新的谷氨酸受体调节蛋白和核酸分子及其用途的制作方法

专利名称：新的谷氨酸受体调节蛋白和核酸分子及其用途的制作方法
相关的申请本申请要求2000年12月22日提交的美国专利临时申请号60/257,589的利益，该申请的全文在此引入作为参考文献。
背景技术：
谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统(CNS)中绝大多数兴奋突触的递质，并在各种CNS功能中起重要的作用(综述参见Hollmann(1994)Annu.Rev.Neurosci.1731-108)。近10年来，主要是通过将分子生物学的技术应用于谷氨酸受体和转运蛋白的研究，对谷氨酸能突触的了解有了很大的进展。谷氨酸门控阳离子通道有三个家族，分别称为离子化的谷氨酸受体(iGluRs)；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，即α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体和红藻氨酸受体。同时也存在三类(根据其氨基酸同一性划分)促代谢的G蛋白偶联谷氨酸受体(mGluRs)，这些受体通过G蛋白亚基作用于细胞膜的离子通道和第二信使，例如二酰甘油和cAMP，从而修饰神经元和胶质细胞的兴奋性。此外，在脑中，至少有二种胶质谷氨酸转运蛋白和三种神经元转运蛋白。
现已清楚，谷氨酸在各种神经元活性的调节上是很重要的，这些神经元活性包括，但不限于，神经的可塑性、神经的发育和神经变性。NMDA受体和AMPA/红藻氨酸受体起谷氨酸门控阳离子通道的作用，而促代谢(metabotropic)受体(mGluRs)通过G蛋白调节第二信使的产生。分子水平的研究表明，NMDA以多亚基(NMDAR1和NMDAR2A-2D)的形式存在，还表明mGluRs以多亚型(mGluR1-mGluR8)的形式存在。而且，已发现至少三种mGluRsmGluR1、mGluR4和mGluR5的剪接变体。
mGluR1和mGluR5的亚型与磷脂酰肌醇-钙第二信使系统的兴奋偶联，而mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGluR6、mGluR7、mGluR8与抑制腺苷酸环化酶活性的G蛋白偶联。促代谢的谷氨酸受体(mGluRs)，例如mGluR1和mGluR5，通过神经元内的1，4，5-三磷酸肌醇和ryanodine敏感的Ca2+存储可以增加细胞内Ca2+的浓度。两种类型的存储都与质膜内可透过Ca2+的通道在功能上偶联。mGluR介导的细胞内Ca2+浓度的增加可以激活Ca2+敏感的K+通道和依赖于Ca2+的非选择性离子通道。这些mGluR介导的效应往往是由于ryanodine敏感的Ca2+的流动所产生的，而不是1，4，5-三磷酸肌醇敏感的Ca2+存储库的Ca2+的流动所产生，由此推测mGluRs、细胞内的Ca2+存储和细胞膜内的Ca2+敏感的离子通道之间在功能上存在密切的相互关系。
就促代谢谷氨酸受体亚型5(mGluR5)而言，在鼠和人的大脑中已鉴定出两个同工型。与mGluR5a相比，mGluR5b在第七跨膜结构域之后50个残基处含有32个插入的氨基酸。人受体的一级序列与大鼠的同源受体相比，共有约93-96％的同一性。大鼠和人的mGluR5大的细胞外结构域的推导氨基酸序列之间是非常保守的(98.6％)，由此推测mGluR5的氨基末端区有重要的功能。两种人的同工型在爪蟾卵母细胞中的表达都引起了谷氨酸应答，由此推测人脑的两种受体能激活磷脂酶C，并产生Ca2+激活的C1电流。
由于谷氨酸能突触无所不在的分布，mGluR有可能参与到CNS的各种功能中。此外，mGluR亚型的大的差异性和不均一的分布，为开发选择性地与1种或有限几种CNS功能中涉及的mGluRs相互作用的药剂提供了有利条件。因此，有必要详细了解mGluRs在CNS功能中的独特作用，以及，尤其是鉴定特定的mGluRs的调节剂，以用于建立新的治疗各种精神病和神经的紊乱的策略。
发明简述本发明基于，至少是部分基于编码新的分泌蛋白家族的核酸分子的发现，该分泌蛋白与促代谢谷氨酸受体亚型5亚家族有同源性，尤其是与促代谢谷氨酸受体亚型mGluR5a和mGluR5b的N端部分有同源性，在这里称为促代谢谷氨酸受体亚型5调节蛋白(在此亦称为“mGluR5M”蛋白或“mGluR5M”家族)。本发明的mGluR5M分子以及mGluR5M模拟物，和/或mGluR5M调节剂可用于各种细胞加工中的调节。因此，本发明的一个方面是提供编码mGluR5M蛋白或其生物活性部分的分离的核酸分子，以及适用作检测编码mGluR5M的核酸的引物或杂交探针的核酸片段。
在一个实施方案中，mGluR5M核酸分子与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其互补序列有60％同一性，SEQ ID NO1为质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，该质粒保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775。在优选的实施方案中，分离的mGluR5M核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO3所示，或是其互补序列。在另一个实施方案中，分离的mGluR5M核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，或是其互补序列。在还有另一个优选的实施方案中，分离的mGluR5M核酸分子的序列为质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，或其互补序列，该质粒保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775。
在另一个实施方案中，mGluR5M核酸分子包括编码一种蛋白的核苷酸序列，该蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO2的氨基酸序列、或质粒的DNA插入片段所编码的氨基酸或氨基酸序列有足够高的同源性或同一性，所说的质粒保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775。在另一个优选的实施方案中，mGluR5M核酸分子包括编码一种蛋白的核苷酸序列，该蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO2的氨基酸序列、或质粒的DNA插入片段所编码的氨基酸或氨基酸序列至少有60％的同一性，所说的质粒保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775。
在另一个实施方案中，本发明分离的核酸分子编码的mGluR5M蛋白包括N端的mGluR样结构域和/或C端的独特结构域。还有一个实施方案中，本发明分离的核酸分子编码的蛋白包括G蛋白偶联的受体家族3的共有序列。在又有另一个实施方案中，mGluR5M核酸分子编码缺失跨膜结构域的mGluR5M蛋白。在还有另一个实施方案中，mGluR5M核酸分子编码mGluR5M蛋白，而且该核酸分子是天然存在的核苷酸序列。在还有另一个实施方案中，mGluR5M核酸分子编码缺失跨膜结构域的mGluR5M蛋白。
本发明的另一个实施方案描述了mGluR5M核酸分子的特征，该核酸分子特异检测与编码非mGluR5M蛋白的核酸分子有关的mGluR5M核酸分子。例如，在一个实施例中，长度至少为30个核苷酸的mGluR5M核酸分子在严格条件下，与包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的互补核酸分子，或质粒的DNA插入片段的核苷酸序列杂交，所说的质粒保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775。在另一个实施方案中，mGluR5M核酸分子在严格条件下，与由SEQ ID NO1中大约880-1823位核苷酸组成的核酸分子的互补核酸杂交。本发明的另一实施方案提供分离的、mGluR5M核酸编码链的反义核酸分子。
本发明的另一个方面是提供包含mGluR5M核酸分子的载体。在某些实施方案中，该载体是重组的表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供含有本发明载体的宿主细胞。本发明还提供产生mGluR5M蛋白的方法，通过在合适的培养基上培养本发明的含重组表达载体的宿主细胞，从而产生mGluR5M蛋白。
本发明的另一个方面是描述了分离的，或重组的mGluR5M蛋白或多肽的特征。在一个实施方案中，分离的mGluR5M蛋白包括N端mGluR样结构域。在另一个实施方案中，分离的mGluR5M蛋白包括C端独特结构域。在另一个实施方案中，分离的mGluR5M蛋白缺失跨膜结构域。在另一个实施方案中，分离的mGluR5M蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO2的氨基酸序列有足够高的同源性或同一性。在优选的实施方案中，mGluR5M蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有约60％的同一性。在另一个实施方案中，mGluR5M蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方案描述了分离的mGluR5M蛋白的特征，该蛋白由与SEQ ID NO1的核苷酸序列至少有约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上同一性的核苷酸序列或其互补序列编码。本发明的另一实施方案描述了分离的mGluR5M蛋白的特征，该蛋白与具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽具有约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上的同一性。本发明还描述了由下述核酸分子编码的mGluR5M蛋白的特征该核酸分子的核苷酸序列在严格的杂交条件下，与含有SEQ ID NO1的核苷酸序列核酸分子的互补核酸杂交。
本发明的mGluR5M蛋白，或其生物活性部分可以与非mGluR5M多肽操作连接而形成融合蛋白。本发明还描述了与mGluR5M蛋白特异结合的抗体的特征，例如单克隆或多克隆抗体。此外，mGluR5M蛋白，或其生物活性部分可以掺入药物组合物中，根据需要，该组合物可以包括可药用的载体。
另一方面，本发明提供一种检测mGluR5M在生物样品中表达的方法，该方法通过使生物样品与能够检测mGluR5M核酸分子、蛋白或多肽的试剂接触，从而检测mGluR5M核酸分子、蛋白或多肽在生物样品中的存在。
再一方面，本发明提供一种检测mGluR5M活性在生物样品中的存在的方法，该方法通过使生物样品与能够检测mGluR5M活性指示剂的试剂接触，从而检测生物样品中mGluR5M活性的存在。
还有一方面，本发明提供一种调节mGluR5活性的方法，该方法包括使细胞与mGluR5M蛋白、肽、核酸分子、肽模拟物或其他小分子接触，从而调节mGluR5在细胞中的活性。在一个实施方案中，mGluR5M蛋白、肽、抗体、核酸分子、肽模拟物或其他小分子抑制mGluR5活性。在另一个实施方案中，mGluR5M蛋白、肽、抗体、核酸分子、肽模拟物或其他小分子刺激mGluR5活性。在优选的实施方案中，该试剂是与mGluR5M蛋白特异结合的抗体。在另一个实施方案中，该试剂是mGluR5M核酸分子。在还有一个实施方案中，该试剂是mGluR5M蛋白、肽或肽模拟物。
在一个实施方案中，本发明的方法用于治疗具有以mGluR表达或活性异常为特征的紊乱的受试者，其方法是给受试者施用mGluR5M蛋白、肽、抗体、核酸分子、肽模拟物或其他小分子。在优选的实施方案中，以mGluR5M蛋白或核酸表达异常为特征的紊乱是中枢神经系统的疾病。
本发明还提供了鉴定遗传改变是否存在的诊断测定方法，该遗传改变至少具有以下特征之一(i)编码mGluR5M蛋白基因的异常修饰或突变；(ii)所说基因的错误调节；(iii)mGluR5M蛋白翻译后的异常修饰，其中，所说基因的野生型编码有mGluR5M活性的蛋白。
本发明的另一个方面是提供一种鉴定与mGluR5M蛋白结合或调节mGluR5M蛋白活性的化合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定与mGluR5M蛋白结合的化合物的方法，该方法包括使mGluR5M蛋白与测试化合物(任选和mGluR配体一起)接触，并测定mGluR5M蛋白是否与该测试化合物结合。在另一个实施方案中，本发明提供一种鉴定与mGluR5M蛋白结合或调节mGluR5M蛋白活性的化合物的方法，该方法包括使表达mGluR5M蛋白的细胞与mGluR5M蛋白和测试化合物接触，然后测定该测试化合物对mGluR5M蛋白的结合和活性的影响，从而鉴定调节mGluR5M蛋白活性的化合物。
由以下的详述和权利要求，本发明的特优点是显而易见的。
附图简述

图1描述了人mGluR5M的cDNA序列和推测的氨基酸序列。核苷酸序列(A图)相应于SEQ ID NO1的1-1823位核苷酸。加下划线处为编码区。氨基酸序列(B图)相应于SEQ ID NO2的1-369位氨基酸。
图2是人mGluR5M(SEQ ID NO2)氨基酸序列的多序列比对(MSA)，即人mGluR5的前370个氨基酸残基(SEQ ID NO4的1-370位氨基酸残基)，以及鼠mGluR5的前369个氨基酸残基(SEQ IDNO5的1-369位氨基残基)。序列比对用Clustal算法进行，该算法是MEGALIGN程序(例如，3.1.7版本)的一部分，而该程序是DNASTAR序列分析软件包的一部分。配对方式的序列比对参数如下K-tuple＝1；空位长度罚分＝3；Window＝5；对角线剃齿(Diagonalssaved)＝5。多序列比对的参数如下空位罚分＝10；空位长度罚分＝10。星号表示比对的蛋白中重要的保守残基。
发明详述本发明是基于新的分子的发现，在此称为促代谢的谷氨酸受体亚型5调节(“mGluR5M”)蛋白和核酸分子，它包括具有某种保守结构和功能特征的分子的一个家族。术语“家族”在本发明中指蛋白和核酸分子时，其意思是指具有共同的结构域，以及按照这里所定义，具有足够高的氨基酸或核苷酸序列同源性或同一性的两种或两种以上的蛋白或核酸分子。这种家族成员可以天然存在，并来源于相同或不同的种。例如，一个家族可以包含人类来源的第一蛋白，以及其它不同的人类来源蛋白，或者，可以含有非人类来源的同源蛋白。家族成员也可以具有共同的功能特性。
例如，本发明的mGluR5M蛋白与促代谢谷氨酸受体mGluR5a和mGluR5b的N端胞外结构域有显著的同源性。已知促代谢谷氨酸受体共有某种保守的氨基酸残基，其中有些已确定在配体结合和/或受体功能方面是重要的。例如，已知促代谢谷氨酸受体在N端胞外结构域和胞外环内，至少共有19个保守的半胱氨酸残基，有人提出，这些残基在受体的三维结构，和/或在分子内转导方面是重要的。如SEQ ID NO2所述的人mGluR5M氨基酸序列中，至少存在三个这种保守的半胱氨酸残基。此外，根据促代谢谷氨酸受体的N端胞外结构域与已知的细菌周质结合蛋白(PBLs)的同源性，预测丝氨酸残基(位于SEQ ID NO4所述的人mGluR5M序列中第152位氨基酸)和苏氨酸残基(位于SEQID NO4所述的人mGluR5M序列中第175位氨基酸)在谷氨酸的结合方面是重要的，两者均存在于SEQ ID NO2所述的人mGluR5M氨基酸序列中(即SEQ ID NO2中的丝氨酸152和苏氨酸175)。在图2中，这些重要的保守残基用星号表示。
在一个方面，本发明的mGluR5M蛋白是氨基酸序列为约330-410个氨基酸的蛋白，优选序列的长度约为340-400个氨基酸，更优选约350-390个氨基酸，还更优选约360-380个氨基酸，或约369-370个氨基酸，并包括至少一个这里所述的表现mGluR5M蛋白家族的特征的结构域或共有序列。在另一个实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白含有信号序列。这里所使用的，“信号序列”包括长度约为20个氨基酸残基的肽，该肽存在于分泌蛋白和膜内在蛋白的N端，并含有至少30％疏水氨基酸残基。在优选的实施方案中，信号序列含有至少约15、20、25、30、35、40或更多的氨基酸残基，并至少有约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更多的疏水氨基酸残基(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或脯氨酸)。这种“信号序列”在本领域中亦称为“信号肽”，它用来将含有这种序列的蛋白引导至脂双层。例如，发现在SEQ ID NO2的约1-20位的氨基酸(SEQ ID NO2所述的mGluR5M氨基酸序列的蛋氨酸1-丙氨酸20)为信号序列。还有另一个实施方案中，mGluR5M蛋白是成熟的mGluR5M蛋白。这里所使用的，术语“成熟的mGluR5M蛋白”是指已将信号肽裂解的mGluR5M蛋白。在有代表性的实施方案中，成熟的mGluR5M蛋白含有SEQ ID NO2的21-369位氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白包括N端mGluR样的结构域。这里所用的术语“N端mGluR样的结构域”是指含有大约250-350个氨基酸的氨基酸序列的蛋白结构域，该氨基酸序列与mGluR的氨基酸序列至少共有80％的同一性。优选“N端mGluR样的结构域”包括含有约260-340、270-330、280-320、290-310或约300个氨基酸残基(例如约302个氨基酸残基)的蛋白结构域，并与mGluR的氨基酸序列共有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在一个典型的实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白含有包括SEQ ID NO2的约1-303位氨基酸的N端mGluR样的结构域。
在还有另一个实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白包括C端独特序列。这里所用的“C端独特结构域”是指mGluR5M蛋白家族成员的蛋白结构域，该结构域包括mGluR5M蛋白氨基酸序列中C端到N端mGluR样结构域氨基酸残基。这里所用的“C端独特结构域”是指长度为约50-75个氨基酸残基的蛋白结构域，优选长度至少为至少约55-70个氨基酸残基，更优选长度至少为约60-65个氨基酸残基(例如，长度约为63个氨基酸残基)，并且与另一mGluR5M家族成员的C端氨基酸残基至少有约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。然而，如这里进一步所详述的，mGluR5M蛋白家族成员的C端独特结构域与mGluR的氨基酸序列的同源性不够高。例如，mGluR5M同源物的C端独特序列与人mGluR5M的SEQ ID NO2的304-369氨基酸的C端独特序列至少有80％的同源性，但与人mGluR5无明显的同源性。
根据存在的至少一个G蛋白偶联的受体家族3的特征共有序列，可以进一步鉴定mGluR5M家族的成员(或N端mGluR样的结构域)。例如，mGluR5M蛋白可以包括G蛋白偶联的受体家族3_1共有序列，该共有序列具有序列[LV]-X-N[LIVM](2)-X-L-F-X-I[PA]-Q[LIVM]-[STA]-X-[STA](3)-[STAN](SEQ ID NO6)。这里所述的共有序列是按照标准的Prosite Signature命名而描述的(例如，所有的氨基酸按其通用单个字母符号表示；X是指任意氨基酸；X(n)是指任意n个氨基酸，例如，X(2)是指任意2个氨基酸；[LIVM]是表示方括号内出现的氨基酸中的任意一个，例如，L、I、V、M中的任意一个，或者是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或蛋氨酸中的任意一个)。
在还有另一个实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白缺失跨膜结构域。这里所用的“跨膜结构域”包括至少有约10个氨基酸残基的蛋白结构域，其中约60％的氨基酸残基含有非极性侧链，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。在优选的实施方案中，“跨膜结构域”包括至少有约13个氨基酸残基的蛋白结构域，优选有约16个、更优选约19个、甚至更优选约21、23、25、30、35或40个氨基酸残基的蛋白结构域，其中至少约70％、优选约80％、更优选约90％的氨基酸残基含有非极性的侧链，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。跨膜结构域是亲脂性的，并且横跨细胞膜(例如，在真核细胞中横跨细胞膜或细胞器膜)。含有跨膜结构域的蛋白或多肽称为“膜结合”蛋白或多肽。相反，“缺失跨膜结构”的蛋白或多肽不是膜结合的，例如是胞质的、分泌的或存在于细胞器内的蛋白。
本发明优选的mGluR5M分子的氨基酸序列与氨基酸序列为SEQ IDNO2的mGluR5M蛋白有足够高的同源性或同一性。这里所用的“足够高的同源性”或“足够高的同一性”是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够量或最小量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或同一的氨基酸残基(例如有类似侧链的氨基酸残基)，从使第一和第二氨基酸或核苷酸序列共有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，对于共有共同结构域的氨基酸或核苷酸序列，在其结构域的氨基酸序列之间至少共有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性，而且至少含有一个、优选含有二个结构域时，则在此被定义为有足够高的同源性或同一性。此外，共有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性，而且共有共同的功能活性的氨基酸或核苷酸序列在这里定义为有足够高的同源性或同一性。
这里可交换使用的“mGluR5M活性”、“mGluR5M的生物活性”、“或mGluR5M的功能活性”是指由mGluR5M蛋白、多肽或核酸分子所产生的活性，例如，按照标准技术，在体内、或在体外测定的作用于表达mGluR的细胞的活性。
在本发明的优选方面，“mGluR5M活性”、“mGluR5M的生物活性”、“或mGluR5M的功能活性”包括谷氨酸受体功能和/或活性的调节(例如，增强或抑制)，特别是促代谢的谷氨酸受体功能和/或活性(例如，mGluR5功能和/或活性)的调节。在一个实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白直接调节谷氨酸受体功能和/或活性，例如，以依赖或不依赖配体的方式，通过与受体结合，增强或抑制受体的活性而进行调节。在另一个实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白，例如，通过影响谷氨酸受体配体的供给，间接地调节谷氨酸受体功能和/或活性。举例来说，mGluR5M蛋白可以通过直接与谷氨酸结合，调节神经递质、神经毒性、兴奋毒性和/或代谢功能。
在优选的实施方案中，mGluR5M的活性至少是以下以活性之一(1)G蛋白连接的第二信使信号传递途径的调节(例如，调节二酰基甘油和/或肌醇三磷酸介导的信号途径)，例如，在神经细胞信号传递和神经系统功能中涉及的信号传递途径；(2)谷氨酸能传递的调节；(3)神经元兴奋性的调节；(4)突触传递的调节；(5)神经递质释放(如谷氨酸释放)的调节；(6)依赖电压的，和/或不依赖电压的，和/或配体门控的离子通道(例如K+通道或Ca2+通道)的调节；(7)神经元发育的调节(例如，在发育的大脑中，神经元的分化、迁移和存活的调节)；(8)神经系统功能的调节；(9)神经变性过程的调节(例如，急性或慢性的神经退行性变过程)。在还有一个实施方案中，mGluR5M的活性是mGluR5二聚化的调节(例如mGluR5a和/或mGluR5b的二聚化)和/或其他mGluR家族成员的二聚化(例如mGluR1的二聚化)。
因此，本发明的mGluR5M蛋白(以及肽、核酸分子、抗体、肽模拟物和小分子)可以用来治疗，例如，神经变性障碍和/或疾病(例如，运动神经元疾病(MND)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、享廷顿舞蹈病、帕金森氏病和阿尔茨海默病、中风、癫痫持续状态后急性发作的脑损伤、脑缺血或创伤性脑损伤和/或运动障碍。本发明的mGluR5M蛋白(以及肽、核酸分子、抗体、肽模拟物和小分子)可以用作认知增强剂、抗癫痫剂和/或用于治疗疼痛和/或高血压，其他反应于本发明的mGluR5M蛋白治疗相关的临床状况包括癫痫、健忘症、焦虑症、痛觉过敏和/或精神障碍(例如，精神分裂症和/或其他精神病)。在优选的实施方案中，本发明的mGluR5M蛋白(以及肽、核酸分子，抗体、肽模拟物和小分子调节剂)用于治疗精神分裂症和/或其他精神障碍，其中包括，但不限于分裂情感性的障碍、双极情感性的障碍、单极情感性障碍和青春期行为障碍。
如这里所述，本发明的优选实施描述了分离的mGluR5M蛋白和具有mGluR5M活性的多肽的特征。优选的mGluR5M蛋白至少有N端mGluR样结构域和/或C端独特结构域，以及mGluR5M活性。在优选的实施方案中，mGluR5M蛋白含有C蛋白偶联的受体家族3_1共有序列和mGluR5M活性。在另一个优选的实施方案中，mGluR5M蛋白至少含有N端mGluR样的结构域和/或G末端独特结构域，以及G蛋白偶联的受体家族3_1共有序列，mGluR5M活性，以及与SEQ ID NO2氨基酸序列有足够同源性或同一性的氨基酸序列。
