专利名称：人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、其编码序列、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及一种人丝氨酸/苏氨酸激酶(humanserine/threoninekinase a，hSTKa)及其转录本hSTKc的cDNA序列。本发明还涉及由上述核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用及生产方法蛋白激酶的主要作用是催化蛋白质的磷酸化，总体上包括蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，简称“STK”)和蛋白质的酪氨酸激酶两大类。蛋白激酶在生物体内发挥着重要的功能，其在生物体内主要是通过蛋白的磷酸化或者通过与起调节作用的小分子结合，在翻译后水平上对蛋白发挥正常功能进行调控的。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的表达受到糖皮质激素、生长因子、细胞体积及细胞损伤等各种因素的影响。
STK在进化上非常保守，其结构上尤其在其催化功能语中有许多保守区域。如催化区的N端为甘氨酸富集段，该富集段附近还有一个赖氨酸，研究显示该区与ATP的结合有关。催化区中心是保守的天冬氨酸，它与激酶的催化活性密切相关。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶广泛存在于生物体的各个部分中，包括各种组织、器官和血清中，参与细胞发挥正常功能所必须的众多过程，如基因的转录，翻译，蛋白的分泌及细胞的移动和细胞器的生物合成等。
由于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在细胞生理活动中所起的基础性作用，人们对其，尤其是该家族成员在人类中的表达作用情况的研究日渐广泛和深入。1994年，Small D等人克隆了人干细胞STK-1并研究了其在正常人骨髓中的表达情况，结果表明，STK-1可能是造血干细胞的生长因子受体(Proc Natl Acad Sci 1994，91(2)459-463)。1996年，Chen，H.，等人研究了人皮肤微脉管内皮细胞STK-1基因组第九和第十个外显子的和突变情况。1998年，Li X.等人报道克隆得到了STK-2。Brodbeck，D.，Nakatani，K.，Masure，S.，等人克隆并鉴定了了RAC-gamma serine/threonine protein kinase(Akt-3)(J.Biol.Chem.274(14)，9133-9136(1999)；Biochem.Biophys.Res.Commun.257(3)，906-910(1999)；Eur.J.Biochem.265(1)，353-360(1999)。2001年Stanchi，F.等人在分离与酵母序列相似的人类基因时还得到了一个由603个氨基酸残基组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，Genbank登录号为CAA07196，进一步证明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶对细胞生长的必需性(Yeast，18(1)，69-80)。
然而，在本发明之前，尚没有任何人公开过本发明所述的人丝氨酸/苏氨酸激酶hSTKa和hSTKc。
本发明的目的之二是提供一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码一种人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶b(humanserine/threoninekinase c，hSTKc)，它是上述hSTKa的转录剪切本。
本发明的目的之三是提供一种蛋白，该蛋白被命名为人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶a(humanserine/threoninekinase a，hSTKa)。
本发明的目的之四是提供一种蛋白，该蛋白被命名为人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶c(humanserine/threoninekinase c，hSTKc)。
本发明的目的之五是提供一种利用重组技术生产所述的hSTKa和hSTKc蛋白的方法。
本发明的目的之六是提供hSTKa和hSTKc核酸序列和蛋白的应用。
在本发明提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人hSTK蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3中所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的hSTK蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有hSTK蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有hSTK蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hSTK蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3中核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hSTK蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hSTK蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hSTK蛋白活性的多肽。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“hSTK蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有hSTK蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中3-2009位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框3-2009位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中3-2009位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸3-2009位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸3-2009位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人hSTK相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“hSTK蛋白多肽”指具有hSTK蛋白活性的SEQ IDNO.2或SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人hSTK相同功能的、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括hSTK蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与本发明的hSTK DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗hSTK多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含hSTK多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了hSTK多肽的可溶性片段。通常，该片段具有hSTK多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明所指的hSTK蛋白或多肽的类似物与天然hSTK多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括hSTK多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内hSTK的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有hSTK多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hSTK的核酸分子。
