专利名称：从含有高水平叶绿素的金盏花提取物中纯化叶黄素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从可能含有高水平叶绿素色素的粗金盏花提取物中纯化黄体素和玉米黄素的方法。
来自金盏花提取物的类胡萝卜素，尤其是叶黄素，在家禽产业用于给肉鸡皮肤和蛋黄着色已经有数十年。金盏花提取物中存在的黄体素的浓度远远高于玉米黄素的浓度。用于家禽产业的含有相对高浓度玉米黄素的着色配方最近已经出现在市场上，其中黄体素已经被异构化以便产生玉米黄素(Torres的美国专利5,523,494，和Rodriguez的美国专利5,973,211)。
除了类胡萝卜素在家禽产业中的商业重要性，最近关于它们在促进人类健康中的潜在角色使类胡萝卜素已经受到了科学家们相当大的关注。像α和β-胡罗卜素、黄体素和玉米黄素这样的化合物已经表现出具有很强的抗氧化活性，该活性可以阻碍或阻止像癌症、动脉硬化、白内障、黄斑退化和其它疾病(Bowen，WO98/45241)。黄体素和玉米黄素是存在于人类视网膜的黄斑部位的仅有的类胡萝卜素，而且与负责视觉敏锐度的黄斑的正常功能有关。也已经报导，类胡萝卜素增强了免疫反应。作为代谢过程的副产物而产生，和发源于环境污染物(例如二氧化氮、污染空气构成的臭氧层、重金属、卤化烃、电离辐射和香烟烟雾)的自由基被暗示为影响上述提到的许多疾病的致病因素。类胡萝卜素是能够促使一连串有害化学反应的高活性氧自由基的有力猝灭剂。类胡萝卜素也作为链断裂抗氧化剂，尤其是在低氧分压下。因此，类胡萝卜素可以猝灭诱导自由基的反应，也能阻止自由基的产生，从而限制了自由基/氧化的破坏。
从万寿菊手摘的金盏花花瓣含有一种在自然界发现的最高浓度的类胡萝卜素。工业规模栽培金盏花以及机械化收割过程已经增加了通常与花瓣一起获得的叶、茎、杂草和其它植物部分的收获量。当从这样的原材料提取粗粉时，就可以获得含有高水平叶绿素和有关化合物的油树脂。因此，黄体素和玉米黄素在这样的油树脂中的浓度比从手摘花中获得的浓度相对低一些。
具有高含量叶绿素的金盏花提取物通常是在碱性条件下皂化来完成类胡萝卜素以及叶绿素的水解。可变水平的其它脂类、叶绿酸和不可皂化物也通常存在于反应混合物中。因此，来自机械化收割的金盏花粗粉的油树脂中相对低浓度的叶黄素，以及杂质色素水平的可变性已经阻止了用于人类消费的叶黄素产物的商业发展。因此，存在对于从可能含有高水平叶绿素的大规模、机械化收割的金盏花栽培物所得粗粉中获得高纯度的黄体素和玉米黄素浓缩物的工业方法的需求。
更明确地说，本发明涉及一种从皂化提取物中纯化叶黄素的方法。该方法包括如下步骤将皂化提取物分散在水中以形成分散体；在一定条件下混合分散体，使任何水溶性化合物的一部分溶解在水中，以形成含水相和不能溶解于水的残余物；从残余物中分离含水相；在一定条件下用非极性溶剂接触残余物，使任何脂溶性化合物的一部分溶解在非极性溶剂以及一部分叶黄素从非极性溶剂中沉淀出来，以形成沉淀物；从沉淀物中分离非极性溶剂；用极性溶剂洗涤沉淀物，使任何残余叶绿素中至少一部分溶解在极性溶剂中；从沉淀物中分离极性溶剂，以生产一种包括具有期望纯度水平的叶黄素的产物。
在本发明的一个方面，皂化提取物是从含有类胡萝卜素和叶绿素混合物的机械化收割的金盏花中获得的。
作为其变化，该方法进一步可以包括如下步骤从非极性和极性溶剂中回收任何类胡萝卜素的绝大部分；在惰气环境下将产物去溶剂化且干燥；在混合之前，将分散体的pH值调整到大约5.0～7.0之间。可以通过加入一种选自磷酸、硫酸、盐酸、乙酸或任何具有类似特性的无机酸或有机酸的酸来调整pH值。
进一步变化中，该方法可以包括如下额外的步骤在混合之前，将分散体的温度调整到大约45℃～80℃之间；在用非极性溶剂接触残余物之前，用水洗涤残余物，其中用于洗涤的水的pH值被调整到大约5.0～7.0之间，温度被调整到大约45℃～80℃之间。
一方面，非极性溶剂选自己烷、庚烷、环己烷、辛烷、芳族烃、醚和卤代烃，极性溶剂选自酮、醇、胺及其混合物。
另一方面，该产物中的叶黄素包括水解黄体素和玉米黄素的混合物。在皂化提取物中黄体素和玉米黄素可以超过类胡萝卜素的95％。该产物在每一千克皂化提取物也可以包括400～900克总类胡萝卜素。皂化提取物可以包括0～20％的叶绿素。类胡萝卜素在分散体中的浓度可以是每一千克皂化提取物中含大约0.1～15克类胡萝卜素，或更优选的是每一千克皂化提取物中含大约5～10克类胡萝卜素。
