专利名称：药物活性化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物活性化合物，尤其涉及一种肝脏靶向的药物活性化合物。
在Kramer W等，J.Biol.Chem.；Vol 28718598-18604，1992和EP-B-0417725中公开了苯丁酸氮芥被作为典型药物连接到胆汁酸甾环的3α-OH位上，以在胆汁酸的3α羟基和羧基之间形成酯键。
同样地，在EP-A-0232788和US 4793949中公开了一种治疗癌症的药物，其中N-卤代烷基氨基甲酰基被结合在甾环中3-OH的位置上。
在Marin等Int.J.Cancer，78346-352，1998和Macias等，J.LipidRes.；391792-1798，1998中报道了通过甘氨胆酸的甘氨酸部分，共扼于甘氨胆酸的顺铂(cis-platin)的合成，其结果是顺铂中的一个氯原子丢失。在顺铂中的两个氯原子对药物的效力非常重要，因为它们与DNA形成双功能加合物。
在Manoharan等Annals of the New York Academy of Sciences，NewYork，vol.660，1992，306-309，页XP002162255中公开了胆汁酸与寡核苷酸DNA磷酸二酯，与磷酸二酯RNA摹拟物，以及与硫磷酯(phosphorothioates)的共扼作用，其中通过使用氨基连接物以提高反义寡核苷酸的生物利用率。因此，在此发明的连接物与药物活性部分之间没有酰胺键。
在Stephen等1992，Biochen.Pharmacol；431969-1974中报道了通过在胆汁酸C25羧基与三碘甲状腺氨酸的丙胺酸侧链的α氨基之间的酰胺键，甲状腺激素L-T3被连接到胆汁酸。药物和胆汁酸的连接引起药物中的氨基丢失，氨基被认为对药物的效力很重要。
在C.O.Mills等，Biochimica et Biophysica Acta，115(1991)，151-156页(见WO99/07325)中，公开了基于胆酰基(cholyl)-赖氨酰-荧光素的荧光胆汁盐，其中，通过使用包括赖氨酸分子α氨基的酰胺键，将赖氨酰连接到胆酰基基团上，同时通过异硫氰酸盐组使荧光组连接到赖氨酸分子的ε氨基组。C.O.Mills等(上述)注意到了在胆酰基-赖氨酰-荧光素和天然胆汁酸胆酰基甘氨酸之间，胆汁输出和肝提取物的相似性，并且建议以类似的方式处理这两种化合物。C.O.Mills等的一个结论是相对于游离荧光素，具有较高的胆汁分泌和胆酰基-赖氨酰-荧光素肝提取物，该结论虽然没有给出这方面的具体教导，但是提示与胆汁盐共轭可能是把化合物靶向肝脏的有效方法，。
在M.J.Monte等，Journal of Hepatology，1999；31521-528中，公开了将胆汁酸用作分子，用于将向肝瘤穿梭运输细胞抑制药物，并阐述了一种抗肿瘤化合物，该化合物是通过下面的方法获得的将顺铂结合到甘氨酸的羧基上，以产生顺一二氨络物氯胆酰基甘氨酸铂(II)。
本发明的目的是提供一种肝脏靶向的药物活性化合物，其中在肝脏靶向的部分和药物活性部分之间存在强健，但是不会不适当地影响药物活性部分的效果，借此，将药物活性部分靶向肝细胞内部的细胞器是可能的。
本发明提供了肝脏靶向的药物活性化合物，其具有如下的通式(I) 其中A是α-OH或者β-OH，B是α-H或者β-H，C是-H，α-OH或者β-OH，或者B和C共同形成一个双键，D是-H，α-OH或者β-OH，E是是-H，α-OH或者β-OH，G是侧链部分，-NH-J选自(i)含有氨基的药物活性化合物的残基，其中所述的NH-基团是由所述的药物活性化合物的氨基基团提供的，和(ii)被加成了氨基的药物活性化合物的残基，其中所述的-NH-基团由所述的被加成的氨基提供；X和Y各自独立代表一个单键，-(CH2)z-(其中z为1到8)，-O-或者-S-；n是0或者1；m是0或者1；和p是0或者1，条件是当-NH-J是(i)时，m是1。
