专利名称：高效血管生成抑制剂的设计及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程制药技术领域。
血管生成是指从已有的血管衍生、生长出新的血管。血管新生在许多人类重要疾病，如恶性肿瘤、类风湿性关节炎、视网膜和脉络膜血管新生，以及许多皮肤疾病中起着重要作用。抗血管生成治疗，即血管生成抑制疗法，是30年前由Judah Folkman博士率先提出的(Folkman，J.N.Engl.J.Med.，285，1182-1186，1971；Folkman，J.Ann.Surg.，175，409-416，1972)。他提出可以通过切断肿瘤的血液供应，达到消灭肿瘤的目的。在血管生成的过程中，有许多调节因子在发挥作用，如生长因子，细胞外基质分子，细胞膜结合的蛋白质，生长因子受体等。目前正在进行临床实验的抗血管生成药物一血管生成抑制剂，也可因其作用靶分为内皮细胞抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、血管生成生长因子拮抗剂等。其中最为著名的为Judah Folkman博士实验室发现的血管生成抑制剂angiostatin(O′Reilly，M.S.等，Cell 79，315-328，1994)，endostatin(O′Reilly，M.S.等，Cell88，277-285，1997)，人纤溶酶原kringle 5(Cao，Y.H.等，J.Biol.Chem.272，22924-22928，1997)，以及其它实验室发现的vasostatin，restin，arresten，canstatin，tumstain，prolactin N端16kD片段，troponin I，pigment epithelium derived factor，platelet factor 4等。尽管这些血管生成抑制剂呈现出非常诱人的应用前景，但是其缺陷也非常明显在小鼠动物模型实验时，angiostatin的使用剂量高达上百毫克/公斤体重，endostatin的剂量也为几十毫克/公斤体重，kringle 5的使用剂量也在几十毫克--上百毫克/公斤体重，据估计当这些血管生成抑制剂在人体使用时，使用剂量将达到至少几克/人的剂量。这样大的药物使用剂量势必会增加今后该类药物毒副作用发生的可能性，造成该类药物质量控制难度加大、生产规模和生产成本增大、而且药物价格居高。
整联蛋白(integrin)是由α、β两个亚基组成的跨膜蛋白异二聚体，它们通过和细胞外基质分子的相互作用控制细胞的迁移、分化和增殖。20多种整联蛋白中的大多数分子都能识别含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)或NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸，Asn-Gly-Arg)等序列的细胞外基质配基。一些整联蛋白能对血管生成过程起调节作用，针对某些整联蛋白的抗体也被发现具有抑制血管新生的作用。
血管生成是一个复杂的生理过程，正在新生的血管具有多种分子标记，而非单一的标记，使它们区别于已经生成的血管。因此一个好的抗血管生成的血管生成抑制剂应该具有对新生血管的多种标记分子的选择性，这样才能达到对新生血管具有导向性、选择性作用的效果；对新生血管多个标记分子或靶点同时发生作用，将会从总体上提高药物对血管生成的抑制作用；而对新生血管多靶点，和导向性、选择性的作用结果就能导致只要使用较低剂量药物，就能高效地发挥抗血管生成的作用。迄今为止的抗血管生成药物，诸如上述的angiostatin、endostatin、kringle 5等都只针对新生血管的单一靶点进行作用的分子，它们对血管的专一性和选择性尚嫌不够、对新生血管生成的抑制也只是从一个靶点进行单兵作战、效果有限，所以结果导致需要如此高的使用剂量。
本发明的目的是研制一种新的高效血管生成抑制剂，即构建一种对整联蛋白(integrn)具有结合作用的血管生成抑制剂，使现有的血管生成抑制剂具有对整联蛋白的亲和性或结合能力，赋予现有血管生成抑制剂以整联蛋白的亲和性。该种高效血管生成抑制剂能够显著提高现有的血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长及血管新生的活性和效率，提高血管生成抑制剂对内皮细胞及新生血管的特异性和选择性，降低现有血管生成抑制剂的使用剂量。