本发明还包括检测hSTK核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hSTK多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对hSTK DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于hSTK基因产物或片段。较佳地，指那些能与hSTK基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制hSTK蛋白的分子，也包括那些并不影响hSTK蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的hSTK基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的hSTK基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达hSTK或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人.In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y，1981)。本发明的抗体包括能阻断hSTK功能的抗体以及不影响hSTK功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用hSTK基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与hSTK基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明中，人hSTKa的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgt10cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用两对寡核苷酸为引物A1 CGATGACATCGACGGGGAAGGAC；A2 CAACAA GCTGCTG CAGGACCTG为正向引物；B1CAGGTCCTCATC CTCCTGGCTCG；B2 GATGGCCTC GTGGAGGT GACATG为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断，大小分别为约一千和一千一百个碱基对的片段及杂质。去除杂质，提高所需核苷酸片段的浓度，分别用PshAI酶切得到的片段，并连接，最后得到目的片段。
以人睾丸λgt10cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用两对寡核苷酸为引物A1CGATGACATCG ACGGGGAAGGAC；A2 CAACAA GCTGCTG CAGGACCTG为正向引物；B1CA GGTCCTCATC CTCCTGGCTCG；B2 GCTAGTG TGTCTAAGGCTGCTCG为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断，大小分别为约一千和一千三百个碱基对的片段及杂质。去除杂质，提高所需核苷酸片段的浓度，分别用PshAI酶切得到的片段，并连接，最后得到目的片段。
本发明的hSTKa和hSTKc是由同一DNA转录翻译而来，只是在转录过程中由于转录产物的剪切拼接方式不同，故而产生了不同的蛋白，但其在序列和制备方法上有很大的相似性。
用本发明的hSTKa和hSTKc蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS ranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它与某些已鉴定的丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族成员(如CAA64382、JC1446和CAA07196)都有一定同源性，并且其结构中具有丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族成员的特征功能域。
综上所述，本发明的hSTKa和hSTKc属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，具有该家族成员的共同特征，即可通过胞外的免疫球蛋白样结构与细胞因子接合，并通过其胞内部分的磷酸酯酶活性将细胞因子携带的信号传递至胞内，作用于靶分子，从而对细胞乃至生物体的生理活动提到调控作用。这些生理作用包括促进组织生长，调控细胞的生长和增殖，激活、抑制免疫细胞，刺激造血细胞，激活炎症反应，防止病毒、细菌入侵等。
将本发明的hSTKa和hSTKc核苷酸或氨基酸序列与医药上可接受的载体相连可以制成试剂、药物和试剂盒，以预防、诊断和治疗由于hSTKa或hSTKc表达不正常而引起的疾病。
表1为hSTKa、hSTKac和CAA07196的氨基酸序列同源比较。其中，“*”表示三个序列中相应位置上的氨基酸相同，“”表示三个序列中相应位置上的氨基酸虽不相同但其理化性质大致相同，“.”表示三个序列中相应位置上的氨基酸理化性质有一定相同性，“-″表示三个序列中相应位置上没有对应的氨基酸。
(2).PCR产物的测序将PCR扩增产物与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprepPlasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后获得全长cDNA序列，共2023bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于3-2009位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出hSTKa的氨基酸序列，共668个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。