连接J和分子剩余部分的酰胺键很强，这样使得其在体内不会断裂。这明显地不同于以前的建议，那些建议基于为基于胆汁酸的药物提供运载工具，此运载工具在体内可以很容易地被从药物上切割下来。因此本发明依赖于提供与药物活性化合物相关的氨基(或者是其它可以提供-NH-J中的-NH-基团的基团)。
当药物活性化合物本身含有提供-NH-J中-NH-的氨基的时候(如在阿霉素中)，m值为1是重要的，因为这样，经由任选-(G)p-基团依附到分子剩余物上的氨基，提供了所述药物活性化合物的被结合的(因此是非官能性)氨基的功能。在这种情况下，优选对G和Y进行选择，从而使得合成侧链上的NH2基团可以在物理上接近于-NH-J的-NH-基团，以此模仿通常出现在未共扼药物活性化合物上的未结合氨基的作用。
在药物活性化合物没有-NH-基团的情况下，这个基团应该被加在药物分子的适当位置上。在-NH-基团是由被添加到药物活性化合物的氨基所提供(如三苯氧胺)的情况下，那么就不需要存在侧链氨基，因此m在此情况下可以为0。在后面这种情况中，药物活性化合物本身可以含有氨基，也可以不含有氨基，但是如果本身含有氨基，由于它没有参与该化合物和胆汁酸部分的连接，所以仍然可以执行其所需的功能。
-NH-J残基可以基于任何选自下面的药物活性化合物抗生素、利尿剂、肽、抗病毒药物、抗癌药物、肝病治疗药物、抗高血压药物、肾活素抑制剂、脯氨酰羟化酶抑制剂、干扰素诱导剂、DNA反义/正义和核糖体(ribosymes)。或者，-NH-J残基也可以基于多肽、蛋白质、核苷酸(DNA或者RNA)。
例如，-NH-J可以基于阿霉素，表阿霉素，米托蒽醌，氨甲蝶呤，三苯氧胺，丝裂霉素C，氟尿嘧啶，阿拉伯胞嘧啶糖苷，硫鸟嘌呤，阿昔洛维(acyclovir)，丙氧鸟苷，两性霉素，伯氨喹，熊脱氧胆酰基赖氨酰半胱氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰磺基丙氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰蛋氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰-谷胱甘肽-(还原型)，熊脱氧胆酰基赖氨酰蛋氨酸砜，氨甲蝶呤，阿糖胞苷，L-半胱氨酸，磺基丙氨酸，L-半胱氨酸亚磺酸(L-cysteine sulphinic acid)，N-乙酰半胱氨酸，蛋氨酸，蛋氨酸砜，蛋氨酸亚砜，L-谷胱甘肽，S-腺苷基-同型半胱氨酸，S-腺苷基-蛋氨酸，8-氨基喹啉，双二乙氨乙基芴酮(2，7-二[2-(二乙基氨基)乙氧基]-9H-芴-9-酮)，双二乙氨乙基芴酮类似物，如双二乙氨乙基芴酮二盐酸化物，3，6-二[2-(二甲基氨基)乙氧基]-9H-氧杂蒽-9-酮二盐酸盐，2，7-二[二甲基氨基乙酰基]-9H氧杂蒽二盐酸酸水合物，2，8-二[二甲基氨基乙酰基]-二苯并噻吩二盐酸酸水合物和2，8-二[二甲基氨基乙酰基]-二苯并呋喃-二盐酸酸水合物，苯丙氨酸氮芥(4-(二[2-氯乙基]氨基)-L-苯丙氨酸)。因此，本发明的化合物主要涉及将有利肝脏靶向的活性化合物运送到肝脏。这些化合物可以做如下的分类1肝脏治疗药物靶向的化合物。
2治疗胆管紊乱药物靶向的化合物。
