专利名称：中国汉族人基质金属蛋白酶－9基因重构、表达、纯化及其医学应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中人体基因的重构后表达、纯化方法，特别是人基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的重组、表达和纯化；以及MMP-9蛋白本身、类似物、衍生物在肝癌医学诊断、治疗方面的应用。
背景技术：
恶性肿瘤转移是一个连续、复杂、多因素参与的多阶段过程。其中细胞外基质(ECM)是肿瘤细胞在转移过程中面临的第一道屏障。肿瘤细胞可产生大量的蛋白酶水解基质，使肿瘤细胞易于转移。ECM降解酶系统至少包括六大类，其中基质金属蛋白酶(MMPs)最为重要，它几乎能降解多糖以外的全部ECM成分。肿瘤的侵袭转移过程中，MMPs过度表达。
MMP-9的临床应用本专利发明人检测了170例肝癌(原发性肝癌115例和继发性肝癌55例)患者外周血及40例肝脏良性疾病(肝脏良性肿瘤11例和肝硬化29例)患者外周血，30例健康人外周血MMP-9。结果显示血清MMP-9含量在肝癌组(523.25±410.96ng/ml)和肝脏良性疾病组(200.06±163.59ng/ml)、健康人(123.39±58.51ng/ml)组之间具有显著性差异(p＝0.0001，p＝0.0001值)(表一)；肝癌、良性肝病和正常人的阳性率分别为73.5％、35％和3.3％(cut-off值240.41ng/ml)，判断肝癌敏感度73.5％，特异度96.7％(表二)。表明定量检测肝癌患者外周血中MMP-9浓度是协助诊断肝癌的参考指标。
表一 MMP-9在肝脏疾病中表达病例分组 NMean(ng/ml)Std DeviationStd ErrorMinimMaxim p肝癌170 523.25 410.9631.52 26.202160.0原发性肝癌 115 490.39 397.5037.07 26.202160.0继发性肝癌 55 591.97 433.4558.45 93.001812.00.080肝脏良性疾病40 200.06 163.5925.87 22.30677.400.0001肝良性肿瘤 11 270.40 228.7068.96 26.50677.40肝硬化 29 173.38 126.1523.42 22.30564.200.094正常人 30 123.39 58.51 10.68 21.30257.600.0001表二 MMP-9表达的阳性率病例分组N MMP-9表达 P(2-sided)阴性 阳性肝癌 170 45(26.5％)125(73.5％)肝脏良性疾病 40 26(65.0％)14(35.0％) ＜0.01正常人 30 29(96.7％)1(3.3％) ＜0.01本发明人通过研究还证实了血清MMP-9水平与肝癌的复发、转移密切相关(表三)。因此外周血MMP-9高水平的原发性肝癌患者可考虑在介入或手术等局部治疗前后给予系统化治疗，预防其转移的发生，以期提高治愈率。
表三 肝癌MMP-9水平与是否转移是否转移NMMP-9(ng/ml)MeanStd DeviationStd Errorp无转移 45391.23 286.96 33.36有转移 28530.86 363.27 63.550.044
发明内容
为了稳定地获得足量的MMP-9蛋白，同时为制备用于研究MMP-9蛋白的高效的抗MMP-9抗体，本发明的发明人通过基因重组的方法，获得了重组中国汉族人MMP-9 cDNA，为了加强其抗原性，发明人又进一步构建了一种PMMP-9基因，同时稳定、高效的表达了人重组MMP-9蛋白。
本发明的目的是提供上述中国汉族人MMP-9基因重组、表达和MMP-9蛋白纯化的方法。同时揭示MMP-9的血浆含量和组织含量与肝癌复发转移、早期预测的内在关系。
本发明的技术方案为克隆、重组、表达纯化人MMP-9和PMMP-9蛋白的方法，包括以下步骤(1)、克隆中国汉族人MMP-9的基因，用反转录PCR法扩增MMP-9的基因；(2)、将上述扩增的MMP-9基因与克隆载体连接，构建人MMP-9克隆质粒；(3)、将上述人MMP-9克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达人MMP-9a、将上述带有中国汉族人MMP-9基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650 OD值为1.0时停止培养；
c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)、纯化人MMP-9a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化人MMP-9；d、用离子交换和凝胶过滤层析进行纯化。(6)、重组中国汉族人PMMP-9基因的构建a、以MMP-9质粒DNA为模板以新引物作PCR扩增得到MMP-9的衍生物PMMP-9；b、将PCR产物PMMP-9克隆到克隆载体质粒上；c、经酶切将PMMP-9基因亚克隆到表达载体；(7)、重组中国汉族人PMMP-9蛋白的表达和纯化a、将上述带有重组人PMMP-9基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650 OD值为1.0时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；e、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；
f、裂解细菌，离心取上清液；g、初步纯化重组人PMMP-9；h、用离子交换和凝胶过滤层析进行纯化。本发明专用引物的基因序列为引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为纯化的中国汉族人MMP-9的电泳2为纯化的重组中国汉族人PMMP-9的电泳图具体实施方式
