专利名称：用于增强天然杀伤细胞活性的发酵的大豆萃取液的制作方法
技术领域：
本发明涉及发酵的大豆(Glycine max(L.))萃取液在增强天然杀伤细胞(NK细胞)的活性、预防和/或治疗个体涉及天然杀伤细胞活化作用的疾病中的用途。本发明还涉及其提高个体免疫力的用途，如提升化疗法与放射疗法等患者的免疫力，减轻这些疗法副作用的产生。
具有增强NK细胞活性效力的物质可用于作为预防或治疗疾病的药剂。大豆为人类膳食中一种异黄酮的集中来源。其亦包含多种化合物，包括皂苷类、植物甾醇类、大豆植酸盐、蛋白酶抑制剂、酚酸、复合糖类(complex sugars)、硼、卵磷脂、ω-3脂肪酸与叶酸，其对健康有益。许多东方传统食品(如天贝(tembe)与纳豆)均由大豆发酵制成。例如天贝是由大豆使用少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、米根霉(R.Oryzae)、少根根霉(R.arrihizus)与黑根霉(R.stolonifer)发酵制成。纳豆则使用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)发酵制成。传统的发酵食品可作为优良的蛋白质来源。然而，现有技术均未公开任何已知的发酵的大豆食品与大豆具有增强NK细胞活性的功效。
本发明的一个目的为提供一种增强个体NK细胞活性的方法，其包括给予有此需要的个体有效量的发酵的大豆萃取液，其中发酵的大豆萃取液由大豆水性萃取物与至少一种乳酸菌及至少一种酵母共同发酵制成。具体地说，大豆为一种黄豆或黑豆。更具体地说，本发明的发酵的大豆萃取液包括发酵的黄豆萃取液与发酵的黑豆萃取液。
本发明的另一目的为提供一种预防和/或治疗个体涉及NK细胞活化作用的疾病，其包括给予有此需要的个体有效量的发酵的大豆萃取液。具体地说，本发明的发酵的大豆萃取液可用于预防和/或治疗个体涉及NK细胞活化作用的疾病，可通过发酵的大豆萃取液预防或治疗癌症、感染性疾病或调节个体涉及天然杀伤细胞活性的免疫系统。
本发明还涉及一种改善患者健康的方法，此方法包括将有效量的发酵的大豆萃取液给予需要改善和增进免疫力的健康人或患者。
上述目的与概说仅提供本发明的简要介绍。为了更详细了解本发明的这些目的与其它目的及本发明本身，本领域技术人员应配合附图
解读本发明的详细说明与权利要求书。说明书与附图中指定的编号代表相同或相似的组件。
本领域技术人员参考详细说明与附图时，将更了解本发明的许多其它优点与特色，其中涵括本发明原则的优选实施例仅为实例说明。
具体地说，本发明的发酵的大豆萃取液可用于预防和/或治疗个体涉及NK细胞活化作用的疾病，如癌症及感染性疾病。此外，本发明的发酵的大豆萃取液亦可用于调节个体涉及NK细胞活化作用的免疫系统，如经化疗法及放射疗法治疗的癌症病人。制造发酵的大豆萃取液的方法发酵的大豆萃取液的制法是由大豆水性萃取液与至少一种乳酸菌与至少一种酵母共同发酵后，发酵的液体经例如加热杀菌，及视需要过滤与浓缩。
根据本发明，用于制备发酵的大豆萃取液的优选的大豆选自黄豆与黑豆。更具体地说，本发明的发酵的大豆萃取液为发酵的黄豆萃取液或发酵的黑豆萃取液。
发酵的大豆萃取液的制法是由大豆萃取液与至少一种乳酸菌(例如乳酸杆菌属(Lactobacillus)之一种或多种菌株或多种乳酸杆菌属的数种菌株)及至少一种酵母菌(例如酵母菌属(Saccharomyces)之一种或多种菌株或多种酵母菌属的数种菌株)共同发酵。水性大豆萃取液与一种或多种乳酸菌及视需要选用的酵母菌的发酵作用可依任何顺序进行或同时进行，优选同时进行。
若发酵过程中使用的微生物超过一种以上时，该发酵作用使用微生物按顺序进行或同时进行。优选地，采用选定品级的非基因改造的有机大豆的水性萃取液作为起始原科。优选地，发酵作用采用乳杆菌的多相培养物进行，例如含5、10、15、20、25或30株乳杆菌的培养物，并在乳杆菌的多相培养物中添加至少一种酵母。