3保护性试剂(如射线保护剂)靶向的化合物，该制剂本身不起治疗作用。
4酶靶向的化合物，该酶被设计用来局部活化另一种前体药物(如，通过给予一种惰性的前体药物，该药物在肝脏中被靶定的酶局部活化)。由于药物不是被连接在胆汁酸部分上，所以在体内可能不会被很快清除，因此其具有有潜在优势。
5试剂靶向的化合物，该试剂在肝脏中积极地进行物质替换以形成通常有用的活性物质。
对于侧链部分而言，-G-可以是-(CH2)q-(其中q是1到8，也可以是1到5，优选是3到5，最优选是4)，也可以是-O-或-S-。当将药用活性化合物连接到肝脏靶向的胆酸分子部分的部分上存在侧链氨基的时候(即m＝1)，-G-通常都应该存在(即p＝1)。当p＝1并且-G-是-O-，-S-，或者-(CH2)q-(当q是3到5时)时，优选Y代表单键。
通式(I)化合物中的类固醇部分可以基于胆酸，鹅脱氧胆酸，脱氧胆酸，猪脱氧胆酸，猪胆酸，α-、β-、或ω-鼠胆酸，降胆汁酸，石胆酸，3β-羟基胆酸(hydroxycholenoic acid)，熊脱氧胆酸，异胆酸(5α-胆烷-24-酸)(allocholic acid(5α-cholan-24-oic-acid))，或者类似物。
共轭胆酸是相对亲水的，从而不很容易被细胞内的细胞器吸收。因此，它具有快速的肝细胞转运。而共轭脱氧胆酸的亲水性比共轭胆汁酸小，更能够穿透细胞，所以它具有相对较慢的肝细胞转运。共轭脱氧胆酸具有凋亡(apoptotic)的性质，并且被胆管细胞(肝细胞)吸收。因此，当共轭脱氧胆酸与抗肿瘤药物共轭时，就能够将抗肿瘤药物靶向到胆管肿瘤(肝细胞肿瘤)之上。
共轭石胆酸是胆酸盐中疏水性最强的物质，因此最能够穿透细胞。它能够被细胞核吸收，因此当它与药物进行共轭结合时，可以将药物定位到细胞核中。
共轭熊脱氧胆酸的亲水性很强，所以对细胞穿透性较差，它的肝细胞转运介于胆汁酸和石胆酸之间。熊脱氧胆酸盐水具有抗胆汁淤积(anticholestatic)性质，因此若将它与已知的、影响胆汁淤积性质的药物相结合，那么通过协同机制或者另外的机制，可能会增强它们的抗胆汁淤积潜能。
本发明提供了一种制备上述通式(I)化合物的方法，该方法包括下面的步骤将通式(II)的化合物(其中A，B，C，D，E，G，n，m和p的涵义如前文所述)和具有氨基的药物活性化合物反应，以在药物活性化合物的氨基和通式(II)所示化合物的羧基之间形成酰胺键。 本发明优选的化合物是通式(III)的化合物 其中，G和J的涵义如前文所述。
现在对本发明进行进一步的详细描述实例1胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)的合成总反应路线 步骤1-胆酰基-赖氨酸-N-ε-FMOC(V)的制备在-5℃的温度下，向化合物(IV)，胆酸(1.46g，3.573mmol)中加入无水丙酮(10cm3)和三乙胺(500μl，3.59mmol)，在反应器中搅拌20min，然后逐滴加入氯甲酸异丁酯(0.534ml，1.3g，4.56mmol)并保持温度在-5和-10℃之间。滴加完成20min后，在15℃下剧烈搅拌反应30min。在25ml的锥形瓶中，将氢氧化钠(0.153g，3.825mmol)水(8cm3，8g)溶液添加到N-ε-FMOC-L-赖氨酸(3.568mmol，1.314g)中，搅拌直至形成澄清的溶液(约20min)。将该溶液迅速加入到前文所述的胆汁酸混合液中，开始在+4℃下剧烈搅拌10min，再在室温继续搅拌50min。
