专利名称：降低非人哺乳动物来源凝血物质复合物抗原性并灭菌的方法
技术领域：
本发明涉及生物材料领域。更具体地说，本发明涉及一种对哺乳动物血液来源的凝血物质复合物进行灭菌以及降低其抗原性的方法，以及经该方法处理得到的非人哺乳动物来源凝血物质复合物组合物。
背景技术：
凝血物质复合物主要含有纤维蛋白原，第XIII因子，纤维连接蛋白等。该复合物在凝血酶和钙离子的存在下，可转变为纤维蛋白网，而发挥有效的止血和组织封闭作用，它可用于外科临床。
普通的凝血物质复合物从人血浆制得。其制备方法为提取分离人血浆后，利用各种化学试剂如聚乙二醇、乙醇、硫酸铵，借助低温沉淀或沉淀而从人血浆中浓缩凝血物质复合物。然而，上述制备方法的缺点是其整个制备过程必须在无菌条件下进行，否则难以用常规的方法(如过滤法、气体灭菌法、化学消毒法)将复合物中的诸如细菌等微生物除去。采用从人血制备的凝血物质复合物，由于其原料来源有限，因此其成本昂贵。而且，它易导致人类血源性疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等)的传播。因此难以在我国临床上常规使用。
利用哺乳动物血液来源的凝血物质复合物，可以有效地克服上述人血来源的凝血物质复合物的不足。但是，哺乳动物血液来源的凝血物质复合物是异种物质，直接用于人体后，会产生免疫反应；同时，由于该凝血物质复合物的粘度很大，且属于蛋白质，化学性质不稳定，难以用过滤除菌法和化学法进行除菌。
杨莉(中国专利申请号95106859；公告号1138483)和Kent(美国专利号6171549)等人先后报道了用钴60的电离辐射法进行上述复合物的灭菌，取得较好的效果。但该方法的问题是电离辐射灭菌法需要特殊的加工控制系统，辐射监测和测量装置，该装置投资巨大；而且辐射剂量的误差很难严格控制，一般误差在预定的辐射剂量20-50％左右。在误差小于额定辐射剂量时，产品的抗原性不能有效降低，免疫反应严重，微生物不能有效去除；而误差大于额定辐射剂量，常常会导致蛋白质变形，从而影响凝血复合物的功能。
Ritter于1801年发现，在可见光紫端外侧，有一种不可见光线，称为紫外线。进一步研究发现，紫外线可使氯化银变黑，而且比可见光更有效，从而证明了紫外线的化学作用。1877年，英国人Downes和Blunt在用紫外线照射杀灭枯草杆菌的实验中证明了紫外线的杀菌作用，从而建立了紫外线杀菌发展史上的第一个里程碑。至1929年，Gates在研究紫外线的杀菌作用时发现，不同波长的紫外线对微生物的杀灭作用不同，杀菌作用光谱平行于核酸碱基对紫外线的吸收光谱。这一发现被后人称为紫外线灭菌研究发展史的第二个里程碑。
紫外线是一种电磁波，作为横向波在空间传播。其传播速度是每秒钟振动的频率和波长的乘积。与可见光一样，紫外线的传播亦是直线传播。不同物质对紫外线的透过率不同。普通玻璃对于可见光是透明的，但却不能透过紫外线。而石英玻璃可以透过80％以上的杀菌紫外线。有机玻璃几乎不透过紫外线。紫外线分为A波，B波，C波和真空紫外线。其中C波紫外线为杀菌紫外线，其波长范围是200-275nm。一般认为，杀菌作用最强的波段是254nm左右，但不同作者用不同微生物试验的结果不尽相同。Gates指出对金黄色葡萄球菌杀灭作用最强的波长是265.2nm。Duggar等证明对芽孢杆菌杀灭作用强的波段是265.2-280.4nm之间。Sygkes指出240-280nm是最强的杀菌波段。紫外线可以杀灭各种微生物，包括细菌、真菌、病毒、立克次体等。每种微生物都有其特定的紫外线死亡阈值。杀菌剂量(K)是照射强度(I)和照射时间(T)的乘积(即，K＝It)。
紫外线杀菌的机理主要作用于微生物的核酸，由于DNA核苷酸的碱基受紫外线照射后被破坏，从而导致微生物死亡。紫外线可以被蛋白质上的氨基酸所吸收，从而使这些化学基团破坏，导致蛋白质变形，结构改变，使其失去功能。目前还未曾见到有关用紫外线处理哺乳动物血液来源凝血物质复合物的报道。
因此，本领域仍然迫切需要有对哺乳动物血液来源的凝血物质复合物进行灭菌的新方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种对哺乳动物血液来源的凝血物质复合物进行灭菌且同时降低其抗原性的新方法。
本发明的另一个目的是提供一种无菌且抗原性降低的哺乳动物血液来源的凝血物质复合物组合物。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种降低非人哺乳动物来源凝血物质复合物抗原性并同时灭菌的方法，该方法包括在所述复合物中加入浓度为0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸，用剂量为50-1000万μW·s/cm2的紫外线照射，在辐照时使所述复合物溶液的厚度为1-50毫米。