本发明的目的可以通过以下措施来达到构建含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)或NGR(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸)等整联蛋白结合序列肽段的血管生成抑制剂(如angiostatin、endostatin，kringle 5等) 基因-即高效血管生成抑制剂基因，可以将该高效血管生成抑制剂基因克隆在基因治疗载体中，直接用于基因治疗；可以利用重组DNA技术进行基因工程表达含RGD或NGR等整联蛋白结合序列肽段的高效血管生成抑制剂，分离纯化重组高效血管生成抑制剂蛋白质；或用多肽合成方法合成含有RGD或NGR等整联蛋白结合序列的肽段，然后用化学偶联的方法将含有RGD或NGR等序列的肽段连接到天然来源的或重组DNA来源的血管生成抑制剂上，构成能够和整联蛋白具有结合作用的血管生成抑制剂，即本发明所述的高效血管生成抑制剂。和整联蛋白具有结合作用的，含有RGD或NGR等序列的肽段可以融合在血管生成抑制剂的N端或C端，或同时融合在血管生成抑制剂的N端和C端 A肽、B肽分别是长度为3至90个氨基酸残基的、含有RGD或NGR等整联蛋白结合序列的多肽片段，A肽、B肽分别具有和整联蛋白结合的能力。本发明所述的高效血管生成抑制剂可显著提高现有的血管生成抑制剂抑制内皮细胞增殖和血管生成的生物活性，能够作为治疗疾病的药物，更有效地治疗人或动物的、和血管新生相关的疾病，如恶性肿瘤、类风湿性关节炎、视网膜和脉络膜血管新生，以及相关的皮肤疾病等，或者作用诊断用的药物，对人或动物的、和血管新生相关的疾病进行定位和诊断。本发明所述的高效血管生成抑制剂的基因工程生产或多肽合成及化学偶联方法传统，常规，简单，易行，产量高，对研制生产高效血管生成抑制剂具有重要的指导意义和实用价值。
实施例11.合成编码含有RGD或NGR等整联蛋白结合序列的多肽片段的PCR引物，按血管生成抑制剂基因5’或3’基因序列设计PCR引物，通过PCR反应扩增获得含有RGD或NGR等整联蛋白结合序列肽段的血管生成抑制剂基因。如合成引物15’CGGGATCGATGACGACGACAAGGCATGCGACTGCCGTG 3’，引物25’GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC 3’，引物35’GCGAATTCTAGGCTGCACACTGAGGGAC 3’。其中，引物1编码了BamHI位点和肠激酶识别位点序列，引物2中GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGT编码了含有RGD序列的肽段，GTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC编码人纤溶酶原第449-456位氨基酸，即环柄结构域5(kringle 5)的N端；引物3编码人纤溶酶原第538-543位氨基酸。
以人纤溶酶原基因cDNA为模板，以引物2和3为引物，进行PCR扩增反应，再以引物1和3为引物，以第一次的PCR产物为模板，进行PCR扩增反应，获得含有RGD序列的环柄结构域5基因，即本发明所述的高效血管生成抑制剂的一个分子--高效血管生成抑制剂分子1RGD-Kringle 5(含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纤溶酶原环柄结构域5)。该高效血管生成抑制剂分子1RGD-Kringle 5的氨基酸序列为ACDCRGDCFCGVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAA2.为了便于比较本发明所设计的高效血管生成抑制剂分子1--RGD-Kringle5的实际效果和优越之处，本实例中我们同时克隆、表达了不含有RGD序列的环柄结构域5，以作为对照和比较。
分别合成编码人纤溶酶原环柄结构域5N端和C端的引物，引物45’CGGGATCGATGACGACGACAAGGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGAC3’，引物4编码人纤溶酶原第449-456位氨基酸，即环柄结构域5的N端，其5’端有肠激酶识别位点序列编码序列。以人纤溶酶原基因cDNA为模板，以引物4和3为引物，进行PCR扩增反应，获得环柄结构域5基因。