由成人全脑RNA文库鉴定出人mGluR5M cDNA，该cDNA的长度约为1823个核苷酸，并编码长度为369个氨基酸残基的蛋白。人mGluR5M蛋白含有SEQ ID NO2的约1～303位氨基酸的N端mGluR样的结构域，同时含有SEQ ID NO2的约304～369位氨基酸的C端独特结构域。人mGluR5M蛋白还含有SEQ ID NO2的约158～176位氨基酸的G蛋白偶联的受体家族3_1共有序列。
含有编码人mGlu 5M(在此可互换称作YI 176)的核苷酸序列的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，保藏日期为2000年12月12日，保藏号为PTA-2775。该保藏物的维持是根据国际认定的专利程序微生物保藏的布达佩斯条约的规定。该保藏仅是为本领域的技术人员提供方便，而不承认该保藏是35U.S.C§112所要求的。
以下对本发明的各个方面作更详细的描述I、分离的核酸分子本发明的一个方面涉及分离的核酸分子，该核酸分子编码mGluR5M蛋白，或其生物活性部分，还涉及足以可用作杂交探针来鉴别编码mGluR5M的核酸(例如，mGluR5M mRNA)的核酸片段，以及用作mGluR5M核酸分子的扩增和突变的PCR引物的核酸片段。这里所用的术语“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及用核苷酸类似物所产生的该DNA或RNA的类似物。上述的核酸分子可以是单链的，或是双链的，但优选是双链的DNA。
“分离的”核酸分子是从其他核酸分子分离出来的核酸分子，而其中的其他核酸分子存在于核酸的天然来源中。优选“分离的”核酸不含有该核酸来源的生物的基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的序列(亦即，位于该核酸的5’和3’端的序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的mGluR5M核酸分子可以含有少于约5Kb、4Kb、3Kb、2Kb、1Kb、0.5Kb或0.1Kb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然位于上述核酸分子来源的细胞的基因组DNA中的核酸分子的侧翼。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，在用重组技术产生时，可以基本上不含其他的细胞物质，或培养基；或在用化学法合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。
本发明的核酸分子，例如含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，即质粒中的DNA插入片段的核苷酸序列，或其部分的核酸分子，可以用标准的分子生物技术分离，该序列的信息亦在此提供，其中所说的质粒保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775。用SEQ ID NO1的核酸序列，即ATCC保藏的、保藏号为PTA-2775的质粒中的DNA插入片段的核苷酸序列的全部或部分作为探针，采用标准的杂交和克隆技术，可以分离出mGluR5M核酸分子(例如在Sambrook，J，Fritsh，E.F，和Maniatis，T.分子克隆实验指南第二版中所述，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory印刷，Cold SpringHarbor，NY，1989)。
还有，含有全部或部分SEQID NO1的核酸分子，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2755的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，可以用合成的寡核苷酸引物，通过聚合物酶链反应(PCR)来分离，其中的引物是根据SEQ ID NO1，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列而设计的。
本发明的核酸可以用cDNA、mRNA或者基因组DNA来作为模板，并采用合适的寡核苷酸引物，按照标准的PCR技术进行扩增。由此扩增的核酸可以克隆到合适的载体中，并通过DNA序列分析，分析其特征。此外，相应于mGluR5M核苷酸序列的寡核苷酸可以用标准的合成技术制备，例如用自动DNA合成仪制备。
在优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。SEQ ID NO1的序列相应于人mGluR5M cDNA。该cDNA包含编码人mGluR5M蛋白的序列(即“编码区”，核苷酸4-1113，包括横向联核苷酸1110-1113的终止密码子)，以及5’非翻译序列(核苷酸1-3)和3’非翻译序列(核苷酸1110或1113-1823)。或者，该核酸分子可以只包含SEQ ID NO1的编码区(如核苷酸4-1110或1113，相应于SEQ ID NO3)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含与SEQID NO1所示的核苷酸序列，即在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，或这些核苷酸序列的任何一种的一部分互补的核酸分子。与SEQ ID NO1所示的核酸分子，或与在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的插入DNA片段的核苷酸序列互补的核酸分子是与其足够互补的核酸分子，从而形成稳定的双链体。
在还有另一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含的核苷酸序列与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或与在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列至少有约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
此外，本发明的核酸分子可以只包含SEQ ID NO1的核酸序列，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物，或编码mGluR5M蛋白的生物活性部分的片段。由mGluR5M基因的克隆所测定的核苷酸序列，可产生探针和引物，这些探针和引物可设计成用来鉴定和/或克隆其他mGluR5M家族成员以及其他种的mGluR5M同源物。该探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸。该探针/引物(例如，寡核苷酸)通常包含约5-10、10-15、15-20、20-25个或更多个核苷酸，这些核苷酸在严格条件下，与SEQ ID NO1，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的有义序列；与SEQ ID NO1，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒中的DNA插入片段的核苷酸序列的反义序列；或与天然存在的SEQ ID NO1的突变体杂交。或者，该探针/引物(例如寡核苷酸)包含SEQ ID NO1，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的有义序列；SEQ ID NO1，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒中的DNA插入片段的核苷酸序列的反义序列；或天然存在的SEQ ID NO1的突变体的约5-10、10-15、15-20、20-25或更多个连续核苷酸。用来检测mGluR5M序列的探针/引物的典型例子包含SEQ ID NO1的有义或反义序列的约880-1823位核苷酸。
基于mGluR5M核苷酸序列的探针可以用来检测编码相同或同源蛋白的转录物或基因组序列。在优选的实施方案中，该探针还包括与其连接的标记基因，例如，标记的基因可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅因子。这种探针可以用作诊断测试试剂盒的一部分，用来鉴定错误表达mGlu 5M蛋白的细胞或组织，例如，测定受试者的细胞样品中编码mGluR5M的核酸水平，如检测mGluR5MmRNA水平，或测定基因组的mGluR5M基因是否突变或缺失。
编码“mGluR5M蛋白生物活性部分”的核酸片段可以通过以下步骤制备分离SEQ ID NO1，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的一部分，该序列编码具有mGluR5M生物活性的多肽(mGluR5M蛋白的生物活性前面已描述过)；表达mGluR5M蛋白的被编码部分(例如，通过体外重组表达)以及评价mGluR5M蛋白被编码部分的活性。在一个典型的实施方案中，编码本发明蛋白的生物活性部分的核酸分子包括长度大于100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800或更多个核苷酸、并在严格的杂交条件下，与SEQ ID NO1，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列。
本发明还包括与SEQID NO1所示的核苷酸序列，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列不同，由于遗传密码的简并性因而能编码与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所编码的同样的mGluR5M蛋白的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明分离的核酸分子的核苷酸序列编码含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白。
除了SEQID NO1所示的mGluR5M核苷酸序列，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列以外，本领域的技术人员懂得，在某个群体中(例如，人种)可能存在导致mGluR5M蛋白的氨基酸序列改变的DNA序列的多态性。由于天然的等位基因变异，这种mGluR5M基因的多态性可能存在于某个群体的个体之间。这里所用的术语“基因”和“重组基因”是指包含编码mGluR5M蛋白，优选哺乳动物的mGluR5M蛋白的可读框的核酸分子。这种天然的等位基因的变异杂通常可引起mGluR5M基因的核苷酸序列的1-5％的变异。由天然的等位基因变异引起，并且不改变mGluR5M蛋白的功能活性的一些和全部的这种核苷酸的变异，和所产生的mGluR5M基因的氨基酸多态性也被认为属于本发明的范围。
此外，编码其他mGluR5M家族成员，并因此而具有与SEQ ID NO1的mGluR5M序列不同的核苷酸序列核酸分子，也考虑为属于本发明的范围。例如，灵长类的mGluR5M cDNA可以根据人mGluR5M的核苷酸序列来鉴定。编码不同种的mGluR5M蛋白，因而具有不同于SEQ IDNO1的mGluR5M序列的核苷酸序列的核酸分子，也属于本发明范围内。
与本发明的mGluR5M cDNA的天然等位基因的变异体和同源物相应的核酸分子，可按以下方法分离根据其与这里所公开的mGluR5M核酸的同源性，用这里公开的cDNA，或其一部分作为杂交探针，按照标准的杂交技术，在严格的杂交条件下进行杂交。
因此，在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子的长度至少为15个核苷酸，并且在严格的条件下，与含有SEQ ID NO1核苷酸序列，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的互补序列杂交。在另一个实施方案中，该核酸的长度至少为30、50、100、250或500个核苷酸，并且在严格的条件下与含有SEQ ID NO1核苷酸序列，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的互补核酸分子杂交。
这里所用的术语“在严格的条件下杂交”是指从杂交和洗涤的条件考虑，在此条件下，相互之间相同性或同源性非常高的核苷酸序列仍能互相杂交。优选的条件是使相互之间至少有约70％，更优选至少有约80％，甚至更优选至少有约85％或90％同一性的序列仍能相互杂交。这样的严格条件是本领域的技术人员熟知的，而且能在CurrentProtocols in Molecnlar Biology，Ausubel等，John Wiley和Sons出版，Inc.(1995)，2，4和6节中查到。其他的严格条件可在分子克隆实验室指南，Sambrook等，Cold spring Harbor印刷，Cold springHarbor，NY(1989)，第7、9和11章中查到。优选的、非限定的严格的杂交条件例子有在4×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约65-70℃下杂交(或在1×SSC加50％甲酰胺中，在约42-50℃下杂交)，随后在1×SSC中，在约65-70℃下洗1次或多次。优选的，非限定的高度严格杂交条件的例子有在1×SSC中，在约65-70℃下杂交(或在1×SSC加50％甲酰胺中，在约42-50℃下杂交)，随后在0.3×SSC中，在约65-70℃下洗1次或多次。优选的，非限制的降低严格性的杂交条件的例子有在4×SSC中，在约50-60℃下杂交(或选择在6×SSC加50％甲酰胺中，在约40-45℃下杂交)，随后在2×SSC中，在约50-60℃下洗涤1次或多次。介于上述所举值中间的范围，例如，在65-70℃或42-50℃之间的范围也包括在本发明内。在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl，10μM NaH2PO4，和1.25μM EDTA，pH7.4)可用来代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后，每次洗涤为15分钟。对于预计长度小于50个碱基对的杂交体，其杂交温度应比杂交体解链温度(Tm)低5-10℃，其中Tm按以下公式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+C碱基对数目)+4(G+C碱基对数目)。对于长度为18-49个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+]+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，[Na+]是杂交缓冲液中的钠离子的浓度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。技术熟练的专业人员也认识到其他的试剂也可加入杂交和/或洗涤缓冲液中，以减少核酸分子与膜，例如硝酸纤维素膜或尼龙膜，的非特异性杂交，该试剂包括，但不限于，封闭剂(例如，BSA或鲑鱼或鲱鱼精子载体DNA)，清洁剂(如SDS)，螯合剂(如DTA)，Ficoll，PVP等。特别是使用尼龙膜时，另外优选的非限制的严格杂交条件是在0.25-0.5MNaH2PO4，7％SDS中，在约65℃下杂交，随后用0.02M NaH2PO4，1％SDS在65℃下洗涤1次或多次，参见，例如，Church和Gilbert(1984)Proc Natl.Acad.Sci.USA 811991-1995(或用0.2×SSC，1％SDS洗涤)。
优选本发明的分离的核酸分子在严格的条件下与SEQ ID NO1或3的序列的互补序列杂交，并相当于天然存在核酸分子。这里所用的“天然存在的”核酸分子是指含有天然存在的核苷酸序列(例如，编码天然的多肽)的RNA或DNA分子。
除了可能存在于群体中的mGluR5M序列的天然存在的等位基因变体之外，技术熟练的人员会进一步懂得，通过突变，可将改变引入SEQID NO1的核苷酸序列，或引入在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的插入片段的核苷酸序列中，从而导致编码的mGluR5M蛋白的氨基酸序列的改变，而不改变mGluR5M蛋白的功能。例如，可以在SEQ IDNO1序列，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列上，进行核苷酸的取代，从而导致“非必需”氨基酸残基的取代。“非必需”氨基酸残基是在mGluR5M的野生型序列(例如，SEQ ID NO2)中可以改变而不改变其生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所必须的残基。例如，特别是本发明的mGluR5M蛋白和图2中的mGluR 5蛋白以及标有星号的氨基酸残基之间保守的氨基酸残基，预测是不容易改变的。此外，定义为G蛋白偶联的受体家族3_1的共有序列的氨基酸尤其是不容易改变的。还有，本发明的mGluR5M蛋白和G蛋白偶联的受体蛋白家族的其他成员(如图2中所述的mGluR 5R蛋白)之间保守的其它氨基酸残基也可能不容易改变。
因此，本发明的另一个方面是编码其活性非必需的氨基酸残基有改变的mGluR5M蛋白的核酸分子。这种mGluR5M蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO2不同，但仍保持生物活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码某种蛋白的核苷酸序列，其中该蛋白包含的氨基酸序列至少与SEQ ID NO2有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
编码与SEQ ID NO2的蛋白同源的mGluR5M蛋白的分离的核酸分子可通过下述方法产生在SEQ ID NO1序列中引入1个或1个以上核苷酸的取代、添加或缺失，从而在该序列所编码的蛋白中引入1个或1个以上氨基酸的取代、添加或缺失。可以采用标准的技术在SEQ ID NO1中引入突变，例如采用定点诱变和PCR介导的诱变技术。优选在1个或1个以上预测为非必需氨基酸残基的位置引入保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指其中的氨基酸残基用有类似侧链的氨基酸残基取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中是明确的。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选mGluR5M蛋白中预测为非必需的氨基酸残基被相同侧链家族的另一氨基酸残基取代。或者，在另一实施方案中，可在整个或部分mGluR5M编码序列中，随机引入突变，例如通过饱和诱变，然后对产生的突变体筛选其mGluR5M生物活性，以鉴定出保持活性的诱变体。SEQ ID NO1诱变后，可对其编码蛋白进行重组表达和蛋白活性的测定。
在优选的实施方案中，对突变mGluR5M蛋白分析其以下方面的能力(1)调节G蛋白连接的第二信使信号传递途径(例如，调节二酰甘油和/或三磷酸肌醇介导的信号传递途径)；(2)调节谷氨酸能的传递；(3)调节神经元的兴奋性；(4)调节突触的传递；(5)调节神经递质的释放(例如，谷氨酸的释放)；(6)调节依赖电压的和/或不依赖电压的和/或配体门控的离子通道(例如，K+通道或Ca2+通道)；(7)调节神经元的发育(例如，调节发育的脑中神经元的分化、迁移和/或存活)；(8)调节神经变性过程(例如急性或慢性的神经变性过程)；和/或(9)调节mGluR5的二聚化(例如，mGluR5a和/或mGluR5b的二聚化)。
除了上述的编码mGluR5M蛋白的核酸分子以外，本发明的另一个方面是反义的分离的核酸分子。“反义”核酸包含与编码蛋白的“有义”核酸互补的核苷酸序列，例如，与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA序列互补。因此，反义核酸可通过氢键与有义核酸键合。反义核酸可以与完整的mGluR5M编码链互补，或仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码mGluR5M的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”是指含有翻译为氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区(例如，人mGluR5M的编码区对应为SEQIQNO3)。在另一个实施方案中，反义核酸分子与编码mGluR5M的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”是指在编码区侧翼的5’和3’序列，它不翻译为氨基酸(即，亦称为5’和3’非翻译区)。
给出这里公开的编码mGluR5M的编码链序列(例如，SEQ ID NO3)，本发明的反义核酸可按照Watson和Crick碱基配对的规则来设计。反义核酸分子可以与完整的mGluR5M mRNA编码区互补，但更优选为仅与mGluR5M mRNA的编码或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，该反义的寡核苷酸可以与mGluR5M mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。例如，反义的寡核苷酸的长度可以为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个核苷酸。本发明的反义核酸可采用本领域已知的方法，用化学合成法和酶连接反应构建。例如，反义核酸(如，反义的寡核苷酸)可以用天然存在的核苷酸或经过不同修饰的核苷酸通过化学法合成，其中修饰的核苷酸设计成可增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸之间所形成的双链体的物理稳定性，例如，可采用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。能用来产生反义核酸的修饰的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧羧甲基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、和2，6-二氨基嘌呤。或者，上述的反义核酸可用表达载体由生物法产生，其中，核酸已按反义方向亚克隆到该表达载体中(即由插入的核酸所转录的RNA相对于目的靶核酸是反义的方向，在以下小节进一步描述)。
本发明的反义核酸分子通常用来施用给受试者，或在原位产生，从而使其与细胞的mRNA和/或编码mGluR5M蛋白的基因组DNA杂交或结合，由此而抑制该蛋白的表达，例如通过抑制其转录和/或翻译。该杂交可通过常规的核苷酸互补而形成稳定的双链体，或者，例如在反义核酸结合为DNA双链的情况下，通过在双螺旋的大沟发生特异的相互作用而形成稳定的双链体。本发明的反义核酸分子的常规给药方式的例子有在组织位点直接注射。或者，可将反义核酸分子进行修饰，使其能导向选择的细胞，然后通过全身给药。例如，对于全身给药，可将反义分子修饰成能与受体或在细胞表面上表达的抗原特异性结合，例如，将反义核酸分子与和细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体连接。该反义核酸分子也可以用这里所述的载体送递到细胞。为了使反义分子达到足够的细胞内浓度，优选将该反义核酸分子置于强的polII或pol III启动子的调控之下的载体构建体。
在还有另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-端基异构的核酸分子。α-端基异构的核酸分子与互补的RNA形成特定的双链杂交体，与通常的β-单元相反，在该杂交体中，二条链的走向是相互平行的(Ganltier等(1987)Nucleic Acids.Res.156625-6641)。该反义核酸分子也可以包括2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acid Res.156(31-6148)或是嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Le.215327-330)。
在还有另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，它能切割单链的核酸，例如mRNA，核酶与该单链核酸有互补的区域。因此，核酶(例如锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591中描述)能够用来催化裂解mGluR5M mRNA转录物，由此而抑制mGluR5M mRNA的翻译。对编码mGluR5M的核酸有特异性的核酶可以根据这里公开的mGluR5M cDNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO1)来设计。(例如，可以构建四膜虫属L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与编码mGluR5M的mRNA中被裂解的核酸序列互补。参见Cech等，美国专利No.4,987,071；和Cech等，美国专利No.5,116,742。或者，可以用mGluR5M mRNA从RNA分子库中选择有特异的核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见，例如，Bartel D.和Szostak，J.W.(1993)Science2611411-1418。
