专利名称：一种新型富含蛋白多肽的营养液的提取制备方法
一、综述蛋白肽是正常存在脏器体内的，在蛋白质合成与降解过程中的中间产物或终产物。它是由两个至几十个氨基酸通过肽健连结而成的肽链片段。多肽片段的来源有三个1、细胞内蛋白质合成的不完全产物和合成后为修饰蛋白质而切下的肽段。2、细胞内蛋白质被各种蛋白酶在降解过程中的不完全降解产物。3、食物中补充的动物，植物蛋白质在胃肠道消化吸收过程中被胃蛋白酶，胰蛋白酶降解的产物(1)对食物中补充的多肽，动物体内小肠上细胞可以用细胞间质的直接透入，细胞膜囊泡的吞入和多肽转运蛋白的方式吸收转运多肽进入血液循环(2，3，4，5)，通过血液循环运达机体的各个部位，大脑中枢神经系统亦可采用同样的方式通过血脑屏障吸收血液中的多肽进入脑脊液(6，7，8，9)。
进入体内的多肽经以下多种形式参与细胞和组织的正常生理功能和生物代谢1、蛋白质合成，作为蛋白质的合成底物，提供自由的必需与非必需氨基酸以维持正常的蛋白质合成过程(1)。2、能量代谢，在心、肝、肾、脑细胞内，由多肽降解的自由氨基酸通过无氧酵解及三羟酸循环的糖异生途径合成富含能量的三磷酸线苷(ATP/GTP)。此一过程对大脑、心脏、肾脏在缺血缺氧的状况下尤为重要(1)。3、激素调控的生物代谢过程。类激素多肽(如胰岛素类，生长激素类)参与了正常激素调控的生物学过程，对糖、脂肪，蛋白质代谢，能量代谢，细胞分化，生长的调控等(1)。4、大脑神经信息的传递，储存和利用。许多蛋白多肽可以作为类神经递质参与到正常的神经生理活动中以维持大脑正常的学习，记忆功能，以及正常的意识和行为的控制过程(10，11，12，13)。5、机体器官的生长发育。生长发育过程是一些特殊蛋白质诱发的细胞行态和功能的变化过程，其中有上百种不同结构的蛋白质作为信息传递介质参与其中，多肽的结构多态性为多肽有能力影响以上众多蛋白质的活性和功能提供了可能。6、细胞与机体的衰老和死亡。机体细胞的存活与死亡是一个极为复杂的过程，它受到多种因素的调控和制约。其基本过程为诱发因子的刺激，激活了细胞内相对应的信息传递系统(包括控制存活或死亡的系统)，在经过平衡调整后，这些控制细胞存活与死亡的系统指引细胞走向存活或死亡。在以上整个生物过程中，多肽可在激活存活调控系统，抑制死亡信息传递过程中促使细胞走向存活。多肽有能力对各组织，器官进行综合调控，以达到延缓机体衰老和退化，促进延年益寿的作用(14，15，16，17，18，19，20，21，22)。7、肿瘤的发生发展。各种肿瘤的发生是一个在多种因素诱异下(包括致癌物，有毒化合物，遗传因素)细胞失去了控制其正常生长变化能力的表现。目前，科学家发现，在动物实验中，部分多肽可降低肿瘤的发生率，抑制肿瘤的生长速度(23)。8、抗菌消炎。革兰氏阴性细菌释放的内毒素是造成机体组织病理反应的主要物质，在上个世纪九十年代，美国的科学家发现短片段的富含电荷的多肽具有结合灭活内毒素的作用以降低内毒素对人体的影响(24，25，26)。9、调整机体对营养物质的摄取。定量多肽类营养物质的食入可降低机体对脂肪类成份的需求，减少脂肪类以各种形式在体内的累积，以期达到降低动脉粥样硬化的程度，减少缺血缺氧对各脏器，尤其是对大脑和心脏的损伤。
现以实例对多肽在以上所述各方面的影响加以具体描述。
1、蛋白质合成。细胞内降解的各种肽链和食入吸收的肽链在进入细胞溶酶体后，将会被多肽水解酶(Peptideses)完全降解为自由氨基酸，这些自由氨基酸将会被转运RNA(tRNA)辩认转运至蛋白合成的核蛋白体上参与信息RNA(mRNA)的翻译过程，合成蛋白质。合成的蛋白质经过修饰，转运，激活后就将参与到多种细胞内外的生物学过程中去，比如DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，降解，生物信息的传递，能量代谢，细胞结构的构筑，免疫蛋白质的合成与降解。
2、能量代谢。能量代谢是指细胞利用糖，脂肪酸，氨基酸为基本原料通过糖的无氧酵解，有氧氧化来降解含高能量的分子，转化分子中的能量至储存能量的化合物三磷酸线苷(ATP/GTP)上。脂肪酸则是先转化为乙酰辅酶A的形式再进入三羧酸循环。蛋白多肽必须先降解为自由氨基酸，而后通过精氨酸循环进入糖代谢的反应过程中去。其中，氨基酸是三大能量来源之一，尤其在缺氧状况下由氨基酸转化为糖的异生过程对维持正常细胞存活意义重大。多肽提供的20种氨基酸对机体脑，心、肾、肝脏的功能维持具有至关重要的意义(1)。