实施例2hSTKa在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码hSTKa的cDNA序列，用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得hSTK a cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-CCCCGGATCCATGACA TCGACGGGGA AGG，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的hSTKa的部分编码序列；3′端引物序列为5’TGACAAGCTTACTTTTCG GGATAATTC，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和hSTKa的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和HindIII消化pQE-9载体和插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用PshAI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证hSTK的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的hSTK。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱hSTK。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白，纯化后的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例3hSTKa在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码hSTKa的cDNA序列下列寡核苷酸引物进行扩增，获得hSTKacDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-CCCCAAGCTTATGACA TCGACGGGGA AGG该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的hSTKa的部分编码序列；3′端引物序列为5’-TGACGGATCCACTTTTCG GGATAATTC该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和hSTKa的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII及BamHI消化pcDNA3载体和插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用PshAI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证hSTKa的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行，转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1MNaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例4hSTKc的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人睾丸λgt10cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用两对寡核苷酸为引物A1CGATGACATCG ACGGGGAAGGAC；A2 CAACAA GCTGCTG CAGGACCTG为正向引物；B1CA GGTCCTCATC CTCCTGGCTCG；B2 GCTAGTG TGTCTAAGGCTGCTCG为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断，大小分别为约一千和一千三百个碱基对的片段及杂质。去除杂质，提高所需核苷酸片段的浓度，分别用PshAI酶切得到的片段，并连接，最后得到目的片段。
2.PCR产物的测序将PCR扩增产物与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprepPlasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后获得全长cDNA序列，共2223bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于3-2009位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出hSTKc的氨基酸序列，共736个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例5
hSTKc在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码hSTKc的cDNA序列，用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得hSTKc cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-CCCCGGATCCATGACA TCGACGGGGA AGG，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的hSTKc的部分编码序列；3′端引物序列为5’-AGTGAAGCTTAG GCTGCTCGCG GCGGGCG，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和hSTKc的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和HindIII消化pQE-9载体和插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用PshAI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证hSTKc的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的hSTK。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱hSTK。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白，纯化后的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例6hSTKc在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码hSTKc的cDNA序列下列寡核苷酸引物进行扩增，获得hSTKccDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-CCCCAAGCTTATGACA TCGACGGGGA AGG该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的hSTKc的部分编码序列；3′端引物序列为5’-AG TGGGATCCAG GCTGCTCGCG GCGGGCG该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和hSTKc的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII及BamHI消化pcDNA3载体和插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用PshAI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证hSTKc的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行，转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例7同源比较用本发明的hSTKa和hSTKc蛋白(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4)在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDSranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它与某些已鉴定的丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族成员(如CAA64382、JC1446和CAA07196)都有一定同源性，并且其结构中具有丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族成员的结构特征。
丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白家族成员的结构特征为[LIVMFYC]-x-[HY]-x-D-[LIVMFY]-K-x(2)-N-[LIVMFYCT](3).其中，[LIVMFYC]是指从LIVMFYC其中氨基酸中任选一个，x为任意氨基酸，x(2)为任意2个氨基酸。本发明的蛋白属于该结构如下hSTKaRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCQKVAIKIVNREKLSESVLMKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKFFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHYACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPPDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWY(SEQ ID NO.2中19-270)；hSTKcRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCQKVAIKIVNREKLSESVLMKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKFFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHYACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPPDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWY(SEQ ID NO.4中19-270)(htttp//smart.embl-heidelberg.de/smart/show motifs.pl)综上所述，本发明的hSTKa和hSTKc属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，具有该家族成员的共同特征，即可通过胞外的免疫球蛋白样结构与细胞因子接合，并通过其胞内部分的磷酸酯酶活性将细胞因子携带的信号传递至胞内，作用于靶分子，从而对细胞乃至生物体的生理活动提到调控作用。这些生理作用包括促进组织生长，调控细胞的生长和增殖，激活、抑制免疫细胞，刺激造血细胞，激活炎症反应，防止病毒、细菌入侵等。
本发明的hSTKa和hSTKc除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明hSTKa和hSTKc还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，例如可将本发明hSTKa和hSTKc的N端与鼠STK的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明的hSTKa和hSTKc的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
实施例8制备抗体将本发明的hSTKa和hSTKc重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀hSTK基因翻译产物的能力加以评估。
实施例9作为微矩阵的底物微矩阵，又称为DNA芯片。通过使用一些著名的生物软件(如LASERGENESOFTWARE(DNASTAR)，来选择将hSTK全长cDNA、EST、或基因片段作为微矩阵的底物样品。然后通过使用喷墨技术及一系列化学方法如射线、化学、热力学、机械方法等把样品固定在载体上，如玻璃上，得到芯片(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；andShalon，D.et al.(1996)Genome Res.6639-645.)，形成的元件有点状、条形等等。一块典型的芯片通常含有一定数量的元件。杂交反应后，洗去未结合的探针，然后用扫描仪来检测发生杂交反应的元件及反应的程度。探针与每一个芯片元件的互补性和结合量都可通过对扫描出的图像的分析来判断。
杂交结果可用于检测出hSTKa和hSTKc基因变异、突变及多态现象，理解由于hSTKa和hSTKc表达不正常引起的疾病的分子基础，诊断疾病，并可改进及监测相关药剂的活性。
实施例10试剂盒的制备试剂盒1它含有(1)特异性扩增hSTKa和hSTKc的引物对和使用说明。该试剂盒还可含有或不含有将mRNA逆转录成cDNA的所需试剂。其中，该特异性引物的序列衍生自SEQ IDNO1的序列。对逆转录成的cDNA进行特异性扩增，以检测样品中是否含有hSTKa和hSTKc的核酸序列。该试剂盒还可含有进行PCR反应所需的其他试剂，例如缓冲液等。
此外，较佳地，至少一个所用的引物跨越了两个外显子，因为此时对应于hSTKa和hSTKc的基因组序列将不产生扩增产物。
试剂盒2该试剂盒含有针对hSTKa和hSTKc的特异性的抗体(例如实施例5中制备的多克隆抗体，或者用标准的杂交瘤技术产生的抗hSTKa和hSTKc的单克隆抗体)，和使用说明。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在或缺失hSTKa和hSTKc蛋白。先通过特异性免疫反应形成免疫复合物，然后用常规技术检测免疫复合物。
试剂盒3该试剂盒含有可特异性地与hSTKa和hSTKc的mRNA杂交的探针。它还可含有或不含有杂交缓冲液。该试剂盒通过核酸分子与hSTKa和hSTKc特异性探针之间的杂交反应来检测样品中是否存在hSTKa和hSTKc的核酸分子。
试剂盒也可用于检测出基因变异、突变及多态现象，并检测出一系列与本发明的hSTK相关的基因，从而对相关疾病的诊断、治疗起辅助作用。
实例11
制成药物本发明的hSTKa和hSTKc蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等可作为药物，可促进烫伤烧伤、组织切除乃至器官摘除后的伤口愈合，防止伤口感染。将本发明的hSTKa和hSTKc核酸反义链或hSTKa和hSTKc抗体制成试剂盒可用于减轻或辅助治疗由于hSTKa和hSTKc表达量过高而导致的疾病，也可辅助临床上肿瘤和癌症的诊断，预防及治疗。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
此外，本发明hSTKa和hSTKc核酸(编码序列或反义序列)可以直接引入细胞，以提高hSTKa和hSTKc的表达水平或者抑制hSTKa和hSTKc的过度表达。本发明的hSTKa和hSTKc蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因hSTKa和hSTKc缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