或者，通过将与mGluR5M的调节区(如mGluR5M的启动子或增强子)互补的核苷酸序列导向而形成阻止mGluR5M基因在靶细胞中转录的三螺旋结构，从而抑制mGluR5M基因的表达。一般参见Helene，C.(1991)Anticancer Drng Des.6(6)569-84；Helene，C.等，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci 66027-36；以及Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15。
还有另一个实施方案中，可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链上对本发明的核酸分子进行修饰，以改进分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，可以对核酸分子的脱氧核糖磷酸主链进行修饰，以产生肽核酸(参见Hyrup B等(1996)Bioorganic&Medicinal Chemistry 4(1)5-23)。这里所用的术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸主链被假肽主链所取代，仅保留4种天然的核碱基。现已表明，中性的PNA主链在低离子强度条件下，能够与DNA和RNA杂交。PNA寡聚物的合成可以用Hyrup B.等(1996)同上；Perry-O’keefe等PNAS 9314670-675中所述的标准固相肽合成方法进行。
MGluR 5M核酸分子的PNA可以用在治疗和诊断的应用中。例如，PNA可用作反义或反基因试剂，例如，通过诱导转录或翻译的停滞，或抑制复制，进行基因表达的序列特异性调节。MGluR 5M核酸分子的PNA也可以用于基因中个单碱基对突变的分析中(例如，通过PNA定向的PCR膜片钳)；作为‘人工的限制性酶’与其他酶联合使用(如S1核酸酶(Hgrup B.(1996)同上))；或作为探针或引物用于DNA测序或杂交(Hgrup B等，(1996)同上；Perry-O’keefe同上)。
在另一个实施方案中，可以通过将亲脂的基团或其他辅助基团与PNA连接，通过形成PNA-DNA嵌合物，或通过脂质体或其他本领域已知的药物送递技术的应用来修饰mGluR5M中的PNA(例如，提高其稳定性或细胞的摄取)。例如，可以产生兼有PNA和DNA优点的mGluR5M核酸分子的PNA-DNA嵌合体。这种嵌合体使DNA识别酶(例如，RNA酶H和DNA聚合酶)能与DNA部分反应，而PNA部分则会提供高结合亲和性和特异性。PNA-DNA嵌合体可以用适当长度的接头连接，该长度根据碱基的堆积、核碱基间键的数量，和方向(Hgrup B.(1996)同上)方面选择。PNA-DNA嵌合物的合成可按Hyrup B.(1996)同上，和Finn P.J.等(1996)Nucleic Acid Res 24(17)3357-63中所述的方法进行。例如，DNA链可以用标准的亚磷酰胺偶联化学法在固相支持物上合成，修饰的核苷类似物，例如5’-(4-甲氧三苯甲基)氨基-5’-脱氧-胸苷亚磷酰胺，可以用作PNA和DNA的5’端之间的接头(Mag，M.等(1989)Nucleic Acid Res.175973-88)。PNA单体然后逐步地偶联，产生具有5’PNA片段和3’DNA片段的嵌合分子(Finn P.J等(1996)同上)。或者，嵌合分子可以用5’DNA片段和3’PNA片段合成(Peterser，K.H.tffu，(1975)Bioorganic Med.chem.Lett.51119-11124)。
在其他的实施方案中，寡核苷酸可以包括其他添加的基团，例如，肽(例如用于在体内对宿主细胞受体的导向)，或促进跨细胞膜转运的试剂(参见，如Letsinger等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.US.866553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84648-652；PCT公布号No.WO88/09810，1988年12月15日公布)。此外，寡核苷酸可以用诱导杂交的裂解剂(参见，如Krol等，(1988)BioTechniques 6958-976)或嵌入剂(参见，例如，Zon(1988)Pharm.Res.5539-549)进行修饰。因此，该寡核苷酸可以与另一分子(例如，肽、诱导杂交的交联剂、转运剂、或诱导杂交的裂解剂)偶联。
II.分离的mGluR5M蛋白和抗-mGluR5M抗体本发明的一个方面是分离的mGluR5M蛋白及其有生物活性的部分，以及适用作免疫原以产生抗-mGluR5M抗体的多肽片段。在一个实施方案中，天然的mGluR5M蛋白可采用标准的蛋白纯化技术，由细胞或组织来源，通过适合的纯化方案来分离。在另一个实施方案中，mGluR5M蛋白通过重组DNA技术来产生。或者，mGluR5M蛋白或多肽可以采用标准的肽合成技术，由化学法合成，而代替重组表达。
“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含来自mGluR5M蛋白来源的细胞或组织的细胞的物质，或其他污染的蛋白，或者，用化学法合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含细胞的物质”包括mGluR5M蛋白的制备物，在该制备物中，蛋白与细胞的组分分离，其中的细胞是用来分离或重组产生该蛋白的细胞。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞的物质”包括含有少于约30％(按干重量)非mGluR5M蛋白(这里亦称为“污染的蛋白”)的mGluR5M蛋白，更优选少于约20％的非mGluR5M蛋白的mGluR5M蛋白的制备物。当该mGluR5M蛋白或其生物活性部分是由重组方法产生时，还优选基本上不含培养基，即培养基的含量少于约20％，更优选少于约10％，最优选少于约5％的蛋白制备物的体积。
术语“基本上不含化学前体或其他化学物质”是指蛋白与化学前体或其他化学物质分离的mGluR5M蛋白制备物，其中的化学前体或其他化学物质参与蛋白的合成。在一个实施方案中，术语“基本上不含化学前体或其他化学物质”是指含有少于约30％(按干重)的化学前体或非mGluR5M化学物质，还更优选含有少于约10％化学前体或非mGluR5M的化学物质，以及最优选含有少于约5％化学前体或非mGluR5M的化学物质。
MGluR5M蛋白的生物活性部分所包含的肽含有的氨基酸序列与下述序列有足够的同源性，或来源于下述序列mGluR5M蛋白的氨基酸，例如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，它包含的氨基酸序列比全长mGluR5M蛋白的少，并表现出mGluR5M蛋白的至少一种活性。通常，生物活性部分包含至少有1种mGluR5M蛋白活性的结构域或基序。mGluR5M蛋白的生物活性部分可以是多肽，例如，它的长度为10、25、50、100或更多个氨基酸。
在一个实施方案中，mGluR5M蛋白的生物活性部分至少含有N端的mGluR样结构域和/或C端独特结构域。在另一个实施方案中，mGluR5M蛋白的生物活性部分含有至少一个G蛋白偶联的受体家族3_1的共有序列。
可以理解，本发明优选的mGluR5M蛋白的生物活性部分可含有至少一个上述鉴定的结构域和/或分布型。更优选mGluR5M蛋白的生物活性部分可含有至少2个上述鉴定的结构域和/或分布型。此外，其它蛋白区域缺失的其他生物活性部分，可以用重组技术制备，并评价天然mGluR5M蛋白的一种或多种功能活性。
在一个优选的实施方案中，mGluR5M蛋白含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。在其他的实施方案中，mGluR5M蛋白基本上与SEQIDNO2同源或同一，并保留SEQ ID NO2蛋白的功能活性，但其氨基酸序列有差别，其原因如以上I节所详述，是由于天然的等位基因变异或突变而造成。因此，在另一个实施方案中，mGluR5M蛋白是如以下所述的蛋白含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少约60％同一的氨基酸序列，并保留SEQ ID NO2的mGluR5M蛋白的功能活性。优选该蛋白与SEQ ID NO2的氨基酸至少有约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99或更高的同一性，并保留SEQ ID NO2的mGluR5M蛋白的功能活性。
为了测定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分数，可将序列进行比对，用于最优比较目的(例如，在第一和第二氨基酸或核苷酸序列中之一，或两者中，引入空位，用于最优比对，非相同的序列可考虑进行比较)。在优选的实施方案中，用作比较而比对的参考序列的长度至少为该参考序列长度的30％，优选为至少40％，更优选为至少50％，甚至更优选为至少60％，还甚至更优选为至少70％、80％或90％(例如，将第二序列与含有369个氨基酸残基的SEQ ID NO2的mGluR5M氨基酸序列进行比对时，至少比对111个，优选至少148个，更优选至少185个，甚至更优选至少221个，以及甚至更优选258、295或332个氨基酸残基)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的某一位置被与第二序列相应位置相同的相同氨基酸残基或核苷酸所占据时，则此两个分子在该位置上是相同的(这里所用的氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸的“同源性”意义是相同的)。两种序列间的同一性百分数是该序列共有的相同位置数的函数，考虑了为进行二种序列的最优比对而需要引入的空位数，以及每个空位的长度。
序列间的序比对和同一性百分数的测定可采用数学算法完成。在优选的实施方案中，两种氨基酸序列间的同一性百分数采用Blosum 62矩列或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，用Needleman和Wunsch(J.Mol.(48)444-453(1970))算法测定，该算法已并入GCG软件包的GAP程序中(http//www.gcg.com提供)。在还有另外一个实施方案中，采用NWSgapdna.CMP矩阵，以及空位权重40、50、60、70或80，和长度权重1、2、3、4、5或6。优选的与GAP程序一起使用的参数的非限定例子有空位罚分为12，空位延伸罚分为4，以及移码空位罚分为5的Blosum 62评分矩阵。
在另一个实施方案中，用E.Meyers和W.Miller的算法测定二种氨基酸或核苷酸序列间的同一性百分数，其中所说的算法已并入ALGN程序中(2.0版或2.0U版)，它采用PAM120权重余数表，空位长度罚分为12并且空位罚分为4。
本发明的核酸和多肽序列还可用作“询问序列”，对公开的数据库检索例如其他家族成员或相关序列的同一性。这种检索可以用Altschul等(1990)在J.Mol.Biol.215403-10中所述的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸的检索可用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12，以得到与本发明的mGluR5M核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序进行，评分＝100，字长＝3，用Blosum62矩阵获得与本发明的mGluR5M多肽分子同源的氨基酸序列。为了获得用于进行比较的有空位的比对，如Altschul等在(1997)Nucheic Acids Res.25(17)3389-3402中所述，可使用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可采用有关程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http//www.nobi.nlm.nih.gov。
本发明的蛋白和蛋白片段包括下述的蛋白含有长度至少为公开蛋白长度的25％的氨基酸序列(更优选至少为50％和甚至更优选为至少75％)，并与公开的蛋白有至少60-70％的序列同一性(更优选至少有70-75％的同一性和甚至更优选至少有75-80％、80-85％、85-90％、90-95％或更高的同一性)，其中的序列同一性的测定方法如这里所述。
本发明还提供mGluR5M嵌合或融合蛋白，这里所用的mGluR5M“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非mGluR5M多肽操作连接的mGluR5M多肽。“mGluR5M多肽”是指含有相当于mGluR5M氨基酸序列的多肽，而“非mGluR5M多肽”是指该多肽含有的氨基酸序列相当于与mGluR5M蛋白基本上不同源的蛋白，例如与mGluR5M蛋白不同的蛋白，和来源于相同或不同生物的蛋白。在mGluR5M融合蛋白中，mGluR5M多肽可以相当于全部或部分的mGluR5M蛋白。在优选的实施方案中，mGluR5M融合蛋白含有mGluR5M蛋白的至少一个生物活性部分。在另一个优选的实施方案中，mGluR5M融合蛋白含有至少二个mGluR5M蛋白的生物活性部分。在融合蛋白中，术语“操作连接的”是要表明mGluR5M多肽和非mGluR5M多肽是框内融合。非mGluR5M多肽可以融合到mGluR5M多肽的N端或C端。
例如，在一个实施方案中，该融合蛋白是GST-mGluR5M融合蛋白，其中的mGluR5M序列融合到GST序列的C端。这种融合蛋白可促进重组mGluR5M蛋白的纯化。在另一个实施方案中，融合蛋白是在N端含有异源信号序列的mGluR5M蛋白。在某些宿主细胞中(例如哺乳动物宿主细胞)，通过使用异源信号序列可以提高mGluR5M的表达和/或分泌水平。
本发明的mGluR5M融合蛋白可以掺入药物组合物中，并对患者进行体内给药。MGluR5M融合蛋白可用来影响mGluR5M底物的生物利用度。MGluR5M可以用来治疗中枢神经系统的紊乱。此外，本发明的mGluR5M融合蛋白可以用作免疫原，使受试者体内产生抗mGluR5M的抗体，用来纯化mGluR5M配体；以及用于筛选测试中，以鉴定抑制mGluR5M与mGluR5M配体或与mGluR相互作用的分子。
优选本发明的mGluR5M嵌合或融合蛋白用标准的重组DNA技术产生。例如，按照常规的技术，将编码不同多肽序列的DNA片段框内连接在一起，例如利用平端或交错端的末端连接；限制性酶消化以提供合适的末端；适当补齐粘端；碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接；以及酶法连接。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术合成，这些技术包括自动DNA合成仪。或者，可以用锚状引物进行基因片段的PCR扩增，使两个连续的基因片段间形成互补的突出端，然后将此基因片段退火并再扩增而产生嵌合的基因序列(参见，Currentprotocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等，JohnWiley和Sons1992)。此外，许多已编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体市场上都有售。编码mGluR5M的核酸可以克隆到上述市售的载体中，从而使融合部分与mGluR5M蛋白框内连接。
本发明还包括mGluR5M蛋白的变体，它可以起mGluR5M激动剂(模拟物)的功能，或起mGluR5M拮抗剂的功能。mGluR5M蛋白的变体可通过诱变产生，例如，mGluR5M蛋白的不连续点突变或截短。MGluR5M蛋白的激动剂可使其基本上保留与天然存在形式的mGluR5M蛋白相同、或一部分的生物学活性。GluR5M的拮抗剂可抑制天然存在的mGluR5M蛋白形式的一种或多种活性，例如，通过竞争性抑制，mGluR5M的蛋白酶活性。因此，用限定功能的变体治疗，可引起特定的生物学效应。在一个实施方案中，与用天然存在形式的mGluR5M蛋白治疗相比，用具有天然存在形式的mGluR5M蛋白的生物活性中的一部分的变体治疗，对受试者的副作用较少。
在一个实施方案中，起mGluR5M激动剂(模拟物)功能，或mGluR5M拮抗剂功能的mGluR5M蛋白的变异体，可用下述方法鉴定对mGluR5M蛋白的突变体，例如截短突变体的组合文库，筛选其mGluR5M蛋白激动剂或拮抗剂活性。在一个实施方案中，多样化的mGluR5M突变体文库可通过在核酸水平上的组合诱变来产生，并由多样化的基因文库所编码。多样化的mGluR5M变体文库可以通过下述的方法产生，例如，将合成的寡核苷酸混合物用酶法连接成各种基因序列，从而使一组简并的潜在mGluR5M序列可以按单个多肽的形式表达，或者以包含一组mGluR5M序列的一组大融合蛋白(如噬菌体展示)的形式表达。由简并的寡核苷酸序列生产潜在mGluR5M变体的方法有很多种。可以在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后将合成的基因连接到适合的表达载体中。使用一组简并的基因，可以在一种混合物中提供全部编码所需要的一组潜在mGluR5M序列。合成简并的寡核苷酸的方法在本领域是已知的(参见，例如，Narang，S.A(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic AcidRes.11477。
此外，编码mGluR5M蛋白片段的序列的文库可以用来产生多样化的一组mGluR5M片段，用于筛选和随后选择mGluR5M蛋白的变体。在一个实施方案中，产生编码序列的文库的方法如下用核酸酶处理mGluR5M编码序列的双链PCR片段，处理的条件是使每个分子仅发生约一次切口，然后使双链DNA变性，再使DNA复性形成双链DNA，该DNA可以包括不同切口的产物的有义/反义对，用S1核酸酶处理重新形成的双链体，以除去单链部分，再将得到的片段文库连接到表达载体中。用这种方法可获得编码各种大小的mGluR5M蛋白的N端、C端和内部片段的表达文库。
已知在本领域有几种用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物，以及用于对cDNA文库筛选具有选择特性的基因产物的技术。这些技术适用于对mGluR5M蛋白组合诱变所产生的基因文库进行快速筛选。能进行高通量分析、使用最广的用于筛选大基因文库的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用产生的载体文库转化适合的细胞，以及在某种条件下使组合的基因表达，在该表达条件下，通过对所需活性的检测，促进了分离出编码该被测产物基因的载体。Recrusive ensemble诱变(REM)，是一种新的技术，它可提高文库中功能突变体的频度，可以结合筛选测定用于鉴别mGluR5M变体(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 897811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
在一个实施方案中，可以利用基于细胞的测定来分析多样化的mGluR5M文库。例如，可以将表达载体文库转染到通常合成mGluR5M的细胞系中，然后培养转染的细胞，从而使特定的突变mGluR5M表达，并可通过多种分析天然mGluR5M蛋白活性的分析方法中的任何一种，检测该突变体的表达对细胞内mGluR5M活性的影响。然后可从细胞中回收质粒DNA，用来评价所调节的mGluR5M活性，同时对每个克隆进一步分析其特性。
分离的mGluR5M蛋白，或其一部分或片段可以用作免疫原，采用标准的技术来产生与mGluR5M结合的抗体，用于生产多克隆和单克隆抗体。全长的mGluR5M蛋白，或者本发明提供的mGluR5M的抗原肽片段，可以用作免疫原。mGluR5M的抗原肽包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中的至少8个氨基酸，并包含mGluR5M的表位，从而使产生的抗该肽链的抗体与mGluR5M形成特异的免疫复合物。优选所说的抗原肽包含至少10个氨基酸残基，更优选含有至少15个氨基酸残基，甚至更优选至少20个氨基酸残基，最优选含有至少30个氨基酸残基。
优选抗原肽所包含的表位是对mGluR5M蛋白独特的mGluR5M区(例如，在SEQ ID NO2的C端独特结构域约304-369位氨基酸)。
MGluR 5M免疫原通常用于采用免疫原对合适的受试者(例如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)免疫接种来制备抗体。合适的免疫原性制剂可包含，例如，重组表达的mGluR5M或化学合成的mGluR5M多肽。该制备物还可包括佐剂，例如完全或不完全的福氏佐剂，或类似的免疫刺激剂。合适的受试者用免疫原性的mGluR5M制备物免疫接种后诱导多克隆的抗mGluR 5m抗体的应答。
因此，本发明的另一个方面涉及抗mGluR5M抗体。这里所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有与抗原，例如，mGluR5M特异结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子的免疫学活性部分的例子，包括F(ab)和F(ab’)2片段，它可用酶，例如，胃蛋白酶，处理抗体而产生。本发明提供结合mGluR5M的多克隆和单克隆抗体。这里所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一群抗体分子，它们只含有能与特定的mGluR5M表位免疫反应的一种抗原结合位点。因此，单克隆抗体的组合物通常对与其免疫反应的特定mGluR5M蛋白呈现出单一结合亲和性。
多克隆的抗mGluR5M抗体可按以上所述，通过对合适的受试者免疫接种mGluR5M免疫原而制备。免疫接种的受试者的抗mGluR5M抗体滴度可以用标准的技术随时间监测，例如用固定化mGluR5M的酶联免疫吸附分析(ELISA)。需要时，可从哺乳动物(例如从血)中分离出抗mGluR5M的抗体分子，然后进一步用众所周知的技术纯化而得到IgG部分，例如用蛋白A亲和层析法。在免疫接种后的适当时期，例如在抗mGluR5M抗体滴度最高的时候，可从受试者获得产生抗体的细胞，并通过标准技术来制备单克隆抗体，例如最初由Kohler和Milstein(1975)在Nature 256495-497中描述的杂交瘤技术(另参见Brousn等(1981)J.Immunol.127539-49；Brousn等(1980)J.Biol.2554980-83；Yeh等(1976)PNAS762927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer 29269-75)、更近期的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunol Today 472)、EBV-杂交瘤技术(cole等(1985)，Monoclonal Antibodies and cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc，pp77-96)或三瘤技术。产生单克隆抗体杂交瘤的技术是众所周知的(参见R.H.Kenneth的Monoclonal AntibodiesAnewDimension In Biological Analyses，Plenum出版公司，NewYork，New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402；M.L.Gefter等(1977)Somatic Cell Genet.3231-36)。简单地说，将无限增殖的细胞系(通常是骨髓瘤)融合到来自于如上所述用mGluR5M免疫原免疫接种的哺乳动物的淋巴细胞(通常是脾细胞)，然后对产生的杂交瘤细胞的培养上清进行筛选，以鉴定产生结合mGluR5M的单克隆抗体的杂交瘤。
很多人们熟知的用来融合淋巴细胞和无限增殖细胞系的方法中，任何一种都可以应用于产生抗mGluR5M单克隆抗体的目的(参见，例如，G.Galfre等，(1977)Nature 26655052；Gefter等，SomaticCell Genet，同上；Lerner，Yale J.Biol.Med.，同上；Kenneth，Monoclonal Antibodies；同上)。此外，普通的技术人员懂得，很多由这种方法变更来的方法也可以使用。通常，无限增殖细胞系(例如，骨髓细胞系)与淋巴细胞来源于同一个种的哺乳动物。例如，鼠杂交瘤的制备方法是用本发明的免疫原性制备物免疫接种小鼠，然后将取自该小鼠的淋巴细胞与无限增殖的小鼠细胞系融合。优选的无限增殖细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，该细胞系对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感。按照标准技术，很多骨髓瘤细胞系中的任何一种都可用作融合配偶体，例如，P3-NS1/1-Ag4-1、p3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系可从ATCC获得。通常，使用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合，然后用HAT培养基选择由融合所产生的杂交瘤细胞，HAT培养基杀死未融合的和非生产性地融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞因其未转化而在数天后死亡)。通过筛选杂交瘤的培养物上清中结合mGluR5M的抗体，例如用标准的EL1SA分析，来检测产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