3、激素调控的生物学过程.ER(Estradiol)，一种醛固酮类激素，调节着不同组织的分化和生长(27)。ER实施其生物学活性是通过ER核受体(两种亚型)转运至细胞核，在基因起动子上存在的ER结合序列(ERE)，并在活性蛋白(Activator Protein)AP-1的协助下对靶基因进行调控，两种ER核受体呈现有不同的组织分布和转录调控活性，同时对不同的化合物有选择的结合作用。今年初，以色列的科学家从质粒多肽库中分离出了两队多肽15个氨基酸组成的链状多肽LPALDPTKRWFFETK，和23个氨基酸构成的环型多肽CA-ELPALDPTKRWFFETKPPPPC。这两种多肽均具有类似ER的生理学作用。其提供的实验证据包括结合抑制实验多肽可抑制(H3)Estradiol与MAB(Mono-Antibody)E2-15和ER受体的结合。转录调控实验阳性。动物体内实验可增强CREASTINE激酶的特殊活性(7)。胰岛素是胰岛细胞分泌的蛋白质激素。胰岛素原肽链在切除了信号肽段后，它由两条肽链以二硫腱的形式组成一个完整的蛋白分子。胰岛素类多肽是指具有与胰岛素同源序列的多肽分子(IRPSInsulin Related Peptides)包括已分离出的BOMBYXIN，MIP、LIRP，INSL3，4，5，6，EPIL，在类胰岛素中，目前已发现了21个均与A链B胰岛素有同源序列的多肽(28)。类胰岛素多肽除了积极参与糖代谢的调节外，在以下几个方面也显示出其生物学功能最近科学家已从动物的生殖系统中发现了高表达的宝百新(BOMBYXIN)，这种多肽被认为与生殖系统的成熟和生殖器官的功能控制有极为密切的关系，胰岛素生长因子(IGFs)调控着细胞的分化，生长和存活，它是一个控制细胞器官，机体形态大小的最重要的因子。类胰岛素多肽对细胞内胰岛素信息系统在控制生命周期方面的干扰和调节将有利于机体的长寿。
4、神经细胞的生长，存活和学习与记忆。神经细胞是一类特殊的组织细胞，它的主要生理学功能体现在接收信息的刺激，正确的传导信息，同时储存大量有用的信息。而维持正常的神经细胞的存活，防止其衰老，死亡是保证其正常生理功能的基础。在过去40年中，科学家发现，不同的刺激激发的神经细胞的正常活动性是促使神经细胞存活和生长的首要条件。在正常状况下，神经细胞接受来自于细胞膜电位的改变，不同的神经生长因子的诱导(NGF，BDNF，NMDA等)，其细胞膜受体能够将信息传入细胞内，再通过细胞内的信息传递系统的传导后(Ca++，MAPK system，Calcinurin system，JUKsystem，Calmodulin system，IPK3 system)进入细胞核，激活不同的转录因子(CREB，NEFs，NFKB，Jun)，通过调整各自下游的基因组来改变整个神经细胞的基本结构，生理活性和功能状态，这一过程是由上百种蛋白质参与的极为复杂的系统。这些系统的相互作用是通过系统内蛋白质之间的相互作用而达成的，这些相互作用的调控是极为重要的。在正确的调控下，神经细胞避免死亡，走向存活(15，16，17，18)。多肽可在不同的水平上对这一复杂的系统进行调控和干扰。首先在物理方法降解的蛋白多肽中，可以产生相对结构上特异的多肽，它们可以与细胞膜上的特异受体结合参与诱导，其依据的基本原理为受体与结合物是由至少三种方式进行的锁与钥匙模式(Lock and Key)，受体与结合物的空间结构完全吻合；诱导式吻合模式(Induced fit)，结合物的空间结构通过诱导与受体的结构吻合然后结合；多构象稳定结合模式(Stabilization of comformationalEnsembles)，同一种受体的结合部位可具有多种不同的结合构象以适应不同构象的结合物的结合(29)。而以上每一种机理均可被活性多肽采用以达到激活某一类或几类受体的作用。第二，Hsc70/Hsc90(热休克蛋白)等结构变构稳定蛋白质在细胞内信息传递过程中起着非常重要的调节各种信息蛋白质的结构和功能作用。最新的研究资料显示，多肽-F，多肽-K，可以直接结合，影响，调节Hsc70/Hsc90的功能状态，间接调节与细胞生长，存活相关的信息传递(15)。