本发明另一方面提供了用上述方法得到的无菌且抗原性降低的非人哺乳动物来源凝血物质复合物组合物，该组合物含有非人哺乳动物来源凝血物质复合物以及0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。
本发明的意义在于通过采用本发明方法，可以简便地、有效地降低非人哺乳动物来源的凝血物质复合物中各种蛋白质异种免疫原性，杀灭其中的微生物，同时保存促进凝血的功能，从而为哺乳动物血来源的凝血物质复合物的临床应用，以发挥有效的止血和组织封闭功能奠定了坚实的基础。本发明方法制得的无菌且抗原性降低的非人哺乳动物来源凝血物质复合物组合物作为一种止血和组织封闭剂的组成部分之一，可以广泛地用于普外科、神经外科、心血管外科、泌尿外科、妇产科、整形外科、五官科、烧伤科等领域。另外，本发明所涉及的哺乳动物血液不仅原料来源广泛，价格低廉，同时，所制备的凝血物质复合物还可以有效地避免人类血源性疾病的传播。
下面将进一步详细描述本发明。
发明
具体实施例方式
首先，本发明提供了一种降低非人哺乳动物来源凝血物质复合物抗原性并同时灭菌的方法，该方法包括在所述复合物中加入浓度为0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸，用剂量为50-1000万μW·s/cm2的紫外线照射，在辐照时使所述复合物溶液的厚度为1-50毫米。
所述“非人哺乳动物”例如可以是除人之外的灵长类动物、羊、牛、猪、熊、猫、狗、马、啮齿类动物等。但是，从血液的来源、成本和大批量制备等角度考虑，较佳的哺乳动物选自猪、牛、羊和马。
非人哺乳动物来源凝血物质复合物主要含有纤维蛋白原、第XIII因子、纤维连接蛋白等。它可以市售购得，或可用本领域技术人员熟知的方法从非人哺乳动物血液制得。上述购得或制得的非人哺乳动物来源凝血物质复合物可直接用于本发明的方法中，也可用常规方法经适当地稀释或增浓后用于本发明的方法中。在较佳的实施方案中，宜使非人哺乳动物来源凝血物质复合物中的纤维蛋白原浓度为0.5-200毫克/毫升，更佳的为10-100毫克/毫升。
在本发明方法中，对非人哺乳动物来源凝血物质复合物进行灭菌是通过采用高剂量的紫外线辐照来实现的。在现有技术中，紫外线对清水进行灭菌的常用剂量在6-7万μW·s/cm2范围内。而为实现本发明的目的，需要采用剂量为高剂量，即50-1000万μW·s/cm2的紫外线进行辐照灭菌。在一个较佳的实施方案中，紫外线照射剂量宜为100-600万μW·s/cm2。本发明方法中所采用的紫外线的波长为200-300纳米。在较佳的实施方案中，紫外线的波长为200-280纳米，更佳的为240-280纳米。
如上所述，不同物质对紫外线的透过率不同。例如，石英玻璃可以透过80％以上的杀菌紫外线。因此，在本发明的一个较佳实施方案中，可将所述复合物溶液置于石英玻璃容器内进行辐照。石英玻璃容器的厚度可以为1毫米-20毫米，较佳的厚度为5毫米-10毫米。然而，本领域技术人员也可以在本说明书的基础上采用任何其它能使杀菌紫外线透过的材料来制备盛放所述复合物溶液的容器。
另外，在本发明的方法中，受辐照的复合物溶液的厚度需在1毫米-50毫米之间。若厚度超过50毫米，则紫外线不能完全穿透溶液，因而不能起到很好的杀菌作用。若厚度小于1毫米，则处理量小，导致成本提高。在一个更佳的实施方案中，受辐照的复合物溶液的厚度为2毫米-10毫米。
本发明方法在灭菌的同时还导致非人哺乳动物来源凝血物质复合物的抗原性降低。其主要原因是蛋白质的抗原决定簇在高剂量的紫外线作用下发生改变。然而，与此同时，凝血物质复合物中的凝血因子功能也因变性作用而大幅度降低。为此，本发明者设计了一个保护配方，即，在所述凝血物质复合物内加入0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。在该保护配方的作用下，可以有效地使凝血物质中各凝血因子的抗原性降低，同时使凝血蛋白的功能得以有效保存。在一个较佳的实施方案中，路丁的浓度为0.2-3mM，甘氨酸的浓度为0.2-10mM。在一个更佳的实施方案中，路丁的浓度为0.2-1mM，甘氨酸的浓度为0.2-1mM。
本发明还提供了用上述方法得到的无菌且抗原性降低的非人哺乳动物来源凝血物质复合物组合物，该组合物含有非人哺乳动物来源凝血物质复合物以及0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。
该组合物可以制成各种临床外科常规采用的剂型形式，例如粉剂或膜剂，也可粘附于如明胶海绵、胶原蛋白膜、聚四氟乙烯膜等高分子生物材料上。
下面将通过实施例和试验来进一步对本发明的应用作举例说明。