除了制备分泌单克隆抗体的杂交瘤以外，单克隆的抗mGluR5M抗体可用下述方法鉴定和分离用mGluR5M筛选重组的组合免疫球蛋白文库(例如抗体的噬菌体展示文库)，由此分离出与mGluR5M结合的免疫球蛋白文库成员。产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒在市场上有售(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。此外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的例子可从以下文献查到例如，Ladner等，美国专利NO.5,223,409；Kang等，PCT国际公布号WO92/18619；Dower等，PCT国际公布号WO 91/17271；Winter等PCT国际公布号WO 92/20791；Markland等，PCT公布号WO92/15679；Breitling等PCT国际公布号WO 93/01288；McCafferty等，PCT国际公布号WO 92/01047；Garrard等，PCT国际公布号WO92/09690；Ladner等，PCT国际公布号WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等(1992)Hum AntibodyHybridomas 381-85；Huse等(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等(1993)EMBOJ 12725-734；Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clarkson等(1991)Nature 352624-628；Gram等(1992)PNAS 893576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc.Acid.Res.194133-4137；Barbas等(1991)PNAS887978-7982；及McCafferty等Nature(1990)348522-554。
此外，可以用标准的重组DNA技术制备的重组抗mGluR5M抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人和非人的部分，都在本发明的范围内。这种嵌合的和人源化的单克隆抗体可以通过本领域熟知的DNA重组技术来生产，例如用以下文献中所述的方法Robinson等国际申请号PCT/US86/02269；Akra等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，PCT国际公布号WO 86/01533；Cabilly等，美国专利NO.4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 2401041-1043；Liu等(1987)PNAS843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47999-1005；Wood等(Nature 314446-449；和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison，S.L.(1985)Science 2291202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4214；Winter美国专利5,225,539；Jones等(1986)Nature 321525-552Verhoeyan等(1988)Science 2391534；以及Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060。
抗mGluR5M抗体(例如单克隆抗体)可以通过标准技术用于分离mGluR5M，例如采用亲和层析和免疫沉淀法。利用抗mGluR5M抗体可促进从细胞中纯化天然的mGluR5M，以及促进纯化在宿主细胞中表达的重组产生的mGluR5M。此外，抗mGluR5M抗体可以用于检测mGluR5M蛋白(例如，在细胞裂解液或细胞上清中)，以评价mGluR5R蛋白表达的丰度和模式。抗mGluR5M抗体可用在诊断上监测组织中的蛋白水平，作为临床测定步骤的一部分，例如，测定指定的治疗方案的效力。将抗体与可检测的物质偶联(即物理连接)可以促进检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质，和放射性物质。适合的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括荧光素酶、荧光素、和水母发光蛋白，以及适合的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
III重组表达载体和宿主细胞本发明的另一个方面是关于载体，优选表达载体，它含有编码mGluR5M蛋白(或其一部分)的核酸。这里所用的术语“载体”是指一种核酸分子，它能转运与其连接的另一核酸。载体的一种类型是“质粒”，它是指可将另外的DNA片段连接在其中的环状双链DNA。另一种类型的载体是病毒载体，在该载体中，另外的DNA片段可与病毒的基因组连接。一些载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型的哺乳动物的载体)。其他的载体(例如，非附加型的哺乳动物载体)是通过导入宿主细胞而整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主的基因组一起复制。此外，某些载体能指导与其操作连接的基因的表达。这种载体在此称为“表达载体”。一般，在重组DNA技术中使用的表达载体常常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的一种载体形式。但是，本发明还包括其他形式有同等功能的表达载体，例如，病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包含的核酸的形式，是本发明的适合于在宿主细胞表达的形式，也就是说该重组表达载体包括一个或多个调节序列，该序列是根据用于表达的宿主细胞而选择的，并与要表达的核酸序列操作连接。在重组表达载体内，“操作连接”的含意是目的核苷酸序列以能使核苷酸序列得到表达的方式与调节序列连接(例如，在体外转录/翻译系统中，或载体被导入宿主细胞时，在宿主细胞内)。术语“调节序列”考虑是包括启动子、增强子和其他表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)。这种调节序列，例如，在下述文献中有描述Goeddel，Gene Expression TechnologyMothods in Engymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调节序列包括指导核苷酸序列在多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达，以及指导核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的序列(例如组织特异性调节序列)。本领域的技术人员懂得，表达载体的设计可根据待转化的宿主细胞的选择、所要求的蛋白的表达水平等因素来进行。本发明的表达载体可以引入宿主细胞中，从而产生由这里所述的核酸所编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如，mGluR5M蛋白，突变形式的mGluR5M蛋白，融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可以设计成用于mGluR5M蛋白在原核或真核细胞中表达。例如，mGluR5M蛋白可以在细菌，如大肠杆菌、昆虫细胞(采用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethod inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论。或者，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白在原核生物中的表达最常见的是在大肠杆菌中进行，该表达所用的载体含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型的启动子。融合载体在其中编码的蛋白上添加了很多氨基酸，通常加在重组蛋白的氨基末端。这种融合载体有三个用途1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；3)在亲和纯化中起配体的作用，有助于重组蛋白的纯化。在融合表达载体中，常常在融合成分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解的裂解位点，在融合蛋白纯化后，使重组蛋白能与融合组成分离。这类酶及其相关的识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括，pGEX(Pharmacia BiotechInc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)、pMAL(NewEngland Biolabs，Bererly，MA)和pRIT5(Pharmecia，Piscataway，NJ)，这些载体分别将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白，或蛋白A融合到靶重组蛋白上。
纯化的融合蛋白可以用于mGluR5M活性测定中(例如，直接测定，或竞争测定，在以下详述)，或例如用来产生对mGluR5M特异的抗体。在优选的实施方案中，本发明的在逆转录病毒表达载体中表达的mGluR5M融合蛋白可以用来感染骨髓细胞，然后将感染细胞移植到辐射后的受体中。经过足够的时间后(例如6周)，检查受试者受体的病理。
合适的诱导型的非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等，(1988)Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等，GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，san Diego，California(1990)60-89)。由pTrc载体表达靶基因依赖于宿主RNA聚合酶从杂交trp-lac融合启动子的转录。由pET11d载体表达靶基因依赖于由共表达病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的根据T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从固有的原噬菌体提供，其中的原噬菌体携带在LacUV5启动子转录调控下的T7gnl基因。
使重组蛋白在大肠杆菌中的表达最大化的一种策略是使蛋白的表达在蛋白水解重组蛋白的能力减弱的宿主细菌中进行(Gottesman，S，Gene Expression TechnologyMethods inEnzyonology 185，Acadomic press，San Diego，California(1990)119-128)。另一种策略是改变插入表达载体的核酸的核酸序列，使每个氨基酸的每个密码子是在E.Coli中优先利用的密码子(Wada等，(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)。本发明的这种核酸序列的改变可通过标准的DAN合成技术进行。
在另一个实施方案中，mGluR5M表达载体为酵母表达载体。在酿酒酵母中表达的载体例子包括pYepSecl(Baldri，等，(1987)EmboJ.6229-234)、pMFa(Kurjan和HerskowitL，(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54113-123)pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)，和picZ(Invitrogencorp，San Diego，CA)。
或者，mGluR5M蛋白可以用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中进行表达。适用于在培养的昆虫细胞(例如，sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒包括pAC系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在还有一个实施方案中，本发明的核酸用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kanfman等(1987)EMBOJ.6187-195)。用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能常常由病毒调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其他适用于原核和真核细胞的表达系统参见Sambrood，J，Fritsh，E.F，和Maniatis，T.r的分子克隆实验室指南第二版，Cold Spring Harbor Laboratory.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
在另一个实施方案中，重组的哺动物表达载体能够指导核酸优先在特定的细胞类型中表达(例如用组织特异性调节元件来表达该核酸)。组织特异性调节元件在本领域中是众所周知的。适合的、但非限定的组织特异性启动子的例子包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等，(1987)Gene Dev.1268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，尤其是T细胞受体(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白(Banerji等(1983)Cell 33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33741-748)的启动子、神经元特异性启动子(如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS 865473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)Science 230912-916)，和乳腺特异性启动子(如，乳清启动子；美国专利No.4,873,316，以及欧洲申请公开No.264,166)。发育调节的启动子，例如鼠Hox启动子以及α-甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Gene Dev.3537-546)也包括在内。
本发明还提供含有本发明DNA分子的重组表达载体，该DNA分子按反义方向克隆到表达载体中。也就是说，所说的DNA分子与调节序列操作连接，其连接的方式使与mGluR5M mRNA反义的RNA分子能够表达(通过DNA分子转录)。与按反义方向克隆的核酸操作连接的调节序列可以选择为指导反义RNA分子在各种细胞类型中连续表达的调节序列，例如，病毒启动子和/或增强子，或者可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调节序列。反义表达的载体形式可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，在这些载体中，反义核酸在高效调节区的控制下产生，其活性可根据该载体导入的细胞类型来测定。有关用反义基因的基因表达调节的讨论，参见Weintrand，H等，反义RNA作为分子工具用于遗传分析，综述-Trends inGeneties，Vol.1(1)1986。
本发明的另一方面是关于本发明的重组载体所引入的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此可以互换使用。应懂得，这样的术语不仅是指特定的受试者细胞，而且指这种细胞的子代或可能的子代。因为在连续的传代过程中，由于它们的突变或环境的影响，可能会发生某些修饰，实际上这种子代与其亲代细胞不相同，但包括在这里所用的术语之范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，mGluR5M蛋白可以在细菌细胞，如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞对本领域的技术人员是熟知的。
载体DNA可通过常规的转化或转染技术引入原核或真细胞中。这里所用的术语“转化”和“转染”考虑是指各种将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的本领域公知的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂转染、或电穿孔。合适的转化或转染宿主细胞的方法可在Sambrook，等(分子克隆实验室指南第二版，ColdSpring Hirbor Laboratory.Cold Spring Harbor Laboratory PressCold SPring Harbor，NY，1989)、和其他实验指南中查找到。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知是依赖于所用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合子，一般将编码选择标记(例如，抗生素抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予药物抗性的标记，例如G418，潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可以在编码mGluR5M蛋白的同一载体上引入宿主细胞，或可以在单独的载体上引入宿主细胞。被引入的核酸稳定地转化的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如，掺入选择标记的细胞能生存，而其他细胞则死亡)。
本发明的宿主细胞，例如在培养物中的原核或真核细胞可以用来产生(即表达)mGluR5M蛋白。因此，本发明还提供用本发明的宿主细胞产生mGluR5M蛋白的方法。在一个实施例中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(编码mGluR5M蛋白的重组表达载体已引入该细胞中)，从而使mGluR5M蛋白能够产生。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从培养基或该宿主细胞中分离出mGluR5M蛋白。
本发明的宿主细胞也可以用于生产非人的转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是受精的卵母细胞或胚胎干细胞，其中已引入了编码mGluR5M的序列。这种宿主细胞然后可用来产生基因组中引入了外源mGluR5M序列的非人的转基因动物；或者可以用来产生内源mGluR5M序列改变的同源重组动物。这种动物可用于研究mGluR5M的功能和/或活性，以及鉴别和/或评价mGluR5M活性的调节剂。这里所用的“转基因动物”是非人的动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物，如大鼠或小鼠，其中该动物的一个或多个细胞包含转移基因。其他转基因动物的例子包括非人的灵长目、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖类等。转基因是整合到发育成转基因动物的细胞的基因组中的外源DNA，而且保留在成熟动物的基因组中，从而在该转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中指导编码的基因产物的表达。这里所用的“同源重组动物”是非人动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，在发育成该动物之前，通过其内源基因和引入该动物的细胞内的外源DNA分子之间的同源重组，其内源mGluR5M基因已发生改变，其中引入了外源DNA分子的细胞例如为该动物的胚胎细胞。
本发明的转基因动物可以通过将编码mGluR5M的核酸引入受精卵母细胞的雄性前核中而产生，例如通过显微注射、逆转录病毒感染，并使该卵母细胞在假妊娠的雌性饲养动物中发育。mGluR5M cDNA序列，例如SEQ ID NO1的序列，或在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段核苷酸序列，可以作为转移基因引入非人动物的基因组中。或者，非人mGluR5M基因的非人直向同源物，例如小鼠或大鼠的mGluR5M基因，可以作为转基因。或者，根据与SEQID NO1的mGluR5M cDNA序列，或与在ATCC保藏、保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段核苷酸序列(在上述的I节中有更详细的描述)杂交，分离出mGluR5M基因的同源物，并用作转基因。内含子序列和聚腺苷酸化信号也可包括在转基因中，以提高该转移基因的表达效率。组织特异性调节序列可以与mGluR5M转移基因操作连接，以指导mGluR5M蛋白对特定细胞的表达。通过胚胎的操作和显微注射而产生转基因动物的方法，特别是对小鼠之类的动物，在本领域中已成为常规的方法，并在以下文献中有描述，例如Leden等的美国专利NO.4,736,886和4,870,009；Wagner等的美国专利4,873,191；和Hogan，B.，Manipulating the Mouse Embryo，(cold Spring HarborLaboratory press，cold Spring Harbor，N.Y，1986)。类似的方法也用来生产其他的转基因动物。获得转基因的动物可根据mGluR5M转基因在其基因组内的存在，和/或mGluR5M mRNA在该动物的组织或细胞中表达来鉴别。然后，获得转移基因的动物可以用来繁殖携带该转基因的其它动物。此外，携带编码mGluR5M蛋白的转基因的转基因动物可以与携带其他转基因的其他转基因动物杂交。
为了产生同源重组的动物，制备了含有至少一部分mGluR5M基因的载体，这部分mGluR5M基因已引入了缺失、添加或取代，从而使mGluR5M基因发生改变，例如功能的破坏。该mGluR5M基因可以是人的基因(例如，SEQ ID NO1的cDNA)，但更优选是人mGluR5M基因的非人同源物(例如，通过与SEQ ID NO1严格杂交而分离出来的cDNA)。例如，小鼠mGluR5M基因可以用来构建适用于改变小鼠基因组内的内源mGluR5M基因的同源重组载体。在优选的实施方案中，该载体的设计方案为通过同源重组，使内源mGluR5M基因的功能受到破坏(即，不再编码有功能有蛋白；亦称为“敲除”载体)。或者，该载体可设计为通过同源重组，内源mGluR5M基因发生突变，或者改变，但仍然编码有功能的蛋白(例如，可以改变其上游调节区，从而改变内源mGluR5M蛋白的表达)。在同源重组载体中，在mGluR5M基因的改变部分的5’和3’端的侧翼是该mGluR5M基因的其他核酸序列，从而使载体所携带的外源mGluR5M基因与胚胎干细胞内的内源mGluR5M基因发生同源重组。其中的其他侧翼mGluR5M核酸序列有足够的长度使其与内源mGluR5M基因能成功地同源重组。通常，载体中含有数Kb的侧翼DNA(在5’和3’端)(参见，例如，Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503对同源重组载体的描述)。将载体引入胚胎干细胞系中(例如，通过电穿孔)，并选择其中引入的mGluR5M基因已与内源mGluR5M基因同源重组的细胞(参见，如Li，E.等(1992)Cell 69915)。然后将选择的细胞注射入动物(例如小鼠)的胚泡中，以形成聚集的嵌合体(参见，例如，Bradley，A.Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach，E.J.Robertson，出版(IRL，Oxford，1987)113-152)。嵌合的胚胎然后可以植入合适的假妊娠雌性饲养动物中，并使该胚胎发育至足月。通过该转基因的种系传递，生殖细胞中携带同源重组DNA的后代可以用来繁殖所有的细胞都含有同源重组DNA的动物。构建同源同组载体和同源重组动物的方法在以下文献中进一步描述BradLey，A.(1991)Current Opinion in Biotechnology 2823-829，以及Le Mouellec等，PCT国际公开号WO 90/11354；Smithies等，WO 91/01140；Zijlstra等，WO 92/0968；和Berns等，WO93/04169。