可使用的乳杆菌菌株包括例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus CCRC10695、14026、14064、14065和/或14079)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii bulgaricus CCRC 10696、14007、14009、14010、14069、14071、14098和/或16054)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis CCRC10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、14015和/或14117)、克非乳杆菌(Lactobaciilus kefir CCRC 14011)和/或克氏乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens CCRC 16059))。可使用的酵母菌包括例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CCRC 20577、20578、20581、21494、21550、21797、21805、22138、22234、22337、22731和/或22728，和/或乳酒假丝酵母(Candida kefyr CCRC 21269、21742和/或22057))。发酵后，发酵液经由例如加热或放射(优选加热)，杀菌以得到无菌液体。优选地，无菌液体经过滤或离心(优选过滤)，去除大部分或所有死微生物以得到发酵的大豆萃取液。更优选地，继过滤步骤后，去除滤液中部分水以浓缩发酵液体而得到发酵的大豆萃取液。除非另有详细说明，否则本申请进行的试验涉及浓缩步骤后的发酵的大豆萃取液。视需要，发酵的大豆萃取液可经由干燥(例如利用冷冻干燥法)而得到粉末形式的发酵的大豆萃取液。
进行此方法时，混合有机大豆(已脱脂)与蒸馏水，比例为1∶10。混合物于100℃下加热30分钟后并接着过滤以得到大豆萃取液。牛肉与海草于蒸馏水中煮沸30分钟以得到肉汁。添加盐、糖与洋菜以制成特制洋菜培养基。添加乳酸菌与酵母菌株至特制洋菜培养基中。自培养基中取出乳酸菌及视需要添加的酵母添加至大豆萃取液中，并于36-43℃下培养45至50小时。优选地，依据类似的生长特性将各种不同微生物菌株分类，例如依独特营养基的任何需求，微生物菌株是否在发酵后产生良好气味，及所分类的微生物是否可在独特条件下存活等条件分类，以便在培养前将分类的微生物分开加至大豆萃取液中。此步骤的目的在于减少不同菌株之间任何不良交互作用。亦优选地，在培养前先添加等比例的不同类的微生物菌株至大豆萃取液中，所得萃取液于40℃下培养45-47小时。培养期完成时，再将多相培养物移至大豆萃取液中，于36-43℃下培养100-150小时。最终发酵萃取液经加热杀菌及过滤；于浓缩器中排除滤液中95％水份，得到浓缩型的发酵的大豆萃取液。取上层经磁滤器过滤，然后分装在容器中密封。
本发明范围内容包括依上述类似方法制造，但改用中国药草替代大豆制成的发酵的中国药草萃取液。中国药草的发酵的萃取液可为甘草(Glycyrrhiza uralensis Fish)、枸杞(Lycium barbarum)、薏仁(Coixlacryma-jobi L.var.ma-yune Stapf)、山豆根(Sophora tonkinensisgapnep.)、决明(Cassia obtusifolia.)、黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)、茵陈(Artemisia capillaries Thunb.)、黄莲(Coptis chinensisFrsnch.)、龙胆草(Gentiana scabra Bge.)、莲子(Nelumbo nuciferaGaertn.)、菊花(Chrysantheiferamum morifolium Ramat.)、栀子(Gardeniajasminoides Ellis)、麦芽(Hordeum vulgare L.)、肉桂(Cinnamomumcassia Presl)、萝卜(Raphanus sativus L.)、山药(Dioscorea oppositaThunb.)、当归(Angelica sinensis(Oliv.))、川芎(Ligusticum chuanxiongHort.)、羌活(Notopterygium incisum)、白杓(Paeonia lactiflora Pall.)、大蒜(Allium satiumL.)