实施例1一、中国汉族人MMP-9基因cDNA的获得1、取肝细胞，采用美国Trizol RNA抽提试剂盒推荐方法提取总RNA，将总RNA走变性胶，确认总RNA的质量可靠；2、设计引物如下引物1 5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT 3′引物2 5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG 3′3、以上述总RNA为模版，反转录合成人MMP-9的cDNA，PCR扩增，PCR反应体系参照文献(Scarf S.J.，In PCR ProtocolA Guide toMethod and Application，and ed.New York，Academic Press，USA 1990)进行，反应条件为
94℃变性50秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒，共35个循环，最后72℃保温10分钟4、PCR产物经1％琼脂糖电泳初步确证后，酚/氯仿抽提回收；二、构建中国汉族人MMP-9克隆质粒1、按照Klenow多聚酶推荐方法，将PCR产物用Klenow多聚酶补平。
2、将补平的PCR产物与EcoRV酶切的pBluscript KS载体(任何的克隆载体均可以，如T-easy，pGEX等)平端连接，连接反应体系如下pBluscript KS(EcoRV酶切)1ul5x连接缓冲液(什么缓冲液)2ulT4 DNA连接酶1ulEcoRV(1u/1ul) 0.5ulPCR产物 4ulH2O 1.5ul以上混合物16℃连接12小时；3、将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB板，挑取阳性克隆，用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用HindIII和EcoRI双酶切鉴定出重组质粒pBLU-HMMP-9；三、表达质粒pET-MMP-9的构建
1、将上述pBLU-MMP-9克隆载体中人MMP-9(HMMP-9)的基因片段用NdeI和XhoI双酶切下，经1％琼脂糖电泳，回收约2Kb的CMMP-9的基因片段；2、将上述该片段与相同酶切的pET表达载体(表达载体是多样的，如pBluescriptKS、pPUC、pGEM等)连接，连接反应体系如下pET(NdeI，XhoI酶切) 1ul5x连接缓冲液2ulT4 DNA连接酶1ulHMMP-9 5ulH2O 1ul以上混合物16℃连接12小时3、将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，涂布卡那霉素LB板，挑取阳性克隆；4、用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用NdeI和XhoI双酶切鉴定出重组质粒pET-HMMP-9；四、MMP-9在大肠杆菌中的表达1、将筛选出的在E.coliJM109中的重组质粒pET-HMMP-9克隆接种10ml LB试管，16℃300r/min摇床培养，测菌液A650OD值为1.0时停止培养；2、收集细菌，离心5000r/min20分钟，去上清液，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶沉淀，超声破碎菌体，离心10000r/min20分钟，干燥沉淀。
3、将上述10ml菌液放入装有1000mlLB培养基的培养瓶中，在37℃摇箱内培养300r/min，测菌液A650 OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；4、收集细菌，以3000转/分，4℃，离心20分钟，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸盐缓冲液混溶沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至1mM，放于-20℃冻存；五、MMP-9的分离纯化1、将细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心5000转/分，4℃，5分钟，去上清液，再用磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；2、用超声破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使细菌裂解，4℃条件下12,000r/min离心10min，沉淀重悬于30ml基础缓冲液(8M尿素，10mM Tris，pH7.5)。12,000r/min离心10min，取上清液；3、上清液经DEAE离子交换层析分别以基础液加100mM、200mM、400mM NaCl进行洗脱。各组分经12.5％SDS-PAGE分析。含所需蛋白的组分进行Ni-NTG-His柱亲和层析，分别以基础液加15mM、30mM、60mM、120mM、220mM咪唑洗脱。各组分行12.5％SDS-PAGE分析。
如图1所示，所得MMP-9溶液SDS-PAGE电泳呈现一条带。在上述实施例中，表达质粒的构建还可以用一对上游和下游的5′端各带有和表达载体相对应的二个限制性内切酶位点的引物，以人MMP-9克隆质粒DNA为模板，做PCR扩增；将PCR产物用常规方法进行纯化；用二个相应的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，用常规方法纯化酶切后的PCR产物和表达载体；用T4连接酶将纯化的PCR产物和表达载体连接。