在另一个实施方案中，可以产生含有选择系统的转基因非人动物，该选择系统可调节转移基因的表达。这种系统的一个例子是噬菌体P1的Cre/loxP重组酶系统。对于Cre/loxP重组酶系统的描述，参见，例如，Lakso等(1992)PNAS 896232-6236。另一个重组酶系统的例子是酿酒酵母的FLP重组酶系统(0’Gorman等(1991)Science2511351-1355。如果Cre/loxP重组酶系统用于转基因的调节，则需要含有编码Cre重组酶和选择蛋白二者的转移基因的动物。这种动物可能通过构建“双”转基因动物来提供，例如，将两种转基因动物交配，一种含有编码选择蛋白的转基因，另一种含有编码重组酶的转基因。
这里所述的非人转基因动物的克隆可按Wilmut，I等(1997)Nature 385810-813中所述的方法产生。简单地说，可以从转基因动物分离细胞，例如，体细胞，并诱导至退出生长循环并进入Go期。然后，通过电流脉冲，将此静止的细胞融合到动物的去核卵母细胞中，分离静止细胞的动物与提供卵母细胞的动物为同一个种。然后培养重构的卵母细胞，使其发育成桑椹胚或胚泡，并随后转移至假妊娠的雌性饲养动物中。来源于该雌性饲养动物的后代将是分离出细胞，如体细胞的动物的克隆。
IV药物组合物本发明的mGluR5M核酸分子、mGluR5M蛋白、抗mGluR5M抗体、mGluR5M配体、肽、肽模拟物和/或mGluR5M调节剂(这里亦称为“活性化合物”)可以掺入适合于给药的药物组合物中。这种组合物通常含有核酸分子、蛋白、抗体，或调节化合物和可药用载体。这里所用的术语“可药用载体”是指包括一些和全部的与药物的给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，这种介质和试剂用于药物活性物质中在本领域来说是众所周知的。迄今为止除了任何常规使用的介质或试剂与活性化合物不相容以外，上述介质和试剂在组合物中的使用是经过仔细考虑的。补充的活性化合物也可掺入组合物中。
本发明的药物组合物配制成与其给药途径相容的形式。给药途径的例子包括非肠道的给药，例如静脉内、真皮内、皮下的、口服的(例如吸入)、经皮的(局部的)、经粘膜的，和直肠的给药。用于非肠道、真皮内、或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分无菌的稀释剂，例如注射用水、盐溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或二亚硫酸钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液和调节渗透压的试剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。非肠道制剂可以密封入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量的小瓶中。
适用于可注射用的药物组合物包括无菌的含水溶液(水可溶的场合)或分散液，或者，对临时配制的无菌可注射溶液或分散液的制剂来说，包括无菌的粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌剂水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲的盐(PBS)。在所有场合，该组合物必须是无菌的，并应是流动的，其流动性应达到易于注射的程度。在生产和储存的条件下；该组合物必须是稳定的，并且必须能抗微生物，如细菌和真菌的污染作用而能保存。该载体可以是溶剂或含有，举例来说，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙烯醇等)，及其合适的混合物的分散介质。适当的流动性可通过以下方法保持例如，使用包衣，例如卵磷酯；在分散体的场合，保持所要求的颗粒大小；以及使用表面活性剂。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂而达到，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在很多场合，组合物中最好包括等渗剂，例如蔗糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇、氯化钠。在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸酯铝和明胶，可达到使注射组合物延长吸收的目的。
无菌的注射溶液的制备方法如下将活性化合物(例如，mGluR5M蛋白或抗mGluR5M抗体)按所要求的量掺入适当溶剂中，该溶剂含有以上列举的组分中的一种或其组合，然后，按照要求通过无菌过滤。一般，分散体的制备方法是，将活性化合物掺入无菌载体中，该载体含有基本的分散介质和选自以上列举组分中的其他必须组分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法由预先经过无菌过滤的溶液生成含活性组分和其它所需组分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食的载体。口服组合物可以封装在明胶胶囊内，或压成片。用于口服治疗给药时，活性化合物中可掺入赋形剂，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以用流体载体来制备，以便用作嗽口剂，其中在流体载体中的化合物，被经口施用并涮洗和吐出，或吞下。药物相容的粘结剂，和/或佐剂物质也可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有下列的任一种组分，或类似性质的化合物粘结剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻朊酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；滑动剂，例如胶体的二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调料。
用于吸入给药时，化合物可以用气溶胶喷雾的形式由压力容器或分配器，或者喷雾器来递送，压力容器或分配器含有合适的推进剂，例如，二氧化碳气体。
全身的给药也可通过经粘膜或经皮的方法。对于经粘膜或经皮给药，在该制剂使用适合于需要透过的屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是熟知的，例如，对于经粘膜给药，包括清洁剂、胆盐，和梭链孢酸衍生物。经粘膜给药也可以通过使用鼻的喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮给药，如本领域通常所知，可将活性化合物配制在软膏、油膏、凝胶或霜剂中。
该化合物也可以制成栓剂(例如，用常规的栓剂基，如可可酯和其他甘油酯)或保留灌肠的形式，用于直肠递送。
在一个实施方案中，活性化合物采用能防止该化合物从人体迅速消除的载体来制备，例如可控制释放的制剂，包括植入物和微胶囊化递传送系统。生物可降解的、生物相容的聚合物也可以使用，例如乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领的技术人员来说是显而易见的。上述的材料也可从市场上由Alza公司和Nova制药公司获得。脂质体悬浮液(包括用病毒抗原单克隆抗体导向受感染细胞的脂质体)也可以用作可药用载体。这些载体可以按照本领域技术人员熟知的方法制备，举例来说，如美国专利NO.45222811中所述。
尤其有利的是，按剂量单位形式来配制口服或非肠道给药的组合物，以便于给药和有利于剂量的统一。这里所用的剂量单位形式，是指以单元剂量适用于治疗受试者的、物理形式上分开的单位；每单位含有预定量的活性化合物，该量计算为能与所需药用载体结合产生所需疗效的量。本发明的剂量单位形式的规格根据以下方面而定，或直接依赖于以下方面活性化合物的特性和要达到的疗效，以及在合成这种用于治疗个体的活性化合物的技术本身存在的限制。
上述化合物的毒性和疗效可按照标准的药物方法在细胞培养物和实验动物中测定，例如，对于LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(使群体的50％有疗效的剂量)的测定。毒性和疗效的剂量比为治疗指数，它可表示为LD50/ED50的比。表现出大的治疗指数的化合物为优选的化合物。虽然可以使用呈现出毒性副作用的化合物，但必须要仔细设计递送系统，使其能将该化合物导向受影响的组织位点，而将未感染细胞受到破坏的可能性减到最小，从而减少副作用。
由细胞培养物的测定和动物的研究所得的数据可以制定用于人的剂量范围。优选这种化合物的剂量位于包括ED50在内的循环浓度范围内并具有较少或没有毒性。该剂量可根据采用的剂量形式和使用的给药途径，在此范围内变化。对于本发明所用的任何化合物，有疗效的剂量最初可以由细胞培养物的测定来确定。和在细胞培养物中测定一样，可以在动物模型中制定要达到包括IC50(即达到抑制一半最大症状时的被测化合物浓度)的循环血浆浓度范围的剂量。这样的信息可以用来更精确地确定人所用的有效剂量。化合物在血浆中的水平例如可以通过高效液相层析测定。
本发明的核酸分子也可以插入载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可以递送给治疗受试者，例如，通过静脉内注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或通过立体定位注射(参见，例如Chen等(1994)PNAS 913054-3057)。基因治疗载体的药物制剂可包括可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可包括色埋了基因递送载体的缓释基质。或者，在完整的基因递送载体可以由重组细胞，例如逆转录病毒载体完整地产生的场合，该药物制剂可以包括1种或多种产生基因递送系统的细胞。
上述药物组合物可以连同给药说明一起包含在容器、小盒或喷雾器内。
V.本发明的用途和方法这里所述的核酸分子、蛋白、蛋白同源物、肽、抗体等，可以用于下述一种或一种以下的方法中a)筛选测定；b)预测医学(例如，诊断测定、预后测定、监测临床试验和药物遗传学；和c)治疗方法(例如，治疗和预防)。如这里所述，本发明的mGluR5M蛋白具有一种或多种以下的活性(1)调节G蛋白连接的第二信使信号传递途径(例如，二酰基甘油和/或三磷酸肌醇介导的信号传递途径的调节)；(2)谷氨酸能传递的调节；(3)神经元兴奋性的调节；(4)突触传递的调节；(5)神经递质释放的调节(例如，谷氨酸释放)；(6)电压依赖的和/或电压不依赖的和/或配体门控的离子通道(例如K+通道或Ca2+通道)的调节；(7)神经元发育的调节(例如，在发育和/或成熟中的脑中，神经元的分化、迁移和/或存活的调节)；(8)神经变性过程(例如，急性或慢性的神经变性过程)的调节；以及(9)mGluR5二聚化的调节(例如，mGluR5a和/或mGluR5b的二聚化)和/或其他mGluR家族成员二聚化(例如mGluR1的二聚化)的调节。因此，如以下进一步所述，本发明的分离的核酸分子可以用于，例如，表达mGluR5M蛋白(例如在基因治疗应用中，通过重组表达载体在宿主细胞中表达)；用于检测mGluR5M mRNA(例如在生物样品中)或在mGluR5M基因中的基因改变，以及用于调节mGluR5M的活性。mGluR5M蛋白可以用于治疗表以mGluR5M蛋白和/或mGluR5M配体的产生不足或过量为特征的疾病。此外，mGluR5M蛋白可以用于筛选调节mGluR5M活性的药物或化合物，以及治疗有下述形式特征的疾病产生不足或过量的mGluR5M蛋白，或所产生的mGluR5M蛋白与mGluR5M蛋白野生型相比，其活性降低或异常。还有，本发明的抗mGluR5M抗体可以用来检测和分离mGluR5M蛋白，调节mGluR5M蛋白的生物利用度，以及调节mGluR5M的活性。
A筛选测定本发明提供一种鉴定调节剂的方法(这里亦称为“筛选测定”)，其中的调节剂即为与mGluR5M蛋白结合，或对例如mGluR5M的表达或mGluR5M的活性有刺激或抑制作用的侯选或受检化合物或试剂(例如，肽、肽模拟物、小分子物或其他药物)。
在一个实施方案中，本发明提供各种测定方法，用于筛选结合或调节mGluR5M蛋白或多肽、或其生物活性部分的侯选或受检化合物。本发明的受检化合物可以采用本领域所熟知的组合文库方法等多种途径中的任何一种而获得，包括生物文库；空间可寻的平行固相或溶液相文库；需要去卷曲的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；以及用亲和层析选择的合成文库方法。生物学文库方法限于肽链文库，而其他四种方法可应用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物库(Lam，K.S.(1997)Anticancor Drug Des.12145)。
分子文库的合成方法的例子在本领域下述文献中可以查找到Dewitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9111422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等(1993)Science 2611303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；以及Gallop等(1994)J.Med.Chem.371233。
化合物文库可存在溶液中(例如，Houghten(1992)Biotochniques13412-421)，或存在于珠(Lam(1991)Nature 35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364555-556)、细菌(Ladner USP 5,223,409)、孢子(Ladner USP 409)、质粒(Cull等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.891865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249386-390)；(Devlin(1990)Science249404-406)；(Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.876378-6382)；(Flici(1991)J.Mol.Biol.222301-310)；(Lader同上)。
在一个实施方案中，其中的测定是基于细胞的测定，该测定中，使在细胞表面表达mGluR蛋白的细胞与mGluR5M蛋白和受检化合物接触，并测定该受检化合物调节mGluR5M蛋白与mGluR结合的能力。该细胞可以是哺乳动物来源细胞或酵母细胞。测定受检化合物调节mGluR5M蛋白与mGluR结合的能力可通过以下方法来完成，例如，将受检化合物或mGLuR5M蛋白与放射性同位素或酶标记物偶联，从而可以通过检测复合物中的标记化合物来测定受检化合物或mGluR5M蛋白与mGluR蛋白的结合。例如，测试化合物可以用125I、35S、14C或3H直接或间接标记，然后通过直接的放射发射计数，或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，可以用酶法标记化合物或蛋白，例如，用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，或荧光素酶标记，然后通过测定合适的底物转化为产物来检测酶标记物。
测定受检化合物调节mGluR5M蛋白的相互作用的能力也属于本发明的范围，其中的相互作用物均未标记。例如，在受检化合物或mGLuR5M蛋白均未标记的场合，可以采用显微生理计来检测受检化物与mGluR5M蛋白的相互作用。Mc Connell，H.M.等(1992)Science 2571906-1912。这里所用的“显微生理计”(例如，CytosenosorTM)是一种分析仪器，它使用光可寻的电压计传感器(LAPS)测定细胞使其环境酸化的速度。该酸化速度的变化可作为配体与受体反应的指示剂。
在优选的实施方案中，该测定包括使在细胞表面表达mGluR5M蛋白的细胞与mGluR5配体接触，以形成测定混合物；使该测定混合物与mGluR5M蛋白或其变体接触，任选还接触受检化合物，然后测定mGluR5M蛋白或变体或受检化合物与mGluR5蛋白相互作用的能力。在一个实施方案中，测定mGluR5M蛋白或变体或受检化合物与mGluR5M蛋白相互作用的能力包括测定mGluR5M蛋白或变体或受检化物比mGluR5M优先与mGluR5蛋白结合的能力。
采用上述测定直接结合的方法之一，可以完成mGluR5M蛋白，或受检化合物与mGluR5蛋白结合或相互作用的能力的测定。在优选的实施方案中，mGluR5M蛋白或受检化合物与mGluR5蛋白结合或相互作用的能力的测定，可以通过测定mGluR5蛋白的活性或mGluR5下游的靶分子的活性来完成。例如，该靶分子可以是细胞的第二信使，该靶分子的活性可通过以下检测来测定检测该靶分子的诱导(即细胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)、检测该靶分子对合适的底物的催化/酶活性、检测报道基因的诱导(包括与编码可检测的标记，如荧光素酶操作连接的mGluR5反应的调节元件)。或检测细胞内的反应，例如，增殖反应或神经元反应。
在还有一个实施方案中，本发明的测定是无细胞的测定，其中mGluR5M蛋白或其生物活性部分与受检化合物接触，然后测定该受检化合物与mGluR5M蛋白结合的能力。受检化合物与mGluR5M蛋白的结合可以如上述直接或间接地测定。受检化合物与mGluR5M蛋白的结合也可以用以下所述的技术来完成，例如实时生物分子相互作用分析(BIA)。Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.632338-2345和Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705。这里所用的“BIA”是一种实时研究生物特异性相互作用的技术，未对任何相互作用物(例如BIAcoreTM)进行标记。表面等离子共振(SDR)的光学现象改变可以用作生物分子间实时反应的指示。
在优选的实施方案中，测定方法包括使mGluR5M蛋白或其生物活性部分与已知的配体接触，该配体与mGluR5M结合而形成测定混合物；使该测定混合物与受检化合物接触；然后测定该受检化合物与mGlur5M蛋白相互作用的能力，其中，测定该受检化合物与mGlur5M蛋白相互作用的能力包括测定受检化合物比已知的配体优先与mGluR5M或其生物活性部分结合的能力。
在另一个实施方案中，该测定是无细胞的测定，在该测定中，使mGluR5M蛋白或其生物活性部分与受检化合物接触，然后测定该受检化合物调节(例如，刺激或抑制)mGluR5M蛋白或其生物活性部分的活性的能力。测定受检化合物调节mGluR5M蛋白的活性的能力可通过以下方法来完成，例如，采用上述基于细胞的测定方法之一，测定mGluR5M蛋白调节下游mGluR5M靶分子活性的能力。例如，如前面所述，可以测定靶分子对适合的底物的催化/酶活性。或者，如前面所述，可以测定mGluR5M与mGluR结合或相互作用的能力。
在还有一个实施方案中，无细胞测定包括使mGluR5M蛋白或其生物活性部分与已知的配体接触，该配体与mGluR5M蛋白，任选与mGluR蛋白，结合而形成测定混合物，然后使该测定混合物与受检化合物接触，并测定该受检化合物与mGluR5M蛋白相互作用的能力，其中，受检化合物与mGluR5M蛋白相互作用能力的测定包括测定该受检化物比已知配体优先与mGluR5M靶分子结合或调节mGluR5M靶分子的活性的能力。
本发明的无细胞测定可适用于可溶的和/或膜结合形式的分离蛋白(如，mGluR5M蛋白或mGluR5蛋白)。在使用膜结合形式的分离蛋白(例如，mGluR5蛋白)的无细胞测定场合，可能要求使用增溶剂，从而可以使膜结合形式的分离蛋白保留在溶液中。这种增溶剂的例子包括非离子型的清洁剂，例如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰-N-甲基葡糖胺、癸酰基-N-甲基葡糖胺、Tritonx-100、Tritonx-114、Thesit、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-〔(3-胆酰氨基丙基)-二甲氨合〕-1-丙磺酸(CHAPS)、3-〔(3-胆酰氨基丙基)-二甲氨合〕-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPSO)，或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-氨合-1-丙烷磺酸。
在上述本发明测定方法的多个实施方案中，最好将mGluR5M或它的靶分子固定化，以促进将蛋白之一或两者的复合形式与未复合形式分离，以及促进适应该测定的自动化。受检化合物与mGluR5M蛋白的结合，或mGluR5M蛋白在侯选化合物存在或不存在下与靶分子的相互作用，可以在任何适合于包含该反应物的容器中完成。这种容器的例子包括微量滴定板、试管、或微量离心管。在一个实施例方案，可以提供一种添加了某种结构域的融合蛋白，从而使其中一种蛋白或二者结合在基质上。例如谷甘胱肽S-转移酶/mGluR5M融合蛋白，或谷甘胱肽S-转移酶/靶融合蛋白可以吸附在谷甘胱肽琼脂糖凝胶珠(SigmaChemical，St.Lousis，Mo)或谷甘胱肽衍生的微量滴定板上，然后与受检化合物，或受检化合物和非吸附的靶蛋白或mGluR5M蛋白混合，将混合物在导致复合物形成的条件下(例如在生理条件的盐浓度和pH下)温育。温育后，洗涤珠或微量滴定板的孔，以除去未结合的组分，在珠中固定化的基质，如以上所述，例如直接或间接测定复合物。或者，可将复合物与基质解离，并用标准技术测定mGluR5M的结合或活性的水平。
其他将蛋白固定在基质上的技术也用在本发明的筛选测定中。例如，mGluR5M蛋白或mGluR5M靶分子可以利用与生物素和链霉抗生物素蛋白的偶联而固定化。生物素化的mGluR5M蛋白或靶分子可以用本领域众所周知的技术，由生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)制备(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)并固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板上(Pierce Chemical)。或者，与mGluR5M蛋白或靶分子反应，但不干扰mGluR5M蛋白与其靶分子结合的抗体可以衍生化在该滴定板的孔上，并通过抗体偶联将捕捉在孔内的未结合靶或mGluR5M蛋白释放。除了上述GST-固定化复合物的方法之外，检测这种复合物的方法还包括利用抗体与mGluR5M蛋白或靶分子反应的复合物的免疫检测方法，以及酶联免疫吸附分析法，该方法依赖于检测与mGluR5M蛋白或靶分子相关的酶的活性。
在另一个实施方案中，mGluR5M表达的调节剂用某种方法鉴定，在该方法中，使细胞与侯选化合物接触，并测定mGluR5M mRNA或蛋白在细胞中的表达。比较在侯选化物存在与不存在下，mGluR5M mRNA或蛋白的表达水平，然后根据此比较结果，可鉴定该侯选化物为mGluR5M表达的调节剂。例如，在该侯选化合物存在时，mGluR5M mRNA或蛋白的表达大于(统计学上显著大于)其在该侯选化物不存在时的表达，则该侯选化合物被鉴定为mGluR5M mRNA或蛋白表达的刺激剂。或者，在该侯选化合物存在时，mGluR5M mRNA或蛋白的表达小于(统计学上显著小于)其在该侯选化合物不存在时的表达，则该侯选化合物被鉴定为mGluR5M mRNA或蛋白表达的抑制剂。mGluR5MmRNA或蛋白在细胞中的表达水平可以用这里所述的，用于检测mGluR5M mRNA或蛋白的方法来测定。
本发明还有的另一个方面是mGluR5M蛋白可以作为“饵蛋白”用于双杂交测定或三杂交测定中(参见，例如，美国专利NO.5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等(1993)Bitechniques14920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 81693-1696；以及BrentWO94/10300)，以鉴定其他与mGluR5M结合或相互作用(“mGluR5M结合蛋白”或“mGluR5M-bp”)，并与mGluR5M活性有关的蛋白。这种结合mGluR5M的蛋白，例如作为mGluR5M介导的信号传递途径的下游元件，有可能与mGluR5M蛋白的信号增殖有关。或者，这种结合mGluR5M的蛋白可能是与非mGluR5M表达细胞缔合的细胞表面分子，其中这些结合mGluR5M的蛋白与趋化作用有关。
双杂交系统以大多数转录因子的调节性质为基础，它包括可分开的DNA结合和激活结构域。简单地说，该测定采用两种不同的DNA构建体，在一种构建体中，编码mGluR5M蛋白的基因与编码已知转录因子(例如，GAL-4)的DNA结合结构域的基因融合。在另一种构建体中，来源于DNA序列文库，并编码某种未鉴定的蛋白(“猎物”或“样品”)的DNA序列，与编码已知转录因子的激活结构域的基因融合。如果该“饵”蛋白和“猎物”蛋白能在体内相互作用而形成依赖mGluR5M的复合物，则该转录因子的DNA结合和激活结构域会靠得很接近。该靠近使报告基因(例如，LacZ)能够转录，该报告基因与反应于转录因子的转录调节位点操作连接。然后可以检测报告基因的表达，并分离出含有功能转录因子的细胞集落，随后用于获得编码与mGluR5M蛋白相互作用的蛋白的克隆的基因。
