专利名称：一种体内可降解的复合肝支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种体内可降解的复合肝支架及其制备方法，属生物工程材料技术领域。
工程科学与材料科学交叉与融合产生了组织工程学langer R and Vacanti JP.Science，1993；260920-926。它的基本实施途径是在外源三维细胞支架(ECM)上接种细胞，以形成新的组织或器官。这种三维支架可利用两类生物材料制备天然生物材料及其衍生物与合成高分子聚合物。天然生物材料如胶原，具有与细胞特异性相互作用的优点，但存在力学强度低、制备过程中批与批材料间性能差异较大的特点。与天然材料比，合成高分子具有力学强度高，易于大规模生产、材料强度及降解速率可控制等优点，但也存在材料表面没有细胞识别位点的最大缺点Kim SB and Mooney DJ.Trends In Biotech，1998；16224-230。正如Radtner教授Rouhi AM.Chemical Engineering News，1999；77(3)51-59在美国“当代生物材料会议上所指出尽管近30年来生物材料的研究取得了较大的进步，但其在临床应用方面却是失败的。究其原因则是人们在开发、研究生物材料的过程中仅从材料力学强度、降解性能等方面考虑，而没有从材料的生理反应等方面去设计。
目前存在的人工肝系统可分为三大类第一类是通过血液灌流或血液滤过除去血液中的有毒成分，以期使肝病症状改善。这类装置没有将肝脏的合成、分泌等功能考虑在内，虽然在一定时间内对病人有一定的疗效，但因不能提高病人的存活率，未被人们普遍接受。第二类为生物人工肝支持系统(Sorrentino F.Prime ricerche per larealization di un fegatoartificiale.Chir.Patol.Sper.1956，41401-1414)。利用动物或人的肝细胞、肝组织或者整个肝脏来对肝衰病人进行治疗。缺点是这类外源肝细胞一旦与人体组织接触，就会发生免疫排斥反应，其应用也受到很大的限制。第三类是由生物和非生物两部分组成的杂化人工肝支持系统，包括生物和非生物两部分。生物部分最理想的材料是人的原代肝细胞，研究较多的细胞株有C3A细胞Olumide F，Eliashiv A，Kralios N，et al.Hepatic support withhepatocyte suspension in a permeable membrane dialyzer.Surgery，1997；82559-606、HepG2细胞，动物细胞主要有大鼠肝细胞和猪肝细胞。非生物部分是由微载体、中空纤维管组成的灌流器。通过细胞和高分子材料的相互作用，使细胞结合到高分子上，并保持肝细胞特有的分化功能。这些反应装置只能在体外起到辅助肝脏的使用，而且受到癌细胞的安全性、反应器制作工艺的复杂性及所能容纳细胞数量等的种种限制，还不能完全替代肝组织的功能。天然或合成高分子材料如胶原、壳聚糖、半乳酸海藻酸钠、聚乳酸等曾被用于体外肝细胞的培养或用作人工皮肤、人工骨的制备，证明其细胞的相容性及体内的安全性。但用于体内的可降解的人工肝支架材料还未见报道。因此，研制一种能够提供正常肝脏复杂的合成、代谢、解毒、分泌、排泄功能的人工肝仍是一个重要的前沿性课题。
本发明所述的复合肝支架呈纺锤形。
一种制备体内可降解的复合肝支架方法，其特征在于该方法依次包括以下步骤(1)用具有一定强度的细丝制成多层纺锤形模具，将模具放入与模具外型相吻合的容器中，并在容器中加入细胞相容性好的可降解高分子溶液，冻干后从容器中取出，即可制得纺锤形海绵体6；(2)在上述制备的海绵体6的外壁上涂一层可降解高分子溶液，然后放入交联剂中浸泡；湿态下抽出其中的细丝，形成外层为致密层7，内层带多管道5、多孔的、可接种细胞及细胞生长因子的支持体；(3)在上述支持体的外壁上再涂一层可降解高分子溶液，冻干、再交联，即可制得复合支持体；(4)在复合支持体外部细胞培养液入口1和培养液出口2之间包覆一层可溶解的凝胶态物质，同时预制血液入口3和血液出口4；(5)在上述制得的支持体的外壁再涂一层可降解高分子溶液，待溶剂挥发后，即在支持体外围形成外套9；(6)将上述复合支持体放入去离子水中，溶解掉其中的凝胶态物质，在外套9内形成血液空腔8，经干燥后即可制得多管道、多层次的复合肝支架材料；(7)将上述制得的复合肝支架材料在抗凝血药物中浸泡，然后在丙酮浓度依次递减的水溶液中缩聚，即可制得抗凝血的多管道、多层次的复合支架材料。
在上述制备方法中，步骤(1)所述的细丝为细金属丝或细塑料丝。
