用作丙型肝炎病毒ns3－丝氨酸蛋白酶抑制剂的新型肽的制作方法

专利名称：用作丙型肝炎病毒ns3－丝氨酸蛋白酶抑制剂的新型肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的丙型肝炎病毒(“HCV”)蛋白酶抑制剂、包含一种或多种所述抑制剂的药用组合物、制备所述抑制剂的方法和使用所述抑制剂治疗丙型肝炎和相关疾病的方法。本发明特别公开用作HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的新的肽化合物。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)为一种(+)-有义单链RNA病毒，它为非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要病原体，尤其是血液相关性NANBH(BB-NANBH)(参见国际专利申请公布号WO 89/04669和欧洲专利申请公布号EP 381 216)。NANBH区别于其它类型的病毒诱导性肝疾病，例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丁型(δ)肝炎病毒(HDV)、巨细胞病毒(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)肝炎、以及区别于其它形式的肝疾病，例如酒精中毒性肝疾病和原发性胆汁性肝硬化。
最近，已经鉴定、克隆和表达出了多肽加工和病毒复制所必需的HCV蛋白酶(参见例如美国专利号5,712,145)。这种约3000个氨基酸的多蛋白自氨基末端至羧基末端包含核壳蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)以及几种非结构蛋白(NS1、2、3、4a、5a和5b)。NS3为约68kda的蛋白，由HCV基因组的约1893个核苷酸编码，并且具有2个不同的结构域(a)由约200个N-末端氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶结构域；和(b)蛋白C-末端RNA依赖性ATP酶结构域。由于蛋白质序列、整体三维结构和催化机制的相似性，认为NS3蛋白酶是胰凝乳蛋白酶家族的一个成员。其它胰凝乳蛋白酶样酶有弹性蛋白酶、Xa因子、凝血酶、胰蛋白酶、纤溶酶、尿激酶、tPA和PSA。HCV NS3丝氨酸蛋白酶与所述多肽(多蛋白)于NS3/NS4a、NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接点水解有关，因此在病毒复制期间负责生成四种病毒蛋白。这使HCV NS3丝氨酸蛋白酶成为抗病毒化学治疗的令人关注的目标。
已经确定约6kda多肽的NS4a蛋白是NS3丝氨酸蛋白酶活性的辅因子。NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶对NS3/NS4a接点的自动裂解在分子内(即顺式)进行，而其它的裂解位点在分子间(即反式)进行。
对HCV蛋白酶的天然裂解位点的分析揭示，P1存在半胱氨酸和P1’存在丝氨酸，并且这些残基在NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接点中是严格保守的。NS3/NS4a接点包含P1的苏氨酸和P1’的丝氨酸。推定NS3/NS4a上的Cys→Thr取代解释该接点需要顺式而不是反式加工。参见例如Pizzi等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)91888-892，Failla等(1996)Folding & Design 135-42。NS3/NS4a裂解位点也比其它位点更耐受诱变。参见例如Kollykhalov等(1994)J.Virol.687525-7533。还发现，裂解位点上游区的酸性残基是有效裂解所需要的。参见例如Komoda等(1994)J.Virol.687351-7357。
已报道的HCV蛋白酶抑制剂包括抗氧化剂(参见国际专利申请公布号WO 98/14181)、某些肽类和肽类似物(参见国际专利申请公布号WO 98/17679，Landro等(1997)Biochem.369340-9348，Ingallinella等(1998)Biochem.378906-8914，Llinàs-Brunet等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.81713-1718)、基于70-氨基酸多肽水蛭蛋白酶抑制剂c的抑制剂(Martin等(1998)Biochem.3711459-11468，选自人胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂(hPSTI-C3)和小体所有组成成分(MBip)的抑制剂亲和性(Dimasi等(1997)J.Virol，717461-7469)、cVHE2(“camelized”可变结构域抗体片段)(Martin等(1997)Protein Eng.10607-614)和α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)(Elzouki等)(1997)J.Hepat.2742-28)。最近公开了设计用来选择性破坏丙型肝炎病毒RNA的核酶(参见BioWorldToday9(217)4(1998年11月10日))。
另外参见1998年4月30日公开的PCT公布号WO 98/17679(Vertex Pharmaceuyticals Incorporated)、1998年5月28日公开的WO98/22496(F.Hoffmann-La Roche AG)和1999年2月18日公开的WO99/07734(Boehringer Ingelheim Canada Ltd)。
HCV与肝硬化有关，而且诱发肝细胞癌。目前HCV感染患者的预后很差。由于缺乏免疫性或者与HCV感染有关的豁免性(remission)，HCV感染比起其它形式的肝炎更难以治疗。目前的资料表明，肝硬化诊断后四年的存活率小于50％。诊断为患有局灶性可切除性肝细胞癌的患者的五年存活率为10-30％，而局灶性不可切除性肝细胞癌的患者的五年存活率小于1％。
参见A.Marchett等Synlett，S1，1000-1002(1999)，它介绍了HCVNS3蛋白酶抑制剂的二环类似物的合成，其中所公开的化合物的结构式如下 另参见W.Han等Bioorganic & medicinal Chem.Lett，(2000)10，711-713，它介绍了某些包含烯丙基和乙基官能团的α-酮酰胺类、α-酮酯类以及α-二酮类的制备。
另参见WO 00/09558(受让人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公开)，它公开了下式的肽衍生物
其中各单元在其文中作了定义。该系列的示例性化合物为 另参见WO 00/09543(受让人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公开)，它公开了下式的肽衍生物 其中各种单元在其文中作了定义。该系列的示例性化合物为 丙型肝炎的当前疗法包括干扰素-α(INFα)以及使用利巴韦林和干扰素的联合疗法。参见例如Beremguer等(1998)Proc.Assoc.Am.Physicians110(2)98-112。这些疗法存在低持续应答率并时常发生副作用的缺陷。参见例如Hoofnagle等(1997)N.Engl.J.Med.336347。目前，没有疫苗可用于HCV感染。
等待批准以及共同等待批准的美国专利申请序列号09/--------，------------申请、序列号09/------，-------申请、序列号09/--------，-------申请、序列号09/--------，------------申请、序列号09/--------，------------申请和序列号09/--------、------------申请，它们公开了用作丙型肝炎病毒NS-3丝氨酸蛋白酶抑制剂的各种类型肽类。
HCV感染需要新的治疗药物及治疗方法。因此，本发明一个目的是提供有效治疗、预防或改善丙型肝炎的一种或多种症状的化合物。
本发明的另一目的是提供治疗、预防或改善丙型肝炎的一种或多种症状的方法。
本发明再一目的是提供使用本发明提供的化合物调节丝氨酸蛋白酶活性、特别是HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的方法。
本发明又一目的是提供使用本发明提供的化合物调节HCV多肽加工的方法。
发明概述在许多实施方案中，本发明提供HCV蛋白酶的新型抑制剂、包含一种或多种化合物的药用组合物、包含一种或多种所述化合物的药物制剂的制备方法以及治疗、预防或者改善丙型肝炎的一种或多种症状的方法。还提供调节HCV多肽与HCV蛋白酶相互作用的方法。在本发明提供的化合物中，优选抑制HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的化合物。本申请公开包含从P3直至P2’排列的氨基酸的肽化合物。
在第一实施方案中，本发明提供式I化合物 式I其中G、J和Y独立选自以下部分H、烷基、烷基-芳基、杂烷基、杂芳基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂环烷氧基、环烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、环烷基氨基或杂环烷基氨基，前提是Y可以任选被X11或X12取代；X11为烷基、链烯基、链炔基、环烷基、环烷基-烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂芳基、烷基杂芳基或杂芳基烷基，前提是X11还可以任选被X12取代；X12为羟基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰氨基、芳基亚磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、羧酰胺基(carboxamido)、烷氧基羰基氨基、烷氧基羰氧基、烷基脲基、芳基脲基、卤素、氰基或硝基，前提是烷基、烷氧基和芳基可以另外任选被选自X12的部分取代；R1为COR5或B(OR)2，其中R5为H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6或COR7，其中R7为H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10独立选自H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、环烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、CH(R1’)COOR11CH(R1’)CONR12R13CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11
CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’独立选自H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基和杂芳烷基；Z选自O、N或CH；W可以存在或者不存在，当W存在时，W选自C＝O、C＝S或SO2；R、R2、R3和R4独立选自H；C1-C10烷基；C2-C10链烯基；C3-C8环烷基；C3-C8杂环烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；氧、氮、硫或磷原子(所述氧、氮、硫或磷原子的数目为0-6个)；(环烷基)烷基和(杂环烷基)烷基，其中所述环烷基组成为3-8个碳原子，0-6个氧、氮、硫或磷原子，并且所述烷基具有1-6个碳原子；芳基；杂芳基；烷基-芳基；烷基-杂芳基；其中所述烷基、杂烷基、链烯基、杂链烯基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基部分可被任选取代，所述术语“取代”指任选并且化学上适当的被1个或多个选自以下的基团取代烷基、链烯基、链炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基、卤素、羟基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、氨磺酰、亚砜、砜、磺酰脲、酰肼和异羟肟酸酯。
在式I不同部分的上述定义中，不同部分的优选基团如下
R1的优选定义为COR5，其中R5为H、OH、COOR8或CONR9R10，其中R8、R9和R10的定义同上。R1的优选部分为COCONR9R10，其中R9为H，R10为H、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)。其中，R10优选部分为CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’为H或烷基、杂烷基，R2’为苯基、取代的苯基、杂原子-取代的苯基、苯硫基、环烷基、杂原子-取代的环烷基、哌啶基或吡啶基。更优选部分为R1’为H，R11为H或叔丁基；R’为羟甲基；R2’选自以下基团 其中U1和U2可以相同或不同，并且选自以下基团H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、叠氮基、氨基、羟基、取代的氨基、取代的羟基；U3和U4可以相同或不同，并且为O或S；U5选自以下部分烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂烷基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基或其组合；NR12R13选自以下基团NH2，NHMe，N(Me)OMe，NMe2， 其中U6为H、OH或CH2OH。R2的优选部分为 R3的优选部分为 其中R31＝OH或O-烷基。此外，R3还可以为 其中Y19选自以下部分 此外，R3还可以为 其中Y20选自以下部分 最优选的R3为 此外，式I的Z-C-R3部分不含R4时可为以下结构 和 一些其它优选部分为Z为N，R4为H，W为C＝O或SO2。Y的优选部分为 其中Y11选自H、COOH、COOEt、OMe、Ph、OPh、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12选自H、COOH、COOMe、OMe、F、Cl或Br。Y还可以为 其中Y13选自以下部分 Y14选自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc。Y的另外的优选结构为 其中Y15和Y16可以相同或不同，并且独立选自烷基、芳基或杂烷基或杂芳基。Y的另外的优选结构为 其中Y17为CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18为COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。J的优选部分为 G的优选部分为 除非另有定义，否则本文使用的所有科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。因此，例如术语烷基(包括烷氧基的烷基部分)指由具有1-8个、优选1-6个碳原子的直链或支链饱和烃除去一个原子后获得的单价基团；芳基-表示具有6-14个碳原子且具有至少1个苯型环的碳环基团，碳环基团的所有可取代的芳香族碳原子可能作为连接点。优选芳基包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚满基，尤其是苯基和取代的苯基；芳烷基-表示含有芳基并通过低级烷基连接的部分；烷基芳基-表示含有低级烷基并通过芳基连接的部分；环烷基-表示具有3-8个、优选5个或6个碳原子的饱和碳环，其任选被取代；杂环-表示(除以下定义的杂芳基以外)具有至少1个插入碳环结构(由1个环或者2个稠环组成，其中每个环为5元、6元或7元环且可具有或者不具有不含离域pi电子的双键)的O、S和/或N原子的饱和及不饱和环状有机基团，其环结构具有2-8个、优选3-6个碳原子，例如2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-吗啉基，或者2-或3-硫代吗啉基；卤素-表示氟、氯、溴和碘；杂芳基-表示具有至少1个插入碳环结构的O、S和/或N原子且具有足够数量的离域pi电子以提供芳族性质的环状有机基团，芳族杂环具有2-14个、优选4或5个碳原子，例如2-、3-或4-吡啶基，2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、2-、4-或5-噻唑基、2-或4-咪唑基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基，或者3-或4-哒嗪基等。优选杂芳基为2-、3-和4-吡啶基；所述杂芳基也可任选被取代。此外，除非另有特别定义，术语“取代或未取代”或“任选取代”是指相关部分任选并且化学上适当的被属于R12或R13的部分取代。