本发明还包括通过上述筛选测定而鉴定的新型试剂，因此，进一步将按这里所述而鉴定的试剂用于合适的动物模型，也在本发明的范围之内。例如，按本发明书所述而鉴定的试剂(例如，mGluR5M调节剂、反义mGluR5M核酸分子、mGluR5M特异性抗体，或mGluR5M结合配偶体)可以用于动物模型中，用来测定用该试剂治疗时的效果、毒性或副作用。或者，按本发明而鉴定的试剂可以用于动物模型中，用来测定该试剂的作用机制。此外，本发明还包括用上述筛选测定鉴定的新型试剂在本发明所述的治疗方面的用途。
B.检测分析这里所鉴定的cDNA序列的部分或片段(以及相应的完全基因序列)可以作为多聚核苷酸试剂用于很多方面。例如，这些序列可以用于(i)绘出其相应基因在染色体上的位置；并由此而确定与遗传疾病相关的基因区域位置；(ii)由微量的生物样品鉴定个体(组织类型的测定)；以及(iii)有助于对生物样品的法医学鉴定。这些应用在以下小节描述。
1、染色体图谱的描绘一旦分离出基因的序列(或该序列的一部分)，该序列即可用来绘出该基因在染色体上的位置。此过程称为染色体图谱的描绘。因此，这里所述的mGluR5M核苷酸序列的部分或片段可以用来描绘mGluR5M基因在染色体上的位置。描绘mGluR5M序列在染色体上的位置，对于找出这些序列与疾病相关基因之间的关系是重要的第一步。
简单地说，可以通过由mGluR5M核苷酸序列制备PCR引物(优选长度为15-25bp)来描绘mGluR5M基因在染色体上的位置。mGluR5M序列的计算机分析可以预测不跨过基因组内1个外显子，从而使扩增变得复杂的引物，参见，例如本说明书的实施例3。这些引物然后可以用于PCR筛选含有每个人染色体的体细胞杂交体。只有含有相应于mGluR5M序列的人基因的那些杂交体才能产生扩增的片段。
体细胞杂交体的制备方法是使来自不同哺乳动物的体细胞(例如人和小鼠细胞)融合。随着人和小鼠细胞的杂交体的生长和分裂，这些杂交体逐渐以随机的顺序丢失人的染色体，但保留小鼠的染色体。通过使用因缺乏特定的酶而使小鼠细胞在其中不能生长，而人细胞能生长的培养基，使含有编码该所需酶基因的人染色体能保留下来。通过使用各种培养基，可以建立不同组的杂交体细胞系。在一个组的每种细胞系中含有单个人染色体或少量的人染色体，以及全套小鼠染色体，可以容易地绘出特定的人染色体的每个基因的图谱。(D’EustachioP.等(1983)Science 220919-924)。只含有人染色体片段的体细胞杂交体也可以用易位和缺失的人染色体来产生。
对于将特定的序列指定在特定的染色体上来说，用体细胞杂交体的PCR绘图法是快速的方法。用单个热循环器，每天能确定3个或更多个序列。使用mGluR5M核苷酸序列来设计寡核苷酸引物，由一组特定染色体的片段可以完成亚定位。其他能够同样地用于描绘90、1p或1v序列在其染色体上图谱的策略包括，原位杂交(在Fan，Y等(1990)PNAS，876223-27中有述)，用标记的流式分选染色体预筛选，以及通过与染色体特异性cDNA文库杂交的预选择。
DNA序列与中期染色体展开体(spread)的荧光原位杂交(FISH)可进一步用来一步提供精确的染色体定位。染色体展开体可以用细胞来制备，该细胞的分化已通过使用化学物质，如破坏有丝纺锤体的秋水仙碱，而被停止在中期。该染色体可以简单地用胰蛋白酶处理，然后用Giemsa染色。在每条染色体上出现浅色和深色条带的模式，从而可逐个对染色体进行鉴定。FISH技术可用于短至500或600个碱基的DNA序列。但是，大于1000碱基的克隆具有更大的可能性与独特的染色体位置结合，具有足够的信号强度而使检测更为简单。优选1000个碱基，更优选2000个碱基将足以在合理的时间内获得好的结果。对于该技术的综述，参见Verma等，Human ChromosomesA Manual of BasicTechnigues(Pergamon Press，New York 1988)。
描绘染色图谱的试剂可以单独使用来标记单个染色体或该染色体上的单个位点，或者一组试剂可以用于标记多个位点和/或多个染色体。优选用准确地相应于基因的非编码区的试剂用于绘制图谱。在基因家族中，编码序列更有可能是保守的，从而在绘制染色体图谱的过程中增加了其交叉杂交的机会。
一旦序列的染色体定位被精确描绘，该序列在染色体上的物理位置便可与基因图谱数据相关。(这种数据可以在，例如，V.Mckusik，Mendelian Inheritance in Man中查到，并通过JohnsHopkins Unirersity Welch Medical library在线提供)。绘制在同一染色体区域的基因与疾病之间的关系，然后可以通过连锁分析(物理上邻近基因的共同遗传)来鉴定，例如在England，J.等(1987)Nature，325783-787中所述。
此外，可以测定受mGluR5M基因相关疾病的影响和未受影响的个体之间的DNA序列差别。如果在某些或所有受影响的个体中观察到突变，而未在任何未受影响的个体观察到突变，那么该突变有可能是该特定疾病的病因。感染和未感染个体的比较一般包括首先查找染色体中的结构改变，例如缺失或易位，这可由染色体展开体看到，或用基于该DNA序列的PCR可检测到。最后，对来源于几个个体的基因进行完全的测序，以确定突变的存在，和区别突变与多态性。
2、组织类型的测定本发明的mGluR5M序列也可以用于由微量的生物样品来鉴定个体。例如美国陆军正在考虑使用限制片段长度的多态性(RELP)来鉴定其全体员工。在该技术中，将每个人的基因组DNA用一种或多种限制性酶消化，并用作探针在Southern印迹上探查，以产生独特的条带用于鉴定。该方法并不受到当前的“Dog标志”的限制，该“Dog标志”可以丢失、关闭或失去，造成阳性鉴定的困难。本发明的序列可作为附加的DNA标志用于RFLP(美国专利5,272,057中描述)。
此外，本发明的序列可以用来提供另一种技术，该技术对选择的个体基因组的一部分，测定其实际逐个碱基的DNA序列。因此，这里所述的mGluR5M核苷酸序列可以用来由该序列的5’和3’端制备两种PCR引物。这些引物然后可以用于扩增个体的DNA，并随后测定其序列。
用此方式制备个体的一组相应DNA序列，这些DNA序列组可以用来提供独特的个体鉴定，由于等位基因的不同，每个个体的一组这样的DNA序列是独特的。本发明的序列可以用来由个体和组织获得这样的鉴定序列。本发明的mGluR5M核苷酸序列独特地代表人基因组的部分。在这些序列的编码区，等位基因变异的发生达到某种程度，在非编码区达到较大的程度。现已确定，人的个体间等位基因变异发生的频率为每500个碱基约1次。这里所述的每种序列，在某种程度上可以用作标准，来源于个体的DNA可以与其比较而进行鉴定。由于在非编码区发生较多数量的多态性，因此用来对个体进行区分所需的序列较少。SEQ ID NO1的非编码序列，以一组可能为10-1000个的引物，可以充分提供阳性的个体鉴定，该引物中的每种引物产生100个碱基的非编码扩增序列。如果使用预测的编码序列，例如SEQ ID NO3中的序列，对阳性个体鉴定，更合适的引物数为500-2000个。
如果用一组来源于这里所述的mGluR5M核苷酸序列的试剂来产生独特的个体鉴定数据库，那些同样的试剂以后可以用来鉴定来源于个体的组织。使用独特的鉴定数据库，无论是活的或死的个体，都能用非常少量的组织样品进行个体的阳性鉴定。
3、部分mGluR5M序列在法医生物学中的应用基于DNA的鉴定技术也可以用于法医生物学中。法医生物学是利用在犯罪现场发现的生物学证据的遗传分型为工具而进行阳性鉴定，例如，罪行的犯罪者的科学领域。为了作出这种鉴定，可使用PCR技术扩增取自很少量的生物样品的DNA，该生物样品例如是在犯罪现场发现的组织，如头发或皮肤；或体液，如血液，唾液，或精液。然后将扩增的序列与标准比较，由此而鉴定该生物样品的来源。
本发明的序列可以用来提供多核苷酸试剂，例如导向人基因组的特定基因座的PCR引物，它可通过，例如，提供另一个“鉴定标记”(亦即，另一个对特定的个体是独特的DNA序列)，从而提高基于DNA的法医鉴定的可靠性。如以上所述，实际的碱基序列信息可以作为限制酶产生的片段所形成的模式的精确替代物而用于鉴定中。导向SEQID NO1的非编码区的序列特别适用于这种用途，因为在非编码区中出现大量的多态性，使利用这种技术来区分个体变得更容易。多核苷酸试剂的例子包括mGluR5M核苷酸序列或其部分，例如，来源于SEQ IDNO1非编码区的长度至少为20个碱基，优选至少30个碱基的片段。
这里所述的mGluR5M核苷酸序列还可以用来提供多核苷酸试剂，例如标记的或可标记的探针，它可以用于，例如，原位杂交技术中，以鉴定特定的组织，如脑组织。法医病理学家而临着未知来源的组织的场合，这种技术尤为有用。一组这样的mGluR5M探针可以用来按种和/或按器官类型来鉴定组织。
以类似的方式，这些试剂，例如，mGluR5M引物或探针可以用来对组织培养物的污染进行筛查(即筛查在培养物中存在不同类型细胞的混合物)。
C.预测医学本发明还涉及预测医学的领域，其中采用诊断测定、预防测定、和监测临床试验用于预后(预测)的目的，从而对个体进行预防性的治疗。因此，本发明的一个方面是关于在生物样品(例如血、血清、细胞、组织)范围内测定mGluR5M蛋白和/或核酸表达，以及mGluR5M的活性的诊断测定，由此而确定某个体是否患有与mGluR5M的表达或活性异常有关的疾病或紊乱，或是否有形成该紊乱的危险。本发明也提供预防(或预测)的测定，用于确定个体是否有形成与mGluR5M蛋白、核酸的表达或活性有关的紊乱的危险。例如，可以在生物样品中测定mGluR5M基因的突变。这种测定可用于预后或预测的目的，从而可以对个体在其发作以mGluR5M蛋白、核酸的表达或活性为特征或与其相关的疾病之前，进行预防性的治疗。
本发明的另一方面涉及在临床试验中，监测试剂(例如，药物，化合物)对mGluR5M的表达和活性的影响。
这些试剂和其他试剂在以下小节中进一步详述。
1、诊断测定检测mGluR5M蛋白或核酸在生物样品中的存在或不存在的典型方法包括从待测受试者获得生物样品，使该生物样品与能检测mGluR5M蛋白或编码mGluR5M蛋白的核酸(如mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，从而检测mGluR5M蛋白或核酸在生物样品中的存在。优选的检测mGluR5M mRNA或基因组DNA的试剂是能与mGluR5M mRNA或基因组DNA杂交的标记核酸探针。该核酸探针可以是，例如，全长的mGluR5M核酸，如SEQ ID NO1的核酸，或是mGluR5M酸的片段或部分，如长度至少为15，30，50，100，250或500个核苷酸，并在严格条件下，足以能与mGluR5M mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。其他适合用于本发明的诊断测定的探针在此描述。
优选用于检测mGluR5M蛋白的试剂为能与mGluR5M蛋白结合的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或者更优选是单克隆的抗体。可以使用完整的抗体，或其片段(例如，Fab或F(ab’)2)。术语“标记的”，就探针或抗体而言，是指包括探针或抗体的直接标记，以及间接标记，前者通过将可检测的物质与探针或抗体偶联(即物理连接)；后者通过使探针或抗体与直接标记的另一试剂的反应性。间接标记的例子包括用荧光标记的第二抗体检测第一抗体；和用生物素对DNA探针进行末端标记，从而使其可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白来检测。术语“生物样品”包括由受试者分离出来的组织、细胞和生物液体；以及存在于受试者体内的组织、细胞和体液。也就是说，本发明的检测方法可以用于在体外、同样也可以用于在体内检测生物样品中的mGluR5M mRNA、蛋白，或基因组DNA。例如，在体外检测mGluR5M mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。体外检测mGluR5M蛋白的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。体外检测mGluR5M基因组DNA包括Southern杂交。此外，体内检测mGluR5M蛋白的技术包括将标记的抗mGluR5M抗体引入受试者体内。例如可用放射性的标记将抗体标记，然后用标准的显象技术检测其在受试者体内的存在和位置。
在一个实施方案中，生物样品含有来源于受检受试者的蛋白分子。或者，该生物样品可以含有来源于受检受试者的mRNA分子或基因组DNA分子。优选的生物样品是由受检受试者用常规方法分离的血清样品。
在另一个实施方案中，该方法还包括由对照受试者获得对照生物样品，使该对照样品与能够检测mGluR5M蛋白、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，从而检测mGluRM蛋白、mRNA或基因组DNA在生物样品中的存在，并比较在对照样品中与在受检样品中，mGluR5M蛋白、mRNA或基因组DNA的存在。
本发明还包括检测在生物样品中mGluR5M的存在的试剂盒。例如，该试剂盒可包括能检测生物样品中mGluR5M蛋白或mRNA的标记化合物或试剂；测定样品中mGluR5M量的装置；比较该样品与标准样品中mGluR5M的量的装置。该化合物或试剂可以包装在合适的容器中。该试剂盒还可包括使用该试剂盒检测mGluR5M蛋白或核酸的说明书。
2、预后测定这里所述的诊断方法可以进一步用来鉴定患有与mGluR5M或mGluR表达或活性异常有关的疾病或紊乱，或有形成该疾病或紊乱的危险的受试者。例如，这里所述的测定，如前面所述的诊断测定或下述的测定，可以用来鉴定患有与mGluR5M蛋白、核酸的表达或活性有关的紊乱，例如CNS或精神紊乱，或具有形成该紊乱的危险的受试者。或者，该预防测定可以用来鉴定患有或具有形成CNS或精神紊乱危险的受试者。因此，本发明提供一种鉴定与mGluR5M或mGluR表达或活性异常有关的疾病或紊乱的方法，在该方法中，从受试者获得测试样品，并检测mGluR5M蛋白或核酸(例如，mRNA，基因组DNA)，其中存在mGluR5M蛋白或核酸者则被诊断为患有与mGluR5M或mGluR表达或活性异常有关的疾病或紊乱，或有形成该疾病或紊乱的危险。这里所用的“受检样品”是指由目的受试者获得的生物样品。例如，受检样品可以是生物液体(例如，血清)、细胞样品、或组织，特别是神经元细胞样品或组织。
此外，这里所述的预后测定可以用来确定是否能将某种试剂给予受试者(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白、肽、核酸、小分子，或其他侯选药物)，以治疗与mGluR5M表达或活性异常有关的疾病或紊乱。例如，这种方法可以用来确定是否能用某种试剂来有效地治疗受试者的紊乱，例如CNS或精神的紊乱。或者，这种方法可以用来确定是否能用某种试剂来有效地治疗受试者的炎性疾病。因此，本发明提供一种方法，该方法用来确定是否能用某种试剂来有效地治疗受试者的与mGluR5M或mGluR表达或活性异常有关的紊乱，在该方法中，获得受检样品，并检测其mGluR5M蛋白或核酸的表达或活性(例如，其中mGluR5M蛋白或核酸表达或活性丰富者则被诊断为可给予其该试剂，以治疗与mGluR5M或mGluR表达或活性异常有关的紊乱。)本发明的方法还可以用于检测mGluR5M基因中的遗传改变，由此来确定具有该改变基因的受试者是否有患以炎性反应异常为特征的紊乱的危险。在优选的实施方案中该方法包括检测取自受试者的细胞样品中是否存在改变，该遗传改变的特征在于至少有一种影响了编码mGluR5M蛋白基因的完整性，或使该mGluR5M基因错误表达。例如，这种遗传改变的检测方法是通过查明至少存在下述情况之一1)mGluR5M基因中缺失1个或1个以上的核苷酸；2)mGluR5M基因中添加了一个或一个以上的核苷酸；3)mGluR5M基因中一个或一个以上的核苷酸被取代；4)mGluR5M基因的染色体重排；5)mGluR5M基因的信使RNA转录水平的改变；6)mGluR5M基因的异常修饰，例如基因组DNA的甲基化模式；7)mGluR5M基因的信使RNA转录物的非野生型剪接模式的存在；8)mGluR5M蛋白的非野生型水平；9)mGluR5M基因的等位基因的丢失；以及10)mGluR5M蛋白的不合适翻译后修饰。如这里所述，在本领域中有很多可以用于检测mGluR5M基因改变的测定技术。优选的生物样品是用常规方法从受试者分离的组织或血清样品。
在某些实施方案中，上述改变的检测包括探针/引物在聚合物酶链反应(PCR)(参见，如美国专利NO.4,683,195和4,683,202)，例如锚式PCR或RACE PCR，或者，在连接链反应(LCR)(参见，例如，Landegran等，(1988)Science 2411077-1080；和Nakazawa等，(1994)PNAS 91360-364)中的使用，其中后者对检测mGluR5M基因中的点突变特别有用(参见，Abravaya等，(1995)Nucleic AcidsRes.23675-682)。该方法可包括以下各步从病人采集细胞样品；由该细胞样品分离核酸(例如，基因组，mRNA或两者)；在mGluR5M基因(如果存在的话)能发生杂交和扩增的条件下，使核酸样品与一种或一种以上和mGluR5M特异性杂交的引物接触；以及检测扩增产物的存在或不存在；或检测扩增产物的大小，并与对照样品比较其长度。一般希望PCR和/或LCR最好用作初始的扩增步骤，并结合使用这里所述的其他任何一种用于检测突变的技术。
其他的扩增方法包括自动维持序列扩增(Guatelli，J.C.等，1990，Proc.Natl.Acad Sci.USA 871874-18787、转录扩增系统(Kwoh，D.Y.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)861173-1177)、QB复制酶(Lizarai，P.M.等1988，Bio/Technology 61197)，或其他任何的核酸扩增方法，随后用本领域技术人员所熟知的技术检测扩增的分子。这些检测方案特别适用于检测含量非常低的核酸分子。
在另一个实施方案中，来源于样品细胞的mGluR5M基因的突变可根据限制酶酶切图谱的改变来鉴定。例如，分离样品和对照的DNA；扩增(任选)；用一种或一种以上的限制性内切酶消化；通过凝胶电泳测定片段的长度大小并比较。样品和对照DNA间片段长度大小的不同表明了样品DNA中的突变。此外，使用序列特异性的核酶(参见，例如，美国专利NO.5,498,531)，根据核酶酶切位点的出现或丢失，可以用来计算存在的特异性突变。
在其他实施方案中，mGluR5M中的基因突变可以通过将样品和对照的核酸，例如DNA或RNA，与包含数百个或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列杂交(Cronin，M.T.等(1996)Human Mutation 7244-255；Kozal，M.J.等(1996)Nature Medicine 2753-759)。例如，如Cronin，M.T.等在前面指出的文章中所述，mGluR5M中的基因突变可以在包含发光DNA探针的二维阵列中鉴定。简单地说，第一杂交阵列的探针，通过制成线状连续重叠探针的阵列，可以用来全面搜查样品和对照中的长段DNA，以鉴定序列之间的碱基改变。该步骤能鉴定点突变。随后是用第二杂交阵列杂交，该阵列使用较小的与所有检测的变异体或突变体互补的特异化的探针陈列来确定特定突变体的特征。每个突变阵列由平行的两组探针组成，一组与野生型基因互补，另一组与突变基因互补。
在还有另一个实施方案中，本领域所熟知的各种测序反应中的任何一种都可用于直接测定mGluR5M基因的序列，并通过比较样品mGluR5M与相应的野生型(对照)序列来检测其突变。测序反应的例子包括基于由Maxim和Gilbert(1977)PNAS 74560)或Sanger((1997)PNAS 745463)建立的技术的反应。也可设想，进行诊断测定时可以采用各种自动测序方法中的任何一种((1995)Biotechniques 19448)，包括用质谱法测序(参见，例如PCT国际公开NO.WO94/16101；Coher等(1996)Adv.Chromatogr.3612)-162；和Griffin等(1993)Appl Biochem.Biotechnol.38147-159)。
其他检测mGluR5M基因突变的方法包括使用防止裂解的试剂来检测RNA/RNA，或RNA/DNA异双链体错配碱基的方法(Myers等(1985)Science 2301242)。一般，“错配裂解”技术从制备异双链体开始，该异双链体是由含有野生型mGluR5M序列的杂交的(标记的)RNA或DNA与来自组织样品的有可能突变的RNA或DNA杂交而形成。用裂解双链体单链区的试剂处理双链的双链体，该单链区是由于对照和样品链之间的碱区错配而存在的。例如，RNA/DNA双链体可以用RNA酶处理；DNA/DNA杂交体用S1核酸酶处理，从而用酶法消化错配区。在其他实施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA双链体可用羟氨或四氧化锇处理，以及用哌啶处理，以消化错配区。错配区消化后，所产生的物质按大小在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，以测定突变位点。例如，参见Cotton等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397Saleeba等，(1992)酶学方法217286-295。在优选的实施方案中，对照DNA或RNA可以标记，以便于检测。
在还有另一个实施方案中，在确定的系统中，采用识别双链DNA中错配碱基对的一种或一种以上的蛋白(所谓“DNA错配修复”酶)，来检测来自细胞样品的mGluR5M cDNA的点突变，并绘出其图谱。例如，大肠杆菌的mutY酶裂解G/A错配的A，HeLa细胞的胸苷DNA糖基化酶裂解G/T错配的T(Hsu等(1994)Carcinogenesis 151657-1662)。按照典型的实施方案，基于mGluR5M序列，例如，野生型的mGluR5M序列的探针与受检细胞的cDNA或其他DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理双链体，然后对裂解产物(如果有的话)按照电泳等方案进行检测。例如，参见美国专利NO.5,459,039。
在另一个实施方案中，电泳迁移率可以用来鉴定mGluR5M基因中的突变。例如，单链构象多态性(SSCP)可以用于检测突变型和野生型核酸之间的电泳迁移率的差别(Orita等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862766，另参见Cotton(1993)Mutat Res 285125-144；以及Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 973-79)。使样品和对照的mGluR5M核酸的单链DNA片段变性和复性。单链核酸的二级结构根据其序列不同而异，在电泳迁移率上产生的变化可以检测甚至单个碱基的改变。可以对该DNA片段进行标记，或用标记的探针检测。采用RNA(而不是用DNA)可以提高该测定的灵敏度，RNA的二级结构对序列的变化更为敏感。在优选的实施方案中，本发明的方法利用异双链体分析，根据其电泳迁移率的改变来分离双链的异双链体分子(Keen等，(1991)Trends Genet 75)。
还有另一个实施方案中，采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Mgers等，(1985)Nature 313495)来测定突变体或野生型的片段在聚丙烯酰胺凝胶中的移动。采用DGGE作为分析方法时，DNA需要进行修饰，以保证其不完全的变性，例如通过PCR加入约40bp高融点富含GC的DNA的GC膜片钳。在另一个实施方案中，采用温度梯度代替变性梯度，来鉴定对照和样品DNA的迁移率差别(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem 26512753)。
其他用于检测点突变的技术的例子包括，但不限于，选择性的寡核苷酸杂交，选择性的扩增、或选择性的引物延伸。例如，可制备其中心已置入已知突变的寡核苷酸引物，然后使其与靶DNA杂交，杂交的条件是只有找到完全匹配时才能发生杂交(Saiki等，(1986)Nature 324163)；Saiki等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA866230)。在将寡核苷酸附着到杂交膜上并与标记的靶DNA杂交时，上述的等位基因特异的寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA核苷酸或大量的不同突变体杂交。
或者，基于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以与本发明结合起来使用。作为引物用于特异性扩增的寡核苷酸可以在其分子的中心携带目的突变(从而使扩增依赖于不同的杂交)(Gibbs等(1989)Nuclei Acids Res.172437-2488)，或在一个引物的3’端携带该目的的突变，在合适的条件下，该3’端的错配可防止或减少聚合酶引起的延伸(Prossner(1993)Tibtech 11238)。此外，在突变区引入一个新的限制性位点，以形成一种根据裂解进行检测的方法，这也是合乎需要的(Gasparin等(1992)Mol.Cell Probes 61)。可以预测，在某些实施方案中，也可以用Tag连接酶进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88189)。在这种情况下，只有该5’序列的3’端完全匹配时才能发生连接，这样有可能通过检查是否存在扩增，来检测在特定位点是否存在已知突变。
