专利名称：重组人白细胞介素－2及其衍生物注射液和制备方法
技术领域：
本发明专利涉及重组人白细胞介素-2及其衍生物的一种新剂型。具体涉及一种以重组人白细胞介素-2及其衍生物为原料药制备的注射液，本发明还涉及该药物的制备方法。
白细胞介素-2系由白细胞产生的淋巴因子，是一种多功能的细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用。临床上应用于晚期肾癌、恶性黑色素瘤及癌性胸腹腔积液的治疗，也可试用于其他恶性肿瘤的综合治疗。采用低剂量的白细胞介素-2对结节性麻风病、支原体感染、疱疹及爱滋病进行免疫治疗也有良好疗效。是临床疗效显著的基因工程药物之一。
重组人白细胞介素-2是利用基因工程方法克隆和表达的白细胞介素-2，它的功能和临床效果同白细胞介素-2一致。
目前，重组人白细胞介素-2及其衍生物的制剂均为冻干粉针剂，这是由重组人白细胞介素-2的不稳定性决定的。但是现有的粉针剂存在以下一些不足①粉针剂在生产时需将药物溶液冻干结成固体，再直接升华除去水分。此过程需特殊设备、耗时长、耗能大，故成本较高。
②重组人白细胞介素-2及其衍生物粉针剂在使用时要先用注射用水将其溶解才能注射，十分不便且易造成二次污染。
本发明的目的是提供一种临床使用方便、能够减少污染，降低生产成本、缩短生产周期的重组人白细胞介素-2及其衍生物的注射液和制备方法。
本发明由重组人白细胞介素-2及其衍生物、生理允许的醋酸缓冲系统、生理允许的促溶剂、和一定比例的氯化钠组成的注射液。
本发明中的重组人白细胞介素-2为螺旋状的长肽链，由133个氨基酸组成，其中共有三个半胱氨酸(Cys)分别在第58、105、125位，其58位与105位的Cys生成的二硫键为活性所必需，但125位为游离的Cys，并非其活性所必需，且易错配或生成二聚体，降低生物活性。可以使用基因工程的方法利用点突变把Cys125改成Ser(丝氨酸)，或将Cys125变成Ala，或将104位的Met(蛋氨酸)变成Ala(丙氨酸)。以上这些均属于重组人白细胞介素-2衍生物的范围。故这些重组人白细胞介素-2衍生物被认为属于本发明的范围。
重组人白细胞介素-2是一种偏碱性的亲脂性蛋白质，少量溶解于水，利用大分子如PEG和肝素等化合物进行化学修饰，可增加其溶解性。这些经修饰过的重组人白细胞介素-2也属于重组人白细胞介素-2的衍生物。故这些重组人白细胞介素-2衍生物也被认为属于本发明的范围。
本发明中使用促溶剂目的是增加重组人白细胞介素-2及其衍生物的溶解度，人生理范围允许内的羟丙基-β-环糊精或聚山梨酯80均可以提高其溶解性，羟丙基-β-环糊精还能提高重组人白细胞介素-2及其衍生物的稳定性。本发明中使用的羟丙基-β-环糊精，是由羟丙基取代β-环糊精生成的水溶性环糊精衍生物，取代度为0.6～10.0。以上这两种物质应属于本发明中使用的辅料范围。
本发明是由以下两种组合制成的注射液(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.05～2.0mg羟丙基-β-环糊精5～50mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.05～2.0mg聚山梨酯80 0.04～4.0mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg本发明原、辅料配比的优选范围是(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.1～1.0mg羟丙基-β-环糊精10～20mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物0.1～1.0mg
聚山梨酯80 0.04～0.4mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg本发明原、辅料的优选配比是重组人白细胞介素-2及其衍生物0.1mg羟丙基-β-环糊精20mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1mg聚山梨酯80 0.04mg醋酸钠 0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化钠 8.0mg将以上各组分按下述步骤生产由于重组人白细胞介素-2及其衍生物是生物制品，故其生产条件应符合国家规定的标准。整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套。使用的器皿应干烤灭菌，消除热源。
按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液。然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质。过滤时的滤膜为0.22um，过滤后溶液呈澄清透明状。
按以上比例将溶液加入重组人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um。最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中。
用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％。蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL～2依赖细胞株。
本发明研制成的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，具有以下优点①无须冻干，不需要冻干所需的特殊设备，车间和人员。将生产周期缩短了两个工作日，节省了大量能源。
②临床使用时无须先用注射用水溶解，如制成预冲式注射剂包装形式还可直接注射，增加了使用的方便度，减少溶解过程中造成的二次污染的机会。
③在动物实验中观察到，本发明同现有的粉针剂型相比较，促进了药物的吸收，提高了药物的生物利用度。
用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％。蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株。
按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液。然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质。滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状。
按以上比例将溶液加入人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um。最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中。
用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％。蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株。