本发明还包括式I化合物的互变异构体、旋转异构体、对映异构体和其它的旋光异构体及其药学上可接受的盐、溶剂化物和衍生物。
本发明又一特征是包含作为活性成分的式I化合物(或其盐、溶剂化物或异构体)和药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物。
本发明还提供制备式I化合物的方法以及治疗疾病例如HCV及相关疾病的方法。治疗方法包括给予患有一种或多种所述疾病的患者治疗有效量的式I化合物或者包含式I化合物的药用组合物。
还公开了式I化合物在制备治疗HCV和相关疾病的药物中的用途。
优选实施方案的详细描述在一个实施方案中，本发明公开了作为HCV蛋白酶抑制剂、尤其是HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的式I化合物或其药学上可接受的衍生物，其各种定义见上文。
具有优良的HCV蛋白酶抑制活性的本发明代表性化合物与它们的活性一并列于表1中(Ki*值范围以纳摩尔表示，nM)。
表1化合物与HCV蛋白酶连续检测结果
HCV连续检测的Ki*范围类别A＝1-100；B＝101-1000；C＝＞1000nM。
部分类型的本发明化合物以及合成不同类型的本发明式I化合物的方法列举如下，接着用示意图说明，再后是示例性实施例。
R＝MeR＝苄基 X＝OtBuX＝OHX＝NH2X＝NMeOMeX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH X＝H，Y＝tBu；X＝tBu，Y＝H R＝炔丙基R＝烯丙基 X＝Ot-丁基X＝OH X＝Ot丁基X＝OH X＝Ot丁基X＝OHX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH R＝tBuR＝HR＝Me X＝H，Y＝COOHX＝COOH，Y＝H 根据它们的结构，本发明化合物可与有机酸或无机酸、或者有机碱或无机碱形成药学上可接受的盐。形成所述盐的合适的酸的实例为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲磺酸和本领域技术人员熟知的其它的无机酸以及羧酸类。对于与碱形成盐的合适碱为例如NaOH、KOH、NH4OH、氢氧化四烷基铵等。
在另一实施方案中，本发明提供包含作为活性成分的本发明肽的药用组合物。药用组合物通常还包含药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体(本文统称为载体材料)。由于它们的HCV抑制活性，所述药用组合物具有治疗丙型肝炎和相关疾病的用途。
在另一实施方案中，本发明公开了制备包含作为活性成分的本发明化合物的药用组合物的方法。在本发明的药用组合物和方法中，活性成分一般与适合的载体材料混合给药，载体材料根据预定给药形式适当选择，即口服片剂、胶囊剂(固体填充、半固体填充或液体填充)、使用时配制用粉剂、口服凝胶剂、酏剂、可分散颗粒剂、糖浆剂、混悬剂等，并且符合常规制药实践。举例来说，对于以片剂或胶囊剂形式口服给药，活性药物成分可与任何口服非毒性药学上可接受的惰性载体组合，例如乳糖、淀粉、蔗糖、纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、滑石粉、甘露糖醇、乙醇(液体形式)等。此外，当要求或者需要时，也可在混合物中掺入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。粉剂和片剂可包含约5-95％的本发明化合物组分。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖类、玉米甜味剂、天然及合成树胶如阿拉伯树胶、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。用于上述剂型的润滑剂的实例有硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、瓜尔胶等。
适当的情况下也可包含甜味剂、增香剂和防腐剂。下面更详细地讨论以上提及的一些术语，即崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂等。
另外，本发明组合物可配制成持续释放形式，以控制任何一种或者多种成分或活性成分的释放速率，达到最佳治疗效果，即最佳HCV抑制活性等。持续释放的合适剂型包括多层片剂，它包含多个不同崩解速率层，或者为活性成分浸渍在其中的控释聚合物基质，将其加工成片剂形式或者包含所述浸渍或包囊性孔型聚合物基质的胶囊剂。
液态制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。实例可列举肠胃外注射用水溶液剂或者水-丙二醇溶液剂，或者加入甜味剂和遮光剂(Pacifiers)的口服溶液剂、混悬剂和乳剂。液态制剂也可包括鼻内给药的溶液剂。
适于吸入的气雾制剂可包括溶液剂和粉末形式的固体，它们可以与药学上可接受的载体例如惰性压缩气体(如氮气)混合应用。
制备栓剂时，首先熔融低熔点的蜡，例如脂肪酸甘油酯(如可可脂)的混合物，通过搅拌或者类似的混合使活性成分均匀分散于其中。然后将熔融的均匀混合物倾入到适当大小的模具中，使之冷却并由此固化。
还包括这样的固态制剂可在临用前配制成口服或肠胃外给药的液态制剂。所述液态制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂。
本发明化合物也可经皮给药。透皮组合物可采用乳膏、洗剂、气雾剂和/或乳剂的形式，所述组合物可包含在基质型或者贮库型透皮贴剂中，这是本领域的常规技术。
本发明化合物优选口服、静脉内或皮下给药。
药用制剂优选为单位剂型。单位剂型时，制剂细分为包含适量活性成分的适当大小的单位剂量，例如包含达到所需目的的有效量。
根据具体应用，制剂的单位剂量中，本发明的活性成分剂量通常可以不同或调整，从约1.0毫克到约1,000毫克，优选约1.0到约950毫克，更优选约1.0到约500毫克，一般为约1到约250毫克。实际使用剂量可根据患者的年龄、性别、体重以及所治疗病症的严重程度而变化。所述技术对本领域的熟练技术人员是众所周知的。
通常，包含活性成分的人类口服剂型可以每天给药1次或2次。给药量和给药频率需要根据主治医师的判断调整。口服给药的一般推荐日剂量范围从约1.0毫克/天到1,000毫克/天，可以一次或分次给药。
部分有用的术语说明如下胶囊剂-指特殊容器或者包封物，它们由甲基纤维素、聚乙烯醇或变性明胶或淀粉制成，其装有或包含含活性成分的组合物。硬壳胶囊一般由较高凝胶强度骨架和猪皮明胶的掺合物制成。胶囊本身可包含少量染料、不透明剂、增塑剂和防腐剂。
片剂-指包含活性成分及合适稀释剂的压缩或模压固体剂型。通过压缩混合物或湿法制粒、干法制粒或压缩获得的颗粒制备片剂。
口服凝胶剂-指活性成分分散于或溶于亲水性半固体基质中。
使用时配制用粉剂(powerder for constitution)指包含活性成分和合适稀释剂的粉末掺合物，它可用水或果汁混悬。
稀释剂-指通常构成组合物或者剂型主要部分的物质。合适的稀释剂包括糖类，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；从小麦、玉米、大米和马铃薯获得的淀粉；以及纤维素，例如微晶纤维素。组合物中稀释剂数量占总组合物的重量百分比从约10％到约90％，优选约25％到约75％，更优选从约30％到约60％，更优选从约12％到约60％。
崩解剂-指加入到组合物中促使其崩解并释放出药物的物质。合适的崩解剂包括淀粉；“冷水可溶的”改性淀粉，例如羧甲基淀粉钠；天然和合成树胶类，例如槐树豆胶、卡拉牙胶、瓜尔胶、黄蓍胶和琼脂；纤维素衍生物，例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；微晶纤维素和交联微晶纤维素，例如交联羧甲基纤维素钠；藻酸盐，例如藻酸和藻酸钠；粘土如膨润土；以及泡腾混合物。组合物中的崩解剂含量范围占组合物的重量百分比从约2％到约15％，更优选从约4％到约10％。
粘合剂-指使粉末粘合或者“胶着”在一起并使它们粘聚形成颗粒，因此在配制中用作“胶粘剂”的物质。粘合剂增加稀释剂或增量剂已有的粘结强度。合适的粘合剂包括糖类如蔗糖；从小麦、玉米、大米和马铃薯获得的淀粉；天然树胶类如阿拉伯树胶、明胶和黄蓍胶；海藻衍生物如藻酸、藻酸钠和藻酸钙铵；纤维素材料如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠及羟丙基甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；以及无机物，例如硅酸镁铝。组合物中的粘合剂含量可占组合物的重量百分比从约2％到约20％，更优选从约3％到约10％，更优选约3％到约6％。
润滑剂-指加入到剂型中以便在其被压制后通过减少摩擦或磨损使片剂、颗粒等自模具或者冲模中脱出的物质。合适的润滑剂包括金属硬脂酸盐，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钾；硬脂酸；高熔点蜡；以及水溶性润滑剂，例如氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠、油酸钠、聚乙二醇和d’l-亮氨酸。润滑剂通常在压制前的最后步骤加入，因为它们必须存在于颗粒的表面、颗粒与压片机配件之间。组合物中润滑剂含量可占组合物重量百分比从约0.2％到约5％，优选约0.5％到约2％，更优选从约0.3％到约1.5％。
助流剂(glident)-防止结块并改善颗粒流动性的物质，使得制备物流动平滑均匀。合适的助流剂包括二氧化硅和滑石粉。组合物中助流剂含量可占组合物总量的重量百分比从约0.1％到约5％，优选从约0.5％到约2％。
着色剂-使组合物或者剂型着色的赋形剂。这类赋形剂可包括食品级颜料和吸附到合适吸附剂(例如粘土或氧化铝)上的食品级颜料。着色剂含量可占组合物的重量百分比从约0.1％到约5％，优选从约0.1％到约1％。
生物利用度-指与标准物或者对照物相比，给药剂型的活性药物成分或者治疗部分吸收进入体循环的速率和程度。
制备片剂的常规方法是人们已知的。所述方法包括干法，例如直接压缩和压制压缩生产的颗粒，或者湿法或其它的特殊方法。制备其它给药形式例如胶囊剂、栓剂等的常规方法也是人们熟知的。
本发明的另一个实施方案公开了上文公开的药用组合物在治疗疾病例如丙型肝炎等中的用途。该方法包括给予患有一种或多种所述疾病并需要这种治疗的患者治疗有效量的本发明药用组合物。
在另一实施方案中，本发明化合物可以用于治疗人类HCV，其治疗模式可以是单药疗法或联合疗法，例如联合应用抗病毒药物(如利巴韦林)和/或干扰素(如α-干扰素)等。
如上所述，本发明还包括所述化合物的互变异构体、旋转异构体、对映异构体和其它立体异构体。因此，本领域技术人员知道，本发明的一些化合物可存在适当的异构体形式。这类不同形式化合物已考虑在本发明范围内。
本发明另一个实施方案公开了本发明公开的化合物的制备方法。所述化合物可通过本领域已知的几种技术制备。代表性示例方法在以下反应流程中概述。应当理解，虽然以下示例性流程介绍了几个本发明代表性化合物的制备，但是适当的替代任何天然及非天然氨基酸将会形成基于所述替代的所需化合物。这类变化已考虑在本发明范围内。
在以下流程、制备和实施例的说明中所使用的缩写为THF四氢呋喃DMFN，N-二甲基甲酰胺EtOAc乙酸乙酯AcOH乙酸HOOBt3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮EDCl1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐DEC1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐NMMN-甲基吗啉ADDP1，1’-(偶氮二羰基)二哌啶DEAD二乙基偶氮二羧酸酯MeOH甲醇EtOH乙醇Et2O乙醚DMSO二甲基亚砜HOBtN-羟基苯并三唑PyBrOP溴-三-(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐Bn苄基Bzl苄基Et乙基Ph苯基iBoc异丁氧基羰基iPr异丙基
tBu或But叔丁基Boc叔丁氧基羰基Cbz苄氧基羰基Cp环戊二烯基Ts对-甲苯磺酰基Me甲基THP四氢吡喃基iBoc异丁氧基羰基Chg环己基甘氨酸一般制备流程以下的流程介绍中间体结构单元的合成方法流程1
流程2 流程3
流程4 制备中间体制备实施例1步骤A化合物(1.1)