实施例2一、重组中国汉族人PMMP-9基因的获得1、设计引物如下引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC 3′引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA 3′2、选择上述中国汉族人MMP-9 cDNA为模板；获得重组中国汉族人PMMP-9的基因，PCR扩增，PCR反应体系参照文献(Scarf S.J.，In PCR ProtocolA Guide to Method and Application，and ed.New York，Academic Press，USA 1990)进行，反应条件为94℃变性50秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒，共35个循环，最后72℃保温10分钟3、PCR产物经1％琼脂糖电泳初步确证后，酚/氯仿抽提回收；二、构建重组中国汉族人PMMP-9克隆质粒1、按照Klenow多聚酶推荐方法，将PCR产物用Klenow多聚酶补平。
2、将补平的PCR产物与EcoRV酶切的pBluscript KS载体(任何的克隆载体均可以)平端连接，连接反应体系如下pBluscript KS(EcoRV酶切) 1ul5x连接缓冲液(什么缓冲液) 2ulT4 DNA连接酶 1ulEcoRV(1u/1ul) 0.5ulPCR产物 4ulH2O 1.5ul以上混合物16℃连接12小时；3、将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB板，挑取阳性克隆，用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用HindIII和EcoRI双酶切鉴定出重组质粒pBLU-HPMMP-9；三、表达质粒pET-PMMP-9的构建1、将上述pBLU-PMMP-9克隆载体中重组人PMMP-9的基因片段用NdeI和XhoI双酶切下，经1％琼脂糖电泳，回收约450bp的PMMP-9的基因片段；2、将上述该片段与相同酶切的pET表达载体(表达载体是多样的，如pBluescriptKS、pPUC、pGEM等)连接，连接反应体系如下pET(NdeI，XhoI酶切) 1ul5x连接缓冲液 2ulT4 DNA连接酶 1ulHPMMP-9 5ul
H2O1ul以上混合物16℃连接12小时3、将连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB板，挑取阳性克隆；4、用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用NdeI和XhoI双酶切鉴定出重组质粒pET-HPMMP-9；四、PMMP-9在大肠杆菌中的表达1、将筛选出的在E.coliJM109中的重组质粒pET-HPMMP-9克隆接种10ml LB试管，16℃300r/min摇床培养，测菌液A650OD值为1.0时停止培养；2、收集细菌，离心5000r/min20分钟，去上清液，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶沉淀，超声破碎菌体，离心10000r/min20分钟，干燥沉淀。
3、将上述10ml菌液放入装有1000mlLB培养基的培养瓶中，在37℃摇箱内培养16小时测菌液A650 OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；4、收集细菌，以3000转/分，4℃，离心20分钟，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸盐缓冲液混溶沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至1mM，放于-20℃冻存；五、PMMP-9的分离纯化1、将细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心5000转/分，4℃，5分钟，去上清液，再用磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；2、用超声破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使细菌裂解，4℃条件下12000转/分离心，30分钟，取上清液；3、上清液经DEAE离子交换层析和Ni-NTG-His柱亲和层析分别以基础液加100mM、200mM、400mM NaCl进行洗脱。各组分经12.5％ SDS-PAGE分析。含所需蛋白的组分进行Ni-NTG-His柱亲和层析，分别以基础液加15mM、30mM、60mM、120mM、220mM咪唑洗脱。各组分行12.5％SDS-PAGE分析。
权利要求
1.一种表达纯化中国汉族人MMP-9 cDNA基因和重组PMMP-9的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、克隆中国汉族人MMP-9的基因，用反转录PCR法扩增MMP-9的基因；(2)、将上述扩增的MMP-9基因与克隆载体连接，构建人MMP-9克隆质粒；(3)、将上述人MMP-9克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达中国汉族人MMP-9a、将上述带有中国汉族人MMP-9基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650 OD值为1.0时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)、纯化人MMP-9a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化人MMP-9；d、用离子交换和凝胶过滤层析进行纯化。(6)、重组中国汉族人PMMP-9基因的构建a、以MMP-9质粒DNA为模板以新引物作PCR扩增得到MMP-9的衍生物PMMP-9；b、将PCR产物PMMP-9克隆到克隆载体质粒上；c、经酶切将PMMP-9基因亚克隆到表达载体；(7)、重组中国汉族人PMMP-9蛋白的表达和纯化a、将上述带有重组中国汉族人PMMP-9基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650 OD值为1.0时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；e、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；f、裂解细菌，离心取上清液；g、初步纯化重组人PMMP-9；h、用离子交换和Ni-NTG-His柱亲和层析进行纯化。