5、肿瘤的发生和发展。肿瘤的生成是一个在外界多种因素诱导下(化学、物理、生物)机体某一器官的正常生长代谢发生的紊乱的失控过程。多肽YY(Peptide YY，PYY)是一个36个氨基酸组成的多肽，其C和N末端均含有酪氨酸(Tyrosine)，它与神经多肽Y和胰腺多肽均有70％的同源序列。PYY是大脑和消化道富含的一种多肽，其主要生物学功能有降低胃液分泌，减慢胃内容物排空，延长消化物在肠道的滞留时间。PYY的受体已在动物消化道细胞膜上分离出来，它的更多的生物学活性正在研究中，最新的研究结果表明PYY对大肠癌，胰腺癌和乳腺癌的发生和发展均有明显的抑制作用，在动物实验中对上述癌症的治疗有明显的疗效(23)。多肽混合物在肠道中可对多种致癌物进行吸附，结合，增加排泻，以期降低毒物的吸收和降低各脏器肿瘤的发生率，这将为肿瘤的预防提供一个最佳的途径。
6、抗菌消炎。革兰氏阴性细菌的内毒素是存在细菌表面的一种脂多糖(Polysachariders，LPS)。在毒血症诱发休克的病理过程中，内毒素起着主要的病理作用。内毒素的主要成分是糖脂，脂肪酸A，脂肪酸A所拥有的醚键和胺基键性连接多脂链特性使之能与多肽起相互作用。美国的科学家在上个世纪九十年代测试了大量的多肽，试图找到对毒素有特效的药物，他们发现，具有多电荷特性的短链多肽，如N-Gly-Tyr-Leu-Phe-Val-Leu-Lys-Lys2能够有效地结合革兰氏阴性细菌释放出的内毒素，以降低内毒素对人体造成的损害。美国另所大学(Creighton University Medical School)发现了六组不同的多肽也具有抗菌作用Brevinin-20a，Brevinin-20b，Temporin10a，10b，10c，10d(24，25，26)。
P物质是末稍神经分泌的一种多肽，它通过与受体结合的形式参与许多慢性炎性反应。如慢性脉管炎，慢性支气管炎，各类慢性皮炎。多肽结构差异性为寻找P物质的拮抗剂提供了丰富的来源(30)。
7、营养物质的摄取。多肽与多肽类激素通过以下途径加强营养物质的摄取控制糖，蛋白质，脂肪的吸收比例；调节胃液，胰液的分泌和胃肠的蠕动速度。
8、意识与行为的控制。正常的意识与行为对个人与社会都有非常重要的意义，在过去50年里，科学家已对上百种多肽进行了动物测试，发现他们的综合作用对意识与行为的控制至关重要(13)。
9、多肽的多态性。随着人类对哺乳动物的遗传信息的解密，动物的基因数量在四万左右，蛋白质中氨基酸的序列在四千万以上。这意味着动物脏器组织细胞合成的蛋白质降解后可提供上百万种不同天然结构的多肽(11)。
10、物理方法降解蛋白质的基本原理。科学家发现用超声波提供的能量可将大分子长链的DNA(脱氨核糖核酸100-200KBP)随机打断成中小片段的DNA片段(10-600BP)，这种方法只是随机打开核苷酸间的链性连接，而并不会改变DNA的基本结构(核苷，戊糖和磷酸)，现已在医学分子生物学实验室被广泛应用在准备预杂交用的SSDNA上(Salmon spirm DNA)(31)。根据同样原理，用超声振荡来打断蛋白质的肽键，化大分子长链的蛋白质(50-3,000氨基酸)为2-100个氨基酸组成的多肽片段。与蛋白酶降解法相比有本质的不同随机性降解，不受酶切位点的限制，制备的产物多态性高，不会造成多肽和氨基酸的正常结构改变，故不会改变多肽和氨基酸的天然结构。
二、制取1、材料来源动物血、动物脑脊液，动物大脑组织。
2、器械准备200毫升注射器，500毫升输液瓶，100毫升玻璃瓶，10毫升玻璃瓶，500毫升烧杯，100毫升量杯，500毫升量杯，30毫升吸管，1毫升吸管，10毫升吸管，5毫升吸管，30毫升离心管，所用玻璃器皿均应高温高压消毒。
无菌消毒水用过滤水装置0.2微米过滤器制备，然后高温高压消毒。
100％碘酒，75％酒精。
50微升至1000微升样品加样器一套。
电动匀浆器一套。
超生振荡仪一台。
0.4微米/500毫升过滤器。
离心机，高温高压消毒锅，4度/-20度冰箱，冰盒。
无菌操作箱，37度培养箱，酒精灯，天平。
3、收取标本牛新鲜血将牛蹄，头固定，用肥皂液洗净牛颈部，刮去牛毛，用碘酒，酒精消毒，用手术刀打开皮肤，从颈静脉抽取全血，转入消毒的500毫升输液瓶中，封口，将瓶放入冰盒中保存。
牛脑脊髓液新屠宰退皮的牛，从牛背部用注射器抽取脑脊液，转入500毫升输液瓶中，封口，将瓶放入冰盒中保存。
牛全脑组织新屠宰退皮的牛，分离牛头，牛后脑部退皮后用骨钻，骨钳打开头颅骨，无菌取出全脑组织，放入无菌托盘中分割成小块，放入1000毫升广口消毒瓶中，封口，将瓶放入冰盒中保存。