将化合物(1.08)(3.00g，12.0mmol；Harbeson，S.L；Abelleira，S.M.；Akiyama，A.；Barrett，R.；Carroll，R.M.等；J. Med.Chem.；37(18)1994；2918-2929；)的DMF(15mL)和CH2Cl2(15mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOOBt(1.97g，12.0mmol)、N-甲基吗啉(4.0mL，36.0mmol)和EDCl(2.79g，14.5mmol)，搅拌10分钟，然后加入HCl·H2N-Gly-OBn(2.56g，13.0mmol)。将所得溶液在-20℃搅拌2小时，冷冻保存过夜，然后浓缩至干，接着用EtOAc(150mL)稀释。将EtOAc溶液用饱和NaHCO3、H2O、5％H3PO4、盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(1.09)(4.5g，94％)。LRMSm/z MH+＝395.1。步骤B化合物(1.1) 将化合物(1.09)(7.00g，17.8mmol)的无水乙醇(300mL)溶液在室温于氢气氛下，在存在Pd-C(300mg，10％)下搅拌。反应进度通过tlc.监测。在2小时后，将混合物通过硅藻土垫过滤，真空浓缩所得溶液获得化合物(1.1)(5.40g，定量)。LRMS m/z MH+＝305.1。制备实施例2步骤A化合物(1.3) 将制备实施例1步骤B的化合物(1.1)(1eq.)、化合物(1.2)(Novabiochem，第04-12-5147号)(1.03eq.)、HOOBt(1.03eq.)、N-甲基吗啉(2.2eq.)和二甲基甲酰胺(70mL/g)的混合物在-20℃搅拌。加入EDCl(1.04eq.)，反应物搅拌48小时。将反应混合物倾入5％KH2PO4水溶液，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有机物依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、盐水洗涤，有机层用无水MgSO4干燥。过滤混合物，然后蒸发，真空干燥滤液，残余物用Et2O-己烷研磨，过滤获得标题化合物(1.3)(86％收率)，C25H39N3O7(493.60)，质谱(FAB)M+1＝494.3。步骤B化合物(1.4) 将制备实施例2步骤A的化合物(1.3)(3.0g)用4N HCl/二氧六环(36mL)处理，在室温下搅拌7分钟。将混合物倾入1.5L冷(5℃)己烷中并搅拌，然后在0℃保持0.5小时。混合物在干燥空气中抽滤，将收集的固体进一步干燥获得标题化合物(1.4)(2.3g，88％收率)，C20H31N3O5·HCl，H1NMR(DMSO-d6/NaOD)δ7.38(m，5H)，5.25(m，1H)，4.3-4.1(m，1H)，3.8(m，2H)，3.4-3.3(m，被HDO屏蔽)，1.7-1.1(m，4H)，1.35(s，9H)，0.83(m，3H)。制备实施例3化合物(1.5) 制备实施例2步骤A的化合物(1.3)按照以下的制备实施例7步骤A基本相同的方法处理，获得化合物(1.5)。制备实施例4化合物(1.6) 制备实施例3的化合物(1.5)按照制备实施例2步骤B基本相同的方法处理获得化合物(1.6)。制备实施例5步骤A化合物(2.09) 二甲胺盐酸盐(1.61g，19.7mmol)、N-Boc-苯基甘氨酸、化合物2.08(4.50g，17.9mmol，Bachem Co.# A-2225)、HOOBt(3.07g，18.8mmol)和EDCl(4.12g，21.5mmol)的无水DMF(200mL)和CH2Cl2(150mL)溶液在-20℃加入NMM(5.90mL，53.7mmol)。在上述温度搅拌30分钟后，反应混合物保存在冰箱中过夜(18h)。然后加温至室温，加入EtOAc(450mL)、盐水(100mL)和5％H3PO4(100mL)。分出各层后，有机层用5％H3PO4(100mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×150mL)、水(150mL)和盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，然后真空浓缩获得白色固体化合物(2.09)(4.86g)，使用时无需再提纯。步骤B化合物(2.1) 将制备实施例5步骤A的化合物(2.09)(4.70g，粗制品)溶于4NHCl(60mL，240mmol)，所得溶液在室温下搅拌。反应进度用TLC监测。4小时后，真空浓缩上述溶液获得白色固体化合物(2.1)，它在下一步反应中使用时无需再提纯。LRMS m/z MH+＝179.0。制备实施例6步骤A化合物(2.2) 按照制备实施例2步骤A基本相同的方法，用苯基甘氨酸N，N-二甲基酰胺盐酸盐代替苯基甘氨酸叔丁酯盐酸盐制备化合物(2.2)。质谱(FAB)M+1＝465.3。步骤B化合物(2.3) 使步骤A的化合物(2.2)(1.85g)与4N HCl/二氧六环(50mL)在室温下反应1小时。混合物在20℃水浴中真空蒸发，用异丙醚研磨，过滤，干燥获得化合物(2.3)(1.57g，98％收率)，C18H28N4O4·HCl，质谱(FAB)M+1＝365.3制备实施例7步骤A化合物(2.4) 将制备实施例5步骤A的化合物(2.2)(2.0g)的二氯甲烷(60mL)溶液用二甲基亚砜(3.0mL)和2，2-二氯乙酸(0.70mL)处理。混合物在搅拌下冷却至5℃，然后加入1M二环己基碳二亚胺/二氯甲烷溶液(8.5mL)。除去冷水浴，搅拌混合物22小时。然后加入2-丙醇(0.5mL)，再搅拌1小时。过滤混合物，依次用冰冷的0.1N NaOH(50mL)、冰冷的0.1N HCl(50mL)、5％KH2PO4水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液用无水硫酸镁干燥，然后过滤。蒸发滤液，然后在硅胶上用色谱法分离，用乙酸乙酯洗脱获得化合物(2.3)(1.87g，94％收率)，C23H34N4O6，质谱(FAB)M+1＝463.3。步骤B化合物(2.5) 按照制备实施例2步骤B基本相同的方法制备化合物(2.5)。制备实施例8步骤A化合物(3.1)步骤A-1.化合物3.02 将化合物3.01(4.6g，用N-Boc-S-甲基半胱氨酸(BachemBiosciences Inc.)按照Boger，J.Org.Chem.，1988，53，487的方法制备)的DMF(150mL)溶液用CS2CO3(6.1g)处理，然后用溴化苄(2.3mL)处理，上述混合物在室温下搅拌4小时。真空浓缩混合物，然后将残余物悬浮于EtOAc(200mL)。混合物依次用5％KH2PO4水溶液、盐水洗涤，有机萃取液用无水MgSO4干燥。过滤混合物，蒸去滤液，获得产物3.02(6.2g)；[α]D-33.7(c1.3，CHCl3)。步骤A-2.化合物3.03 按照U.Larsson等，Acta Chem.Scan.，1994，48(6)，517-525中的方法，将过硫酸氢钾制剂(R)(16.4g，Aldrich Chemical Co.)的水(90mL)溶液缓慢地加入0℃化合物3.02(6.1g)的MeOH(150mL)溶液。混合物在室温下搅拌4小时，然后用旋转蒸发器浓缩至1/2体积，加入冷水(100mL)，混合物用EtOAc萃取。萃取液用盐水洗涤，用无水MgSO4干燥。过滤混合物，蒸去滤液获得产物3.03(5.9g)；[α]D-26.3(c0.9，CHCl3)。步骤A-3.化合物3.2 将前一步骤产物3.03用4N HCl/二氧六环处理0.5小时，获得产物3.2，C12H17NO4S·HCl(307.79)；质谱(FAB)M+1＝272.0。制备化合物3.3 使化合物(3.2)(S-甲基半胱氨酸砜苄酯盐酸盐)和化合物(3.1)(N-Boc-环己基甘氨酸)按照制备实施例2步骤A的基本相同的方法反应获得化合物(3.3)C25H38N2O7S(510.64)。步骤B化合物(3.4) 上述步骤A的化合物(3.3)(0.7g)、10％Pd/C(0.05g)和EtOH-二氧六环(100mL)的混合物在3atm H2气氛下搅拌5小时。过滤混合物，真空蒸发至干获得化合物(3.4)(0.56g，97％收率)，C18H32N2O7S(420.52)质谱(FAB)M+1＝421.2。步骤C化合物(3.5) 上述步骤B的化合物(3.4)与制备实施例2步骤B的化合物(1.4)按照制备实施例2步骤A的基本相同的方法反应获得化合物(3.5)，C38H61N5O11S(795.98)，质谱(FAB)M+1＝796.3。制备实施例9化合物4.1 制备实施例8步骤C的化合物(3.5)按照制备实施例2步骤B的基本相同的方法反应获得化合物(4.1)C33H53N5O9S.HCl(732.33)。制备实施例10化合物(4.2) 将制备实施例9的化合物(4.1)(0.7g)、二甲基甲酰胺(15mL)和二异丙基乙胺(0.38mL)的溶液在5℃用氯甲酸异丁酯(0.15mL)处理。除去冷水浴，搅拌6小时。将反应混合物倾入5％KH2PO4水溶液(100mL)，用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并的有机层依次用冷5％K2CO3水溶液、5％KH2PO4水溶液、盐水洗涤，有机层用无水MgSO4干燥。过滤混合物，真空蒸去滤液，残余物用Et2O-己烷研磨，过滤剩下化合物(4.2)。制备实施例11化合物(4.3) 化合物(4.2)按照以下的制备实施例14步骤H基本相同的方法反应获得化合物(4.3)。制备实施例12化合物(4.4) 将制备实施例11的化合物(4.3)(约0.10g)用无水三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，约10mL)溶液处理约2小时。溶液用二甲苯(约50mL)稀释，蒸空蒸发。残余物用Et2O研磨，过滤获得化合物(4.4)。制备实施例13化合物(4.5) 使制备实施例12的化合物(4.4)与二甲胺按照制备实施例2步骤A基本相同的方法反应获得化合物(4.5)。制备实施例14步骤A化合物(5.2) 在0℃搅拌冷却下，向化合物(5.01)(1.11g，7.0mmol)的无水DMF(10mL)和无水CH2Cl2(10mL)溶液中加入HOBT(1.19g，7.25mmol)，N-甲基吗啉(2.3mL，21.0mmol)和DEC(1.6g，8.4mmol)。所得溶液在0℃搅拌15分钟，接着加入H-Val-O-tBu(1.54g，7.35mmol)。将溶液置于冰箱过夜。观察到大量的沉淀，将溶液浓缩至干，然后用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并的有机层用5％H3PO4溶液、H2O、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤获得粗产物5.1(2.4g，98％收率)。
将粗产物(如上获得)的4N HCl/二氧六环溶液在室温下搅拌7小时，浓缩至干获得化合物(5.2)。步骤B化合物(5.4) 将化合物(5.3)(F.L.Bach，Jr.等J.Amer.Chem.Soc.，(1955)77，6049)(17.5g，0.086mmol)的50％MeOH/50％H2O(300mL)溶液在搅拌下加入Boc酸酐(47.0g，0.215mol)。然后在溶液中滴加50％的浓NaOH溶液调节至pH＝9.5。所得溶液在室温下搅拌过夜，然后用浓HCl中和至pH＝8，用柠檬酸酸化至pH＝2.94，接着用CH2Cl2萃取。合并的有机层用MgSO4干燥获得化合物(5.4)(27.16g，95％收率)步骤C化合物(5.5) 0℃的亚硫酰氯(3.37mL，0.046mmol)的DMF(3.59mL，0.046mol)溶液加温至室温，搅拌35分钟。然后将溶液冷却至0℃，接着加入以上步骤B的化合物(5.4)(15.0g，0.045mol)的CH3CN(150mL)和吡啶(3.73mL，0.046mol)溶液。所得溶液加温至室温，搅拌过夜。将溶液倾入冰水(700mL)中，用EtOAc(150mL)萃取三次。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(5.5)(10.8g)。步骤D化合物(1.08) 以下的制备实施例14步骤D的化合物(6.6)(6.5g，0.044mol)的CH2Cl2(130mL)溶液在搅拌下加入Boc酸酐(9.65g，0.044mol)和DMF(50mL)。所得溶液在室温下搅拌一个周末，浓缩至干，然后加入H2O(120mL)和50％NaOH调节至pH＝10-11。将溶液搅拌2小时，再加入Boc酸酐(1.93g，8.8mmol)，在室温下搅拌过夜。将溶液用CH2Cl2萃取，水层在0℃用1N HCl酸化至pH＝4，然后用CH2Cl2萃取3次。然后合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(1.08)(4.50g，41％收率，M-叔丁基+2＝192)。步骤E化合物(5.7) 向以上获得的化合物(1.08)(4.5g，0.018mol)的DMF(22mL)和CH2Cl2(22mL)溶液在搅拌下加入HOBT(2.7g，0.02mol)、N-甲基吗啉(6mL，0.054mol)、DEC(4.17g，0.022mol)和烯丙基甘氨酸.TsOH(6.1g，0.02mol)。所得溶液在室温下搅拌一个周末，然后浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并的有机层用10％H3PO4、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤获得粗产物(5.7g)。将粗产物的4N HCl/二氧六环(50mL)溶液在室温下搅拌50分钟，浓缩至干获得化合物(5.7)(4.79g，94％收率，MH+＝245.1)。步骤F化合物(5.8) 以上步骤E的化合物(5.7)(3.1g，0.011mol)的无水CH2Cl2(55mL)溶液在搅拌下于13分钟内滴加TEA(1.69mL，0.012mol)，然后滴加步骤C的化合物(5.5)(2.83g，0.011mol)的无水CH2Cl2(55mL)溶液。所得溶液在室温下搅拌1.5小时。然后将有机层用饱和NaHCO3、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤获得化合物(5.8)(4.67g，MH+＝457.2)步骤G化合物(59) 步骤A的化合物(5.2)(0.34g，1.31mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在0℃加入HOBT(0.214g，1.31mmol)、N-甲基吗啉(0.43mL，3.9mmol)和DEC(0.5g，1.09mmol)。将混合物在室温下搅拌15分钟，然后加入步骤F的化合物(5.8)(0.5g，1.09mmol)。所得溶液在冰箱中保存过夜，然后浓缩至干，再用EtOAc-H2O萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3、5％H3PO4和盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，然后过滤，浓缩至干获得化合物(5.9)(0.65g，MH+＝697.4)步骤H化合物(5.10) 步骤G的化合物(5.9)(0.6g，0.8mmol)的无水CH2Cl2(8mL)溶液中加入Dess-Martin试剂(0.732g，1.72mmol)，在室温下搅拌1小时，然后滴加H2O(0.031mL)和Dess-Martin试剂(0.373g，0.86mmol)的CH2Cl2(12mL)溶液。