当本发明的hSTKa和hSTKc蛋白多肽被用作药物时，治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
序列表<210>1<211>2032<212>核苷酸<213>人类<220><221>编码序列<222>(3)..(2009)<223><400>1cg atg aca tcg acg ggg aag gac ggc ggc gcg cag cac gcg cag tat 47Met Thr Ser Thr Gly Lys Asp Gly Gly Ala Gln His Ala Gln Tyr1 5 10 15gtt ggg ccc tac cgg ctg gag aag acg ctg ggc aag ggg cag aca ggt95Val Gly Pro Tyr Arg Leu Glu Lys Thr Leu Gly Lys Gly Gln Thr Gly20 25 30ctg gtg aag ctg ggg gtt cac tgc gtc acc tgc cag aag gtg gcc atc 143Leu Val Lys Leu Gly Val His Cys Val Thr Cys Gln Lys Val Ala Ile35 40 45aag atc gtc aac cgt gag aag ctc agc gag tcg gtg ctg atg aag gtg 191Lys Ile Val Asn Arg Glu Lys Leu Ser Glu Ser Val Leu Met Lys Val50 55 60gag cgg gag atc gcg atc ctg aag ctc att gag cac ccc cac gtc cta 239Glu Arg Glu Ile Ala Ile Leu Lys Leu Ile Glu His Pro His Val Leu65 70 75aag ctg cac gac gtt tat gaa aac aaa aaa tat ttg tac ctg gtg cta 287Lys Leu His Asp Val Tyr Glu Asn Lys Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Leu80 85 90 95gaa cac gtg tca ggt ggt gag ctc ttc gac tac ctg gtg aag aag ggg 335Glu His Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Leu Val Lys Lys Gly100 105 110agg ctg acg cct aag gag gct cgg aag ttc ttc cgg cag atc atc tct 383Arg Leu Thr Pro Lys Glu Ala Arg Lys Phe Phe Arg Gln Ile Ile Ser115 120 125gcg ctg gac ttc tgc cac agc cac tcc ata tgc cac agg gat ctg aaa 431Ala Leu Asp Phe Cys His Ser His Ser Ile Cys His Arg Asp Leu Lys130 135 140cct gaa aac ctc ctg ctg gac gag aag aac aac atc cgc atc gca gac 479Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu Lys Asn Asn Ile Arg Ile Ala Asp145 150 155ttt ggc atg gcg tcc ctg cag gtt ggc gac agc ctg ttg gag acc agc 527Phe Gly Met Ala Ser Leu Gln Val Gly Asp Ser Leu Leu Glu Thr Ser160 165 170 175tgt ggg tcc ccc cac tac gcc tgc ccc gag gtg atc cgg ggg gag aag 575Cys Gly Ser Pro His Tyr Ala Cys Pro Glu Val Ile Arg Gly Glu Lys180 185 190tat gac ggc cgg aag gcg gac gtg tgg agc tgc ggc gtc atc ctg ttc 623Tyr Asp Gly Arg Lys Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe195 200 205gcc ttg ctg gtg ggg gct ctg ccc ttc gac gat gac aac ttg cga cag 671Ala Leu Leu Val Gly Ala Leu Pro Phe Asp Asp Asp Asn Leu Arg Gln210 215 220ctg ctg gag aag gtg aag cgg ggc gtg ttc cac atg ccg cac ttt atc 719Leu Leu Glu Lys Val Lys Arg Gly Val Phe His Met Pro His Phe Ile225 230 235ccg ccc gac tgc cag agt ctg cta cgg ggc atg agc gag gtg gac gcc 767Pro Pro Asp Cys Gln Ser Leu Leu Arg Gly Met Ser Glu Val Asp Ala240 245 250 255gca cgc cgc ctc acg cta gag cac att cag aaa cac ata tgg tat ata 815Ala Arg Arg Leu Thr Leu Glu His Ile Gln Lys His Ile Trp Tyr Ile260 265 270ggg ggc aag aat gag ccc gaa cca gag cag ccc att cct cgc aag gtg 863Gly Gly Lys Asn Glu Pro Glu Pro Glu Gln Pro Ile Pro Arg Lys Val275 280 285cag atc cgc tcg ctg ccc agc ctg gag gac atc gac ccc gac gtg ctg 911Gln Ile Arg Ser Leu Pro Ser Leu Glu Asp Ile Asp Pro Asp Val Leu290 295 300gac agc atg cac tca ctg ggc tgc ttc cga gac cgc aac aag ctg ctg 959Asp Ser Met His Ser Leu Gly Cys Phe Arg Asp Arg Asn Lys Leu Leu305 310 315cag gac ctg ctg tcc gag gag gag aac cag gag aag atg att tac ttc 1007Gln Asp Leu Leu Ser Glu Glu Glu Asn Gln Glu Lys Met 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515 520 525Glu Lys Glu Glu Gln Ile Phe Val Val Ile Lys Asp Lys Pro Leu Ser530 535 540Ser Ile Lys Ala Asp Ile Val His Ala Phe Leu Ser Ile Pro Ser Leu545 550 555 560Ser His Ser Val Ile