在上述制备方法中，步骤(1)、(2)、(3)所述的可降解高分子溶液为胶原盐(醋)酸溶液、明胶水溶液、明胶与海藻酸钠混合液、胶原与海藻酸钠混合液、胶原与半乳酸海藻酸钠混合液(海藻酸钠中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)、壳聚糖醋酸溶液、壳聚糖/胶原混合液、壳聚糖/明胶混合液、壳聚糖/海藻酸钠混合液的任意一种。
在上述制备方法中，所述的可降解高分子溶液中还可复合细胞(如肝细胞、内皮细胞)生长因子(HGF)、转移生长因子(TGF-α)。以促进细胞生长、防止细胞癌变。
在上述制备方法中，步骤(2)与(3)中所述的交联剂对于可降解高分子为胶原、明胶类蛋白质的溶液，交联剂可选择1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐/丙酮体系或1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐/2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸体系；对于可降解高分子为含海藻酸钠或半乳酸-1，4-乙二氨基海藻酸钠的溶液，交联剂还可选择乙二胺/1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐/氯化钙体系。对于只含可降解高分子壳聚糖的溶液，不需交联。
在上述制备方法中，步骤(1)、(2)、(3)、(5)中可直接将抗凝血药物复合在可降解高分子溶液中，然后按步骤(6)进行，即可制得抗凝血的多管道、多层次的复合支架材料。
在上述制备方法中，步骤(5)中所述的可降解高分子溶液可采用聚乳酸、聚乳酸/与聚羟基乙酸、聚乳酸/聚己内酯共聚物的1，4-二氧六环或氯仿溶液中的任一种。
由于本发明所使用的生物材料既具有一定的机械强度与韧性，又具有非常好的细胞、血液相容性。多管道、多层复合结构至少可维持在一个月以上，内皮细胞与肝细胞可以在支架的管道与孔隙中充分生长、分裂。以利于后期体内植入时微血管的形成及对肝细胞数量的要求。
下面结合附图
具体说明本发明的一种体内可降解的复合肝支架及其制备方法。
本发明的一种体内可降解的复合肝支架主要包括由可降解高分子材料制成的培养液入口1，培养液出口2，血液入口3，血液出口4，其内部带管道5的海绵体6，致密层7，血液空腔8以及外套9。
本发明的一种体内可降解的复合肝支架制备方法为本发明使用的明胶、海藻酸钠、盐酸、丙酮、1、4-二氧六环、肝素钠、氯化钠均为分析纯，由北京化工试剂店购买。I型胶原蛋白由北京挚友酒精制品厂购买。金属丝(不锈钢丝、铜丝、钨丝)、聚丙稀睛纤维、聚丙烯纤维、聚乳酸、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸与聚己内脂共聚物、壳聚糖(脱乙酰度DD为78％，分子量Mw为4.15×105)、半乳酸-1，4-乙二氨基海藻酸钠(海藻酸钠中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)由山东或上海医疗器械厂购买。2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸(MES)为美国，Sigma公司产品。1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC HCI)为上海伯奥生物科技有限公司产品。冻干机(Labconco型，德国)。孔径、孔隙率的测定采用压汞仪(Quantachrome Autosorb-60，American)，压力范围0～400MPa。(1)纺锤形多管道海绵体的制备取直径为0.1～1mm、长3～6cm的细丝数(10～20)根，两端用细线紧密缠绕成束，然后由外向内用镊子逐层弯曲成纺锤形模具。将模具放入两头细(直径3～10mm)、中间粗(直径8～15cm)的与纺锤形模具外型相吻合的容器中，加入细胞相容性好的可降解高分子0.5～1.5wt％的I型胶原盐酸(5～50mM)溶液或0.5～1.5wt％的I型胶原(5～50mM)盐酸溶液、体积比为1～5∶1(v/v)的1～30wt％的明胶/1～3wt％海藻酸钠混合液、体积比为1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％的I型胶原(5～50mM)盐酸溶液/1～3wt％海藻酸钠混合液、体积比为1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