所得溶液在室温下搅拌2.5小时，然后加入50％饱和NaHCO3/50％饱和Na2S2O3(20mL)溶液，然后在室温快速搅拌1.5小时。将溶液用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩至干获得化合物(5.10)(0.588g，100％收率，MH+＝695.2)。制备实施例15步骤A化合物(6.2) 化合物(6.1)(5.0g，19.89mmol)的CH2Cl2(20mL)和DMF(10mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(3.25g，19.89mmol)、EDCl(4.58g，23.87mmol)和N-甲基吗啉(6.56mL，59.69mmol)。所得溶液在室温下搅拌10分钟，然后加入NH4Cl(1.38g)，保持在0℃过夜。将溶液浓缩，用EtOAc-H2O萃取。合并的有机层用NaHCO3、H3PO4、和盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干。粗产物用柱色谱法提纯，用2.5％MeOH/97.5％CH2Cl2洗脱获得化合物(6.2)(1.95g，MH+＝251.1)。步骤B化合物(6.3) 步骤A的化合物(6.2)(12.32g，49.28mmol)的4N HCl/二氧六环(270mL，43.08mmol)溶液在室温下搅拌2小时，然后浓缩至干获得化合物(6.3)(8.40g，100％收率)。步骤C化合物(1.08)(别种合成法) 1-硝基丁烷(16.5g，0.16mol)和乙醛酸.H2O(28.1g，0.305mol)的MeOH(122mL)溶液在0℃-5℃搅拌下，在2小时内滴加三乙胺(93mL，0.667mol)。将溶液加温至室温，搅拌过夜，然后浓缩至干获得油状物。将油状物与水混合，用10％HCl酸化至pH-1，然后用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(6.5)(28.1g，99％收率)。步骤D化合物(6.6) 步骤C的化合物(6.5)(240g，1.35mmol)的乙酸(1.25L)溶液在搅拌下加入10％Pd/C(37g)。所得溶液在59psi氢化3小时，然后在60psi氢化过夜。蒸去乙酸，残余物与甲苯共沸三次，然后用MeOH以及乙醚研磨。然后过滤溶液，再与甲苯共沸两次获得化合物(6.6)(131g，66％收率)。步骤E化合物(1.08) 步骤D的化合物(6.6)(2.0g，0.0136mol)的二氧六环(10mL)和H2O(5mL)溶液在0℃搅拌下加入1N NaOH水溶液(4.3mL，0.014mol)。将所得溶液搅拌10分钟，然后加入Boc酸酐(0.11g，0.014mol)，再在0℃搅拌15分钟。将溶液加温至室温，搅拌45分钟，在冰箱保存过夜，然后浓缩至干获得粗产物。粗产物的EtOAc及冰溶液中加入KHSO4(3.36g)和H2O(32mL)，搅拌4-6分钟。分出有机层，水层用EtOAc萃取两次。合并的有机层用H2O、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(1.08)(3.0g，89.2％收率)。步骤F化合物(1.09) 步骤E的化合物(1.08)(3.0g，0.012mol)的DMF(15mL)和CH2Cl2(15mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(1.97g，0.012mol)、N-甲基吗啉(4.0mL，0.036mol)和EDCl(2.79g，0.0145mol)。将反应物搅拌10分钟，然后加入H-Gly-OBZ.HCl(2.56g，0.013mol)。所得溶液在-20℃搅拌2小时，在冰箱保存过夜，然后浓缩至干，接着用EtOAc稀释。所得EtOAc溶液用饱和NaHCO3、H2O、5％H3PO4、盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(1.09)(4.5g，94％收率，MH+＝395.1)。步骤G化合物(6.9) 步骤F的化合物(1.09)(4.5g，0.0114mol)的4N HCl/二氧六环(45mL)溶液在室温下搅拌45分钟，然后浓缩至干获得化合物(6.9)(4.5g，MH+＝295.1)。步骤H化合物(6.11) Boc-苯基-Gly化合物(6.1)(0.398g，1.58mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)的溶液置于100mL圆底烧瓶中，在-20℃搅拌下加入HOBT(0.258g，1.58mmol)、EDCl(0.364g，1.903mmol)和N-甲基吗啉(0.523mL，4.759mmol)。将混合物搅拌5分钟，然后加入步骤G的化合物(6.9)(0.5g，1.51mmol)和CH2Cl2(5mL)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，然后保存在冰箱中过夜。将反应物浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并的有机层用5％H3PO4和盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(6.11)(0.75g，94％收率，MH+＝528.1)。步骤J化合物(6.12) 步骤H的化合物(6.11)(0.75g，1.423mmol)的4N HCl/二氧六环(21mL)溶液在室温下搅拌3小时，然后浓缩至干获得化合物(6.12)(0.68g，100％收率)。步骤K化合物(6.14)
化合物(6.13)(0.44g，1.725mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-20℃搅拌下加入EDCl(0.39g，2.07mmol)、HOBT(0.18g，1.725mmol)和N-甲基吗啉(0.523mL，4.76mmol)。将反应物搅拌5分钟，然后加入步骤J的化合物(6.12)(0.68g，1.64mmol)的CH2Cl2(7mL)溶液。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，保存于冰箱过夜，然后浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并的有机层依次用5％H3PO4、盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(6.14)(0.59g，54％收率，MH+＝667.3)。步骤L化合物(6.15) 步骤K的化合物(6.14)(0.593g，0.89mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液在搅拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.76g，1.784mmol)。所得溶液在室温下搅拌2小时，然后加入混合物H2O/CH2Cl2。将混合物搅拌45分钟，然后加入50％饱和NaHCO3/50％Na2S2O3(10mL)，再搅拌1.5小时。在溶液中再加入CH2Cl2，有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，用柱色谱提纯，用2.5％MeOH/97.5％CH2Cl2洗脱获得化合物(6.15)(0.48g，82％收率)。步骤M化合物(6.16) 步骤L的化合物(6.15)(0.16g，0.24mmol)的无水EtOH(10mL)溶液在搅拌下加入Pd/C(40.8mg)。将所得溶液剧烈搅拌，然后加入1滴AcOH。然后将溶液在H2气氛下搅拌2小时，再通过硅藻土过滤获得化合物(6.16)(0.133g，95％收率，MH+＝575.3)。步骤N化合物(6.18) 化合物(6.17)(0.5g，1.59mmol))的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(0.259g，1.59mmol)、NMM(0.48g，4.77mmol)和EDCl(0.366g，1.91mmol)。将混合物搅拌5分钟，然后加入步骤G的化合物(6.9)(0.5g，1.51mmol)和CH2Cl2(5mL)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，在冰箱保存过夜，然后浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并有机层后用5％H3PO4和盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(6.18)(0.95g，MH+＝592.1)。步骤O化合物(6.19) 将步骤N的化合物(6.18)(0.93g，1.58mmol)的4N HCl/二氧六环(26mL)溶液在室温下搅拌2小时。然后浓缩至干获得化合物(6.19)(0.96g，100％收率，MH+＝492.1)。步骤P化合物(6.20) 化合物(6.13)(0.51g，2.02mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(0.33g，2.02mmol)、N-甲基吗啉(0.61g，6.06mmol)和EDCl(0.46g，2.42mmol)。将反应物搅拌5分钟，接着加入步骤O的化合物(6.19)(0.94g，1.92mmol)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，然后冷藏过夜，浓缩至干，然后用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并有机层后用5％H3PO4和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(6.20)(1.29g，87％收率)。步骤O化合物(6.21) 步骤P的化合物(6.20)(1.27g，1.74mmol)的无水EtOH(50mL)溶液在搅拌下加入Pd/C(100mg)。将所得溶液剧烈搅拌，然后加入2滴AcOH。接着将溶液氢化2小时，通过硅藻土过滤获得化合物(6.21)(1.07g，96％收率，MH+＝641.1)。步骤R化合物(6.22) 步骤Q的化合物(6.21)(0.25g，0.39mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-25℃搅拌下加入HOBT(0.06g，0.39mmol)、N-甲基吗啉(0.12g，1.17mmol)、EDCl(0.089g，0.469mmol)，搅拌10分钟，接着加入步骤B的化合物(6.3)(0.069g，0.37mmol)。将所得溶液在-25℃搅拌15分钟，冷藏过夜，然后浓缩至干，用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取，合并有机层后依次用5％H3PO4、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(6.22)。步骤S化合物(6.23) 步骤R的化合物(6.22)(0.23g，0.302mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液在搅拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.256g，0.60mmol)。所得溶液在室温下搅拌2小时，然后加入混合物H2O/CH2Cl2，再搅拌45分钟。在反应物中加入50％饱和NaHCO3/50％Na2S2O3(10mL)，将其搅拌1.5小时。溶液中再加入CH2Cl2，然后将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干，在硅胶上用柱色谱法提纯，用1％-3％MeOH/99-97％CH2Cl2洗脱获得化合物(6.23)(0.08g，34％收率，MH+＝771.2)。制备实施例16步骤A化合物(7.2) 化合物(7.1)(0.476g，1.51mmol)的CH2Cl2(60mL)和DMF(60mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(0.246g，1.51mmol)、N-甲基吗啉(0.458g，4.53mmol)和EDCl(0.351g，1.81mmol)。将反应物搅拌5分钟，接着加入制备实施例15步骤F的化合物(6.8)(0.5g，1.51mmol)。所得溶液在-20℃搅拌3小时，然后在冰箱保存过夜，浓缩至干，用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并有机层后依次用5％H3PO4、H2O、盐水洗涤两次，用Na2SO4干燥，浓缩至干获得化合物(7.2)(0.82g，94％收率，MH+＝592.1)步骤B化合物(7.3) 步骤A的化合物(7.2)(0.82g，1.39mmol)的4N HCl/二氧六环(20mL)溶液在室温下搅拌2小时，然后浓缩至干获得化合物(7.3)(0.84g，100％收率，MH+＝492.3)步骤C化合物(7.4) 化合物(6.13)(0.36g，1.40mmol)的CH2Cl2(60mL)和DMF(60mL)的溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(0.228g，1.40mmol)、NMM(0.425g，4.20mmol)和EDCl(0.322g，1.68mmol)。将反应物搅拌5分钟，接着加入步骤B的化合物(7.3)(0.84g，1.40mmol)。所得溶液在-20℃搅拌3小时，然后在冰箱保存过夜，浓缩至干，然后用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取，合并有机层后用5％H3PO4、H2O、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(7.4)(0.57g，57％收率，MH+＝731.3)。步骤D化合物(7.5) 步骤C的化合物(7.4)(0.55g，0.75mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液在搅拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.64g，1.50mmol)。所得溶液在室温下搅拌2小时，然后加入混合物H2O/CH2Cl2。将混合物搅拌45分钟后加入50％饱和NaHCO3/50％Na2S2O3，再搅拌1.5小时。溶液中再加入CH2Cl2，然后将有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩至干获得化合物(7.5)(0.24g，44％收率，MH+＝729.5)。