专利名称：缺血性疾病治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以人粒细胞集落刺激因子(以下，简称为人G-CSF)为有效成分的缺血性疾病治疗剂。
闭塞性动脉硬化症为，因为动脉硬化性病变使四肢、特别是下肢的主动脉闭塞或狭窄，其末稍发生缺血性障碍的疾病的疾病，作为临床症状分为冷感、麻痹感、间歇性跛行、安静时疼痛、溃疡和坏死。本国的闭塞性动脉硬化症患者约10万人(多田裕辅治疗学，31卷289-292页；1997年)，推测由于高龄者人口增加、或饮食的欧美化，今后还会增加。对闭塞性动脉硬化症的治疗方法，根据症状或患者的状态等，除了进行运动疗法、药物疗法、血液流动再建术以外，最近还在尝试基因治疗和骨髓细胞的肌肉内移植等。
通过上述疗法，虽然现在对闭塞性动脉硬化症的治疗取得了一定的效果，但是各自的疗法存在以下所述的问题。即，如今的状况是，运动疗法虽然在轻度的症例中确认有延长步行距离的效果，但本疗法的效果难于预想，另外，即使有延长步行距离的效果，患者也不会满足，希望血液流动再建术的情况也有30％的报告(太田敬日本医事新报，3935号25-29页；1999年)，不能说是十分有效果的治疗方法。
对于药物治疗，现状是，主要处方化的抗血小板剂能防止病情的恶化，即使最近开发的微循环血流改善剂和氧搬运能改善剂也只是期待适用于轻度症例，所有药物对闭塞性动脉硬化症的根本上的治疗药还没有。
相对于此，血液流动再建术为现在的最有效的治疗法，根据患者的状态或病变的部位、范围进行经皮血管形成术或旁路手术，但是这些中伴随手术的特别担心、除了伴随手术的合并症或死亡例以外，也存在不能期待长期生存的情况等问题。
另外，基因治疗方面，正进行使用具有血管内皮细胞增殖因子或上皮细胞增殖因子等血管新生作用的因子的基因治疗，但是现在关于实验治疗领域之外的安全性和效果的评价还没固定，所以一般还没普及。
最近，报告了治疗效果的骨髓细胞的肌肉内移植是，通过将骨髓细胞移植到患病部位附近的肌肉中，其在血管内皮细胞分化形成血管，进行治疗的疗法，今后，虽然需要增加病症例数对其效果进行评价，但也能治疗重病症例，所以期待作为将来的治疗法。然而，认为这种疗法也存在伴随采集骨髓的患者和医疗人员的负担大的一个问题。
通过最近的研究，不仅在骨髓中，在末梢血液中也存在能分化为血管内皮细胞的造血干细胞(从分化成内皮细胞的功能的观点来看，称为“内皮细胞的前体细胞”，但因为该细胞原本是从造血干细胞派生而来的，本说明书中从可形成内皮细胞的细胞集团的概念上使用“造血干细胞”的语句)，已逐渐知道它们是与血管新生有关(Qun Shi et al.Blood vol92，362-367；1998，Takayuki Asahara et al.Blood vol95，952-958；2000)。因此，通过采集末梢血液中的造血干细胞，将其移植到患病部位附近的肌肉中，可以期待治疗闭塞性动脉硬化症。优点是这种情况下的与采集末梢血液干细胞相关的患者和医疗人员的负担要比移植骨髓中的干细胞的情况轻。但通常因为末梢血液中的造血干细胞的存在频度相当低，所以能否得到为治疗闭塞性动脉硬化症的必要且充分量的造血干细胞还存有疑问。
发明内容
人G-CSF是作为粒细胞系造血前体细胞的分化增殖因子发现的造血因子，因为能促进生物体内嗜中性细胞造血所以临床应用作为骨髓移植或癌症化疗法后的嗜中性细胞减少症治疗剂。另外，上述作用以外，人G-CSF还有作用于造血干细胞刺激其增殖分化的作用和将骨髓中的造血干细胞动员到末梢血中的作用，实际上，基于后者的作用，在临床现场，为了促进进行化疗法后的癌症患者的造血恢复，进行将用人G-CSF动员的末梢血造血干细胞移植的末梢血干细胞移植术。G-CSF的该造血干细胞动员作用比相同粒细胞系的造血因子GM-CSF强得多。另外，从副作用少的观点看，G-CSF相对于GM-CSF有优越性。
因此，在通过对闭塞性动脉硬化患者进行骨髓细胞的肌肉内移植的治疗之前，因为通过人G-CSF给药可期待骨髓中的造血干细胞的频度变高，所以能减少骨髓细胞采集时的骨髓穿刺次数，并且能减轻患者的负担。此时，通过从末梢血中得到移植的造血干细胞，可以进一步减轻患者和医疗人员的负担。更进一步，因为末梢血液中的造血干细胞显示了寄予血管形成，所以认为通过人G-CSF给药使末梢血液中的造血干细胞增加，而促进血管形成。因此，通过只对患者给药人G-CSF，就可期待治疗闭塞性动脉硬化症。显然，通过这样的人G-CSF给药治疗闭塞性动脉硬化症，从不进行采集造血细胞或移植即可的方面看，对患者和医疗人员的负担大大减轻。
附图的简单说明
图1表示G-CSF给药的小鼠产生的末梢血液单细胞的给药(B)和G-CSF给药(C)对大鼠缺血肢毛细血管密度的影响的图。将各个体的毛细血管密度对B组、C组、对照组(A)作图。
使用上述3种方式的人G-CSF的闭塞性动脉硬化症的治疗，因为对重症患者也可期待效果，所以对患者来说是很大的福音，但与促进血管内皮前体细胞的分化增殖的血管内皮细胞因子(VEGF)、上皮细胞增殖因子(EGF)、肝细胞增殖因子(HGF)、成纤维细胞增殖因子(FGF)等具有血管新生作用的因子或其基因治疗并用，可期待进一步增加其治疗效果。此时，可以将这些因子或其基因投与患者，例如投与在患病部分附近。同样，与临床上作为闭塞性动脉硬化症的药物疗法使用的抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂、高血脂症治疗剂等并用，也可期待增大其治疗效果。