、五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)、生地(Rehmannia glutinosa Libosch.)、五加(Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith)、阿胶(Equus asinus L.)、女贞子(Ligustrum lucidum Ait.)、绿豆(Phaseolus radiatus L.)、小麦(Triticum aestivum L.)、扁豆(Dolichoslablab L.)、白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)、防风(Saposhnikoviadivaricata)、金银花(Lonicera japonica Thund.)、桂枝(Cinnamimumcassia Presl.)、生姜(Zingiber officinale Rosc.)、天麻(Gastrodia elataBl.)、天门冬(Asparagus cochinchinensis(Liur.)Merr.)、石斛(Dendrobiunloddigesii Rolfe)以及黑芝麻(Sesamum indicum L.)。增强NK细胞活性的用途天然杀伤细胞为外周血淋巴细胞的小族群，对人体健康与疾病有重要的功能。除了其在控制转移与感染方面的作用，NK细胞亦参与免疫调节作用、造血作用、生殖及神经内分泌交互作用。NK细胞活性与NK细胞数不相同。NK细胞的数量可能充足，但除非经过活化，否则无法有效发挥其作用。NK细胞活性下降与许多疾病的发展与进行有关，亦与放射疗法及化疗法有关。因此，NK细胞功能似乎为疾病的生物标记，且为指示健康情形下降或改善的重要指针。此外，NK细胞活性亦为多种癌症的重要诊断因素。
本发明的研究证实，发酵的大豆萃取液比其它已知的发酵的大豆食品及未发酵的大豆更能提高NK细胞活性。由发酵的大豆萃取液提高的NK细胞活性可通过调节信号转导、调节生长因子活化及杀死癌细胞和/或传染性细胞而具有细胞毒性效应。且提高的NK细胞活性可抑制肿瘤生长。
由上文可知，本发明的发酵的大豆萃取液对增强NK细胞活性具有优越效果，因此可用于预防和/或治疗个体涉及提高NK细胞活性的疾病，如癌症、传染性疾病及免疫调节作用。本发明的具体实施例中，发酵的大豆萃取液可用作消炎剂、抗癌剂或促进免疫功能的药剂。抗癌剂用途本发明的发酵的大豆萃取液具有治疗和/或预防癌症的抗癌活性，并可克服已有技术用于治疗癌症的化放疗剂的一项或多项缺点。可使用发酵的大豆萃取液治疗的癌症包括人类最常见的癌症，亦即乳癌、结肠癌、子宫颈癌、前列腺癌、肾癌、肺癌、结肠癌与肝癌。
本发明的发酵的大豆萃取液可在癌细胞中诱发一种或多种抑制细胞增生的效应，诱发细胞分化，诱发细胞凋亡(渐进性细胞死亡)，和/或阻断细胞循环。因此，本发明的萃取液对癌细胞具有极广泛的活性，因此可有效治疗和/或预防癌症，包括良性前列腺肥大、前列腺癌、乳癌、子宫癌、白血病、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、结肠癌、睪丸癌、淋巴瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、胰癌、肺癌、脑瘤、皮肤癌、胃癌、口腔癌、肝癌、喉癌、膀胱癌、甲状腺癌、肝癌、肾癌及鼻咽癌。促进免疫功能用途除了控制癌症的作用外，NK细胞亦有助于调节及影响我们整体健康的免疫系统功能。利用免疫疗法来帮助提升NK细胞活性已渐成趋势且将随对免疫系统的知识增加而更为广泛应用。活体外试验指出本发明的发酵的大豆萃取液可改善免疫功能。发酵的大豆萃取液对于动物(Balb/c老鼠)免疫力的调节的影响，是通过将动物以发酵的大豆萃取液与含有或不含各种促细胞分裂剂的刺激而试验，这些促细胞分裂剂包括脂多醣、伴刀豆凝集素A以及植物血球凝集素(PHA)。脾脏细胞增殖分析显示，发酵的大豆萃取液与免疫力调节中的T细胞及B细胞的交互作用有关。发酵的大豆萃取液也与抗发炎的反应有关。大豆萃取液也可将巨噬细胞的吞噬活性增强71％。相似的结果也可在老鼠的活体内试验中发现。发酵的大豆萃取液的抗癌效果，也证实是由所释放的细胞激素而调节。由发酵的大豆萃取液而得到的培养液，可刺激45-56％的外周血液单核细胞。白细胞介素-1β、白细胞介素-β及肿瘤坏死因子α的浓度，都远高于未处理的对照组。