基是指选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基以及它们的异构体中的1个基团取代的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基以及它们的异构体。
本发明中， 是表示由于存在手性碳而产生的异构体或其混合物的键，具体表示表示结合到纸面前侧的 以及表示结合到纸面对侧的 或者它们的混合物。
本发明中，只要没有特别说明，包含所有异构体。例如，烷基和烷氧基包括直链的基团和支链的基团。而且，由于手性碳的存在等产生的异构体(R、S体、α、β体、对映异构体、非对映异构体)、具有旋光性的光学活性体(D、L、d、1体)、由色谱分离产生的极性体(高极性体、低极性体)、平衡化合物、它们的任意比例的混合物、外消旋混合物均包含在本发明中。
本发明中，R1表示的基团均优选，但更优选氢原子、C1～4烷基或1个-OR2取代的C1～4烷基。
本发明中，R2表示的基团均优选，但更优选氢原子、C1～4烷基、苯甲基或者1个C1～4烷氧基取代的C1～4烷基。
作为用于本发明的具体化合物，可以例举N-羟基-5-羟基-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺，N-羟基-5-甲氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺，N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺，N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(R)-甲基-4(R)-[N-(4-苯氧基苯基羰基)氨基]戊酰胺，N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(R)-甲基-4(S)-[N-(4-苯氧基苯基羰基)氨基]戊酰胺，N-羟基-5-苯甲氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺或N-羟基-5-(2-甲氧基乙氧基)甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺或者它们的非毒性盐。
本发明中使用的化合物可以以盐的形式使用。盐优选没有毒性、水溶性的盐。
作为适当的盐，可以例举碱金属(钾、钠等)的盐、碱土金属(钙、镁等)的盐、铵盐、可药用的有机胺(四甲铵、三乙胺、甲胺、二甲胺、环戊胺、苯甲胺、苯乙胺、哌啶、单乙醇胺、二乙醇胺、三(羟甲基)胺、赖氨酸、精氨酸、N-甲基-D-葡糖胺等)的盐。
本发明中使用的化合物或者它们的非毒性盐也可以通过公知的方法转变成水合物。
(1)抑制血管肥厚的效果损伤颈动脉内膜后，观察2周。在血管内膜损伤前口服给予被测药的式(II)表示的N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺1次，然后1天口服给药2次，持续2周(2、6、20mg/kg/day)。 在血管损伤后第15天，在戊巴比妥(50mg/kg)麻醉的条件下取出损伤血管，制成约2mm的冷冻标本。将其切片分成3份，分别以100μm间隔制作圆形切片，进行苏木精曙红(Hematoxylin Eosin；H.E)染色。使用计算机图像解析装置(NIH Image)，计算肥厚面积相对于血管内面积的比例(狭窄率(Steneosisi area)％)作为肥厚面积的抑制。测定对每个切片进行3次，取其平均值。结果如
图1所示。
(2)对血管平滑肌细胞增殖的抑制效果在血管内膜损伤前口服给予被测药的上述式(II)表示的N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺1次，然后1天口服给药2次(20mg/kg/day)。在由仓鼠取出损伤了内膜的颈动脉的1、8、16和24小时前，通过皮下注射注入5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU50mg/kg)。
在颈动脉损伤后第1天和第7天取出损伤血管，制成冷冻标本。BrdU(+)细胞用小鼠单克隆抗体(SIGMA)染色，接着用结合在过氧化物酶上的山羊抗小鼠Ig抗体染色，用二氨基联苯胺(DAB)检测。为了确认细胞总数，用苏木精将切片染色。通过下述计算式计算中膜和新生内膜的BrdU阳性率(Brdu index)。BrdU阳性率＝[DAB的(+)细胞数/苏木精的(+)细胞数]×100由图2所示的结果可知，在损害后第7天显著地抑制增殖。
(3)对血管平滑肌细胞游走的抑制效果与上述(2)同样地给予被测药和BrdU。
在颈动脉损伤后第3、5和7天，由仓鼠取出损伤血管。用PBS洗涤血管，放入0.3％过氧化氢/冷甲醇溶液中。在用含有1％BSA的PBS稀释得到的5％山羊血清中，培养45分钟，防止非选择性蛋白结合。在含有1％BSA的PBS中，使用组蛋白H1单克隆抗体，培养60分钟。然后，使用用含有1％BSA的PBS稀释得到的1％山羊抗小鼠Ig抗体，将切片培养45分钟。测定用DAB使之显色的组蛋白H1(+)细胞的个数(Cells/mm2)，评价平滑肌细胞由中膜到内膜的游走。结果如图3所示。由图3可知，内膜表面的平滑肌细胞的个数与对照组相比显著减少。工业实用性根据上述结果可知，通式(I)表示的化合物在高负载胆固醇饲料时的血管狭窄模型中，除了抑制血管平滑肌细胞的游走、增殖以外，也可以非常有效地抑制实际血管肥厚的形成。这样，通式(I)表示的化合物对血管狭窄具有抑制作用，因而可以判断本化合物对基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防有效。
本发明化合物的毒性非常低，可以判断作为药品使用非常安全。例如，N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺的使用大鼠的1次口服给药的最小致死量为2000mg/kg以上。
本发明中使用的对基质金属蛋白酶，例如明胶酶或溶基质素等具有强效抑制作用的通式(I)表示的异羟肟酸衍生物或其非毒性盐在包括人在内的动物中，特别是人中，对基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防有用。