进一步，本发明的G-CSF也可应用作为相同的缺血性疾病的下述疾病的治疗剂。即，本发明提供以G-CSF为有效成分治疗外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍(脑中风、脑梗塞等)、缺血性肾疾病、四肢缺血性疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、缺血性心脏疾病(缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全等)等的治疗剂。
本发明达到了上述的考察结果。即，本发明提供将人G-CSF作为有效成分的缺血性疾病治疗剂。
以下，对本发明进行详细说明。
具体实施例方式
人G-CSF是具有下述式1表示的氨基酸序列的蛋白，但本发明所用的人G-CSF是，除上述之外，也可以是对具有该序列的蛋白进行1个以上的氨基酸的替换、添加、缺失操作的改性体，也可以是进一步对式1所表示的蛋白和改性体进行各种修饰的，只要具有G-CSF活性就适用。这里所说的“各种修饰”是指糖链的结构变换、添加、缺失操作或使其结合聚乙二醇和维生素B12等、无机或有机化合物。
式1人G-CSF的氨基酸序列Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 16Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 32Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 48Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 64Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 96Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 112Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 128Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 144Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 174
这样的人G-CSF的制备方法，只要是制备上项中规定的序列，不论什么方法，具体来说，使用人G-CSF产生肿瘤或人G-CSF产生杂交瘤，进一步使用通过基因组转换赋予G-CSF产生能的转化宿主制备上项中规定的序列，但根据要制备的人G-CSF的结构，在制备工序的适当阶段适宜地采用改变操作或各种修饰操作。另外，通过基因转换制备的情况下，无论该宿主是哪类，采用大肠菌、动物细胞等通常所用的宿主。
本发明的缺血性疾病治疗剂，为了得到作为医药制剂的形态，可以含有必要的制剂担载体或附形剂，还可含有稳定剂或吸收防止剂，剂型也可选择注射剂、控释制剂、经鼻剂、口服剂、经肺剂、经皮剂、经粘膜剂等适当的制剂，可以根据需要使用适当的装置。
含有本发明的缺血性疾病治疗剂的人G-CSF的给药量和给药次数可考虑对象患者的病态来决定，但给药量通常成人每人为0.1～500μg/kg/day，优选1～50μg/kg/day的用量。另外，给药次数可以1周中给药1～7天。给药方法优选静脉内、皮下、肌肉内等。但是，本发明并不限定人G-CSF的用量。另外，也可以与迄今使用抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂、高血症治疗剂等期待对缺血性疾病有效果的药剂、进一步基因治疗等并用。
以下，举实验例(药理效果)、实施例(制剂例)对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限于此。实验例1(药理效果)将裸小鼠(BALB/cA Jcl-nu)的左大腿动静脉结扎后摘出，制成下肢缺血模型。无处置组中，发现缺血2周后的5例中有3例(60％)下肢脱落，2例(40％)下肢坏死。另一方面，对从下肢缺血3日前到术后1天进行共计5次皮下给药G-CSF 100μg/kg/day的组中，2周后5例中有1例(20％)下肢脱落，3例(60％)坏死，1例(20％)未发现损伤，比无处置组下肢损伤减轻。由此可知，G-CSF可能具有通过促进血管新生，改善缺血后下肢损伤的作用。实验例2(药理效果)