4、材料的前期处理分离血清全血自然凝固后，用离心机分离血清和血浆，10，000转/分钟(RPM)，室温下，30分钟，吸取上清液转入500毫升输液瓶中4度冰箱保存。
分离脑组织蛋白质适量的脑组织加入适量的无菌消毒水(50克/50毫升)，用匀浆器匀浆至液体状，用离心机分离，10,000转/分(RPM)，室温下，30分钟，吸取上清液转入500毫升输液瓶中4度冰箱保存。
5、配置及制备蛋白多肽液。
配置初级多肽液38.0％无菌消毒水30.0％血清30.0％全脑匀浆上清液1.0％ 脑脊液1.0％ 蔗糖100.00％ 初级蛋白质液200毫升初级蛋白质液装入500毫升输液瓶中，加盖，置入超声波振荡仪中振荡30分钟(室温下)。振荡液用0.4微米的过滤器滤过。
滤过液以5毫升/瓶分装入成品瓶中(在无菌操作箱中操作)。
成品高温，高压消毒45分钟(摄氏120度/12磅)。
封口加盖装盒，4度保存。
三、总结现代医学，分子生物学提供了越来越多的科学证据显示人体细胞的发生，发育，存活与死亡过程是内外环境条件，多基因多系统综合调节，控制的结果，保持机体器官始终处于良好的状态只靠单一营养物质是远远不够的，天然多肽复合物作为有效的有益于机体健康的复合调控物质来源的研究才刚刚起步，随着科学研究的深入，越来越多的科学证据会被发掘出来为人类健康服务。
当今世界保健食品的发展趋势是朝向多成份多层次高科技含量的方向发展，多肽营养液的发明可以作为这一潮流的先锋，希望它能作为新一代保健食品为人类的健康做出贡献。
动物多肽的组织来源不只局限于血，脑脊液，大脑，任何组织器官均可。
1、发明要点(1)多肽营养液可以通过保健食品对人体产生有益的作用是本发明首次宣示的概念和理论。
(2)本发明首次描述了新颖的多肽营养液的全套制备方法。
(3)本发明首次提出了用超声振荡仪降解蛋白质获取多肽产物的方法。
(4)本发明首次制备了动物多肽营养液并显示其具有巨大的市场价值。
2、产品特点(1)多肽含量丰富。生物学作用明确，产品中也含有微量元素等。
(2)新方法操作简易，实用。
(3)由此新方法制备的产品不会改变其天然结构，故无任何毒副作用。
3、产品应用多肽营养液的基功能是补充能量，增加营养；抗菌消炎；轻度镇静，止痛。长期服用可协调各组织，脏器的功能，促进新陈代谢，降低血糖血脂，延缓机体衰老，提高人体免疫能力，预防肿瘤的发生和发展；增强记忆力。
用法口服。
禁忌无，老少皆宜。
四、参考文献1.陈诗书 医学分子生物学 上海医科大学出版社 19992.Inui K，Terada T，Masuda S，Saito H.Physiological andPharmacological implications of peptide trans-porters，PEPT1and PEPT2.Nephrol Dial Transplant 2000；15 Suppl 611-33.Detmers FJ，Lanfermeijer FC，Poolman B.Peptides and ATPbinding cassette peptide transporters.Res Microbiol 2001Apr-May；152(3-4)245-584.Lee VH.Membrane transporters.Eur J Pharm Sci20000ct；11 Suppl 2S41-505.Ashida K，Katsura T，Motohashi H，Saito H，Inui K.Thyroid hormone regulates the activity and expres-sion ofthe peptide transporter PEPT1 in Caco-2 cells.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol 2002 Apr；282(4)G617-236.Prokai L.Peptide drug delivery into the central nervoussystem.Prog Drug Res 1998；5195-1317.Kastin AJ，Pan W，Maness LM，Banks WA.Peptidescrossing the blood-brain barriersome unusualobservations.Brain Res 1999 Nov 27；848(1-2)96-1008.Bickel