用1M HCl(4.43cm3)将反应液的最终pH调到2左右。将该酸化溶液用乙酸乙酯(3×50ml)在分液漏斗内进行萃取。合并萃取后的乙酸乙酯，过滤，蒸馏水(pH2)洗涤，再用硫酸钠干燥。干燥后的溶液在40℃下旋转蒸发，蒸干后得到化合物(V)，胆酰基-赖氨酸-N-ε-FMOC，该物质为白色固体，纯度90％，产率97％。用TLC进行进一步的纯化。步骤2-转化得到化合物(VIII)将化合物(VI)，阿霉素盐酸化物(24mg，40μmol)和三乙胺(6μl，40μmol)悬浮于300μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。添加溶解于200μlDMF中的化合物(V)，胆酰基-赖氨酰-N-ε-FMOC(34mg，40μmol)；降温至0-2℃后，添加羟基苯三唑(6mg，40μmol)，随后添加100μl DMF中的二环己基-碳化二亚胺(8mg，40μmol)。在避光的环境中，混合液在0℃下搅拌30min，接着在室温(21℃)下搅拌18h。反应后的DMF溶液用100μl的醋酸稀释溶液(1ml冰醋酸溶解在10ml蒸馏水中)进行酸化。离心，收集上清液。加入二乙醚形成粘性沉淀，随后加入200μl甲醇，在真空浓缩。另外加入甲醇200μl，通过逐滴加入二异丙醚，化合物(VII)，胆酰基-赖氨酰(FMOC)阿霉素从甲醇溶液中沉淀出来。沉淀出来的胆酰基-赖氨酰(FMOC)阿霉素用二乙醚洗涤三次，真空中彻底干燥20min，再经过TLC纯化后，其产率为98％，纯度达到96％。
用5％的哌啶(200μl)溶液使胆酰基-赖氨酰(FMOC)阿霉素进行温和的断裂，在室温下温育10min。加入20μl0.5M的HCl终止反应，随后加入二异丙醚来产生化合物(VIII)，胆酰基-赖氨酰-阿霉素。经过TLC纯化后，胆酰基-赖氨酰-阿霉素的产率≥96％，纯度≥94％。
经过质谱测定化合物(VIII)的分子量为1062.5(见
图1，该图显示了化合物(VIII)和其钠加合物的质量(分子量为1084.5)，C-13同位素的质量(分子量＝1085.4)，C-14同位素的质量(分子量＝1086.4)。已经显示化合物(VIII)能溶于水，甲醇和乙醇，不溶于非极性溶剂，如乙氧基乙烷。体外毒性测试用原位末端标记的方法，将上述合成的胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)与游离的阿霉素和胆酸盐相对照，进行毒性测试。原位末端标记法可以进行凋亡和坏死的半量测试。
使用24孔板中的HepG2细胞(眼镜蛇美国典型培养中心(CobraAmerican Type Culture Collection))进行实验。将阿霉素、胆酸盐或者胆酰基-赖氨酰-阿霉素(一直到0.86μmol的各种剂量)平行添加三次并且培养4h。用胰蛋白酶处理，使细胞从平板上消化下来，细胞离心(cytospun)，然后冷冻。
为了测量细胞的活性，将切片升至室温30min，再在丙酮中固定10min，用石蜡封存。
制备原位末端标记(ISEL)阳性混合液缓冲液(1ml)，dATP(1μl)，dCTP(1μl)，dGTP(1μl)，DiglldUTP(1μl)和Klenow DNA聚合酶(4μl)。同样制备原位末端标记(ISEL)阴性混合液缓冲液(1ml)，dATP(1μl)，dCTP(1μl)，dGTP(1μl)，DiglldUTP(1μl)和水(4μl)。向细胞转子(cytospin)和盖玻片上加入60μl的ISEL阳性混合液或阴性混合液。在37℃下漂浮水浴1h，取走盖玻片，用蒸馏水洗涤3次，每次5min，再用pH7.5的TBS洗涤5min。抗异羟洋地黄毒苷(digoxigen)碱性磷酸酶和TBS以1∶200的比例稀释后加入，并在室温下温育1h后，用pH7.5的TBS洗涤2.5mins，再用pH8.2的TBS洗涤2.5mins。制备的底物混合物包括如下物质磷酸萘酚(10mg)，N，N-二甲基甲酰胺(1ml)，Tris pH8.2(49)，IM左旋(四)咪唑，(50μl)和坚牢蓝(Fast blue)(50mg)。