Ser Gln Thr Ser Phe Arg Ala Glu Tyr Lys Ala565 570 575Thr Gly Gly Pro Ala Val Phe Gln Lys Pro Val Lys Phe Gln Val Asp580 585 590Ile Thr Tyr Thr Glu Gly Gly Glu Ala Gln Lys Glu Asn Gly Ile Tyr595 600 605Ser Val Thr Phe Thr Leu Leu Ser Gly Pro Ser Arg Arg Phe Lys Arg610 615 620Val Val Glu Thr Ile Gln Ala Gln Leu Leu Ser Thr His Asp Pro Pro625 630 635 640Ala Ala Gln His Leu Ser Asp Thr Thr Asn Cys Met Glu Met Met Thr645 650 655Gly Arg Leu Ser Lys Cys Gly Ile Ile Pro Lys Ser660 665<210>3<211>2223<212>核苷酸<213>人类<220><221>编码序列<222>(3)..(2213)<223><400>3cg atg aca tcg acg ggg aag gac ggc ggc gcg cag cac gcg cag tat47Met Thr Ser Thr Gly Lys Asp Gly Gly Ala Gln His Ala Gln Tyr1 5 10 15gtt ggg ccc tac cgg ctg gag aag acg ctg ggc aag ggg cag aca ggt 95Val Gly Pro Tyr Arg Leu Glu Lys Thr Leu Gly Lys Gly Gln Thr Gly20 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530 535 540agc tcc atc aag gct gac atc gtg cac gcc ttc ctg tcg att ccc agt 1679Ser Ser Ile Lys Ala Asp Ile Val His Ala Phe Leu Ser Ile Pro Ser545 550 555ctc agc cac agc gtc atc tcc caa acg agc ttc cgg gcc gag tac aag 1727Leu Ser His Ser Val Ile Ser Gln Thr Ser Phe Arg Ala Glu Tyr Lys560 565 570 575gcc acg ggg ggg cca gcc gtg ttc cag aag ccg gtc aag ttc cag gtt 1775Ala Thr Gly Gly Pro Ala Val Phe Gln Lys Pro Val Lys Phe Gln Val580 585 590gat atc acc tac acg gag ggt ggg gag gcg cag aag gag aac ggc atc 1823Asp Ile Thr Tyr Thr Glu Gly Gly Glu Ala Gln Lys Glu Asn Gly Ile595 600 605tac tcc gtc acc ttc acc ctg ctc tca ggc ccc agc cgt cgc ttc aag 1871Tyr Ser Val Thr Phe Thr Leu Leu Ser Gly Pro Ser Arg Arg Phe Lys610 615 620agg gtg gtg gag acc atc cag gcc cag ctg ctg agc aca cac gac ccg 1919Arg Val Val Glu Thr Ile Gln Ala Gln Leu Leu Ser Thr His Asp Pro625 630 635cct gcg gcc cag cac ttg tca gac acc act aac tgt atg gaa atg atg 1967Pro Ala Ala Gln His Leu Ser Asp Thr Thr Asn Cys Met Glu Met 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Ser Thr Pro Ala Lys Arg Ser Ala His Gly Pro Leu Gly Asp Ser690 695 700Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Gly Gly Asp Ala Glu Tyr Pro Thr Gly705 710 715 720Lys Asp Thr Ala Lys Met Gly Pro Pro Thr Ala Arg Arg Glu Gln Pro725 730 735
表1hSTKa MTSTGKDGGAQHAQYVGPYRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCGKVAIKIVNREKLSESVLhSTKc MTSTGKDGGAQHAQYVGPYRLEKTLGKGQTGLVKLGVHCVTCQKVAIKIVNREKLSESVLCAA07196------------------------------------------------------------hSTKa MKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKhSTKc MKVEREIAILKLIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARKCAA07196-----------LIEHPHVLKLHDVYENKKYLYLVLEHVSGGELFDYLVKKGRLTPKEARK*************************************************hSTKa FFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHhSTKc FFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPHCAA07196FFRQIISALDFCHSHSICHRDLKPENLLLDEKNNIRIADFGMASLQVGDSLLETSCGSPH************************************************************hSTKa YACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPhSTKc YACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIPCAA07196YACPEVIRGEKYDGRKADVWSCGVILFALLVGALPFDDDNLRQLLEKVKRGVFHMPHFIP************************************************************hSTKa PDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWYIGGKNEPEPEQPIPRKVQIRSLPSLEDIDPhSTKc PDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWYIGGKNEPEPEQPIPRKVQIRSLPSLEDIDPCAA07196PDCQSLLRGMSEVDAARRLTLEHIQKHIWYIGGKNEPEPEQPIPRKVQIRSLPSLEDIDP************************************************************hSTKa