步骤E化合物(7.6) 步骤D的化合物(7.5)(0.10g，0.14mmol)的无水EtOH(20mL)溶液在搅拌下加入Pd/C(20mg)。将所得溶液置于100ml圆底烧瓶中剧烈地搅拌，通入H2，并在H2气氛下搅拌过夜。溶液再通过硅藻土过滤，用EtOH洗涤，浓缩至干获得化合物(7.6)(93mg，100％收率，MH+＝639.1)。制备实施例17 按照制备实施例16步骤A-E的基本相同的方法，在步骤A中用化合物(8.1)代替化合物(7.1)制备化合物(8.2)和(8.3)。制备实施例18步骤A化合物(9.2) (S)(+)-2-苯基甘氨酸(9.1)(15.0g，0.099mol)的苯(350mL)溶液在搅拌下加入对甲苯磺酸.H2O(20.76g，0.116mol)和苄醇(30mL，0.29mol)。所得溶液加热回流过夜，溶液变成浆状。然后将溶液冷却到室温，然后加入乙醚。固体通过多孔(scintered)漏斗过滤，用Et2O洗涤两次，然后在氮气氛下干燥获得固体(35.4g)。然后将固体溶于CH2Cl2，用饱和NaHCO3洗涤。合并有机层后用Na2SO4干燥，浓缩至干获得游离胺(18.1g，75.7％收率)。然后将游离胺溶于乙醚，鼓泡通入1N HCl形成白色沉淀。将沉淀过滤，用乙醚洗涤、真空干燥获得化合物(9.2)(15.2g)。步骤B化合物(9.4) Boc-Gly-OH(9.3)(11.35g，0.0648mol)的无水DMF(100mL)和无水CH2Cl2(100mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(10.5g，0.065mol)、EDCl(13.6g，0.0712mol)和N-甲基吗啉(21.3mL，0.194mol)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，然后加入步骤A的化合物(9.2)(18.0g，0.065mol)。将反应物在-20℃搅拌45分钟，然后将其保存于冰箱过夜。将溶液浓缩至干，然后用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取，合并有机层后用H2O、盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩至干获得化合物(9.4)(26.48g，100％收率，MH+＝399.2)。步骤C化合物(9.5) 步骤B的化合物(9.4)(26.4g，0.065mol)的4N HCl/二氧六环(100mL)溶液在室温下搅拌1小时，然后浓缩至干获得化合物(9.5)(22.69g，100％收率，MH+＝299.1)。步骤D化合物(9.6) 制备实施例15步骤E的化合物(1.08)(15.5g，0.0627mol)的DMF(150mL)和CH2Cl2(150mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(10.22g，0.0626mol)、EDCl(13.2g，0.069mol)和NMM(20.67g，0.188mol)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，然后加入步骤C的化合物(9.5)(21.0g，0.063mol)。将反应物在-20℃搅拌1小时，然后在冰箱保存过夜。再将溶液浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取，合并有机层后用H2O、5％H3PO4和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(9.6)(30.3g，92％收率，MH+＝528.1)。步骤E化合物(9.7) 按照以上的制备实施例18步骤C基本相同的方法制备化合物(9.7)(30.0g，100％收率，MH+＝428.1)。步骤F化合物(9.9) Boc-His(Z)-OH(9.8)(0.5g，1.28mmol)的DMF(5mL)和CH2Cl2(5mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(0.209g，1.28mmol)、EDCl(0.27g，1.41mmol)和NMM(0.42mL，3.85mmol)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，然后加入步骤E的化合物(9.7)(0.673g，1.28mmol)，在-20℃搅拌2小时，然后保存于冰箱过夜。再将溶液浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取，合并有机层后用H2O、5％H3PO4和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩获得化合物(9.9)(0.858g，84％收率，MH+＝799)。步骤G化合物(9.11) 按照制备实施例18步骤C的基本相同的方法制备化合物(9.11)(0.76g，100％收率，MH+＝699.2)。步骤H化合物(9.12) N-Boc-环己基甘氨酸(0.263g，1.026mmol)的DMF(5mL)和CH2Cl2(5mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(0.167g，1.026mmol)、EDCl(0.216g，1.13mmol)和NMM(0.338g，3.078mmol)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，然后加入步骤G的化合物(9.11)(0.754g，1.03mmol)。将反应物在-20℃搅拌1小时，然后将其保存于冰箱过夜。再将溶液浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取。合并有机层后用H2O、5％H3PO4和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(9.12)(0.735g，MH+＝938.4)。步骤I化合物(9.13) 步骤H的化合物(9.12)(0.367g，0.377mmol)的无水CH2Cl2(10mL)溶液在搅拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.32g，0.75mmol)。所得溶液在室温下搅拌2小时。将CH2Cl2、饱和Na2S2O4和饱和NaHCO3加入溶液中，溶液在室温下搅拌1小时。分出有机层，用H2O和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得粗产物(340mg)。粗产物在硅胶上用柱色谱提纯，依次用CH2Cl2和4％MeOH/CH2Cl2洗脱获得化合物(9.13)(150mg，MH+＝936.3)。步骤J化合物(9.14) 步骤I的化合物(9.13)(0.15g，1.6mmol)的无水EtOH(40mL)溶液在搅拌下加入10％Pd/C的50％H2O(w/w)溶液。溶液中通入N2，然后在H2气球中搅拌45分钟。用硅藻土滤出催化剂，用EtOH/CH2Cl2洗涤，然后浓缩至干获得化合物(9.14)(0.116g，MH+＝712.2)。制备实施例19步骤A化合物(10.2) L-3-(1-萘基)丙氨酸(2.0g，9.34mmol)的无水EtOH(200mL)悬浮液装入500mL烧瓶中。然后向溶液中鼓泡通入无水浓HCl(2mL)，溶解所有的固体。在45分钟内将溶液冷却至室温，然后浓缩至干，然后加入EtOH(50mL)、10％Pd/C(300mg)和5％Rh/C(300mg)。所得溶液放入parr震荡器并在60psi压力下氢化。反应物通过硅藻土过滤，用EtOH洗涤，浓缩至干获得粗产物(2.4g，MH+＝254.2)。将粗产物溶于CH2Cl2中，然后用饱和NaHCO3洗涤。合并有机层后浓缩至干，在硅胶上用柱色谱法提纯，用5％-20％EtOAc/CH2Cl2洗脱获得化合物(10.2)(0.65g)。步骤B化合物(10.3) N-Boc-环己基甘氨酸(0.643g，2.5mmol)的DMF(5mL)和CH2Cl2(5mL)溶液在-20℃搅拌下加入HOBT(0.407g，2.5mmol)，EDCl(0.527g，2.75mmol)和NMM(0.825mL，7.5mmol)。将所得溶液在20℃搅拌10分钟，然后加入步骤A的化合物(10.2)和CH2Cl2(3mL)，保存于冰箱过夜。再将溶液浓缩至干，接着用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取，合并有机层后用H2O、5％H3PO4和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(10.3)(1.12g，92％收率)。步骤C(10.4) 步骤B的化合物(10.3)(1.1g，2.25mmol)的MeOH(30mL)和H2O(7.5mL)溶液在搅拌下加入LiOH(0.283g，6.75mmol)。所得溶液在室温下搅拌过夜，然后加入5％H3PO4。形成沉淀，蒸发溶液除去大部分的MeOH。再加入CH2Cl2，分出CH2Cl2层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(10.4)(1.068g，100％收率，MH+＝459.1)。步骤D化合物(10.5) 步骤C的化合物(10.4)(1.0g，2.17mmol)的DMF(10mL)和CH2Cl2(10ML)溶液在搅拌下加入HOBT(0.353g，2.17mmol)、EDCl(0.457g，2.38mmol)和NMM(0.715mL，6.51mmol)。所得溶液在-20℃搅拌10分钟，然后加入制备实施例18步骤E的化合物(9.7)(1.13g，2.17mmol)。将反应物在-20℃搅拌0.5小时，然后保存于冰箱过夜。再将溶液浓缩至干，然后用NaHCO3的饱和EtOAc溶液萃取，合并有机层后用H2O、5％H3PO4和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干获得化合物(10.5)(1.8g，M+Na＝890.4)。步骤E化合物(10.6) 步骤D的化合物(10.5)(1.8g，2.07mmol)的无水CH2Cl2(40mL)溶液在搅拌下加入Dess-Martin全碘烷(1.76g，4.15mmol)。所得溶液在室温下搅拌1小时，接着在1.5小时内滴加无水CH2Cl2(40mL)和H2O(0.074mL)，再搅拌2小时。在上述溶液中加入40mL 50％饱和NaHCO3/50％饱和Na2S2O4，将所得溶液剧烈搅拌半小时。然后分出有机层，用H2O洗涤。合并有机层后浓缩至干，在硅胶上用柱色谱法提纯，用2％-3％MeOH/CH2Cl2洗脱获得化合物(10.6)(0.95g，MH+＝866.2)。步骤F化合物(10.7) 按照制备实施例18步骤K的基本相同的方法制备化合物(10.7)。实施例用制备实施例1步骤A和制备实施例2步骤F的方法偶联；用制备实施例1步骤B、制备实施例1步骤F、制备实施例2步骤D和制备实施例4步骤J的方法进行酯去保护；用制备实施例2步骤E和制备实施例4步骤J的方法进行胺去保护以及用制备实施例4步骤H的方法将羟基酰胺氧化成酮酰胺，与上述实施例的α-氨基酸或市售α-氨基酸或文献介绍的α-氨基酸一起以必要的不同组合制备附表2列出的化合物。固相合成固相偶合反应的一般方法合成是在反应容器中完成，容器由在底部装配有聚丙烯滤板(frit)的聚丙烯注射针筒构成。Fmoc-保护的氨基酸用标准固相技术偶合。每个反应容器中装入100mg的初始Fmoc-Sieber树脂(大约0.035mmol)。树脂用每份2mL的DMF(2次)洗涤。用2mL 20％v/v的哌啶DMF溶液处理20分钟去除Fmoc保护基团。树脂用每份2mL的DMF洗涤(4次)。偶合在DMF(2mL)中完成，使用0.12mmol Fmoc-氨基酸、0.12mmol HATU[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸盐]和0.24mmol DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)。振荡2小时后，排干反应容器，将树脂用每份2mL的DMF(4次)洗涤。用下一个Fmoc-氨基酸或封端基团重复偶合过程。固相Dess-Martin氧化的一般方法合成是在反应容器中进行，容器由在底部装配有聚丙烯滤板的聚丙烯注射针筒构成。结合在树脂上的羟基化合物(大约0.035mmol)用0.14mmol Dess-Martin全碘烷和0.14mmol t-BuOH的2mL DCM溶液处理4小时。树脂用每份2mL的20％v/v iPrOH的DCM溶液、THF、50％v/v THF的水溶液(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗涤。制备实施例20N-Fmoc-2’，3’-二甲氧基苯基甘氨酸化合物(901)
氰化钾(1.465g，22.5mmol)和碳酸铵(5.045g，52.5mmol)的水(15mL)溶液中加入2，3-二甲氧基苯甲醛901A(2.5g，15mmol)的乙醇(15mL)溶液。将反应物混合物在40℃加热24小时。减压蒸发使溶液体积减至10mL。加入浓盐酸(15mL)，获得白色沉淀化合物901B。过滤分离出化合物901B(2.2g，9.3mmol)。将化合物901B溶于10％w/w氢氧化钠水溶液(15mL)，所得溶液加热回流24小时。加入浓盐酸，调节pH值至中性(pH7)。将所得包含化合物901C的溶液减压蒸发。将残余物溶于5％w/w碳酸氢钠水溶液(150mL)。溶液在冰浴中冷却至0℃，并在0℃加入1，4-二氧六环(30mL)和9-芴基甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯(2.7g，8mmol)的1，4-二氧六环(30mL)溶液。将反应混合物加温至室温，在室温下搅拌24小时。减压蒸去1，4-二氧六环。用乙醚洗涤水溶液。加入浓盐酸调节pH值至酸性(pH1)。加入乙酸乙酯，有机层用水和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得所需的白色泡沫状固体化合物901(3.44g，7.9mmol)。MS(LCMS-电喷雾)434.1MH+。制备实施例21化合物(801) 将N-Fmoc-苯基丙氨酸801A(5g，12.9mmol)的无水DCM(22mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷却至-30℃，依次加入N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)和氯甲酸甲酯(1.2mL，15.5mmol)。反应混合物在-30℃搅拌1小时，加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(1.51g，15.5mol)和N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)的无水DCM(8mL)溶液。将反应混合物加温至室温，并在室温下搅拌过夜。加入甲苯，将有机层用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得化合物801B(4g，9.29mmol)。