本方法的另一个变化中，每份残余物中非极性溶剂的使用比例为大约1～25份，更优选的为大约5～12份溶剂。每份沉淀物中所使用的极性溶剂的比例为大约1～15份，更优选的为大约4～10份。非极性溶剂和极性溶剂可以在周围环境温度下使用。
在本发明的一个方面，该产物适合于人类使用。
本方法的另一个变化中，公开了一种获得具有期望纯度水平的叶黄素的方法。该方法包括获得一种机械化收割的植物组合物的皂化提取物。植物组合物包括第一种包括叶黄素的植物部分和第二种包括叶绿素的植物部分。用水洗涤皂化提取物，以留下含油残余物。用非极性溶剂在一定条件下接触残余物，使任何脂溶性化合物的至少一部分溶解在非极性溶剂中以及至少一部分叶黄素从非极性溶剂中沉淀出来以形成沉淀物。从沉淀物中分离非极性溶剂。然后用极性溶剂洗涤沉淀物，使任何残余叶绿素的至少一部分溶解在极性溶剂中。从沉淀物中分离极性溶剂，以生产一种包括具有期望纯度水平的叶黄素的产物。
Kitaoka(EP 732 378 A2)描述了一种适用于使用非极性溶剂和水溶液的液-液萃取的极稀着色提取物。为了分析及阐明结构的目的，但不是设计为了商业规模应用，Repeta(Monofr.Oceanogr.Methodol.，1997，10239-60)对多种纯化类胡萝卜素的方法做了详尽的回顾。
本发明公开了从天然资源中，尤其包括含有相对高水平叶绿素的金盏花提取物中，分离和纯化黄体素和玉米黄素的方法。更明确地说，用于该方法的原材料包括含有20g/kg或更多的绿色物质的皂化金盏花提取物。然而，所公开的方法也适用于从其它含有较低水平的杂质叶绿素色素的原材料资源中分离和纯化叶黄素。各种原材料资源包括藻类、蚕排泄物、菠菜和苜蓿叶子。
在本发明的一个优选实施方案中，每一千克含有大约40～150克类胡萝卜素和大约5～20克叶绿素的金盏花提取物被用作起始材料。这样的提取物是Productos Deshidratados de Mexico(PRODEMEX)，LosMochis，Sinaloa，Mexico生产的。用于制备这些提取物的金盏花的花可以是机械化收割的，含有大量叶子、茎干、花梗和其它含有丰富的叶绿素及其衍生物的植物部分。
金盏花粗粉是用机械收割的花脱水制备的。脱水的方式有好几种，包括带式、盘式、架式和转鼓式干燥器或太阳干燥。将干材料磨细，随后用非极性溶剂如己烷来进行溶剂萃取。然后通过蒸发去除溶剂，这样就获得了金盏花油树脂。然后将油树脂皂化以完成所存在的叶黄素和叶绿素的水解。可以通过用氢氧化钠或氢氧化钾或一些其它碱处理油树脂来实现皂化。本领域普通技术人员都熟知皂化条件。
在皂化反应中可以获得游离黄体素、玉米黄素和其它游离叶黄素，以及脂肪酸像肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸的钠盐和钾盐。另外，依赖于用作皂化剂的碱(如分别为NaOH或KOH)，可以用钠或钾取代色素分子上的植基和甲基基团。在皂化过程中，也可以生产水溶性叶绿素。
然后用水洗涤皂化提取物。将提取物分散在水中，并且稀释到最终浓度为每一千克含水分散体含有的全部叶黄素为大约0.1～30克。优选是每一千克含水分散体含有大约5～10克。优选地，将含水的分散体彻底地混合，以形成均匀混合物。
然后用选自乙酸、磷酸、硫酸、盐酸或任何具有类似特性的无机酸或有机酸的水溶液将混合物的pH值调整到大约1.0～7.0之间，优选地在大约5.0～6.5之间。可以将酸溶液的浓度固定在大约5～25％(w/w)之间。混合物的温度应该保持在20℃～80℃之间，优选地在45℃～70℃之间。当含有水溶性叶绿素和其它水溶性杂质的水相可以容易地从上层含油残余物中分离时，混合物的pH值被充分地降低(中和)。可以用传统的分液仪将下层水相分离。含油残余物含有一些残余的水溶性叶绿素和叶黄素。
可以用维持固定pH值的额外的水洗涤降低来自含油的上层相的残余水溶性绿色物质的浓度。对于每次洗涤，每体积份残余物使用4～20体积份的水是可能的，优选是8～15体积份。可以将水洗汇合，用于后续的绿色色素的分离。水洗可以持续到含油残余物基本上不含叶绿素和相应化合物，并且主要含有脂类、水和叶黄素。