因为未处理的巨噬细胞及T淋巴球细胞产生很少或没有产生细胞激素，以及正常的单核球细胞并不会抑制血癌细胞的生长，因此，抗肿瘤的活性可由增加的细胞激素的量而推估。发酵的大豆萃取液的给药本发明中，发酵的大豆萃取液可单独给药或以组合物给药，其中包含发酵的大豆萃取液及医药上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。优选地，发酵的大豆萃取液为发酵的黄豆萃取液或发酵的黑豆萃取液。发酵的大豆萃取液的给药剂量可为每公斤体重约0.001至40毫升，每次给药的最大剂量为每人2000毫升。优选地，发酵的大豆萃取液剂量为0.01至20毫升/公斤个体体重，优选为0.1至5毫升/公斤。这些剂量以浓缩型的发酵的大豆萃取液为主，但可依此计算呈未浓缩型或干粉型式发酵的大豆萃取液的适当剂量。剂量可依个体的健康条件或待预防或治疗疾病调整。
在啮齿动物的慢性毒性试验中已证实，长期每日摄取1至10毫升发酵的大豆萃取液长达6个月时，安全性极高。接受20毫升/公斤与1毫升/公斤给药的两组试验动物均未出现肉眼可见的毒性或死亡率。在艾氏(Ames)试验中，证明发酵的大豆萃取液没有诱发突变性，不会在活体外造成哺乳动物细胞染色体伤害，而且不会在ICR试验小白鼠的骨髓细胞中诱发小核形成。
以发酵的大豆萃取液喂食小白鼠(Balb/c)3周后，检视NK细胞活性如下测试三组。第一组Balb/c小白鼠接受PBS缓冲液，第二组接受0.1％FSE，第三组则接受0.4％FSE。
表1组别 NK细胞活性，杀死百分比喂食PBS补充液体的试验组 24.8±4.80.1％FSE 33.2±4.2**0.4％FSE 35.1±5.9**每个数值均以平均值±SD表示。采用单向ANOVA试验分数数据，**表示与对照组相比较之显著差异程度达0.01。
为分析FSE对化疗法所诱发NK功能下降的恢复能力，为18位接受化疗的患者检查给予发酵的大豆萃取液前及后的NK活性变化。结果显示口服发酵的大豆萃取液患者的NK总活性由5.751％提高至13.493％(p＝0.02)。
NK活性百分比示于下表2表2NK活性临床分析法(n＝18)处理 NK活性(％，K562，E/T＝25) p值对照组(C/T) 5.751FSE(C/T+FSE) 13.493 0.02上述结果为开放标识，交叉试验，没有安慰剂对照组设计的临床分析法。
虽然本文已出示及说明本发明某些新颖特色，且在所附权利要求书中指明，但并无意受上述详细说明的限制，因为可以了解，本领域技术人员可在不偏离本发明精神的前提下，为所说明装置的形式与细节进行各种省略、修饰、取代及改变。
权利要求
1.发酵的大豆萃取液在制备预防和/或治疗个体涉及天然杀伤细胞活化作用的疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的大豆萃取液的应用，其中该疾病为癌症或感染性疾病。
3.根据权利要求1所述的大豆萃取液的应用，其中该萃取液通过将大豆萃取液的水溶液与至少一种乳酸菌及至少一种酵母菌共同发酵而制得，藉此提高天然杀伤细胞活性。
4.根据权利要求1所述的大豆萃取液的应用，其中该发酵的大豆萃取液为发酵的黄豆萃取液。
5.根据权利要求1所述的大豆萃取液的应用，其中该发酵的大豆萃取液为发酵的黑豆萃取液。
6.根据权利要求1所述的大豆萃取液的应用，其中该涉及天然杀伤细胞活化作用的疾病为调节个体涉及天然杀伤细胞活性的免疫系统的疾病。
7.根据权利要求1所述的大豆萃取液的应用，其中所述药物用于个体经化疗法与放射疗法后的免疫力调节。
全文摘要
本发明涉及发酵的大豆(Glycine max(L.))萃取液在增强天然杀伤(NK)细胞活性中的用途，该大豆萃取液由大豆水性萃取液与至少一种乳酸菌及至少一种酵母菌共同发酵制得。具体地说，发酵的大豆萃取液可用于预防和/或治疗个体涉及NK细胞活化作用的疾病，如癌症、感染性疾病及调节免疫系统。本发明的发酵的大豆萃取液还在改善经化学治疗和放射治疗的患者的免疫力方面有效，以减轻对这些治疗途径所产生的副作用的反应。
文档编号A61P37/00GK1471935SQ0212715
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月31日 优先权日2002年7月31日
发明者路孔明 申请人:中天生物科技股份有限公司