Red-Al(6.28mL，21.4mmol)的无水甲苯(8mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷却至-20℃，加入化合物801B(4g，9.29mmol)的无水甲苯(12mL)溶液。将反应混合物在-20℃搅拌1.5小时。有机层用稀盐酸、碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂，粗产物801C在下一步反应使用时无需再提纯。
化合物801C(大约9.29mmol)的己烷(15mL)溶液中依次加入氰化钾(24mg，0.37mmol)和碘化叔丁基铵(34mg，0.092mmol)的水(4mL)溶液以及丙酮合氰化氢(1.27mL，13.9mmol)。将反应混合物在室温下搅拌24小时。加入乙酸乙酯，有机层用水和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得化合物801D(2.4g，6.03mmol)。
化合物801D(2.4g，6.03mmol)的1，4-二氧六环(11mL)溶液中加入浓盐酸(11mL)。将反应混合物在80℃加热3小时。加入乙酸乙酯(25mL)和水(25mL)。有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂获得所需白色泡沫状固体化合物801(2g，4.8mmol)。MS(LCMS-电喷雾)418.1 MH+。实施例101J化合物(101J) 流程5(见下一页)
结合在树脂上的化合物101B、101C、101D、101E、101F和101G从100mg Fmoc-Sieber树脂(0.035mmol)开始，按照固相偶合反应的一般方法制备。按照固相Dess-Martin氧化的一般方法，将结合在树脂上的化合物101G氧化成结合在树脂上的化合物101H。将结合在树脂上的化合物101H用4mL 2％v/v TFA的DCM溶液处理5分钟。滤液加入到1mL AcOH中，将溶液真空离心浓缩获得化合物101J(0.011g，45％收率)。MS(LCMS-电喷雾)703.2 MH+。
利用上文定义的固相合成技术，按照以下结构式制备及使用下列部分 -P1a和P1b其中之一为H，另一个选自
利用上文介绍的方法制备附表3的化合物，所述化合物及其活性数据列于表中。
此外制备附表4中列出的化合物及其活性数据。它们的制备介绍如下。在固相载体上制备表4化合物的一般方法固相合成可用于小量生产本发明的某些化合物。与常规固相合成肽一样，用于固相合成肽基酮酰胺的反应釜包括一个反应容器，反应容器至少有一面可渗透溶剂以及溶解的试剂，但不能渗透所选粒径的合成树脂。这样的反应釜包括带有多孔玻璃滤板的玻璃固体反应容器、带滤板的聚丙烯管或柱或者由Irori Inc.，San Diego CA生产的KansTM反应器。反应釜类型的选择根据所需要的固相树脂体积而定，不同类型的反应釜可在合成的不同阶段使用。下面的方法将在接下来的实施例中引用方法A偶合反应在树脂的N-甲基吡咯烷(NMP)(10-15mL/克树脂)悬浮液中加入N-Fmoc或N-Boc-氨基酸(2eq)、HOAt(2eq)、HATU(2eq)和二异丙基乙胺(4eq)。让混合物反应4-48小时。将反应物排出，树脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(用10-15mL溶剂/克树脂)洗涤。然后真空干燥树脂。
方法B去除Fmoc保护Fmoc-保护的树脂用20％哌啶的二甲基甲酰胺(10mL试剂/g树脂)处理30分钟。将反应物排出，树脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(10mL溶剂/克树脂)洗涤。
方法C去除Boc保护Boc-保护的树脂用1∶1的二氯甲烷和三氟乙酸混合物处理20-60分钟(10mL溶剂/克树脂)。将反应物排出，树脂依次用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、5％二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和二甲基甲酰胺(10mL溶剂/克树脂)洗涤。
方法D缩氨基脲水解将树脂悬浮于由三氟乙酸∶丙酮酸∶二氯甲烷∶水9∶2∶2∶1组成的裂解混合物(10mL/g树脂)处理2小时。将反应物排出。将此步骤再重复3次。树脂依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷洗涤，真空干燥。
方法EHF裂解将干燥的肽-nVal(CO)-G-O-PAM树脂(50mg)置于包含一根小型搅拌棒的HF容器。加入清除剂苯甲醚(总体积的10％)。在存在谷氨酸和半胱氨酸氨基酸下，加入苯硫基甲烷(10％)和1，2-乙二硫醇(0.2％)。然后将HF容器安装在HF仪器(ImmunoDynamics)，系统充溢氮气5分钟。将其用干冰/异丙醇浴冷却至-78℃。20分钟后，蒸馏HF至所需体积(10mL HF/g树脂)。让反应物在0℃继续反应1.5小时。用氮气逐步移出所有HF。然后将二氯甲烷加入树脂中，搅拌此混合物5分钟。接着加入20％的乙酸水(4mL)溶液。搅拌20分钟后，树脂用多孔漏斗过滤，减压除去二氯甲烷。剩余的溶液用己烷(3×)洗涤除去清除剂。同时，将树脂在1mL甲醇中浸湿。将水层(20％HOAc)返回树脂中，将混合物搅拌5分钟后过滤。减压除去甲醇，冻干水层，然后将肽溶于10-25％甲醇(包含0.1％三氟乙酸)，用反相HPLC提纯。II)合成中间体实施例I.合成Boc-3-烷基亚硫酰基丙氨酸 氢化钠(20mmol，800mg 60％油溶液，用己烷洗涤)在四氢呋喃(30mL)中的混合物在0℃下于10分钟内加入烷基硫醇(20mmol，R＝Ph，R＝1-萘基，R＝2-萘基，R＝PhCH2CH2或R＝Et)。除去冷却浴，继续搅拌10分钟，在此期间加入Boc-2S-氨基丙酰基内酯(参阅SyntheticCommunications，(1995)25(16)，2475-2482)(3.74g，20mmol)。用冰浴使其温度保持不超过30℃。将反应混合物在室温下搅拌16小时，浓缩后溶于1M硫酸氢钾水溶液(200mL)和1M HCl(40mL)。混合物用二氯甲烷(2×200mL)萃取。合并有机层后干燥(硫酸钠)，过滤，浓缩。残余物溶于水(200mL)、甲醇(30mL)和碳酸钾(40mmol，5.5g)。冷却并保持在室温的情况下，分批加入过硫酸氢钾制剂(21mmol，13.0g)。将混合物搅拌18小时后真空浓缩除去甲醇。溶液用2M硫酸氢钾酸化(pH＝1)，然后用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并有机层后干燥(硫酸钠)，过滤，浓缩。用反相HPLC提纯。纯化后的产物用酸碱萃取除去去boc化物质而进一步提纯，然后以二异丙基乙铵盐形式保存移防止进一步分解(失去Boc基团)。实施例II.合成2-(1-甲基乙基)-7-甲基-辛-4-烯酸 上述中间体按照公开的方法制备(Wuts，P.G.M.；Ritter，A.R.；Pruitt，L.E.J.Org.Chem.(1992)57，6696-6700)。实施例III.合成Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OH(以下步骤1-7) 步骤1.合成异氰基乙酸烯丙酯(以下步骤a-b)a)合成异氰基乙酸钾盐 将异氰基乙酸乙酯(96.6ml，0.88mol)滴加入乙醇(1.5L)和氢氧化钾(59.52g，1.0mol)的冷冻溶液。将反应物缓慢地加温至室温。2小时后，过滤收集沉淀产物，分几次用冷冻乙醇洗涤。如此获得的异氰基乙酸的钾盐经过真空干燥获得金褐色固体(99.92g，91.8％)。
b)合成异氰基乙酸烯丙酯 步骤a的产物(99.92g，0.81mol)溶解于乙腈(810ml)中，加入稀丙基溴(92ml，1.05mol)。加热回流4小时后获得深褐色溶液。将反应混合物浓缩，剩下的残余物溶于乙醚(1.5L)，用水(3×500ml)洗涤。干燥有机层，过滤，浓缩获得深褐色浆状物。粗产物在7mm Hg(98℃)下真空蒸馏提纯获得澄清的油状物(78.92g，78％)。NMR ppm(CDCl3)5.9(m，1H)，5.3(m，2H)，4.7(d，2H)，4.25(s，2H)。步骤2.合成9-芴基甲氧羰基-正缬氨醛(以下步骤a-c)
a)合成9-芴基甲氧羰基-L-正缬氨酸甲酯(Fmoc-nVal-OMe) 商业获得性Fmoc-L-nVal(25g，73.75mmol)的无水甲醇(469ml)冷冻溶液在1小时内加入亚硫酰氯(53.76ml，737.5mmol)。TLC用乙酸乙酯经过1小时后证实反应完成(Rf＝0.85)。将反应混合物浓缩，残余物溶于乙酸乙酯。有机层依次用饱和碳酸氢钠(3×200ml)、盐水(200ml)洗涤。干燥有机层，过滤，浓缩获得白色固体Fmoc-nVal-OMe(产量26.03g)。NMR ppm(CD3OD)7.7(m，2H)，7.6(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3(m，2H)，4.1(m，2H)，3.7(s，3H)，1.7(m，1H)，1.6(m，1H)，1.4(m，2H)，0.95(t，3H)。
b)合成9-芴基甲氧羰基-正缬氨醇(Fmoc-正缬氨醇) Fmoc-nVal-OMe(26.03g，73.75mmol)的四氢呋喃(123ml)和甲醇(246ml)溶液中加入氯化钙(16.37g，147.49mmol)。将反应混合物冷却至0℃，分几批加入硼氢化钠(11.16g，294.98mmol)。在获得的稠糊状物中加入500ml甲醇，反应物在室温下搅拌90分钟。TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷证实反应完成(Rf＝0.25)。反应通过缓慢加入0℃的100ml水猝灭。减压除去甲醇，剩余的水相用乙酸乙酯稀释。有机层用水(3×500ml)、饱和碳酸氢钠(3×500ml)和盐水(500mol)洗涤。用硫酸钠干燥有机层，浓缩至白色固体(21.70g，90.5％)。NMR ppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.7(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3-4.5(m，2H)，4.2(m，1H)，3.6(s，1H)，3.5(s，2H)，1.5(m，1H)，1.3-1.4(m，3H)，0.99(m，3H)。
c)合成9-芴基甲氧羰基-正缬氨醛(Fmoc-nVal-CHO) 在Fmoc-正缬氨醇(21.70g，66.77mmol)的二氯甲烷(668ml)溶液中加入三乙胺(37.23ml，267mmol)，将溶液冷却至0℃。吡啶三氧化硫络合物(42.51g，267mmol)的二甲基亚砜(96ml)悬浮液加入到上述冷冻溶液中。1小时后，TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷证实反应完成。减压除去二氯甲烷，将残余物溶于乙酸乙酯中，用水(2×50ml)、1N饱和硫酸氢钠(2×50ml)、饱和碳酸氢钠(2×50ml)和盐水(50ml)洗涤。浓缩有机层获得白色固体。获得理论产量(21.57g)，反应物直接进行下一步骤而无需再提纯。步骤3.合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸盐(以下步骤a-b)a)合成Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷 羰基二咪唑(16.2g，0.10mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液在30分钟内滴加肼基甲酸叔丁酯(13.2g，0.100mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液。在接下来的30分钟内加入二苯基甲胺(18.3g，0.10mol)。将反应物在室温下搅拌1小时。加入水(10ml)后将混合物减压浓缩至约150ml。将此溶液倾入水(500ml)中，用乙酸乙酯(400ml)萃取。乙酸乙酯相用1N HCl(2×75ml)、H2O(2×75ml)、饱和碳酸氢钠溶液(2×75ml)和氯化钠(2×75ml)洗涤，用硫酸镁干燥。将混合物过滤，浓缩溶液获得白色泡沫状产物29.5g(85％收率)。所得产物可以用乙酸乙酯/己烷重结晶提纯，但是上述产物纯度足以在下一步直接使用mp 142-143℃ 1H NMR(CDCl3)d 1.45(s，9H)，6.10(dd，2H)，6.42(s，1H)，6.67(bs，1H)，7.21-7.31(m，10H)。C19H23N3O3的分析值C，66.84；H，6.79；N，12.31。实测值C，66.46；H，6.75；N；12.90。