然后用非极性溶剂提取湿润的含油残余物。溶剂可以选自短链脂肪族(如己烷)或芳族烃、烷基取代溶剂或其混合物。优选地，烃含有6～8个碳原子。对于每一份含油残余物，每次提取可以使用大约1～20份非极性溶剂(w/w)，优选地为大约5～10份(w/w)。优选地，使用至少两次提取。提取是在大约-20℃～70℃的温度下进行的，优选地为15℃～45℃，更优选为大约35℃～45℃。脂类和胡萝卜素，以及其它脂溶性物质可以在被分离和混合的非极性溶剂中提取。
在提取过程中从非极性溶剂中沉淀出来的固体富含黄体素和玉米黄素。叶绿素的残余量可能仍然存在。使用极性溶剂的一次或两次额外洗涤应该足以使叶绿素污染物的水平最小化。极性溶剂可以是酮、醇、胺或任何其它具有类似特性的极性溶剂。应该使用与叶绿素分离相同的酸来酸化溶剂。相对于残余固体的重量，可以使用3～20份溶剂，但优选为6～10份。优选地，洗涤在环境温度下进行。可以收集溶剂洗涤物，并将溶剂回收。用通常方法将溶剂去除，并将最终的固体干燥，优选在惰气气氛下进行。
下面的实施例将使得对本发明的理解更全面
在环境温度下，用每份油中含有6份己烷的溶液洗涤含油残余组分。叶黄素开始从溶剂相中沉淀出来，其中溶剂相富含脂肪酸、胡罗卜素和其它可溶于己烷的脂类。然后通过过滤分离溶剂，用与第一次相同的方式将用己烷重复洗涤两次以上。在惰性气体下，将残余固体干燥到大约4％的湿度。
获得了一种重量为49克的含有80％的初始色素的产物。这相当于每一千克产物中含有660克类胡萝卜素的浓度，其中黄体素92.2％和玉米黄素6.1％，这使得它非常适合于人类使用。
用己烷∶庚烷(2∶1)混合物洗涤残余糊状物，每份糊状物使用8份溶剂。在一个箱式离心转桶中离心该混合物，将固相提取两次以上，以去除大部分脂类。通过蒸发从脂类组分中回收溶剂，以留下含有起始物质大约14％的全部类胡萝卜素的含油残余物。这些类胡萝卜素主要代表胡萝卜素、β-玉米黄质、顺式和反式黄体素的环氧化物以及微量反式黄体素。通过在氮气下干燥，从离心机获得的固体颗粒(pellet)中的溶剂被除去，从而产生一种含有原材料中大约80％的色素的产物。黄体素和玉米黄素的总和为全部类胡萝卜素的97.5％。干燥产物的重量是150克。
虽然我们已经描述了许多本发明的实施方案，但显而易见，可以对我们所做的描述进行一些修改，以提供使用本发明的基本方法的其它实施方案。因此，本领域普通技术人员将理解，本发明的范围受所附权利要求的限定，而不受上述通过实施例的方式所详细描述的特定
权利要求
1.一种从皂化提取物中获得高纯化水平叶黄素的方法，该方法包括将皂化提取物分散在水中以形成分散体；在一定条件下混合分散体，使任何水溶性化合物的一部分溶解在水中，以形成含水相和不能溶解于水的残余物；从残余物中分离含水相；在一定条件下用非极性溶剂接触残余物，使任何脂溶性化合物的至少一部分溶解在非极性溶剂中，以及至少一部分叶黄素从非极性溶剂中沉淀出来，以形成沉淀物；从沉淀物中分离非极性溶剂；用极性溶剂洗涤沉淀物，使任何残余叶绿素中至少一部分溶解在极性溶剂中；从沉淀物中分离极性溶剂，以生产一种包括具有期望纯度水平的叶黄素的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的皂化提取物是从含有类胡萝卜素和叶绿素混合物的机械化收割的金盏花中获得的。
3.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括从非极性和极性溶剂中回收任何类胡萝卜素的绝大部分的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括在惰气环境中将产物去溶剂化且干燥的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在混合之前，将分散体的pH值调整到大约5.0～7.0之间。