3.将从1、2中.获得的基因分别经限制性内切酶消解，克隆在各种基因工程表达载体中，如将从1.中获得的PCR产物经BamHI、EcoRI酶切，克隆在大肠杆菌GST融合表达载体pALEX中，首先进行DNA序列分析，验证PCR产物DNA序列的正确性，然后将重组表达菌分别经0.5mM IPTG诱导表达2小时后，进行SDS-PAGE分析表达水平。
4.对3中的表达菌分别进行超声破碎，分别将超声上清进行Glutathione-Agarose亲和层析，收集洗脱峰，一步亲和层析纯化即可得到较纯的GST融合蛋白。对于获得的GST-kringle 5和GST-RGD-kringle 5融合蛋白，用肠激酶对融合蛋白进行切割(酶∶底物＝1∶1000～4000)，两种融合蛋白经37℃酶切10小时后几乎均可被切割完全。
GST-Kringle 5和GST-RGD-Kringle 5融合蛋白酶切产物分别再次进行Glutathione-Agarose亲和层析，收集穿过峰。获得的Kringle 5和高效血管生成抑制剂实例之一RGD-Kringle 5经SDS-PAGE电泳和C18反相HPLC验证纯度。
5.为了比较Kringle 5和高效血管生成抑制剂实例之一RGD-Kringle 5的生物活性的差异，我们进行了内皮细胞增殖抑制活性测定。在添加10％小牛血清、抗生素及3ng/ml的人重组bFGF(来源于暨南大学生物工程研究所)的DMEM培养基中培养ECV304细胞(人内皮细胞株)。实验在24孔细胞培养板中进行，样品的浓度范围为20nM～1280nM，每个浓度作3个重复，以磷酸缓冲液为空白对照，37℃，5％CO2，培养48小时，用胰酶消化细胞，血球计数板计数，比较样品及空白孔中的活细胞个数，以此计算出不同浓度Kringle 5和高效血管生成抑制剂实例之一RGD-Kringle 5对ECV304细胞生长的抑制率。
结果显示重组Kringle 5在320nM时，对ECV304细胞生长的抑制率为31％，1280nM时，抑制率为55％；而作为本发明所设计的高效血管生成抑制剂实例之一的RGD-Kringle 5在320nM时，对ECV304细胞生长的抑制率为58％，1280nM时，抑制率为100％。
从实例1中，我们可以看到在体外内皮细胞生长抑制实验中，本发明所设计的高效血管生成抑制剂实例之一的RGD-Kringle 5对人内皮细胞株ECV304细胞生长的抑制活性至少是Kringle 5的4倍，其ED50仅为Kringle 5 ED50的四分之一。本发明所设计的高效血管生成抑制剂确实显著提高了现有的血管生成抑制剂Kringle 5的生物活性。
实施例2Angiostatin是美国哈佛大学Folkman博士实验室发现的第一个成功的血管生成抑制因子。Angiostatin含有四个kringle分子，kringle 1-4，其中kringle 1的对angiostatin血管内皮细胞抑制活性贡献最大，单独的kringle 1血管内皮细胞抑制活性占angiostatin血管内皮细胞抑制活性的50％以上。为了进一步验证本发明所设计的高效血管生成抑制剂的实际效果和优越之处，本实例2中我们同时克隆、表达了含有RGD序列的环柄结构环柄结构域1(kringle 1)，在实验模型动物体内对它们抗血管生成的生物活性进行了比较。
1.合成编码含有RGD或NGR等序列的多肽片段的PCR引物，按血管生成抑制剂基因5’或3’基因序列设计PCR引物，通过PCR反应扩增获得含有RGD或NGR等整联蛋白结合序列肽段的血管生成抑制剂基因。合成引物15’CGGGATCCATGCCATGGCATGCGACTGCCGTG 3’；引物25’GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGG 3’；引物35’GCGAATTCTAAGCACACTCAAGAATGTCGCAGTAGTC 3’；引物45’CGGGATCCATGCCATGGTGTATCTCTCAGAGTGCAAG 3’。其中，引物1编码了BamH I和Nco I限制性内切酶识别位点，和起始密码子ATG；引物2中GACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGT编码了含有RGD序列的肽段，GTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGG编码人纤溶酶原第80-88位氨基酸，即环柄结构域1(kringle 1)的N端8个氨基酸；引物3编码人纤溶酶原第157-164位氨基酸，即环柄结构域1(kringle 1)的C端9个氨基酸，和终止密码子，以及一个EcoRI限制性内切酶识别位点；引物4只含有BamH I和Nco I限制性内切酶识别位点，起始密码子ATG和一段编码人纤溶酶原第80-88位氨基酸的序列。