％的I型胶原(5～50mM)盐酸溶液/1～3.5wt％半乳酸海藻酸钠(海藻酸钠中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)混合液、0.5～1.5wt％壳聚糖醋酸(10～100mM)溶液、体积比为1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％壳聚糖醋酸(10～100mM)/0.5～1.5wt％的I型胶原醋酸(5～50mM)混合液、体积比为1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％壳聚糖醋酸(10～100mM)/1～30wt％的明胶混合液、或体积比为1～5∶1(v/v)的0.5～1.5wt％壳聚糖/海藻酸钠混合液中的任一种。于-20～-70℃下冷冻，冻干后从容器中取出，即可制得纺锤形海绵体6；(2)支持体的形成取上述制备的纺锤形海绵体6，外涂一层天然高分子溶液，然后放入交联剂(如5～20mL含20～200mg的1-乙基-3-(3二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC HCI)水/丙酮(比例为1∶9v/v)溶液中或1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐/2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸体系；或乙二胺/1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐/氯化钙体系，室温下浸泡6～72小时。湿态下抽出其中的细丝，形成外层为致密层7，可防止细胞穿过，内层带多管道5、多孔(孔径为5～120μm，孔隙率30～70％)的、可接种细胞及细胞生长因子的支持体；(3)复合支持体的形成在上述制备的支持体的外壁上再涂一层厚为0.5～1mm的可降解高分子溶液(如1～30wt％的明胶)，然后冻干、再交联，即可制得复合支持体；(4)预制血液通道将由(3)制得的复合支持体外部培养液入口1与培养液出口2之间包覆一层可溶性高分子(如10～30wt％的明胶水)溶液，(操作温度40～50℃)。同时用两根长5～15mm的细丝状物(如干或凝胶态明胶丝)分别插在两端涂有可溶性高分子的地方(如距一端细胞培养液入口1/4与3/4处)，短丝的外壁上同样涂一层明胶水溶液。同时预制血液入口3和血液出口4；在前期体外培养阶段，培养液可由入口1进，由出口2出，血液由入口3进，由出口4出。在后期体内植入阶段入口1与出口2也可直接通血液；(5)叠加外套待室温下上述明胶溶液凝固后，整个材料外再涂一层可降解高分子聚乳酸(Mw3×104～5)或聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物(70～90∶30～10，Mw3×104～5)或聚乳酸与聚己内酯共聚物(摩尔比为70～90∶30～10，Mw10×104～5)的1，4-二氧六环溶液(浓度为5～35w/v％)。等有机溶剂挥发后，即在支持体外围形成外套9；(6)血液空腔的形成将复合材料放入37℃去离子水中，溶解掉其中的明胶溶液、抽出丝状物、在外套9内形成血液空腔8，经干燥后即可制得多管道、多层次的复合肝支架材料；(7)抗凝血处理将上述制得的复合肝支架材料在抗凝血药物中浸泡，然后在丙酮浓度依次递减的水溶液中缩聚，即可制得抗凝血的多管道、多层次的复合支架材料。
(4)将由(3)制得的纺锤体的外围4mm处开始涂一层30wt％的明胶水溶液，操作温度40℃。同时用两根长10mm的凝胶态明胶丝分别插在距一端口1/5与4/5处，外围同样涂一层明胶水溶液，预制血液入口3和血液出口4；(5)待由(4)制得样品在室温下明胶溶液凝固后，整个材料外壁上再涂一层复合肝素钠(1∶50w/v％)的聚乳酸与聚羟基乙酸(6∶1M/M，Mw5×104～5)的1，4-二氧六环溶液(浓度为30w/v％)。待有机溶剂挥发掉后，将在支持体外围形成外套9；(6)将上述复合材料放入40℃去离子水中，将其中的明胶溶液溶解，在外套9内形成血液空腔8，经干燥后即可制得多管道、多层次的复合肝支架材料。
权利要求
1.一种体内可降解的复合肝支架，其特征在于该复合肝支架主要包括由可降解高分子材料制成的培养液入口[1]，培养液出口[2]，血液入口[3]，血液出口[4]，其内部带管道[5]的海绵体[6]，致密层[7]，血液空腔[8]以及外套[9]。
2.按照权利要求1所述的一种体内可降解的复合肝支架，其特征在于所述的复合肝支架呈纺锤形。