将底物混合液加入每个细胞转子，使其显影15min，再用蒸馏水洗涤，然后测定。
所得结果列在表1中所示，与图2相对应表1化合物(VIII)与阿霉素以及胆酸盐的毒性比较(死细胞％)
从上表的结果可以看出，在0.06到0.86μM的浓度范围内，游离的阿霉素和化合物(VIII)有相似的毒性。体内胆汁分泌测试将胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)，游离阿霉素和游离胆酸盐按照如下的方式进行胆汁分泌测试。
所有的动物实验均是按照当地机构关于实验室动物使用和保护的相关规定进行的。实验测定Wista大鼠中14C-阿霉素(14C-Dox)和14C-胆酰基-赖氨酰-阿霉素(14C-化合物VIII)的胆汁分泌。麻醉大鼠用戊巴比妥对体重为250-300g的大鼠进行腹膜内给药(i.p.为50mg/kg体重)。进行剖腹手术后，插入上部带有Portex聚乙烯管的胆管(20cm长，i.d.＝0.29mm，o.d.＝61mm，A.R.Horwell，London UK)。动物的体温由直肠探针检测并通过连续温度调节器维持在37.5±0.5℃。将14C-Dox(1mg/300ul)或者14C-化合物VIII的药丸溶解在生理盐水中，通过颈静脉直接注射的方法注射进动物(n＝6)体内。每隔10min收集一次等量的胆汁，持续60min。60min后，再收集动物的心脏、肝脏、血液、尿样，用放射性分析，分析其中14C-Dox或者14C-化合物VIII的含量。所有胆汁等份样品还针对基底胆汁背景，在液闪测定仪中分析其放射性。
测量结果是以给予剂量中放射性的百分比来表示的。如下面的表2和表3a所示表2-胆汁分泌
表3aWistar大鼠中累积的胆汁分泌
结果同样图解在图3a和图3b中。
从上面可以看出，与游离的阿霉素相比，化合物(VIII)能够快速的到达肝/胆系统。
我们进行进一步的测试，以估计在Wista大鼠的肝脏、心脏、尿和血液中，所测试化合物的剂量百分比。结果如表3b所示，对应的图解为图4。
表3b60分钟时剂量的百分比
从表3a和3b可以看出，在给药60min后，化合物(VIII)能够有效的靶向肝部，而游离的阿霉素主要存在于血液中，在肝脏中的量极少。实例2重复实例1的实验过程，除了将步骤1中的N-ε-FMOC-L-赖氨酸替换成3.568mmol(0.879g)的N-ε-tBOC-L-赖氨酸来制取胆酰基-赖氨酰-N-ε-tBOC。随后在第2步中用胆酰基-赖氨酰-N-ε-tBOC(26mg，40μl)用来生产胆酰基-赖氨酰(tBOC)阿霉素，用乙酸乙酯(含3M的HCl)代替哌啶溶液对胆酰基-赖氨酸(tBOC)阿霉素进行断裂来生产化合物(VIII)。实例3用当量的脱氧胆酸代替胆汁酸生产通式(IX)的化合物，其余均重复实例1和2中的步骤。 实例4用当量的石胆酸代替胆酸生产通式(X)的化合物，其余均重复实例1和2中的步骤。 实例5将阿霉素盐酸化物(24mg，40μmol)和三乙胺(6μl，40μmol)悬浮于300μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。