这里所述的方法可以利用预包装好的诊断试剂来进行，该试剂盒包含至少一种这里所述的探针核酸或抗体试剂，它可方便地用于临床的设备中，用来对表现出与mGluR5M基因有关疾病的症状的病人，或对与mGluR5M基因有关疾病有家族史的病人进行诊断。
此外，表达mGluR5M的任何细胞类型或组织都可用于这里所述的预后测定中。
3、临床试验中效果的监测监测试剂(例如药物、化合物)对mGluR5M蛋白或活性的影响(例如CNS或精神病反应的调节)不仅可以应用于基本药物的筛选，还可应用于临床试验。例如，通过这里所述的筛选测定而确定的某种试剂在增加mGluR5M基因的表达、蛋白水平，或上调mGluR5M或mGluR活性方面的效果，可以在表现出减少的mGluR5M基因表达、蛋白水平，或下调的mGluR5M或mGluR的活性的受试者的临床试验中进行监测。或者，通过这里所述的筛选分析而确定的某种试剂在减少mGluR5M基因的表达、蛋白水平，或下调mGluR5M或mGluR活性方面的效果，可以在表现出增加的mGluR5M基因表达、蛋白水平，或上调的mGluR5M或mGluR的活性的受试者的临床试验中进行监测。在这种临床试验中，mGluR5M基因的表达或活性，优选例如炎性紊乱涉及的其他基因可以用作特定细胞表型的“读出”或标记。
例如，但不是限定，可以鉴定出在细胞内通过用某种调节mGluR5M活性(例如，如这里所述，在筛选测定中鉴定)的试剂(例如化合物、药物或小分子)处理而受到调节的基因，包括mGluR5M。因此，为了研究试剂对CNS或精神病的影响，例如，在临床试验中，可以将细胞分离出来，并制备RNA，然后分别分析mGluR5M和其他CNS或精神病涉及的基因的表达水平。基因表达的水平(即基因表达的模式)可以通过以下方法定量如这里所述的Northern印迹分析或RT-PCR；或者用这里所述的一种方法测定所产生的蛋白量；或者测定mGluR5M或其他基因的活性水平。按这种方法，基因表达模式可以用作标记，表明该细胞对试剂的生理反应。因此，这种反应状态可以在用该试剂对个体进行治疗之前、和治疗期间的各个点进行测定。
在优选的实施方案中，本发明提供一种监测用某种试剂(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白、肽、核酸、小分子，或通过这里所述的筛选分析而鉴别的其他侯选药物)来治疗受试者的效果，该方法包括以下步骤(i)在该试剂给药之前由受试者获得给药前样品；(ii)检测mGluR5M蛋白、mRNA、或基因组DNA在给药前样品中的表达水平；(iii)由受试者获得一个或一个以上给药后样品；(iv)检测给药后样品中mGluR5M或mGluR蛋白、mRNA、或基因组DNA的表达水平或活性；(v)比较给药前样品中mGluR5M或mGluR蛋白、mRNA或基因组DNA与给药后样品中的mGluR5M蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；以及(vi)相应地改变将试剂给予受试者的情况。例如，为了使mGluR5M的表达或活性增加至高于检测的水平，即为了提高该试剂的效果，应该增加该试剂的给药量。或者，为了使mGluR5M的表达或活性减少至低于检测的水平，即为了降低该试剂的效果，应该减少该试剂的给药量。根据这样的实施方案，mGluR5M表达或活性可以作为某种试剂效果的指示剂，甚至在缺乏可观察的表型反应的时候也可以这样。
D.治疗方法对于有患与mGluR5M或mGluR表达或活性有关疾病的危险(或者易患该病)的受试者，或已有该病的受试者，本发明提供了预防的方法和治疗的方法。就治疗和预防的治疗方法而言，这种治疗可以根据“药物基因组学”领域所得的知识进行修改或修饰。这里所用的“药物基因组学”是指基因组技术的应用，例如基因测序，统计遗传学，以及为了药物在临床的开发和市场的基因表达分析。更具体地说，该术语是指病人的基因如何决定他或她对药物反应的研究(例如，病人的“药物反应表型”，或“药物反应基因型”)。因此，本发明的另一方面是提供用本发明的mGluR5M分子或mGluR5M调节剂，根据个体的药物反应基因型来修改个体的预防或治疗方案的方法。药物基因组学使临床医师或医生可以将预防或治疗疗法用于该治疗最受益的病人。并可避免治疗经受与毒性药物有关的副作用的病人。
1、预防方法在一个方面，本发明通过给予受试者予mGluR5M或调节mGluR5M表达、或调节至少一种mGluR5M或mGluR活性的试剂，提供一种使受试者预防与mGluR5M或mGluR表达或活性异常有关的疾病或状况的方法。有患有由mGluR5M表达或活性异常导致或引起的疾病的危险的受试者，可以通过，例如，这里所述的任何一种诊断或预后测定，或其结合来进行鉴定。预防试剂可以在mGluR5M异常的特征性症状出现之前给药，从而可以预防疾病或紊乱，或者，延缓其进展。根据mGluR5M异常类型，例如，可以用mGluR5M、mGluR5M激动剂或mGluR5M拮抗剂来治疗受试者。可以根据这里所述的筛选测定来确定合适的试剂。本发明的预防方法在以下的小节进一步讨论。
2、治疗方法本发明的另一方面是以治疗为目的的调节mGluR5M表达或活性的方法。因此，在典型的实施方案中，本发明的调节方法包括使细胞与本发明的mGluR5M分子接触，从而调节mGluR5M的活性。或者，本发明的调节方法包括使细胞与某种试剂接触，该试剂调节与该细胞有关的一种或一种以上的mGluR5M蛋白的活性。调节mGluR5M蛋白活性的试剂可以是这里所述的试剂，例如核酸或蛋白、天然存在的mGluR5M蛋白的靶分子、mGluR5M抗体、mGluR5M激动剂或拮抗剂、mGluR5M激动剂或拮抗剂的肽模拟物、或其他小分子。在一个实施方案中，该试剂刺激一种或一种以上的mGluR5M活性。这种刺激试剂的例子包括活性mGluR5M蛋白，和已引入该细胞中的编码mGluR5M的核酸分子。在另一个实施方案中，该试剂抑制一种或一种以上的mGluR5M活性。这种抑制试剂的例子包括反义mGluR5M核酸分子和抗mGluR5M抗体。这些调节的方法可以在体外进行(例如，通过将该细胞与试剂一起培养)，或者，在体内进行(例如，将试剂给予受试者)。这样，本发明对患有mGluR5M蛋白或核酸分子的表达或活性异常的疾病或紊乱的个体提供了治疗的方法。在一个实施方案中，该方法包括将试剂(例如由这里所述的筛选测定所鉴定的试剂)，或将调节(例如上调或下调)mGluR5M表达或活性的试剂联合给予受试者。在另一个实施方案中，该方法包括将mGluR5M蛋白或核酸分子施给受试者作为治疗方法，用以补偿mGluR5M表达或活性的减少或异常。
在mGluR5M异常下调，和/或在mGluR5M活性的增加可能产生有利效果(例如，在mGluR活性异常地上调或增加的场合，例如CNS或精神紊乱)的情况下，刺激mGluR5M的活性是合乎需要的。同样，在mGluR5M异常地上调和/或降低mGluR5M活性可能会产生有利效果的情况下，抑制mGluR5M的活性是合乎需要的。
3、药物基因组学本发明的mGluR5M分子，以及试剂，或通过这里所述的筛选测定鉴定为对mGluR5M活性(例如，mGluR5M基因表达)有刺激或抑制作用的调节剂，可以给予个体，用来治疗(预防或治疗)与mGluR5M活性异常有关的紊乱(例如，CNS或精神紊乱)。结合这种治疗，可以对药物基因组学(即，研究个体的基因型与个体对外源化合物或药物的反应之间的关系)加以考虑。治疗方法在代谢上的差别，通过改变药理活性药物的剂量与血液中的浓度之间的关系，会导致严重的毒性或治疗的失败。因此，医生或临床医师在决定是否给予mGluR5M分子或mGluR5M调节剂，以及修改用mGluR5M分子或mGluR5M调节剂治疗的剂量和/或治疗方案时，可以考虑应用在有关药物基因组学的研究中所获得的知识。
药物基因组学涉及在受影响的个体中，由于用药的改变和不正常的作用而引起的对药物的反应在临床上重要的遗传变异。参见，例如Eichelbaum，M.，Clin Exp Pharmacol physiol，1996，23(10-11)983-985和Linder，M.W.，Clin Chem，1997，43(2)254-266。一般，两种类型的药物遗传条件是可以区分的。遗传状况作为改变药物作用于人体的方式的(药物作用的改变)单因子传递，或者遗传状况作为改变人体作用于药物的方式(药物代谢的改变)的单因子传递。这些药物遗传状况可以作为少见的遗传缺陷或作为天然存在的多态性而存在。例如，葡萄糖-6-磷酸氢酶缺乏(G6PD)是一种常见的遗传性酶病，该病主要的临床并发症是摄取氧化剂药物(抗疟药、磺胺类、止痛药、硝基呋喃)和食用蚕豆后的溶血作用。
一种鉴定预测药物反应的基因组学方法，称为“基因组范围的关联”，主要依赖于高分辨率的人类基因组图谱，该图谱包括已知的基因相关标记(例如“双等位”基因标记图谱，它由60,000-100,000个人基因组的多态或可变的位点组成，每种有二个变体)。这种高分辨率的基因图谱可以与每一个数量上达到统计上有意义的参与II/III期药物试验的病人的图谱比较，以鉴定与特定的观察到的药物反应或副作用有关的标记。或者，这样的高分辨率图谱可由人基因组中约1千万个已知的单核苷酸多态性(SNP)的结合而产生。这里所用的“SNP”是发生在一条DNA中单个核苷酸的常见的改变。例如，DNA的每1000个碱基可出现一次SNP。SNP有可能与疾病过程有关，但绝大多数可能不是与疾病有关的。根据这样的SNP的存在而给出的基因图谱，然后可按照个体的基因组中SNP的特定模式，将其分成不同基因类型的组。按照这种方式，考虑到遗传学类似的个体间的共同性状，可以使治疗方案适合于遗传学类似个体组的需要。
或者，可以采用一种称为“侯选基因方法”的方法，来鉴定预测药物反应的基因。按照这种方法，如果已知编码某种药物靶的基因(例如，本发明的mGluR5M蛋白或mGluR5M)，则可以很容易鉴定该基因在该群体中所有的变体，并可确定是否该基因的一种形式转变为另一种形式与特定的药物反应有关。
作为说明实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和作用时间的主要决定因素。药物代谢酶(如，N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的基因多态性的发现，对于为什么有些病人在服用标准而且是安全剂量的药物后不能得到预期的药效，或表现出增大的药物效应或严重的毒性，提供了一种解释。这种多态性在群体中表达为两种表型，广泛代谢者(EM)和不良代谢者(PM)。不同群体间的PM优势是不同的。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态性的，在PM中已鉴定了几种突变，它们都导致缺乏功能性的CYP2D6。CYP2D6和CYP2C19的不良代谢者在其接受标准剂量时，往往经受增大的药物反应和副作用。如果代谢物是活性的治疗组分，PM显示出没有治疗反应，正如对可待因的止痛药效果的证明一样，可待因的止痛效果是由其CYP2D6形成的代谢产物吗啡所介导的。另一个极端是所谓的超速代谢者，他对标准剂量无反应。近来，超速代谢的分子基础已被鉴定为CYP2D6基因的扩增。
另外，一种称为“基因表达分布图”的方法可以用来鉴定预测药物反应的基因。例如，定量给予一种药物(例如，本发明的mGluR5M分子或mGluR5M调节剂)的动物的基因表达可以给出一种指示与毒性有关的基因途径是否已打开。
由上述一种以上的药物基因组学方法所产生的信息可以用来对个体的预防和治疗确定合适的剂量和治疗方案。在用mGluR5M分子或mGluR5M调节剂，例如用这里所述的典型的筛选测定方法之一而鉴定的调节剂来治疗受试者时，将这种知识用于剂量和药物选择，可以避免不良的作用或治疗的失败，从而提高治疗或预防效果。
以下实施例对本发明作进一步的说明，这些实施例将不会构成限制。本申请中所提出的所有参考文献、专利和公开的专利申请内容均在此引入作为参考。对于作为万维网的一部分而维持的站点的即时说明中的参考信息，在此提及时，加上前缀http//。这种站点所包含的信息是可以公开获得的。并可以用电子学方法通过与提到的地址联系而看得到。
实施例实施例1mGluR5M cDNA的鉴定和特征在本实施例中，描述了编码人mGluR5M(在此也可互换称为“YI176”)的基因的鉴定和特征。
人mGluR5M cDNA的分离从来源于成人脑mRNA的cDNA文库(ClonetechTM)中鉴定称为YI176的全长克隆。(部分YI176cDNA也从ClonetechTM海马cDNA文库中分离)。该人的克隆含有约1823bp的插入片段，该片段含有约1110个核苷酸的蛋白编码序列(即可读框)，它能编码mGluR5M的约369个的氨基酸。
编码人mGluR5M蛋白的核苷酸序列如图1所示，并设定为SEQ IDNO1。由该核酸编码的全长蛋白包括约369个氨基酸，其氨基酸序列如图1所示，并设定为SEQ ID NO2。SEQ ID NO1的编码部分(可读框)设定为SEQ ID NO3。
人mGluR5M的分析人mGluR5M的氨基酸序列的BLAST检索(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol 215403)表明，mGluR5M明显类似于人的促代谢谷氨酸受体(mGluR5)的N末端。特别是，鉴定的mGluR5M蛋白含有与mGluR5蛋白N端的胞外结合结构域几乎相同的N末端(例如，SwissProtTM编号NO.P41594)。mGluR5M的1-303位氨基酸与mGluR5a和/或mGluR5b的N端胞外结构域的同一性为约97％。相反，根据BLAST分析确定，氨基酸304-369是独特的。
更新的BLAST检索鉴定出称为RNF18的cDNA(睾丸特异性环指蛋白，GenBank编号为AB037682(Yoshikawa等(2000)BBA1493349-355))与YI176在3’端有同一性。此外，已有报道，EST含有跨YI176/mGluR5区域的序列(GBESTHUM3_RELBE674422和GBESTHUM3_RELBE467477)，证明了YI176代表真正的mRNA(与人工合成的文库，例如人工的mGluR5相反)。
Prosite检索鉴定出在SEQ ID NO2的约158-176位氨基酸为G蛋白受体家族3_1共有序列。还预测mGluR5M在SEQ ID NO2的约88-91和210-213位氨基酸含有天冬酰胺糖基化位点。
mGluR5M mRNA的组织分布本实施例描述mGluR5M mRNA用Northern印迹分析确定的组织分布。
对各种RNA样品按下述进行Northern印迹杂交。采用制造商的方案和32P-标记的DNA探针对Clonetech Human Multple TissueNorthernsTM和Human Multiple Tissue ArrayTM膜进行探测。含有YI176特异性序列(SEQ ID NO1的959-1103和1481-1846位核苷酸)的探针按下法制备。用QIAprep Spin MiniprepTM试剂盒和制造商的方案，由分离的YI176菌落制备质粒DNA，然后该DNA用Pstl和NotI或BglII和ApaI按照制造商的说明进行限制性消化。限制性片段在1.5％琼脂糖、0.1μg/ml溴乙锭、1x凝胶(Maniatis等，1982)的条件下凝胶电泳，进行大小分级。将合适大小的(PstI/NotI～365bp；BglII/ApaI～144bp)溴乙锭染色的DNA带从凝胶上切下。然后用Clonetech NucleospinTM核酸纯化试剂盒，按照制造商的方案从琼脂糖上提取DNA。用Prime-ItIITM随机引物标记试剂盒，并按其使用方法，用RediveTM(α-32P)dCTP标记提取的DNA。用Amersham的NICKTM柱，并按其使用方案除去未掺入的(α-32P)dCTP。先将膜预杂交，以封闭非特异结合的相互作用，随后用适量的一份32P标记的YI176探针在标准条件下杂交，杂交和洗涤后将膜在空气中干燥，置于X光片下，然后显影和分析。
根据Multiple Tissus NorthernTM分析未检测到条带。但是Multipe Tissal ArrayTM膜表明YI176在神经内表达而不是在心脏或其他非神经组织内表达。除了进一步的Northern分析所得的数据以外，上述这些数据表明，在全脑、大脑皮质、额叶，顶叶、枕叶、颞叶、大脑皮质的中央旁回、脑桥、小脑、胼胝体、扁桃体、尾状核、海马、延髓、壳豆状核、黑质、伏隔核、丘脑和胎儿脑中可检测到mGluR5MmRNA。值得注意，在中枢神经系统的细胞和/或组织中的表达是占主要优势的。
实施例2mGluR5M cDNA的鉴定和特征在本实施例中，描述了编码人mGluR5M基因(这里也可互换称为“YI176”)的染色体图谱的绘制。
用适合的相关询问序列，通过HTGS数据库的BLASTTM检索，确定YI176和mGluR5的染色体位置。这些分析表明，mGluR5绘制在分配至染色体11的BAC上，YI176绘制在分配至染色体11和染色体3的BAC上。其中有重要意义的是至少一些编码YI176的BAC绘制在染色体11的区域。该区域最近被鉴定为受到平衡易位事件的影响的区域之一，该事件与精神分裂症及相关的精神紊乱有关(Millar等，(2000)Hum.Mol.Genet 91415-1423)。特别是Millar及其同事描述了平衡(1，11)(q 42.1q 14.3)易位，该平衡易位与在所研究的苏格兰大家族的精神分裂症及相关的精神紊乱分离。Millar及其同事分析了在染色体1上的受影响区，尤其是描述了两种新的基因，即在精神分裂中破坏(Disrupted-In-Schizophrenia)的1和2(DISC1和DISC2)，认为该两种基因在神经系统功能和/或在精神病易感性中起作用。Miller及其同事将受影响的染色体11区域的特征描述为在断裂点区基因的死亡，并得出结论未必任何在该染色体上的基因的表达都受到易位的影响。上述绘制染色体图谱的数据(例如，放射性杂交图谱)，YI176mRNA的特定表达模式，以及基因组的预测表明该基因是精神分裂症和/或精神紊乱的侯选基因。
实施例3YI176的放射性杂交图谱放射性杂交的作图采用GeneBridge 4放射杂交板(目录号RH02.02Research Genetics，Inc)和制造商的方案进行。简单地说，用引物5’TGCTGCTGCACATGCCCC和5’TTAGATGAGCCTGTCCCTCAGTCC以及来源于每个体细胞杂交体克隆的模板DNA进行聚合酶链反应(PCR)。反应混合物由以下终浓度的组分组成50ng DNA，每种8pmol；dATP，dTTP，dCTP和dGTP(Amersham pharmacia)各0.2μM；1单位AmpliTaqGoldTM聚合物酶；1x反应缓冲液(AppliedBiosystems)；2.5mM MgC12。混合物在95℃温育10分钟，然后进行30个循环的94℃30秒，65℃30秒，72℃23秒(MJResearch DNA EngineTetrad PTC-225)。将PCR扩增产物在3％琼脂糖，1xTAE凝胶上进行大小分离(Maniatis等)。记录每种体细胞杂交体克隆的PCR产物是否存在。结果递交至http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.p1或http//www.sanger.ac.uk/software/Rhserver/Rhserver.shtml进行RH作图。MIT作图服务器将该基因指定在染色体11，距离标记D11 S1350为31.33CR。Sanger作图服务器将该基因指定在染体11，在标记AFMa 131xd5和AFM344zgl之间。
实施例4重组YI176蛋白在HEK293细胞中的表达用InvitrogenTMFLP-IN系统，按照制造商的说明，将YI176cDNA稳定地转染到HEK293细胞中。如由序列分析所预测，在培养基中可检测到YI176蛋白(用于检测的标记表位)，确认已分泌出该蛋白。
实施例5重组YI176蛋白和mGlu5的异二聚体形成按照制造商的说明，用Lipofectamine PlusTM系统(InVitrogen)瞬时共转染至HEK293细胞。样品1用编码V5标记的分泌型mGluR5(含有包括细胞外结构域但缺少跨膜结构域的mGluR5残基1-576)的cDNA，这里称为rtV5，和全长(FL)mGluR5的cDNA共转染的细胞。样品2用rtV5单独转染的细胞。样品3用YI176-V5(标记的YI176)单独转染的细胞。样品4用YI176-V5和FL mGluR5共转染的细胞。样品5用FL mGluR5单独转染的细胞。样品6模拟转染的细胞。
根据已确定的方案由转染的细胞制备细胞膜组分，即细胞裂解后，通过洗涤、离心步骤，分离胞质、核和膜组分。用抗mGluR5抗体通过免疫沉淀，从细胞膜组分中免疫沉淀出蛋白，然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。用抗V5标记的特异性抗体进行Western印迹分析。结果在表1中列出。
表I用抗mGluR5的抗体免疫沉淀、用抗V5抗体的Western印迹
在样品1中检测到V5标记的(分泌的)mGluR5FL mGluR5复合物，表明标记的(分泌的)mGluR5与细胞膜中表达的FL mGluR4受体的二聚化。值得注意，YI176FL mGluR5复合物也同样在样品4中检测到，证明YI176能够与在细胞膜中表达的FL mGluR5二聚化。
等同方案本领域的技术人员使用不超出常规的实验方法会知道，或者可以确定到很多与这里所述的本发明实施方案等同的方案。这种等同的方案可认为包括在下述的权利要求内。
序列表<110>惠氏公司<120>新的谷氨酸受体调节蛋白和核酸分子及其用途<130>AM100369PCT<140>
<141>
<150>60/257,589<151>2000-12-22<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1823<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
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Ser Cys Thr Phe Tyr Ala Phe Lys Thr Arg Asn Val Pro Ala Asn Phe755 760 765Asn Glu Ala Lys Tyr Ile Ala Phe Thr Met Tyr Thr Thr Cys Ile Ile770 775 780Trp Leu Ala Phe Val Pro Ile Tyr Phe Gly Ser Asn Tyr Lys Ile Ile785 790 795 800Thr Met Cys Phe Ser Val Ser Leu Ser Ala Thr Val Ala Leu Gly Cys805 810 815Met Phe Val Pro Lys Val Tyr Ile Ile Leu Ala Lys Pro Glu Arg Asn820 825 830Val Arg Ser Ala Phe Thr Thr Ser Thr Val Val Arg Met His Val Gly835 840 845Asp Gly Lys Ser Ser Ser Ala Ala Ser Arg Ser Ser Ser Leu Val Asn850 855 860Leu Trp Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Glu Thr Leu Arg Tyr Lys Asp865 870 875 880Arg Arg Leu Ala Gln His Lys Ser Glu Ile Glu Cys Phe Thr Pro Lys885 890 895Gly Ser Met Gly Asn Gly Gly Arg Ala Thr Met Ser Ser Ser Asn Gly900 905 910Lys Ser Val Thr Trp Ala Gln Asn Glu Lys Ser Ser Arg Gly Gln His915 920 925Leu Trp Gln Arg Leu Ser Ile His Ile Asn Lys Lys Glu Asn Pro Asn930 935 940Gln Thr Ala Val Ile Lys Pro Phe Pro Lys Ser Thr Glu Ser Arg Gly945 950 955 960Leu Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gly Val Gly Ala965 970 975Thr Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Pro Gly Gly Pro Glu Ser980 985 990Pro Asp Ala Gly Pro Lys Ala Leu Tyr Asp Val Ala Glu Ala Glu Glu9951000 1005