3.一种制备如权利要求1所述体内可降解的复合肝支架材料的方法，其特征在于该方法依次包括以下步骤(1)用一定强度的细丝制成多层纺锤形模具，将模具放入与模具外型相吻合的容器中，并在容器中加入细胞相容性好的可降解高分子溶液，冻干后从容器中取出，即可制得纺锤形海绵体[6]；(2)在上述制备的海绵体[6]的外壁涂一层可降解高分子溶液，然后放入交联剂中浸泡；湿态下抽出其中的细丝，形成外层为致密层[7]，内层带多管道[5]、多孔、可接种细胞及细胞生长因子的支持体；(3)在上述支持体的外壁上再涂一层可降解高分子溶液，冻干、再交联，即可制得复合支持体；(4)在复合支持体外部细胞培养液入口[1]和培养液出口[2]之间包覆一层可溶解的凝胶态物质，同时预制血液入口[3]和血液出口[4]；(5)在上述制得的支持体的外壁再涂一层可降解高分子溶液，待溶剂挥发后，即在支持体外围形成外套[9]；(6)将上述复合支持体放入去离子水中，溶解掉其中的凝胶态物质，在外套[9]内形成血液空腔[8]，经干燥后即可制得多管道、多层次的复合肝支架材料；(7)将上述制得的支持体在抗凝血药物中浸泡，然后在丙酮浓度依次递减的水溶液中缩聚，即可制得抗凝血的多管道、多层次的复合支架材料。
4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的细丝为细金属丝或细塑料丝。
5.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的可降解高分子溶液为胶原盐(醋)酸溶液、明胶水溶液、明胶与海藻酸钠混合液、胶原盐酸溶液与海藻酸钠混合液、胶原盐(醋)酸溶液与半乳酸海藻酸钠混合液(海藻酸钠中10～30％的糖醛酸被半乳酸乙二胺基取代)、壳聚糖醋酸溶液、壳聚糖/胶原混合液、壳聚糖/明胶混合液、壳聚糖/海藻酸钠混合液的任意一种。
6.按照权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于所述的可降解高分子溶液中还可复合细胞(肝细胞、内皮细胞)生长因子(HGF)、转移生长因子(TGF-α)。以促进细胞生长、防止细胞癌变。
7.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(2)与(3)中所述的交联剂对于可降解高分子为胶原、明胶类蛋白质的溶液，交联剂可选择1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐或其稳定体系1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐/2-(N-吗啉)-乙烷-磺酸(MES)；对于可降解高分子为含海藻酸钠或半乳酸-1，4-乙二氨基海藻酸钠的溶液，交联剂还可选择乙二胺/1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐/氯化钙体系；对于可降解高分子为壳聚糖醋酸的溶液，不需交联。
8.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(1)、(2)、(3)、(5)中可直接将抗凝血药物复合在可降解高分子溶液中，然后按步骤(6)进行，即可制得抗凝血的多管道、多层次的复合支架材料。
9.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述的可降解高分子溶液可采用聚乳酸、聚乳酸/与聚羟基乙酸、聚乳酸/聚己内酯共聚物的1，4-二氧六环溶液或聚醚氧酯的四氧呋喃溶液中的任一种。
全文摘要
一种体内可降解的复合肝支架及其制备方法,涉及生物工程材料技术领域。其特征是该支架呈纺锤形,它含有外套、致密层、血液空腔及内部带管道的海绵体。其制备方法是先将可降解高分子溶液倒入纺锤形模具中制成海绵体,将海绵体外壁涂一层可降解高分子溶液后在交联剂中浸泡,形成外层致密,内层带多管道、多孔的支持体;将支持体再交联后制得复合支持体;将复合支持体中的凝胶态物质溶解后即在外套内形成血液空腔;干燥后在抗凝血药物中浸泡,并在丙酮溶液中缩聚,即可制得具有抗凝血的多管道、多层的复合肝支架材料。本支架可使内皮细胞与肝细胞在管道与孔隙中充分生长、分裂,以利于后期体内植入时微血管的形成及对肝细胞数量的要求。
文档编号A61L31/12GK1363400SQ02103610
公开日2002年8月14日 申请日期2002年1月29日 优先权日2002年1月29日
发明者王小红, 崔福斋, 冯庆玲, 徐迎新 申请人:清华大学