b)合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸盐 Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷(3.43g，10mmol)的二氯甲烷(12.5ml)溶液在室温下用三氟乙酸(12.5ml)处理，搅拌30分钟。将溶液滴加到75ml乙醚，过滤收集所得固体(2.7g，80％)。mp 182-184℃。1H NMR(CD3OD)d 6.05(s，1H)，7.21-7.35(m，10H)。13C NMR(CD3OD)d57.6，118.3(q，CF3)，126.7，127.9，141.6，156.9，160.9(q，CF3CO2H)。步骤4.合成Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-CHO(实施例III，步骤2c)(5.47g，16.90mmol)的二氯甲烷(170ml)溶液中加入异氰基乙酸烯丙酯(实施例III，步骤1b)(2.46ml，20.28mmol)和吡啶(5.47ml，67.61mmol)。将反应混合物冷却至0℃，滴加三氟乙酸(3.38ml，33.80mmol)。将反应物在0℃搅拌1小时，然后在室温下搅拌48小时。TLC采用乙酸乙酯证实反应完成。将反应混合物浓缩，并用含20％-70％乙酸乙酯的己烷进行快速色谱法提纯。合并包含所需产物部分，浓缩至白色泡沫状(6.88g，87.3％)。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷显示出一个斑点(Rf＝0.37)。NMRppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.65(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，5.9(m，1H)，5.1-5.4(m，2H)，4.55-4.65(m，2H)，4.3-4.4(m，2H)，4.15-4.25(m，1H)，4.01(s，1H)，3.9-4.0(m，3H)，1.5-1.6(m，2H)，1.35-1.45(m，3H)，0.9(m，3H)。步骤5.合成Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基(步骤4)(5.01g，10.77mmol)的二甲基亚砜(100ml)和甲苯(100ml)溶液中加入EDC(20.6g，107.7mmol)。将反应混合物冷却至0℃，滴加二氯乙酸(4.44ml，53.83mmol)。反应物在0℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌1小时。在0℃下加入水(70ml)，减压除去甲苯。残余物用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤几次，再用1N硫酸氢钠和盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，浓缩。获得理论产量4.99g，反应物直接进入下一步骤而无需再提纯。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷显示一个斑点(Rf＝0.73)。步骤6.合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基(步骤5)(4.99g，10.75mmol)的乙醇(130ml)和水(42ml)溶液中加入二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸盐(实施例III，步骤3b)(7.6g，21.5mmol)和乙酸钠·3H2O(1.76g，12.9mmol)。将反应混合物加热回流90分钟。用薄层色谱法以1∶1乙酸乙酯∶己烷证实反应完成。减压除去乙醇，残余物溶于乙酸乙酯，用1N硫酸氢钠(2×10ml)、饱和碳酸氢钠(2×10ml)和盐水(2×10ml)洗涤。干燥有机层，过滤，浓缩。用快速色谱法提纯所得残余物，使用含20％到50％乙酸乙酯的己烷，获得白色固体(5.76g，78％)。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷显示出两个斑点(顺式异构体和反式异构体)，Rf＝0.42和0.50。步骤7.合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基(实施例III，步骤6)(4.53g，6.59mmol)的四氢呋喃(300ml)溶液中先加入双甲酮(4.62g，32.97mmol)，然后加入四(三苯膦)钯(O)催化剂(0.76g，0.66mmol)。在90分钟后，用TLC(9∶1二氯甲烷∶甲醇)证实反应完成。将反应混合物浓缩，剩余的残余液溶于乙酸乙酯，用0.1M磷酸氢钾(3×50ml)洗涤。有机层用50ml亚硫酸氢钠处理，将两相体系搅拌15分钟。将两相分离，此步骤再重复两次。干燥有机层，过滤，浓缩，用快速柱色谱法(含20％-100％乙酸乙酯的己烷，然后用9∶1二氯甲烷∶甲醇)处理获得白色固体(3.99g，94％)。TLC用9∶1二氯甲烷∶甲醇显示两个斑点(顺式异构体和反式异构体)。NMRδppm(CD3OD)7.75(m，2H)，7.6(m，3H)，7.2-7.4(m，14H)，6.1-6.2(m，1H)，4.25-4.4(m，2H)，4.1-4.2(m，2H)，3.85(s，2H)，1.6-1.8(m，2H)，1.3-1.5(m，2H)，0.95(t，3H)。实施例IV.合成H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂(以下步骤1-2) 步骤1.合成H-Phg-MBHA树脂 将商业获得性MBHA树脂(2.6g，1.12mmol/g，2.91mmol)转移到250ml配置了氮气入口的烧结固相反应容器。将其用每份30ml的二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，根据方法A将其与商业获得性Fmoc-Phg-OH(2.17g，5.82mmol)偶合18小时，反应效率为99.82％。然后按照方法B将树脂去除Fmoc保护。对少量试样的茚三酮定性检测获得深蓝色树脂和溶液，说明反应成功。步骤2.合成H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 以上步骤1获得的树脂(2.6g，0.8mmol/g，2.91mmol)按照方法A与Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH(实施例III，步骤7)(5.82mmol，3.77g)反应。在18小时后，用茚三酮定量分析显示偶合效率为99.91％。将树脂按照方法B除去Fmoc保护。对少量试样的定性茚三酮检测获得深蓝色树脂和溶液，说明反应成功。III)典型丙型肝炎靶的固相装配实施例V.固相合成2，5-二氟-6-羟基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH2(以下步骤1-5) 步骤1.合成Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将化合物H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂(实施例IV，步骤2)(1.5g，1.12mmol/g，1.68mmol)转移到滤板型聚丙烯管中，按照方法A与N-Fmoc-Leu-OH(890mg，2.52mmol)偶合。在18小时后，用茚三酮定性分析显示无色珠状物以及无色溶液。步骤2.合成Fmoc-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将实施例V步骤1获得的树脂(Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂，1.68mmol)按照方法B进行除去Fmoc保护程序。然后按照方法A与商业获得性Fmoc-G(Chx)-OH(0.956g，0.2.52mmol)偶合。18小时后，茚三酮的定量分析显示偶合效率为98％。步骤3.合成2，5-二氟-6-羟基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 实施例V步骤2获得的树脂(Fmoc-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)按照方法B除去Fmoc保护。对少量试样的茚三酮检测获得深蓝色树脂和溶液，说明反应成功。将树脂(150mg，0.168mmol)悬浮于1ml NMP，加入3，6-二氟邻苯二甲酸酐(91mg，0.42mmol)，然后加入二异丙基乙胺(0.146ml，84mmol)，再将反应混合物在室温下振荡18小时。茚三酮定量分析显示偶合效率为97.8％。步骤4.合成2，5-二氟-6-羟基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA树脂 实施例V步骤3的化合物(2，5-二氟-6-羟基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)(200mg)按照方法D进行缩氨基脲水解。步骤5.合成2，5-二氟-6-羟基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-NH2 将实施例V步骤4的树脂(2，5-二氟-6-羟基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA树脂)(100mg)置于HF裂解条件(方法E)获得所需的粗产物。粗产物通过HPLC提纯，采用2.2×25cm反相柱，包含由300埃孔径的10微米胶粒组成的C-18树脂，使用20-50％乙腈水溶液梯度洗脱。分析HPLC用4.6×250mm反相柱，包含由300埃孔径的5微米胶粒组成的C-18树脂，用10-60％乙腈水溶液洗脱(包含0.1％三氟乙酸)，在17.2分钟显示一个峰。用低分辨率质谱证实的所需要的物质(MH+771.5)。实施例VI.固相合成iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH2(以下步骤1-5) 步骤1.合成Fmoc-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将化合物H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂(实施例IV，步骤2)(0.17g，0.8mmol/g，0.19mmol)转移到滤板型聚丙烯管，按照方法A与Boc-Cys((O2)Et)-OH(实施例1)(160mg，0.38mmol)偶合。在18小时后，茚三酮定量分析显示偶合完成99.98％。步骤2.合成Fmoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将前一步骤获得的树脂(实施例VI，步骤1)(Boc-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂，0.19mmol)按照方法C除去Boc保护。然后按照方法A与Fmoc-G(Chx)-OH(0.170g，0.45mmol)偶合。在18小时后，茚三酮定量分析显示偶合效率为99.92％。步骤3.合成iBoc-G(Chx)-Cys(O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂 将前一步骤获得的树脂(实施例VI，步骤2)(Fmoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂)按照方法B除去Fmoc保护。对少量试样的茚三酮检测获得深蓝色树脂和溶液，说明反应成功。将上述树脂(170mg，0.19mmol)悬浮于1ml NMP中，加入氯甲酸异丁酯(0.06ml mg，0.45mmol)，然后加入二异丙基乙胺(0.16ml，0.90mmol)，再将反应混合物在室温下振荡18小时。茚三酮定量分析显示偶合效率为99.35％。步骤4.合成iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA树脂 前一步骤的化合物(实施例VI，步骤3)iBoc-G(Chx)-Cys(O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA树脂(170mg)按照方法D进行缩氨基脲水解。步骤5.合成iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-NH2 将前一步骤的树脂(实施例VI，步骤4)(iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA树脂)(170mg)置于HF裂解条件(方法E)，获得所需要的粗产物。将粗产物用HPLC提纯用2.2×25cm反相柱，包含由300埃孔径的10微米胶粒组成的C-18树脂，使用20-50％乙腈水溶液梯度洗脱。分析HPLC用4.6×250mm反相柱，包含由300埃孔径的5微米胶粒组成的C-18树脂，用10-60％乙腈水溶液洗脱(包含0.1％三氟乙酸)，在16.94分钟显示一个峰。用低分辨率质谱证实为所需要的物质(MH+737.5)。检测HCV蛋白酶抑制活性分光光度分析按照R.Zhang等(Analytical Biochemistry，270(1999)268-275，其公开内容通过引用结合到本文中)介绍的方法对本发明化合物进行HCV丝氨酸蛋白酶的分光光度分析。基于蛋白分解显色酯底物的分析适合连续监测HCV NS3蛋白酶活性。底物衍生自其C末端羧基被4个不同发色醇(3-或4-硝基酚、7-羟基-4-甲基-香豆素或4-苯基偶氮酚)之一酯化的NS5A-NS5B连接序列(Ac-DTEDVVX(Nva)(其中X＝A或P)的P侧。下面介绍这些新的分光光度性酯底物的合成、表征和在高通量筛选中的应用，并且详细介绍HCV NS蛋白酶抑制剂的动力学评价。
材料和方法材料分析用有关缓冲液的化学试剂得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri)。肽合成试剂得自Aldrich Chemicals、Novabiochem(San Diego，California)、Applied Biosystems(Foster City，California)和Perseptive Biosystems(Framingham，Massachusetts)。人工合成肽，或者用自动ABI431A型合成仪(Applied Biosystems)合成肽。LAMBDA 12型UV/VIS分光计得自Perkin Elmer(Norwalk，Connecticut)，96孔UV板得自Corning(Corning，New York)。预热均温块(Prewarming block)得自USA Scientific(Ocala，Florida)，96孔板涡旋器得自Labline Instruments(Melrose Park，Illinois)。Spectramax Plus微量滴定板读数仪(带有单色计)得自Molecular Devices(Sunnyvale，California)。
酶制备使用以前公开的方法(D.L.Sali等，Biochemistry，37(1998)3392-3401)制备重组HCV NS3/NS4A异源二聚体蛋白酶(菌株1a)。蛋白浓度使用预先通过氨基酸分析定量的重组HCV蛋白酶标准品通过Biorad染料方法测定。开始分析前，采用Biorad Bio-Spin P-6预填柱使酶贮藏缓冲液(50mM磷酸钠pH8.0，300mM氯化钠，10％甘油，0.05％月桂基麦芽糖苷和10mM DTT)交换为检测缓冲液(25mMMOPS pH6.5，300mM氯化钠，10％甘油，0.05％月桂基麦芽糖苷，5μMEDTA和5μM DTT)。
底物合成与纯化根据R.Zhang等(同上)报道合成底物，合成开始时用标准方法(K.Barlos等，Int.J.Pept.Protein Res.，37(1991)，513-520)使Fmoc-Nva-OH固定在2-氯三苯甲基氯树脂上。随后利用Fmoc化学装配肽，或者人工进行或者采用自动ABI431型肽合成仪。N-乙酰化且完全保护的肽片断经过10％乙酸(HOAC)和10％三氟乙醇(TFE)的二氯甲烷(DCM)溶液处理30分钟，或者经过2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液处理10分钟后与树脂断开。共沸蒸发合并的滤液和DCM洗涤液(或者重复用碳酸钠水溶液萃取)，以去裂解时使用的酸。DCM相用硫酸钠干燥后蒸发。