对小鼠(BALB/cA)皮下给药G-CSF 100μg/kg/day 5天，之后采血，使用密度梯度法(d＝1.077)，分取单核细胞部分。另外，将裸大鼠(F344/N Jcl-rnu)的左大腿动静脉摘出，制成下肢缺血模型。缺血1日后，对下肢缺血的裸大鼠(F344/N Jcl-rnu)肌肉内给药G-CSF给药小鼠产生的末梢血单核细胞约2×107cell/head(相当于末梢血约5mL)，移植。对照组中，肌肉内给药磷酸缓冲液。移植1周后，作成下肢的组织标本，通过碱性磷酸酶染色，测定毛细血管密度。结果，与对照组相比，末梢血单核细胞给药组中有毛细血管密度高的倾向。(对照组；38.3±1.7，末梢血单核细胞给药组；42.3±2.1毛细血管数/视野各组5匹，平均±标准偏差)。结果示于图1的A和B。
这些显示出下述的可能性，G-CSF促进向小鼠末梢血动员内皮前体细胞，其结果，促进移植了末梢血的大鼠中的血管新生，暗示G-CSF有应用于末梢循环障碍治疗的可能性。实验例3(药理效果)将裸大鼠(F344/N Jcl-rnu)的左大腿动静脉摘出，制成下肢缺血模型，对缺血1周后的下肢组织标本用碱性磷酸酶染色测定血管密度。将从缺血4日前到1周后给药G-CSF 100μg/kg/day的组(G-CSF给药组)与对照组比较。对于对照组肌肉内给药磷酸缓冲液。结果显示，G-CSF给药组比对照组毛细血管密度高(对照组；38.3±1.7，末梢血单核细胞给药组；44.7±2.4毛细血管数/视野各组5匹，平均±标准偏差)。结果示于图1的A和C。
结果显示，G-CSF对缺血部位的血管新生有促进效果，暗示G-CSF有应用于末梢循环障碍治疗的可能性。
产业上的可利用性本发明的以G-CSF为有效成分的缺血性疾病治疗剂，如实验例1～3所示那样，可期待对闭塞性动脉硬化症中比较重症的症例有治疗效果。推断该G-CSF的治疗效果是基于对血管新生的促进，所以对其他的缺血性疾病，即，外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍(脑中风、脑梗塞等)、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病、缺血性心脏疾病(缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全等)也可期待有治疗效果。根据本发明的治疗比现有治疗法简便、安全并且有效。
序列表<110>中外制药株式会社<120>缺血性疾病治疗剂<130>002078<160>1<210>1<211>174<212>PRT<212>人<400>1Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170
权利要求
1.以人粒细胞集落刺激因子为有效成分的缺血性疾病治疗剂。
2.根据权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，其中，缺血性疾病为，外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病、缺血性心脏疾病。
3.根据权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，其中，缺血性疾病为，脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全、闭塞性动脉硬化症。
4.根据权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，缺血性疾病为闭塞性动脉硬化症。
5.根据权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞治疗缺血性疾病中，使用所述治疗剂以从骨髓中得到必要且足够量的造血干细胞。
6.根据权利要求2所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞治疗外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病、或缺血性心脏疾病中，使用所述治疗剂以从骨髓中得到必要且足够量的造血干细胞。
7.根据权利要求3所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞治疗脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全或闭塞性动脉硬化症中，使用所述治疗剂以从骨髓中得到必要且足够量的造血干细胞。
8.根据权利要求4所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞治疗闭塞性动脉硬化症中，使用所述治疗剂以从骨髓中得到必要且足够量的造血干细胞。
9.根据权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞治疗缺血性疾病中，使用所述治疗剂以从末梢血中得到必要且足够量的造血干细胞。
10.根据权利要求2所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞治疗外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病、或缺血性心脏疾病中，使用所述治疗剂以从末梢血中得到必要且足够量的造血干细胞。