添加熊脱氧胆酰基-赖氨酰-N-ε-FMOC(34mg，40μmol)；降温至0-2℃后，添加羟基苯三唑(6mg，40μmol)，随后添加100μl DMF中的二环己基-碳化二亚胺(8mg，40μmol)。在避光的环境中，混合液在0℃下搅拌30min，接着在室温(21℃)下搅拌18h。在反应结束时，过滤该混合物，将甲醇(400μl)添加到滤液中，随后加入二异丙醚沉淀出熊脱氧胆酰基-赖氨酰-阿霉素-FMOC(UCLDFmoc)。用二异丙醚将沉淀洗涤三次，溶解在氯仿(1ml)中，再用二异丙醚沉淀得到UCLDFmoc，其产率为90-96％，纯度范围是91-94％。
将哌啶(5μl)溶解在200μl的DMF中，并用该溶液对6mg UCLDFmoc进行温和断裂，反应条件为室温下搅拌5.5分钟，以得到熊脱氧胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92％，纯度为90-92％)。实例6用脱氧胆酰基-赖氨酰-FMOC(30.6mg，40μl)代替熊脱氧胆酰基-FMOC(30.6mg，40μl)来得到脱氧胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92％，纯度为90-92％)，其余均重复实例5中的步骤。实例7用猪胆酰基-赖氨酰-FMOC(34mg，40μl)代替熊脱氧胆酰基-FMOC(30.6mg，40μl)生产猪胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92％，纯度为90-92％)，其余均重复实例5中的步骤。实例8用石胆酰基-赖氨酰-FMOC(30mg，40μl)代替熊脱氧胆酰基-FMOC(30.6mg，40μl)生产石胆酰基-赖氨酰-阿霉素(产率为89-92％，纯度为90-92％)，其余均重复实例5中的步骤。实例9将10mmol(3.72g)三苯氧胺(1-(p-β-二甲基氨基乙氧基苯基)-反-1，2-联苯丁-1-烯)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或四亚甲基砜(8ml)中，在无水的条件下，将其加入到由0.4mg四氟硼酸硝化物溶解于6ml DMF或四亚甲基砜所得到的溶液中，加入时要用一定的速度搅拌，使温度保持在15℃和25℃之间。添加完成之后，在20℃和35℃之间继续搅拌30min。而后将反应液小心地倒入5ml冷水中。分离有机层，用水洗涤两次，氯化钙干燥。在减压的条件下蒸馏除去过剩的芳香族底物，得到三苯氧胺硝酸盐。
三苯氧胺硝酸盐在酸(H3O+)中与氯化锡(SnCl2)反应，再加入氢氧化钠以得到三苯氧胺胺，产率为92％。所得到的三苯氧胺胺以类似于实例1或2中所描述的方式那样，与胆酰基-赖氨酸-N-ε-FMOC或胆酰基-赖氨酸-N-ε-tBOC反应，以使阿霉素与胆酰基-赖氨酸FMOC或胆酰基-赖氨酸-tBOC连接。再用5％的哌啶进行温和断裂，得到胆酰基赖胺酰三苯氧胺(cholyllysltamoxifen)。将胆酰基赖胺酰三苯氧胺进行磺化，得到能够溶于水的胆酰基赖胺酰三苯氧胺磺酸盐。比较实施例胆酰基赖氨酰CBZ阿霉素(CL(CBZ)-Dox)的合成将阿霉素盐酸化物(48mg，80μmol)和三乙胺(12μl，80μmol)悬浮于600μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。添加溶解在0.4mlDMF中的胆酰基赖氨酸-N-ε-FMOC(64mg，80μmol)；降温至0-2℃后，添加羟基苯三唑(12mg，80μmol)，随后添加100μl DMF中的二环己基-碳化二亚胺(16mg，80μmol)。