U，Yoshikawa T，Pardridge WM.Delivery ofpeptides and proteins through the blood-brain bar-rier.Adv Drug Deliv Rew 2001 Mar 1；46(1-3)247-799.Huber JD，Egleton RD，Davis TP.Molecular physiologyand pathophysiology of tight junctions in the blood-brainbarrier. Trends Neurosci 2001 Dec；24(12)719-2510.McMahon BM，Boules M，Warrington L，Richelson E.Neurotensin analogs indications for use as potentialantipsychotic compounds.Life Sci 2002 Jan 25；70(10)1101-1911.Schrader M，Schulz-Knappe P.Peptidomics technologiesfor human body fluids.Trends Biotechnol 2001 0ct；19(10Suppl)S55-6012.Kastin AJ.What is a neuropeptide？Trends Neuro-sci 2000 Mar；23(3)113-413.McLay RN Pan W，Kasin AJ.Effects of peptideson animal and human behaviora review of studiespublished in the first twenty years of the journalpeptides.Peptides 2001 Dec；22(12)2181-25514.Wang AM，Ma C，Xie ZH，Shen F.Use of carnosineas a natural anti-senescence drug for human beings.Biochemistry(Mosc)2000 Jul；65(7)869-7115.Thulasiraman V，Yun BG，Uma S，Gu Y，ScrogginsBT，Matts RL.Differential inhibition of hsc70 activitiesby two hsc70-binding peptides.Bioch-emistry 2002 Mar19；41(11)3742-5316.Mannon PJ.Peptide YY as a growth factor forintestinal epithelium.Peptides 2002 Feb；23(2)383-817.Hayashi K.Biochemical studies on functional proteinsin the brain nervous system.Neurobio-chemical studieson nerve growth factor.
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1.本发明首次描述了新颖的多肽营养液的全套制备方法。
2.本发明首次提出了用超声振荡降解蛋白质获取多肽产物的方法。
全文摘要
蛋白多肽是正常存在于动物体内各脏器，血液，脑脊液与蛋白质代谢相关的中间产物和终产物。它除了提供蛋白合成的原始底物，参与细胞的能量代谢外，近来科学家发现，多种不同的多肽可以作为多肽类激素物质，细胞内外信息传递因子，脑神经细胞信息传递介质，细菌微生物生长的抑制因子，人提器官发生发育的调控因子，对不同组织细胞，人体器官发生发育的不同阶段起到调节，控制作用。本发明着重描述了从动物体内获取血清，脑脊液，全脑组织，经过匀浆，超声振荡降解蛋白质的方法获取蛋白多肽，按比例配制适于服用的动物多肽营养液，其特点为材料来源充足，制作简易，营养含量丰富，无非天然化学成分，老少皆宜，长期服用效果显著，无任何毒副作用。
文档编号A61P3/02GK1544083SQ0211826
公开日2004年11月10日 申请日期2002年5月7日 优先权日2002年5月7日
发明者李惠明, 李莉 申请人:李惠明, 李莉