DVLDSMHSLGCFRDRNKLLGDLLSEEENQEKMIYFLLLDRKERYPSQEDEDLPPRNEIDPhSTKc DVLDSMHSLGCFRDRNKLLQDLLSEEENQEKMIYFLLLDRKERYPSQEDEDLPPRNEIDPCAA07196DVLDSMHSLGCFRDRNKLLQDLLSEEENQEKMIYFLLLDRKERYPSQEDEDLPPRNEIDP************************************************************hSTKa PRKRVDSPMLNRHGKRRPERKSMEVLSVTDGGSPVPARRAIEMAQHGQRSRSISGASSGLhSTKc PRKRVDSPMLNRHGKRRPERKSMEVLSVTDGGSPVPARRAIEMAQHGQRSRSISGASSGLCAA07196PRKRVDSPMLNRHGKRRPERKSMEVLSVTDGGSPVPARRAIEMAQHGQRSRSISGASSGL************************************************************hSTKa STSPLSSPRVTPHPSPRGSPLPTPKGTPVHTPKESPAGTPNPTPPSSPSVGGVPWRARLNhSTKc STSPLSSPRVTPHPSPRGSPLPTPKGTPVHTPKESPAGTPNPTPPSSPSVGGVPWRARLNCAA07196STSPLSSPRVTPHPSPRGSPLPTPKGTPVHTPKESPAGTPNPTPPSSPSVGGVPWRARLN************************************************************hSTKa SIKNSFLGSPRFHRRKLQVPTPEEMSNLTPESSPELAKKSWFGNFISLEKEEQIFVVIKDhSTKc SIKNSFLGSPRFHRRKLQVPTPEEMSNLTPESSPELAKKSWFGNFISLEKEEQIFVVIKDCAA07196SIKNSFLGSPRFHRRKLQVPTPEEMSNLTPESSPELAKKSWFGNFISLEKEEQIFVVIKD************************************************************hSTKa KPLSSIKADIVHAFLSIPSLSHSVISQTSFRAEYKATGGPAVFQKPVKFQVDITYTEGGEhSTKc KPLSSIKADIVHAFLSIPSLSHSVISQTSFRAEYKATGGPAVFQKPVKFQVDITYTEGGECAA07196KPLSSIKADIVHAFLSIPSLSHSVISQTSFRAEYKATGGPAVFQKPVKFQVDITYTEGGE************************************************************hSTKa AQKENGIYSVTFTLLSGPSRRFKRVVETIQAQLLSTHDPPAAQHLSDTTNCMEMMTGRLShSTKc AQKENGIYSVTFTLLSGPSRRFKRVVETIQAQLLSTHDPPAAQHLSDTTNCMEMMTGRLSCAA07196AQKENGIYSVTFTLLSGPSRRFKRVVETIQAQLLSTHDPPAAQHLSEPPPPAPGLSWGAG**********************************************:.. ::hSTKa KCG--------IIPKS--------------------------------------------hSTKc KCGSPLSNFFDVIKQLFSDEKNGQAAQAPSTPAKRSAHGPLGDSAAAGPGPGGDAEYPTGCAA07196LKG-------QKVATSYESSL---------------------------------------* :hSTKa ----------------hSTKc KDTAKMGPPTARREQPCAA07196----------------
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有hSTK蛋白激酶多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列是SEQ ID NO.1中核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
5.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列是SEQ ID NO.3中核苷酸序列。
6.一种分离得到的hSTK蛋白多肽，其特征在于，它是与SEQ ID NO.2氨基酸序列有至少95％的同源性。
7.一种分离得到的hSTK蛋白多肽，其特征在于，它是具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、其活性片段或其活性衍生物。
8.如权利要求7所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
9.如权利要求6所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
10.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
11.一种用权利要求10所述载体转化的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
13.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
14.一种产生具有hSTK蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将如权利要求1至5所述的核苷酸序列连于表达调控序列，形成hSTK蛋白表达载体；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hSTK蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hSTK蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hSTK蛋白活性的多肽。
15.一种能与权利要求6所述的hSTK蛋白多肽特异性结合的抗体。
16.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
17.一种权利要求1所述DNA分子的应用，其特征在于，它作为引物用于核酸扩增反应或者用制造基因芯片；或者用于制备药物。
18.一种权利要求6所述蛋白多肽的应用，其特征在于，它应用于筛选人丝氨酸/苏氨酸激酶的激动剂或抑制剂；或者用于制备药物。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及一种人丝氨酸/苏氨酸激酶(human serine/threonine kinase a，hSTKa)及其转录本hSTKc的cDNA序列。本发明还涉及由上述核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用及生产方法。
文档编号A61K38/45GK1414103SQ0213649
公开日2003年4月30日 申请日期2002年8月14日 优先权日2002年8月14日
发明者余龙, 唐丽莎, 吴海, 郭金虎, 叶光明 申请人:复旦大学