在避光的环境中，混合液在0℃下搅拌30min，接着在室温(21℃)下搅拌18h。用200μl的稀释醋酸溶液酸化所形成的DMF溶液。离心后，收集上清液，加入乙酸乙酯沉淀出CL(CBZ)-Dox，干燥沉淀物以得到CL(CBZ)-Dox，其产率为92％。细胞毒性分析图5显示了从细胞毒性测试中得到的结果。细胞毒性测试操作如下将大鼠的肝细胞单层培养物与铬-51(4μCi)共培育18小时，接着与0.012M的CL(CBZ)和CL(CBZ)-Dox共培育。测量上清液和细胞的活性。铬-51的释放用总活性(培养基+细胞)的百分比表示。数值为平均数+/-SD[n＝5]。*＝p＜0.001 CL(CBZ)/(CBZ)-Dox和对照(与铬-51培育后，没有加入任何物质)。
在对照(37.61+/-1.56％)，(CBZ)-Dox(36.45+/-3.77％)和CL(CBZ)(49.01+/-2.57％)之间，没有观察到显著差异(P＞0.1)。这表明提供一个游离的氨基来代替阿霉素的氨基是非常重要的，阿霉素的氨基已经被用于在与胆酰基赖胺酰部分的连接中形成酰胺基。进一步毒性测试我们用12种人肿瘤细胞系(包括大细胞肺癌H460，乳腺癌细胞系MCF7，子宫癌细胞系UXF1138L和大细胞肺癌LXFL529L)测试胆酰基-赖氨酰-阿霉素(VIII)的体外抗增殖活性，并与游离的阿霉素和胆汁酸进行了对照比较。5-20.000细胞/孔的细胞被铺在96孔板上。24小时后，加入待分析的化合物，其剂量水平的范围分别为3nM-30μM(胆酰基-赖氨酰-阿霉素和胆酸)，0.3nM-3μM(阿霉素)。连续在测试化合物中暴露4天后，用碘化丙锭确定细胞DNA含量，该物质会产生与细胞数目有关联的荧光信号。
研究发现胆酰基-赖氨酰-阿霉素具有类似于阿霉素的潜在活性。胆酰基-赖氨酰-阿霉素的IC70平均值为1.3μM，游离阿霉素的为0.7μM。胆酰基-赖氨酰-阿霉素和游离阿霉素表现出不同的细胞毒性模式，但是这些化合物对肿瘤细胞的选择性却基本相同。对胆酰基-赖氨酰-阿霉素最敏感的细胞株系是大细胞肺癌H460、乳腺癌细胞系MCF7、子宫癌细胞系UXF1138L和大细胞肺癌LXFL529L。游离的胆酸在体外没有显示出抗肿瘤活性。
权利要求
1.一种肝脏靶向的活性化合物，其具有通式(I)的结构 其中A是α-OH或者β-OH，B是α-H或者β-H，C是-H，α-OH或者β-OH，或者B和C共同形成一个双键，D是-H，α-OH或者β-OH，E是-H，α-OH或者β-OH，-G-是侧链部分，-NH-J选自(i)含有氨基的活性化合物的残基，其中所述的NH-基团是由所述的活性化合物的氨基提供的，和(ii)被加成了氨基的活性化合物的残基，其中所述的-NH-基团由所述的被加成的氨基提供；X和Y各自独立代表一个单键，-(CH2)z-(其中z为1到8)，-O-或者-S-；n是0或者1；m是0或者1；和p是0或者1；条件是当-NH-J是(i)时，m是1。
2.权利要求1的化合物，其中的-NH-J是所述的含有氨基的活性化合物的残基，其中所述的NH-基团是由所述的活性化合物的氨基提供的，而且其中的m是1。
3.权利要求1的化合物，其中的-NH-J是被加成了氨基的活性化合物的残基，而且其中所述的-NH-基团由所述的被加成的氨基提供。
4.以上权利要求中任何一项的化合物，其中的-G-是-(CH2)q-(其中q为1-8)，-O-或者-S-。
5.权利要求4的化合物，其中的-G-是-(CH2)q-，其中的q为1-5。
6.权利要求5的化合物，其中的q是3-5。
7.权利要求5的化合物，其中的q是4。