His Phe Pro Ala Pro Ala Arg Pro Arg Ser Pro Ser Pro Ile Ser Thr101010151020Leu Ser His Arg Ala Gly Ser Ala Ser Arg Thr Asp Asp Asp Val Pro1025 103010351040Ser Leu His Ser Glu Pro Val Ala Arg Ser Ser Ser Ser Gln Gly Ser104510501055Leu Met Glu Gln Ile Ser Ser Val Val Thr Arg Phe Thr Ala Asn Ile106010651070Ser Glu Leu Asn Ser Met Met Leu Ser Thr Ala Ala Pro Ser Pro Gly107510801085Val Gly Ala Pro Leu Cys Ser Ser Tyr Leu Ile Pro Lys Glu Ile Gln109010951100Leu Pro Thr Thr Met Thr Thr Phe Ala Glu Ile Gln Pro Leu Pro Ala1105 111011151120Ile Glu Val Thr Gly Gly Ala Gln Pro Ala Ala Gly Ala Gln Ala Ala112511301135Gly Asp Ala Ala Arg Glu Ser Pro Ala Ala Gly Pro Glu Ala Ala Ala114011451150Ala Lys Pro Asp Leu Glu Glu Leu Val Ala Leu Thr Pro Pro Ser Pro115511601165Phe Arg Asp Ser Val Asp Ser Gly Ser Thr Thr Pro Asn Ser Pro Val117011751180Ser Glu Ser Ala Leu Cys Ile Pro Ser Ser Pro Lys Tyr Asp Thr Leu1185 119011951200Ile Ile Arg Asp Tyr Thr Gln Ser Ser Ser Ser Leu12051210<210>5<211>1203<212>PRT<213>大鼠(Rattus sp.)<400>5Met Val Leu Leu Leu Ile Leu Ser Val Leu Leu Leu Lys Glu Asp Val
1 5 10 15Arg Gly Ser Ala Gln Ser Ser Glu Arg Arg Val Val Ala His Met Pro20 25 30Gly Asp Ile Ile Ile Gly Ala Leu Phe Ser Val His His Gln Pro Thr35 40 45Val Asp Lys Val His Glu Arg Lys Cys Gly Ala Val Arg Glu Gln Tyr50 55 60Gly Ile Gln Arg Val Glu Ala Met Leu His Thr Leu Glu Arg Ile Asn65 70 75 80Ser Asp Pro Thr Leu Leu Pro Asn Ile Thr Leu Gly Cys Glu Ile Arg85 90 95Asp Ser Cys Trp His Ser Ala Val Ala Leu Glu Gln Ser Ile Glu Phe100 105 110Ile Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Glu Glu Glu Glu Gly Leu Val Arg115 120 125Cys Val Asp Gly Ser Ser Ser Phe Arg Ser Lys Lys Pro Ile Val Gly130 135 140Val Ile Gly Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Ile Gln Val Gln Asn Leu145 150 155 160Leu Gln Leu Phe Asn Ile Pro Gln Ile Ala Tyr Ser Ala Thr Ser Met165 170 175Asp Leu Ser Asp Lys Thr Leu Phe Lys Tyr Phe Met Arg Val Val Pro180 185 190Ser Asp Ala Gln Gln Ala Arg Ala Met Val Asp Ile Val Lys Arg Tyr195 200 205Asn Trp Thr Tyr Val Ser Ala Val His Thr Glu Gly Asn Tyr Gly Glu210 215 220Ser Gly Met Glu Ala Phe Lys Asp Met Ser Ala Lys Glu Gly Ile Cys225 230 235 240Ile Ala His Ser Tyr Lys Ile Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Gln Ser Phe245 250 255Asp Lys Leu Leu Lys Lys Leu Arg Ser His Leu Pro Lys Ala Arg Val
260 265 270Val Ala Cys Phe Cys Glu Gly Met Thr Val Arg Gly Leu Leu Met Ala275 280 285Met Arg Arg Leu Gly Leu Ala Gly Glu Phe Leu Leu Leu Gly Ser Asp290 295 300Gly Trp Ala Asp Arg Tyr Asp Val Thr Asp Gly Tyr Gln Arg Glu Ala305 310 315 320Val Gly Gly Ile Thr Ile Lys Leu Gln Ser Pro Asp Val Lys Trp Phe325 330 335Asp Asp Tyr Tyr Leu Lys Leu Arg Pro Glu Thr Asn Leu Arg Asn Pro340 345 350Trp Phe Gln Glu Phe Trp Gln His Arg Phe Gln Cys Arg Leu Glu Gly355 360 365Phe Ala Gln Glu Asn Ser Lys Tyr Asn Lys Thr Cys Asn Ser Ser Leu370 375 380Thr Leu Arg Thr His His Val Gln Asp Ser Lys Met Gly Phe Val Ile385 390 395 400Asn Ala Ile Tyr Ser Met Ala Tyr Gly Leu His Asn Met Gln Met Ser405 410 415Leu Cys Pro Gly Tyr Ala Gly Leu Cys Asp Ala Met Lys Pro Ile Asp420 425 430Gly Arg Lys Leu Leu Asp Ser Leu Met Lys Thr Asn Phe Thr Gly Val435 440 445Ser Gly Asp Met Ile Leu Phe Asp Glu Asn Gly Asp Ser Pro Gly Arg450 455 460Tyr Glu Ile Met Asn Phe Lys Glu Met Gly Lys Asp Tyr Phe Asp Tyr465 470 475 480Ile Asn Val Gly Ser Trp Asp Asn Gly Glu Leu Lys Met Asp Asp Asp485 490 495Glu Val Trp Ser Lys Lys Asn Asn Ile Ile Arg Ser Val Cys Ser Glu500 505 510Pro Cys Glu Lys Gly Gln Ile Lys Val Ile Arg Lys Gly Glu Val Ser
515 520 525Cys Cys Trp Thr Cys Thr Pro Cys Lys Glu Asn Glu Tyr Val Phe Asp530 535 540Glu Tyr Thr Cys Lys Ala Cys Gln Leu Gly Ser Trp Pro Thr Asp Asp545 550 555 560Leu Thr Gly Cys Asp Leu Ile Pro Val Gln Tyr Leu Arg Trp Gly Asp565 570 575Pro Glu Pro Ile Ala Ala Val Val Phe Ala Cys Leu Gly Leu Leu Ala580 585 590Thr Leu Phe Val Thr Val Ile Phe Ile Ile Tyr Arg Asp Thr Pro Val595 600 605Val Lys Ser Ser Ser Arg Glu Leu Cys Tyr Ile Ile Leu Ala Gly Ile610 615 620Cys Leu Gly Tyr Leu Cys Thr Phe Cys Leu Ile Ala Lys Pro Lys Gln625 630 635 640Ile Tyr Cys Tyr Leu Gln Arg Ile Gly Ile Gly Leu Ser Pro Ala Met645 650 655Ser Tyr Ser Ala Leu Val Thr Lys Thr Asn Arg Ile Ala Arg Ile Leu660 665 670Ala Gly Ser Lys Lys Lys Ile Cys Thr Lys Lys Pro Arg Phe Met Ser675 680 685Ala Cys Ala Gln Leu Val Ile Ala Phe Ile Leu Ile Cys Ile Gln Leu690 695 700Gly Ile Ile Val Ala Leu Phe Ile Met Glu Pro Pro Asp Ile Met His705 710 715 720Asp Tyr Pro Ser Ile Arg Glu Val Tyr Leu Ile Cys Asn Thr Thr Asn725 730 735Leu Gly Val Val Thr Pro Leu Gly Tyr Asn Gly Leu Leu Ile Leu Ser740 745 750Cys Thr Phe Tyr Ala Phe Lys Thr Arg Asn Val Pro Ala Asn Phe Asn755 760 765Glu Ala Lys Tyr Ile Ala Phe Thr Met Tyr Thr Thr Cys Ile Ile Trp
770 775 780Leu Ala Phe Val Pro Ile Tyr Phe Gly Ser Asn Tyr Lys Ile Ile Thr785 790 795 800Met Cys Phe Ser Val Ser Leu Ser Ala Thr Val Ala Leu Gly Cys Met805 810 815Phe Val Pro Lys Val Tyr Ile Ile Leu Ala Lys Pro Glu Arg Asn Val820 825 830Arg Ser Ala Phe Thr Thr Ser Thr Val Val Arg Met His Val Gly Asp835 840 845Gly Lys Ser Ser Ser Ala Ala Ser Arg Ser Ser Ser Leu Val Asn Leu850 855 860Trp Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Glu Thr Leu Arg Tyr Lys Asp Arg865 870 875 880Arg Leu Ala Gln His Lys Ser Glu Ile Glu Cys Phe Thr Pro Lys Gly885 890 895Ser Met Gly Asn Gly Gly Arg Ala Thr Met Ser Ser Ser Asn Gly Lys900 905 910Ser Val Thr Trp Ala Gln Asn Glu Lys Ser Thr Arg Gly Gln His Leu915 920 925Trp Gln Arg Leu Ser Val His Ile Asn Lys Lys Glu Asn Pro Asn Gln930 935 940Thr Ala Val Ile Lys Pro Phe Pro Lys Ser Thr Glu Asn Arg Gly Pro945 950 955 960Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Pro Gly Val Ala Gly Ala Gly965 970 975Asn Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Pro Glu Pro Pro Asp Ala Gly980 985 990Pro Lys Ala Leu Tyr Asp Val Ala Glu Ala Glu Glu Ser Phe Pro Ala99510001005Ala Ala Arg Pro Arg Ser Pro Ser Pro Ile Ser Thr Leu Ser His Leu101010151020Ala Gly Ser Ala Gly Arg Thr Asp Asp Asp Ala Pro Ser Leu His Ser
1025 103010351040Glu Thr Ala Ala Arg Ser Ser Ser Ser Gln Gly Ser Leu Met Glu Gln104510501055Ile Ser Ser Val Val Thr Arg Phe Thr Ala Asn Ile Ser Glu Leu Asn106010651070Ser Met Met Leu Ser Thr Ala Ala Thr Pro Gly Pro Pro Gly Thr Pro107510801085Ile Cys Ser Ser Tyr Leu Ile Pro Lys Glu Ile Gln Leu Pro Thr Thr109010951100Met Thr Thr Phe Ala Glu Ile Gln Pro Leu Pro Ala Ile Glu Val Thr1105 111011151120Gly Gly Ala Gln Gly Ala Thr Gly Val Ser Pro Ala Gln Glu Thr Pro112511301135Thr Gly Ala Glu Ser Ala Pro Gly Lys Pro Asp Leu Glu Glu Leu Val114011451150Ala Leu Thr Pro Pro Ser Pro Phe Arg Asp Ser Val Asp Ser Gly Ser115511601165Thr Thr Pro Asn Ser Pro Val Ser Glu Ser Ala Leu Cys Ile Pro Ser117011751180Ser Pro Lys Tyr Asp Thr Leu Ile Ile Arg Asp Tyr Thr Gln Ser Ser1185 119011951200Ser Ser Leu<210>6<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_特征<222>1<223>Leu或Val<220>
<221>misc_特征
<222>4-5<223>Leu，Ile，Val或Met<220>
<221>misc_特征<222>11<223>Pro或Ala<220>
<221>misc_特征<222>13<223>Leu，Ile，Val或Met<220>
<221>misc_特征<222>14<223>Ser，Thr或Ala<220>
<221>misc_特征<222>16-18<223>Ser，Thr或Ala<220>
<221>misc_特征<222>19<223>Ser，Thr，Ala或Asn<220>
<223>人工序列说明共有序列<400>6Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Leu Phe Xaa Ile Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa-1-
权利要求
1.一种分离的核酸分子，它含有与SEQ ID NO3的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列，其中的核酸分子编码包含N端mGluR样结构域和C端独特结构域的多肽。
2.权利要求1所述的核酸分子，它含有与SEQ ID NO3的核苷酸序列至少有90％同一性的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的核酸分子，它含有与SEQ ID NO3的核苷酸序列至少有95％同一性的核苷酸序列。
4.一种分离的核酸分子，它编码含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中的多肽包含N端mGluR样结构域和C端独特结构域。
5.一种分离的核酸分子，它编码含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中的多肽缺失跨膜结构域。
6.一种分离的核酸分子，它编码含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中的同一性百分数用总体比对算法确定。
7.权利要求6所述的核酸分子，其中的同一性百分数采用PAM120权重余数表，空位长度罚分为12，空位罚分为4，按照ALIGN算法来确定。
8.权利要求4-7中任何一项所述的核酸分子，其中所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有90％同一性。
9.权利要求4-7中任何一项所述的核酸分子，其中所编码的氨基酸序列与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有95％同一性。
10.一种在严格条件下与含有SEQ ID NO3的核酸分子的互补序列杂交的分离的核酸分子，其中的核酸分子编码含有N端mGluR样结构域和C端独特结构域的多肽。
11.一种在严格条件下与含有SEQ ID NO1的核酸分子的互补序列杂交的分离的核酸分子，其中的核酸分子编码缺失跨膜结构域的多肽。
12.一种分离核酸分子，它含有保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段。
13.一种含有SEQ ID NO1的核苷酸序列、或其互补序列的分离的核酸分子。
14.一种分离的核酸分子，它编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
15.权利要求1、4-6和10-14中任何一项所述的核酸分子，进一步含有载体核酸序列。
16.权利要求1、4-6和10-14中任何一项所述的核酸分子，进一步含有编码异源多肽的核酸序列。
17.含有权利要求1、4-6和10-14中任何一项所述的核酸分子的宿主细胞。
18.权利要求17所述的宿主细胞，该细胞为哺乳动物宿主细胞。
19.一种非人的哺乳动物宿主细胞，该细胞含有权利要求1、4-6和10-14中任何一项所述的核酸分子。
20.一种分离的多肽，它由含有与SEQ ID NO3的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列的核酸分子编码，其中的多肽含有N端mGluR样结构域和C端独特结构域。
21.权利要求20所述的多肽，它由含有与SEQ IDNO3的核苷酸序列至少有90％同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。
22.权利要求20所述的多肽，它由含有与SEQ ID NO3的核苷酸序列至少有95％同一性的核苷酸序列的核酸分子编码。
23.一种分离的多肽，它含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列，其中的多肽含有N端mGluR样结构域和C端独特结构域。
24.一种分离的多肽，它含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列，其中的多肽缺失跨膜结构域。
25.一种分离的多肽，它含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列，其中的同一性百分数用总体比对算法确定。
26.权利要求25所述的多肽，其中的同一性百分数采用PAM120权重余数表、空位长度罚分为12、空位罚分为4，按照ALIGN算法来确定。
27.权利要求23-26中任何一项所述的多肽，该多肽含有与SEQID NO2的氨基酸序列至少有90％同一性的氨基酸序列。
28 权利要求23-26中任何一项所述的多肽，该多肽含有与SEQID NO2的氨基酸序列至少有95％同一性的氨基酸序列。
29.一种由核酸分子编码的分离的多肽，该核酸分子在严格条件下与含有SEQ ID NO1的核酸分子的互补序列杂交，其中的多肽含有N端mGluR样结构域和C端独特结构域。
30.一种由核酸分子编码的分离的多肽，该核酸分子在严格条件下与含有SEQ ID NO1的核酸分子的互补序列杂交，其中的核酸分子编码缺失跨膜结构域的多肽。
31.一种由保藏在ATCC，保藏号为PTA-2775的质粒的DNA插入片段编码的分离的多肽。
32.一种由包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子编码的分离的多肽。
33.一种含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
34.权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽，进一步含有异源的氨基酸序列。
35.一种与权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽选择性地结合的抗体。
36.一种生产由权利要求1、4-6和10-14中任何一项所述的核酸分子编码的多肽的方法，包括在该核酸分子表达的条件下，培养含有该核酸分子的宿主细胞。
37.一种检测样品中权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽的存在的方法，包括a)使样品与选择性地和该多肽结合的化合物接触；以及b)测定该化合物是否与样品中的多肽结合，由此检测样品中该多肽的存在。
38.权利要求37所述的方法，其中与所述多肽结合的化合为抗体。
39.一种含有与权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽选择性地结合的化合物及使用说明书的试剂盒。
40.一种检测样品中权利要求1、4-6和10-14中任何一项所述的核酸分子的存在的方法，包括a)使样品与选择性地和该核酸分子杂交的核酸探针或引物接触；以及b)测定该核酸探针或引物是否与样品中的核酸分子结合，由此检测样品中该核酸分子的存在。
41.权利要求40所述的方法，其中的样品含有mRNA分子，并与核酸探针接触。
42.一种含有与权利要求1、4-6和10-14中任何一项所述的核酸分子选择性地杂交的化合物及使用说明书的试剂盒。
43.一种鉴定调节细胞中mGluR活性的化合物的方法，包括a)使表达mGluR的细胞与权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽和受检化合物接触；以及b)与合适的对照比较，测定该受检化合物是否调节该多肽的调节mGluR活性的能力。
44.一种调节mGluR活性的方法，包括使表达mGluR的细胞与足够调节mGluR活性的浓度的权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽、或所说的多肽的调节剂接触。
45.一种调节神经元细胞信号传递的方法，包括使神经元细胞与足够调节至少一种神经元细胞信号传递途径的浓度的权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽、或所说的多肽的调节剂接触。
46.权利要求45所述的方法，其中的神经元细胞表达mGluR受体。
47.权利要求46所述的方法，其中的mGluR5受体为mGluR5a或mGluR5b。
48.一种治疗有神经障碍的受试者的方法，包括给予所说的受试者有效量的权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽、或所说的多肽的调节剂，从而治疗神经障碍。
49.一种治疗有精神障碍的受试者的方法，包括给予所说的受试者有效量的权利要求20、23-25和29-33中任何一项所述的多肽、或所说的多肽的调节剂，从而治疗精神障碍。
50.权利要求49所述的方法，其中的精神障碍是精神分裂症。
51.权利要求49所述的方法，其中的精神障碍是分裂情感性障碍。
52.权利要求49所述的方法，其中的精神障碍是两极情感性障碍。
53.权利要求49所述的方法，其中的精神障碍是单极情感性障碍。
54.权利要求49所述的方法，其中的精神障碍是青春期行为障碍。
55.权利要求44所述的方法，其中的调节剂选自mGluR5M核酸分子、mGluR5M抗体或活性抗体片段、核酶、反义核酸分子、小分子调节剂、肽和肽模拟物。
56.权利要求45所述的方法，其中的调节剂选自mGluR5M核酸分子、mGluR5M抗体或活性抗体片段、核酶、反义核酸分子、小分子调节剂、肽和肽模拟物。
57.权利要求48所述的方法，其中的调节剂选自mGluR5M核酸分子、mGluR5M抗体或活性抗体片段、核酶、反义核酸分子、小分子调节剂、肽和肽模拟物。
58.权利要求49所述的方法，其中的调节剂选自mGluR5M核酸分子、mGluR5M抗体或活性抗体片段、核酶、反义核酸分子、小分子调节剂、肽和肽模拟物。
全文摘要
公开了新的mGluR5M多肽、蛋白、和核酸分子。除了分离的、全长mGluR5M蛋白以外，本发明进一步提供分离的mGluR5M融合蛋白、抗原肽、和抗mGluR5M抗体。本发明还提供mGluR5M核酸分子、含有本发明的核酸分子的重组载体、引入了该重组载体的宿主细胞、以及已引入了mGluR5M基因，或其mGluR5M基因已被破坏的非人类的转基因动物。还提供了利用本发明的化合物进行诊断、筛选和治疗的方法。
文档编号A61K31/7088GK1714151SQ01822806
公开日2005年12月28日 申请日期2001年12月21日 优先权日2000年12月22日
发明者B·G·巴特斯, Y·谢, K·古卢科塔, J·E·保尔森 申请人:惠氏公司