以人纤溶酶原基因cDNA为模板，以引物2和3为引物，进行PCR扩增反应，再以引物1和3为引物，以第一次的PCR产物为模板，进行PCR扩增反应，获得含有RGD序列的环柄结构域1基因，即本发明所述的高效血管生成抑制剂的一个分子—高效血管生成抑制剂分子2RGD-Kringle 1(含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纤溶酶原环柄结构域1)。该高效血管生成抑制剂分子2RGD-Kringle 1的氨基酸序列为ACDCRGDCFCGVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECA；同时以人纤溶酶原基因cDNA为模板，以引物4和3为引物，进行PCR扩增反应，获得不含有RGD序列的环柄结构域1基因。
2.将从1、2中.获得的基因分别经限制性内切酶消解，克隆在各种基因工程表达载体中，如将从1.中获得的PCR产物分别经Nco I、EcoR I酶切，克隆在大肠杆菌非融合表达载体pNJUTRX-1中，首先进行DNA序列分析，验证PCR产物DNA序列的正确性，然后将重组表达菌分别经0.5mM IPTG诱导表达2小时后，进行SDS-PAGE分析表达水平。
对表达菌分别进行超声破碎，分别将超声上清进行Lysine Sepharose 4B亲和层析，用缓冲液(0.5M NaCl，0.5M arginine，20mM Tris-HCl，pH 7.4)进行洗脱，收集洗脱峰，进行透析后，一步亲和层析纯化获到较纯的Kringle 1和RGD-Kringle 1重组蛋白质。获得的Kringle 1和高效血管生成抑制剂实例之二RGD-Kringle 1经SDS-PAGE电泳和C18反相HPLC验证纯度，并用牛内皮细胞株BCE细胞进行内皮细胞生长抑制活性实验，确定重组产物的的生物活性。
5.在接种膀胱移行细胞癌的肿瘤小鼠动物模型上，接种癌细胞悬液后第五天，进行Kringle 1和RGD-Kringle 1抗肿瘤生物活性实验，重组Kringle 1和RGD-Kringle 1的用量皆为20mg/kg体重/天，腹腔注射，每日一次，以腹腔注射0.1ml生理盐水组的小鼠为对照，连续给药15天后，测定小鼠肿瘤的大小和重量，计算抑瘤率(肿瘤抑制效率)，抑瘤率＝(1-给药组小鼠平均肿瘤重量/生理盐水对照组小鼠平均肿瘤重量)×100％。结果显示在20mg/kg体重/天的剂量下，Kringle 1的抑瘤率为8％，而本发明的高效血管生成抑制剂实例之二RGD-Kringle 1的抑瘤率为68％，与Kringle 1相比较，RGD-Kringle 1的抑瘤率提高了8倍。
从实例1和2中，我们可以明显看到本发明与现有技术相比较具有明显的优点和创新。本发明所设计的具有整联蛋白的亲和性和结合能力的高效血管生成抑制剂确实在体内外实验中都能大幅度地改善和提高现有血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长和血管新生的活性和效率，具有很好的、作为治疗血管新生相关疾病(如肿瘤)药物的前景。实例1和2有力证明了本发明设计的高效血管生成抑制剂科学、合理、可行和有效。
权利要求
1.一种高效血管生成抑制剂，其特征在于该高效血管生成抑制剂是具有整联蛋白的亲和性和结合能力的血管生成抑制剂。
2.根据权利要求1.所述的高效血管生成抑制剂，其特征在于在血管生成抑制剂分子的一端或两端分别连接有对整联蛋白具有亲和性和结合能力的肽段。
3.根据权利要求1和2.所述的高效血管生成抑制剂，其特征在于在血管生成抑制剂分子的一端或两端分别连接的、对整联蛋白具有亲和性和结合能力的肽段可以是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽，或者是含有天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸序列的段肽，也可以是同时含有上述两种序列的肽段。