2.根据权利要求1所述的表达纯化重组人MMP-9基因和PMMP-9的方法，其特征在于所述反转录PCR法扩增MMP-9的基因和PMMP-9所用的引物为CMMP-9引物1 5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT 3′CMMP-9 引物2 5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG 3′PCMMP-9引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC 3′PCMMP-9引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA 3′
3.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人MMP-9和PMMP-9基因的方法，其特征在于所述将人MMP-9和PMMP-9克隆质粒亚克隆进表达载体的方法为表达载体为任一表达载体；用一对上游和下游的5′端各带有和表达载体相对应的二个限制性内切酶位点的引物，以人MMP-9克隆质粒DNA为模板，做PCR扩增；将PCR产物用常规方法进行纯化；用二个相应的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，用常规方法纯化酶切后的PCR产物和表达载体；用T4连接酶将纯化的PCR产物和表达载体连接。
4.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人MMP-9和PMMP-9基因的方法，其特征在于所述将人MMP-9和PMMP-9克隆质粒亚克隆进表达载体的方法为表达载体为任一表达载体；选用克隆载体和表达载体上相同的限制性内切酶位点。用二个限制性内切酶对克隆载体和表达载体酶切，切出克隆载体内的MMP-9和PMMP-9基因序列，切去表达载体内的多克隆位点序列；用常规方法纯化MMP-9和PMMP-9基因序列和切去表达载体内多克隆位点序列的表达载体；用T4连接酶将纯化的人MMP-9和PMMP-9基因序列和表达载体连接。
5.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人MMP-9基因的方法，其特征在于在所述表达全长人MMP-9和PMMP-9的过程中，LB培养基中加入的抗生素为氨苄青霉素；收获细菌的方法为将培养物以3000转/分离心20分钟，去上清液，收集沉淀。
6.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人MMP-9和PMMP-9基因的方法，其特征在于在所述纯化人MMP-9和PMMP-9的步骤中，用磷酸盐缓冲液洗洗细菌沉淀后，离心的速度为5000转/分，持续5分钟；细菌裂解的方法为超声破碎法或溶菌酶裂解法，细菌裂解后的离心为12000转/分，持续30分钟，取上清液；初步纯化的方法为离子交换层析或分子筛法。
7.表达纯化重组人MMP-9和PMMP-9基因中的专用引物，其基因序列为CMMP-9 引物1 5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT 3′CMMP-9 引物2 5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG 3′PCMMP-9引物3 5′CTACTCTGCCTGCACCACCGAC 3′PCMMP-9引物4 5′CTTGGTCCGGGCAGAAGCCCCA 3′
8.MMP-9血浆和组织含量与肝癌早期诊断和复发转移过程的相关性1).定量检测肝癌患者外周血中MMP-9浓度是协助诊断肝癌的参考指标，其临界值为＞300ng/ml2).治疗前检测周围血中MMP-9的水平能够作为预测肝癌复发转移的较好的指标；其值为＞800ng/ml，超过此值预示肝癌复发和转移。3).治疗前外周血MMP-9高水平的肝癌患者可考虑在介入或手术等局部治疗前后给予系统化治疗，预防其转移的发生，以期提高治愈率。
全文摘要
本发明涉及一种中国汉族人MMP－9基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及MMP－9蛋白及其类似物、衍生物在肝癌临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的中国汉族人肝细胞cDNA，用PCR方法(引物1为5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT引物2为5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG)获得人MMP－9基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取MMP－9及其衍生物PMMP－9，进而应用离子交换柱层析和凝胶过滤纯化出MMP－9及其衍生物PMMP－9，为临床进一步观察肿瘤病人体内MMP－9水平的变化，奠定了物质基础。
文档编号A61K38/48GK1459505SQ02117369
公开日2003年12月3日 申请日期2002年5月21日 优先权日2002年5月21日
发明者胡敬群, 杨建国 申请人:赵平, 胡敬群, 蔡建强