6.根据权利要求5所述的方法，其中可以通过加入一种选自磷酸、硫酸、盐酸、乙酸或任何具有类似特性的无机酸或有机酸的酸来调整pH值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在混合之前，将分散体的温度调整到大约45℃～80℃之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在用非极性溶剂接触残余物之前，该方法进一步包括用水洗涤残余物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的用于洗涤的水的pH值被调整到大约5.0～7.0之间，温度被调整到大约45℃～80℃之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的非极性溶剂选自己烷、庚烷、环己烷、辛烷、芳族烃、醚和卤代烃。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的极性溶剂选自酮、醇、胺及其混合物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的产物中的叶黄素包括水解黄体素和玉米黄素的混合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在皂化提取物中黄体素和玉米黄素含有超过95％的类胡萝卜素。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的产物进一步包括在每一千克皂化提取物中400～900克的总类胡萝卜素。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的皂化提取物包括0～20％的叶绿素。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的类胡萝卜素在分散体中的浓度是每一千克皂化提取物中是大约0.1～15克类胡萝卜素。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述的类胡萝卜素在分散体中的浓度是每一千克皂化提取物中含大约5～10克类胡萝卜素。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述的每份残余物中所使用的非极性溶剂的比例为1～25份。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述的每份残余物中所使用的非极性溶剂的比例为5～12份。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述的每份沉淀物中所使用的极性溶剂的比例为1～15份。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述的每份沉淀物中所使用的极性溶剂的比例为4～10份。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述的非极性溶剂和极性溶剂可以在周围环境温度下使用。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述的产物进一步的特征在于适合于人类服用。
24.一种获得具有期望纯度水平的叶黄素的方法，该方法获得一种机械化收割的植物组合物的皂化提取物，所述组合物包括第一种包括叶黄素的植物部分和第二种包括叶绿素的植物部分；用水洗涤皂化提取物，以留下含油残余物；用非极性溶剂在一定条件下接触残余物，使任何脂溶性化合物的至少一部分溶解在非极性溶剂中，以及至少一部分叶黄素从非极性溶剂中沉淀出来，形成沉淀物；从沉淀物中分离非极性溶剂；用极性溶剂洗涤沉淀物，使任何残余叶绿素的至少一部分溶解在极性溶剂中；和从沉淀物中分离极性溶剂，以生产一种包括具有期望纯度水平的叶黄素的产物。
全文摘要
本发明提供了一种从可能含有高水平叶绿素的皂化金盏花提取物中获得高纯度黄体素和玉米黄素浓缩物的工业规模方法。
文档编号A61P35/00GK1434792SQ01810854
公开日2003年8月6日 申请日期2001年6月7日 优先权日2000年6月9日
发明者G·罗德里格斯, M－D·托里斯－卡尔－多纳, A·迪亚兹 申请人:普罗德麦克斯公司