采用等电点沉淀法制备猪血来源的凝血物质复合物水溶液，使其纤维蛋白原浓度为70毫克/毫升。将该水溶液分为试验组和对照组一，对照组二。在实验组内加入0.5mM路丁和0.5mM甘氨酸；对照组一不加保护剂路丁和甘氨酸，但经过紫外线照射；对照组二不加保护剂，不经紫外线照射。
将待紫外线处理的组置于在石英玻璃制成的装置内，使溶液厚度为2毫米。用波长为253nm的紫外灯照射，照射剂量分别为60万、100万、200万、300万、400万、500万μW·s/cm2。而后分别进行如下试验。
试验一用兔抗猪纤维蛋白原抗体、兔抗猪第XIII因子和兔抗猪纤维连接蛋白抗体分别与试验组和两对照组样品进行抗原抗体反应。放射免疫测定法结果显示试验组和对照组一的游离抗体滴度分别较对照组二提高3倍、5倍、6倍、7倍、10倍和13倍。
试验二按照中国药典规定的方法进行无菌试验和热原试验。分别将试验组、对照组一、对照组二样本加入需氧和厌氧菌培养体系内。试验组和对照组一样品内无细菌生长。同时无热原反应。
试验三将上述试验组，对照组一和对照组二的样品3毫升，分别与等量含凝血酶500U/毫升的40毫摩尔氯化钙溶液混和后，观察纤维蛋白凝胶形成时间。试验组和对照组一的凝胶形成时间见下表一。
表一 纤维蛋白凝胶形成时间(秒) *紫外线照射剂量单位万μW·s/cm2**对照组二的平均纤维蛋白凝胶形成时间为4-8秒试验四取Waster大鼠180只，随机等量分为三组。在乙醚麻醉下，制备肝脏渗血模型。将上述试验组，对照组一和对照组二的样品3毫升，分别与等量含凝血酶500U/毫升的40毫摩尔氯化钙溶液装入双联注射器内，进行肝脏渗血模型止血试验。以确定一分钟内止血率和五分钟止血率。结果如表二所示
表二 肝脏渗血模型一分钟止血率试验(％) *紫外线照射剂量单位万μW·s/cm2**括号外数字为一分钟止血率。单位％；括号内数字为五分钟止血率。单位％。
***对照组二的平均一分钟止血率为85％；五分钟止血率为95％。
从上述试验可以得出结论，经本发明方法处理得到的凝血物质复合物是无菌的，其抗原性降低但却仍然保留了促进凝血的功能。
尽管本发明参照具体例子作了详细的描述，但是本领域技术人员显然能在不脱离本发明的精神和范围的前提下对本发明作各种变化和改动。因此，这些变化和改动均包括在所附权利要求的范围内。
权利要求
1.一种降低非人哺乳动物来源凝血物质复合物抗原性并同时灭菌的方法，其特征在于，在所述复合物溶液中加入浓度为0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸，用剂量为50-1000万μW·s/cm2的紫外线照射，在辐照时使所述复合物溶液厚度为1-50毫米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，路丁的浓度为0.2-1mM，甘氨酸的浓度为0.2-1mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，紫外线照射剂量为100-600万μW·s/cm2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所采用的紫外线的波长为200-300nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合物溶液中的纤维蛋白原浓度为0.5-200毫克/毫升。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物选自猪、牛、羊、马。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合物溶液的厚度为2-10毫米。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述复合物溶液置于石英玻璃容器内进行辐照。
9.一种用权利要求1所述的方法得到的无菌且抗原性降低的非人哺乳动物来源凝血物质复合物组合物，其特征在于，它含有非人哺乳动物来源凝血物质复合物以及0.1-5mM的路丁和0.1-20mM的甘氨酸。
10.根据权利要求9所述的非人哺乳动物来源凝血物质复合物组合物，其特征在于，所述组合物可制成粉剂或膜剂。
全文摘要
本发明提供了一种降低非人哺乳动物来源凝血物质复合物抗原性并同时灭菌的方法，其特征在于，在所述复合物溶液中加入浓度为0.1－5mM的路丁和0.1－20mM的甘氨酸，用剂量为50－1000万μW·s/cm
文档编号A61K35/16GK1480155SQ0213678
公开日2004年3月10日 申请日期2002年9月4日 优先权日2002年9月4日
发明者何红兵 申请人:上海松力生物技术有限公司