氯化纳 8.0mg本例中使用的羟丙基-β-环糊精的取代度为0.6～10.0。将以上各组分按以下步骤生产生产条件应符合国家规定的标准。整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套。使用的器皿应干烤灭菌，消除热源。
按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液。然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质。滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状。
按以上比例将溶液加入人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um。最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中。
用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％。蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株。
氯化纳7.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.9mg聚山梨酯80 0.04mg醋酸钠 0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化纳 8.0mg本例中使用的羟丙基-β-环糊精的取代度为0.6～10.0。将以上各组分按下述步骤生产生产条件应符合国家规定的标准。整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套。使用的器皿应干烤灭菌，消除热源。
按以上配方精确称取醋酸钠，加入醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液。然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质。滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状。
按以上比例将溶液加入人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um。最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中。
用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％。蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株。
用本发明中涉及的制备方法生产，重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％。蛋白活性的检测方法为MTT法，使用的细胞为IL-2依赖细胞株。
权利要求
1.重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于它是以下述比例的原料和方法制成的注射液(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.05～2.00mg羟丙基-β-环糊精5～50mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.05～2.00mg聚山梨酯80 0.04～4.00mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg将以上各组分按下述步骤生产由于重组人白细胞介素-2及其衍生物是生物制品，故其生产条件应符合国家规定的标准。整个生产过程应在100级洁净室内，操作人员戴塑胶手套。使用的器皿应干烤灭菌，消除热源。按以上配方精确称取醋酸钠、醋酸和氯化钠，再加入注射用水，成10mmol/L的醋酸缓冲液。然后加入相应的羟丙基-β-环糊精或相应比例的聚山梨酯80，待其完全溶解以后用过滤系统精密过滤，除去溶液中杂质。过滤时滤膜为0.22um，过滤后的溶液呈澄清透明状。按以上比例将溶液加入重组人白细胞介素-2及其衍生物冻干原液中，待蛋白完全溶解后，用滤膜过滤，滤膜为0.22um。最后，将澄清、透明的溶液用分装机分装到2ml西林瓶、安瓿或1ml预冲式注射器中。
2.根据权利要求1所讲的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于原、辅料配比的优选范围是(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1～1.0mg羟丙基-β-环糊精10～20mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 7.0～8.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1～1.0mg聚山梨酯80 0.04～0.4mg醋酸钠 0.15mg醋酸0.48×10-3ml注射用水1ml氯化钠 8.0～8.5mg
3.根据权利要求1所讲的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于原、辅料的优选配比是(1)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1mg羟丙基-β-环糊精20mg醋酸钠0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化钠7.0mg(2)重组人白细胞介素-2及其衍生物 0.1mg聚山梨酯800.04mg醋酸钠0.15mg醋酸 0.48×10-3ml注射用水 1ml氯化钠8.0mg
4.根据权利要求1、2、3、所描述的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于重组人白细胞介素-2及其衍生物的残留蛋白活性≥99％。
5.根据权利要求1、2、3、所描述的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于本发明中使用的羟丙基-β-环糊精，是由羟丙基取代β-环糊精生成的水溶性环糊精衍生物，取代度为0.6～10.0。
6.根据权利要求1、2、3、所描述的重组人白细胞介素-2及其衍生物注射液，其特征在于发明中使用的聚山梨酯80作为促溶剂，其使用的浓度范围是0.004％～0.4％(W/V)。
全文摘要
本发明涉及了重组人白细胞介素－2及其衍生物的注射液和制备方法，其特征在于它是以重组人白细胞介素－2及其衍生物为主要原料加入羟丙基－β－环糊精或聚山梨酯80、醋酸、醋酸钠、氯化钠和注射用水配置而成的注射液。本发明将重组人白细胞介素－2及其衍生物粉针剂改进为注射液，不仅降低了生产成本、缩短了生产周期，而且使用方便、减少了二次污染，并能促进药物的吸收，提高了重组人白细胞介素－2及其衍生物的生物利用度。
文档编号A61K38/20GK1457882SQ0211773
公开日2003年11月26日 申请日期2002年5月15日 优先权日2002年5月15日
发明者程度胜, 张钰 申请人:程度胜, 北京四环生物工程制品厂