4.根据权利要求3所述的高效血管生成抑制剂，其特征在于人纤溶酶原环柄结构域1蛋白质上连接有含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽。
5.根据权利要求3所述的高效血管生成抑制剂，其特征在于人纤溶酶原环柄结构域5蛋白质上连接有含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的段肽。
6.一种高效血管生成抑制剂的应用，其特征在于该种高效血管生成抑制剂能够显著提高现有的血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长和血管新生的活性和效率，降低现有血管生成抑制剂的使用剂量；该种高效血管生成抑制剂能够作为治疗疾病或者诊断用的药物，治疗人或动物的、和血管新生相关的疾病。
7.根据权利要求4和5所述的高效血管生成抑制剂的应用，其特征在于该种血管生成抑制剂能够有效抑制内皮细胞生长，能够作为治疗疾病或者诊断用的药物，更有效地治疗人或动物的、和血管新生相关的疾病。
8.高效血管生成抑制剂的生产方法，其特征在于构建含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整联蛋白结合序列肽段的血管生成抑制剂基因，将该基因用于基因治疗；或进行基因工程表达，分离纯化重组蛋白质；或用多肽合成方法合成含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整联蛋白结合序列的肽段，然后用化学偶联的方法将含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸等整联蛋白结合序列的肽段连接到天然来源的或重组DNA来源的血管生成抑制剂上，构成能够和整联蛋白具有结合作用的高效血管生成抑制剂。
9.根据权利要求8所述的高效血管生成抑制剂的生产方法，其特征在于，获得编码含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纤溶酶原环柄结构域1基因，用于基因治疗；或者进行基因工程表达，分离、加工、纯化、制备获得含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纤溶酶原环柄结构域1。
10.根据权利要求8所述的高效血管生成抑制剂的生产方法，其特征在于，获得编码含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纤溶酶原环柄结构域5基因，用于基因治疗；或者进行基因工程表达，分离、加工、纯化、制备获得含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段的人纤溶酶原环柄结构域5。
全文摘要
本发明涉及高效血管生成抑制剂及其生产方法与应用。本发明特点是1、本发明提出了具有整联蛋白的亲和性和结合能力的高效血管生成抑制剂，并给出了该高效血管生成抑制剂的一般结构形式，以及含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纤溶酶原环柄结构域1和含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纤溶酶原环柄结构域5的具体结构形式。2、本发明给出了高效血管生成抑制剂的一般生产方法，以及含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纤溶酶原环柄结构域1和含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸肽段－人纤溶酶原环柄结构域5的具体生产方法。3、本发明指明了高效血管生成抑制剂在显著提高现有的血管生成抑制剂抑制内皮细胞生长和血管新生的活性和效率，降低现有血管生成抑制剂的使用剂量方面的应用前景。
文档编号A61P43/00GK1478541SQ02138188
公开日2004年3月3日 申请日期2002年8月30日 优先权日2002年8月30日
发明者华子春 申请人:华子春