在为了上述目的而使用本发明化合物、其非毒性盐、酸加成盐或其水合物时，通常以口服或非口服的形式全身或局部给药。
给药量根据年龄、体重、症状、治疗效果、给药方法、处理时间等而不同，但通常每个成人每次在1mg至1000mg的范围内1天1次至数次口服给药，或者每个成人每次在0.1mg至100mg的范围内1天1次至数次非口服给药(优选静脉给药)，或者在1天1小时至24小时的范围内在静脉内持续给药。
当然如上所述，给药量因各种条件而变化，因此有时用少于上述给药量的量即足够，也有时必须超过上述范围。
给予本发明化合物时，制成用于口服给药的内服用固体制剂、内服用液体制剂以及用于非口服给药的注射剂、外用制剂、栓剂等使用。
用于口服给药的内服用固体制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等。胶囊剂包括硬胶囊剂和软胶囊剂。
在这种内服用固体制剂中，将1种或1种以上活性物质直接混合，或者与赋形剂(乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等)、粘合剂(羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、偏硅酸铝酸镁等)、崩解剂(纤维素羟乙酸钙等)、润滑剂(硬脂酸镁等)、稳定剂、助溶剂(谷氨酸、天冬氨酸等)等混合，按照常规方法，使之制剂化进行使用。另外，根据需要，也可以用包衣剂(白糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等)包覆，另外，也可以用2层以上的层包覆。而且，也包括明胶等能够吸收的物质的胶囊。
用于口服给药的内服用液体制剂包括可药用的溶液剂、悬浊剂、乳剂、糖浆剂、酏剂等。在这种液体制剂中，将1种或1种以上活性物质在一般使用的稀释剂(蒸馏水、乙醇或它们的混合液等)中溶解、悬浊或乳化。而且，该液体制剂也可以含有润湿剂、悬浊化剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、保存剂、缓冲剂等。
作为用于非口服给药的注射剂，包括溶液、悬浊液、乳浊液以及使用时溶解或悬浊于溶剂中进行使用的固态注射剂。注射剂将1种或1种以上活性物质在溶剂中溶解、悬浊或乳化进行使用。作为溶剂，可以使用例如注射用蒸馏水、生理盐水、植物油、丙二醇、聚乙二醇、乙醇等醇类以及它们的组合。而且，该注射剂也可以含有稳定剂、助溶剂(谷氨酸、天冬氨酸、吐温80(注册商标)等)、悬浊化剂、乳化剂、无痛化剂、缓冲剂、保存剂等。这些可以在最后的步骤中灭菌或采用无菌操作方法进行制备、配制。另外，也可以制作无菌的固体制剂，例如冷冻干燥品，在使用前将其溶解于无菌化或无菌的注射用蒸馏水或者其他溶剂中进行使用。
作为用于非口服给药的其他制剂，包括含有1种或1种以上活性物质，采用常规方法配制的外用液体制剂、软膏剂、搽剂、吸入剂、喷雾剂、栓剂以及用于阴道给药的阴道栓等。
喷雾剂除一般使用的稀释剂以外，也可以含有亚硫酸氢钠等稳定剂以及赋予等渗性的缓冲剂，例如氯化钠、枸橼酸钠或枸橼酸等等渗剂。喷雾剂的制作方法例如在美国专利第2868691号和美国专利第3095355号中有详细记载。制剂例制剂例1采用常规方法将下述各种成分混合后压片，得到一片中含有50mg活性成分的片剂100片。N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺 5.0g羧甲基纤维素钙(崩解剂) 0.2g硬脂酸镁(润滑剂) 0.1g微晶纤维素 4.7g
制剂例2采用常规方法将下述各种成分混合后，采用常规方法对溶液进行灭菌，每5ml填充至安瓿中，采用常规方法进行冷冻干燥，得到1安瓿中含有20mg活性成分的安瓿100支。
N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺 2.0g甘露醇 20g蒸馏水 500ml
权利要求
1.一种基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防剂，含有通式(I)表示的异羟肟酸衍生物或其非毒性盐作为有效成分， 式中，R1表示氢原子、C1～8烷基或-OR2取代的C1～8烷基，R2表示氢原子、C1～8烷基、苯甲基或者C1～8烷氧基取代的C1～8烷基。
2.如权利要求1所述的基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防剂，化合物为N-羟基-5-羟基-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺，N-羟基-5-甲氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺，N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺，N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(R)-甲基-4(R)-[N-(4-苯氧基苯基羰基)氨基]戊酰胺，N-羟基-5-乙氧基甲基氧-2(R)-甲基-4(S)-[N-(4-苯氧基苯基羰基)氨基]戊酰胺，N-羟基-5-苯甲氧基甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺或N-羟基-5-(2-甲氧基乙氧基)甲基氧-2(S)-甲基-4(S)-(4-苯氧基苯甲酰基)氨基戊酰胺或者它们的非毒性盐。
3.一种经皮经腔动脉成形术后的再狭窄的治疗和/或预防剂，含有权利要求1所述的通式(I)表示的化合物或其非毒性盐作为有效成分。
全文摘要
一种基于狭窄性血管病变的疾病的治疗和/或预防剂，含有具有基质金属蛋白酶抑制作用的通式(I)表示的异羟肟酸衍生物或其非毒性盐作为有效成分。(式中，R
文档编号A61P9/10GK1434709SQ01810822
公开日2003年8月6日 申请日期2001年4月5日 优先权日2000年4月6日
发明者松野浩之, 植松俊彦 申请人:小野药品工业株式会社