11.根据权利要求3所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞治疗脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全、或闭塞性动脉硬化症中，使用所述治疗剂以从末梢血中得到必要且足够量的造血干细胞。
12.根据权利要求4所述的缺血性疾病治疗剂，在投与患者本身的造血干细胞的治疗闭塞性动脉硬化症中，使用所述治疗剂以从末梢血中得到必要且足够量的造血干细胞。
13.根据权利要求1至4所述的缺血性疾病治疗剂，其中，通过给药，在末梢血中增加的造血干细胞赋予患病部位的血管形成。
14.缺血性疾病治疗法，其特征在于，将以具有血管新生作用的因子或其基因投与患者为特征的缺血性疾病治疗、和权利要求1至3所述的缺血性疾病治疗剂并用。
15.闭塞性动脉硬化症治疗法，其特征在于，将以具有血管新生作用的因子或其基因投与患病部位附近为特征的闭塞性动脉硬化症治疗、和权利要求4所述的缺血性疾病治疗剂并用。
16.缺血性疾病治疗法，其特征在于，将临床上作为缺血性疾病的药物疗法使用的抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂、或高血脂症治疗剂等与权利要求1至3所述的缺血性疾病治疗剂并用。
17.闭塞性动脉硬化症治疗法，其特征在于，将临床上作为闭塞性动脉硬化症的药物疗法使用的抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂、或高血脂症治疗剂等与权利要求4所述的缺血性疾病治疗剂并用。
18.为了治疗缺血性疾病的人粒细胞集落刺激因子的用途。
19.根据权利要求18所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病或缺血性心脏疾病。
20.根据权利要求18所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全或闭塞性动脉硬化症。
21.根据权利要求18所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为闭塞性动脉硬化症。
22.人粒细胞集落刺激因子的用途，其为了在投与患者本身的造血干细胞的缺血性疾病的治疗中从骨髓得到必要且足够量的造血干细胞。
23.根据权利要求22所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病或缺血性心脏疾病。
24.根据权利要求22所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全或闭塞性动脉硬化症。
25.根据权利要求22所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为闭塞性动脉硬化症。
26.人粒细胞集落刺激因子的用途，其为了在投与患者本身的造血干细胞的缺血性疾病的治疗中从末梢血中得到必要且足够量的造血干细胞。
27.根据权利要求26所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病或缺血性心脏疾病等治疗剂。
28.根据权利要求26所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全或闭塞性动脉硬化症。
29.根据权利要求26所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为闭塞性动脉硬化症。
30.人粒细胞集落刺激因子的用途，其特征在于，在缺血性疾病治疗中，投与患者具有血管新生作用的因子或其基因。
31.根据权利要求30所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为外伤、移植时排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、与感染症有关的缺血性疾病、四肢缺血性疾病或缺血性心脏疾病。
32.根据权利要求30所述的人粒细胞集落刺激因子的用途，其中，缺血性疾病为脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全或闭塞性动脉硬化症。
33.人粒细胞集落刺激因子的应用，其特征在于，在缺血性疾病治疗中，在患病部位附近投与具有血管新生作用的因子或其基因。
全文摘要
公开一种以人粒细胞集落刺激因子为有效成分的对缺血性疾病有效的治疗剂。提供一种有效的治疗法，通过投与该治疗剂，可消除特别是用于闭塞性动脉硬化症的现有的运动疗法、药物疗法、血液流动再建术、和最近提案的基因治疗及骨髓细胞的肌肉内移植等中的缺点。进一步本治疗剂也可成为缺血性脑血管障碍、缺血性心脏疾病等缺血性疾病治疗剂。
文档编号A61P19/10GK1466463SQ01816532
公开日2004年1月7日 申请日期2001年9月13日 优先权日2000年9月13日
发明者宫井达也, 彦, 田村政彦 申请人:中外制药株式会社