8.以上权利要求中任何一项的化合物，其中的X和Y各自独立地代表单键或者-(CH2)z-。
9.权利要求9的化合物，其中的X和Y各自独立地代表单键或者-(CH2)z-，其中的z为1-5。
10.权利要求1，2或者3的化合物，其中的p为1，-G-是-O-，-S-或者-(CH2)q-(其中q为3-5)，和Y代表一个单键。
11.权利要求1的化合物，其中的-NH-J基于选自下面的药物活性化合物阿霉素，表阿霉素，米托蒽醌，氨甲蝶呤，三苯氧胺，丝裂霉素C，氟尿嘧啶，阿拉伯胞嘧啶糖苷，硫鸟嘌呤，阿昔洛维，丙氧鸟苷，两性霉素，伯氨喹，熊脱氧胆酰基赖氨酰半胱氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰磺基丙氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰蛋氨酸，熊脱氧胆酰基赖氨酰-谷胱甘肽-(还原型)，熊脱氧胆酰基赖氨酰蛋氨酸砜，氨甲蝶呤，阿糖胞苷，L-磺基丙氨酸，半胱氨酸，L-半胱氨酸亚磺酸，N-乙酰半胱氨酸，蛋氨酸，蛋氨酸砜，蛋氨酸亚砜，L-谷胱甘肽，S-腺苷基-同型半胱氨酸，S-腺苷基-蛋氨酸，8-氨基喹啉，双二乙氨乙基芴酮(2，7-二[2-(二乙基氨基)乙氧基]-9H-芴-9-酮)，双二乙氨乙基芴酮类似物，如双二乙氨乙基芴酮二盐酸化物，3，6-二[2-(二甲基氨基)乙氧基]-9H-氧杂蒽-9-酮二盐酸盐，2，7-二[二甲基氨基乙酰基]-9H氧杂蒽二盐酸酸水合物，2，8-二[二甲基氨基乙酰基]-二苯并噻吩二盐酸酸水合物和2，8-二[二甲基氨基乙酰基]-二苯并呋喃-二盐酸酸水合物，苯丙氨酸氮芥(4-(二[2-氯乙基]氨基)-L-苯丙氨酸)，肽，蛋白质和核苷。
12.权利要求11的化合物，其中药物活性化合物选自阿霉素和三苯氧胺。
13.以上权利要求中任何一项的化合物，其含有选自下列的类固醇部分胆酸，鹅脱氧胆酸，脱氧胆酸，猪脱氧胆酸，猪胆酸，α-、β-、或ω-鼠胆酸，降胆汁酸，石胆酸，3β-羟基胆酸，熊脱氧胆酸，异胆酸(5α-胆烷-24-酸)。
14.权利要求13的化合物，其中的类固醇部分选自胆酸，脱氧胆酸，石胆酸，熊脱氧胆酸和猪脱氧胆酸。
15.通式(III)的化合物， 其中的G和J如权利要求1中所定义。
16.权利要求15中的化合物，其中残基-NH-J基于阿霉素。
17.权利要求15或者16的化合物，其中的G如权利要求4-7的任何一项中所定义。
18.权利要求1中所定义的通式(I)化合物的制备方法，其包括这样的反应步骤将通式(II)化合物 (其中的A，B，C，D，E，G，n，m和p如权利要求1中所定义)与含有氨基的活性化合物反应，以在通式(II)化合物的羧基和活性化合物的氨基之间形成酰胺键。
全文摘要
一种肝脏靶向的活性化合物，其具有通式(I)的结构其中A是α－OH或者β－OH，B是α－H或者β－H，C是－H，α－OH或者β－OH，或者B和C共同形成一个双键，D是－H，α－OH或者β－OH，E是－H，α－OH或者β－OH，－G－是侧链部分，－NH－J选自(i)含有氨基的活性化合物的残基，其中所述的NH－基团是由所述的活性化合物的氨基提供的，和(ii)被加成了氨基的药物活性化合物的残基，其中所述的－NH－基团由所述的被加成的氨基提供；X和Y各自独立代表一个单键，－(CH
文档编号A61K31/704GK1452498SQ01815228
公开日2003年10月29日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月21日
发明者查尔斯·奥斯瓦尔德·米尔斯 申请人:诺金欧洲公司