所述酯底物用标准酸-醇偶合方法(K.Holmber等，Acta Chem.Scand.，B33(1979)410-412)装配。肽片段溶解于无水吡啶(30-60mg/ml)，其中加入10摩尔当量发色团和催化量(0.1eq.)对甲苯磺酸(pTSA)。加入二环己基碳二亚胺(DCC，3eq.)启动偶合反应。用HPLC监测产物形成，在室温下反应12-72小时后证实反应完毕。吡啶溶剂通过真空蒸发除去，进一步与甲苯共沸除去。肽酯用95％TFA的DCM溶液去保护2小时，用无水乙醚萃取3次以去除过量发色团。去保护底物在C3或C8柱上通过反相HPLC纯化，用30％-60％乙腈梯度洗脱(用6个柱体积)。HPLC纯化后的总收率约20-30％。电喷雾离子化质谱证实分子量。底物以干粉干燥保藏。
底物及产物光谱用pH6.5检测缓冲液获得底物和相应的发色团产物的光谱。利用多个稀释度以1-cm比色杯于优化非高峰波长(3Np和HMC为340nm，PAP为370nm，4-Np为400nm)检测消光系数。优化非高峰波长的定义为底物和产物之间产生最大吸光度差异((产物OD-底物OD)/底物OD)的波长。
蛋白酶分析在96孔微量滴定板中用200μl反应混合物于30℃进行HCV蛋白酶分析。对NS3/NS4A异源二聚体优化检测缓冲条件(25mM MOPS pH6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％月桂基麦芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)(D.L.Sali等，同上)。通常，将150μl的缓冲剂、底物和抑制剂的混合物加入各孔中(DMSO终浓度为4％v/v)，使其于30℃预温育约3分钟。然后用50μl在检测缓冲液中的蛋白酶预热溶液(12nM，30CC)启动反应(终体积为200μl)。用配备有单色器的Spectromax Plus微量滴定板读数仪(采用截止滤光片型板读数仪可获得可接受的结果)，在合适波长(3Np和HMC为340nm，PAP为370nm，4-Np为400nm)在检测时间(60分钟)范围内监测各板的吸光度变化。相对于用作非酶水解对照的无酶空白，在合适波长监测Nva和发色团之间的酯键的蛋白裂解。在30倍底物浓度范围内(约6-200μM)评价底物动力学参数。用线性回归确定初速度，采用非线性回归分析(Mac Curve Fit 1.1，K.Raner)用实验数据拟合Michaelis-Menten方程，获得动力学常数。计算酶变率(kcat)，假定酶全部具有活性。
抑制剂和灭活剂的评价对竟争性抑制剂Ac-D-(D-Gla)-L-I-(Cha)-C-OH(27)、Ac-DTEDVVA(Nva)-OH和Ac-DTEDVVP(Nva)-OH，实验测定固定浓度酶和底物的抑制常数，根据用于竟争性抑制动力学的重排Michaelis-Menten方程vo/vi＝1+[l]o/(Ki(1+[S]o/Km))，其中vo为非抑制初速度，vi为存在任何已知抑制剂浓度([l]o)抑制剂的初速度，[S]o为所使用的底物浓度；用vo/vi对抑制剂浓度([l]o)作图。用线性回归拟合获得的数据，用获得的斜率1/(Ki(1+[S]o/Km)计算Ki*值。
在以上各表中给出了获得的本发明不同化合物的Ki*值，其中的化合物按照Ki*顺序排列。根据上述试验结果，熟练技术人员显而易见的是，本发明化合物具有良好的NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂作用。
尽管结合上述具体实施方案阐明了本发明，但是本发明的许多替代、改进及其它变化方案对本领域普通技术人员是显而易见的。所有这样的替代、改进及变化方案均属于本发明实质及范畴。表2 表3 表4
权利要求
1.一种化合物，包括该化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体和互变异构体，以及该化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物具有式I所示的通式结构式I 其中G、J和Y可以相同或不同并且独立选自以下基团H、烷基、烷基-芳基、杂烷基、杂芳基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、杂芳氧基、杂环烷氧基、环烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、环烷基氨基和杂环烷基氨基，前提是Y可以另外任选被X11或X12取代；X11选自以下基团烷基、链烯基、链炔基、环烷基、环烷基-烷基、杂环基、杂环基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂芳基、烷基杂芳基或杂芳基烷基，前提是X11可以另外任选被X12取代；X12为羟基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰氨基、芳基亚磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、羧酰胺基、烷氧基羰基氨基、烷氧基羰氧基、烷基脲基、芳基脲基、卤素、氰基或硝基，前提是所述烷基、烷氧基和芳基可以另外任选被独立选自X12的部分取代；R1为COR5或B(OR)2，其中R5选自以下基团H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6和COR7，其中R7选自以下基团H、OH、OR8、CHR9R10和NR9R10，其中R6、R8、R9和R10可以相同或不同并且独立选自以下基团H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、环烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’ 、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11和CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’可以相同或不同并且独立选自以下基团H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基和杂芳烷基；Z选自O、N或CH；W可能存在或者不存在，且当W存在时，W选自C＝O、C＝S或SO2；R、R’、R2、R3和R4独立选自以下基团H；C1-C10烷基；C2-C10链烯基；C3-C8环烷基；C3-C8杂环烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；氧、氮、硫或磷原子(所述氧、氮、硫或磷原子的数目为0-6个)；(环烷基)烷基和(杂环烷基)烷基，其中所述环烷基的组成为3-8个碳原子，0-6个氧、氮、硫或磷原子，而所述烷基具有1-6个碳原子；芳基；杂芳基；烷基-芳基；烷基-杂芳基；其中所述烷基、杂烷基、链烯基、杂链烯基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基部分可任选被取代，所述术语“取代”指任选并且化学上适当的被1个或多个选自以下的基团取代烷基、链烯基、链炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基、卤素、羟基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、氨磺酰、亚砜、砜、磺酰脲、酰肼和异羟肟酸酯。
2.权利要求1的化合物，其中R1为COR5，而R5为H、OH、COOR8或CONR9R10。
3.权利要求2的化合物，其中R1为COCONR9R10，而R9为H，R10选自H、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13和CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)。
4.权利要求3的化合物，其中R10为CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’为H或烷基、杂烷基，R2’为苯基、取代的苯基、杂原子取代的苯基、苯硫基、环烷基、哌啶基或吡啶基。
5.权利要求4的化合物，其中R1’为H。
6.权利要求5的化合物，其中R11为H或叔丁基；R’为羟甲基；R2’选自 其中U1和U2可以相同或不同，并且独立选自H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、叠氮基、氨基、羟基、取代的氨基、取代的羟基；U3和U4可以相同或不同，并且为O或S；U5选自烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂烷基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基或它们的组合；NR12R13选自NH2，NHMe，N(Me)OMe，NMe2， 其中U6为H、OH或CH2OH。
7.权利要求2的化合物，其中R2选自以下部分
8.权利要求7的化合物，其中R3选自 和 其中R31＝OH或O-烷基；Y19选自以下部分 Y20选自以下部分
9.权利要求8的化合物，其中R3选自以下结构
10.权利要求9的化合物，其中Z＝N，R4＝H。
11.权利要求10的化合物，其中W为C＝O或SO2。
12.权利要求11的化合物，其中Y选自以下部分 其中Y11选自H、COOH、COOEt、Ome、Ph、Oph、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12选自H、COOH、COOMe、Ome、F、Cl或Br；Y13选自以下部分 Y14选自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc；Y15和Y16可以相同或不同，并且独立选自烷基、芳基或杂烷基、或杂芳基；Y17为CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18为COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。
13.权利要求12的化合物，其中Y选自 其中Y17＝CF3、NO2、CONH2、OH、NH2或COOH；Y18＝F、COOH。
14.权利要求13的化合物，其中J选自
15.权利要求14的化合物，其中J为H、CH3或Bn。
16.权利要求15的化合物，其中G选自以下部分
17.权利要求16的化合物，其中G选自
18.一种药用组合物，它包含作为活性成分的权利要求1的化合物。
19.权利要求18的药用组合物，它用于治疗丙型肝炎病毒相关性疾病。
20.权利要求18的药用组合物，它还包含药学上可接受载体。
21.一种治疗HCV蛋白酶相关性疾病的方法，所述方法包含给予需要这种治疗的患者一种药用组合物，该组合物包含治疗有效量的权利要求1的化合物。
22.权利要求21的方法，其中所述给药为通过皮下给药。
23.权利要求1的化合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗HCV蛋白酶相关性疾病。
24.一种制备用于治疗HCV蛋白酶相关性疾病的药用组合物的方法，所述方法包括使权利要求1的化合物与药学上可接受的载体密切接触。
25.一种具有HCV蛋白酶抑制活性的化合物，包括所述化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体和互变异构体，以及所述化合物药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物选自具有以下结构的化合物 R＝MeR＝苄基 X＝OtBuX＝OHX＝NH2X＝NMeOMeX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH X＝H，Y＝tBu；X＝tBu，Y＝H R＝炔丙基；R＝烯丙基 X＝OtBu；X＝OH X＝Ot丁基X＝OH X＝Ot丁基X＝OHX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH R＝tBuR＝HR＝Me X＝H，Y＝COOHX＝COOH，Y＝H
26.一种用于治疗HCV蛋白酶相关性疾病的药用组合物，所述组合物包含治疗有效量的一种或多种权利要求25的化合物和药学上可接受的载体。
27.权利要求26的药用组合物，它还包含抗病毒药物。
28.权利要求26或27的药用组合物，它还包含干扰素。
29.权利要求28的药用组合物，其中所述抗病毒药物为利巴韦林，所述干扰素为α-干扰素。
30.一种选自以下的化合物， 和 或其对映异构体、立体异构体、旋转异构体或互变异构体，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述化合物具有HCV抑制活性。
31.一种药用组合物，它包含一种或多种权利要求30的化合物。
32.一种治疗丙型肝炎病毒相关性疾病的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种权利要求30的化合物。
33.一种调节丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性的方法，该方法包括使HCV蛋白酶与一种或多种权利要求30的化合物接触。
34.一种治疗、预防或改善一种或多种丙型肝炎症状的方法，该方法包括给予有效量的一种或多种权利要求30的化合物。
35.权利要求33的方法，其中所述HCV蛋白酶为NS3/NS4a蛋白酶。
36.权利要求35的方法，其中所述一种或多种化合物抑制HCVNS3/NS4a蛋白酶。
37.一种调节丙型肝炎病毒(HCV)多肽加工的方法，该方法包括使包含所述HCV多肽的组合物在加工所述多肽的条件下与一种或多种权利要求30的化合物接触。
38.权利要求7的化合物，其中R3为环己基。
39.权利要求11的化合物，其中Y选自2-羧基-3-羟苯基、3-四氢呋喃基甲氧基和2-磺苯基。
40.权利要求15的化合物，其中G选自乙基磺酰基甲基、苯基磺酰基甲基、2-苯基乙基磺酰基甲基和1-萘基磺酰基甲基。
全文摘要
本发明公开了具有HCV蛋白酶抑制活性的新型肽化合物以及制备所述化合物的方法。在另一实施方案中，本发明公开了包含所述化合物的药用组合物以及将其用于治疗HCV蛋白酶相关性疾病的方法。
文档编号A61K31/445GK1446201SQ01813921
公开日2003年10月1日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月21日
发明者A·K·萨克塞纳, V·M·吉里亚瓦拉班, S·L·伯根, R·G·洛维, E·E·尧, F·本尼特, J·L·麦克科尔米克, H·王, R·E·皮克, 刘怡宗, 覃天佑, 朱昭宁, A·阿拉萨潘, 陈新海, S·文卡特拉曼, T·N·帕雷克, P·A·平托, B·桑塔纳姆, F·G·恩约罗格, A·K·甘古利, H·A·瓦卡罗, S·J·坎普, O·E·莱维, M·利姆-维尔比, S·Y·塔穆拉 申请人:先灵公司, 科瓦斯国际公司