专利名称：一种防治糖尿病的植物提取物及其制备方法与药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从红豆杉(Taxus spp)，尤其是云南红豆杉Taxusyunnanensis Cheng et L.K.Fu、美丽红豆杉Taxus chinensis var.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu等中提取的防治糖尿病的植物提取物，其制备方法及其药物用途。
背景技术：
随着世界人口的老龄化进程加快，糖尿病已经成为一种常见病、多发病。目前，糖尿病的发病机理仍不十分清楚，它的治疗主要是用药物降低高血糖和防治并发症。胰岛素和主要口服降血糖化学合成药的发明和应用给糖尿病患者带来希望，但它们本身仍分别存在低血糖反应、乳酸中毒等严重药物副作用，影响了它们的使用和疗效(王中孝，山西医科大学学报，2000 31(6)555-556)。寻找和开发高效、低毒、安全可靠的新型降血糖物质是人类亟待解决的课题。
我国中医药学文献记载，红豆杉叶具利尿通经作用，可用于治疗糖尿病(全国中草药汇编下册(第二版)主编谢宗万，人民卫生出版社，722)，红豆杉木材治糖尿病殊效(甘伟松，药用植物学，1991，140)。但红豆杉中具抗糖尿病活性的化学成分的研究和现代药效学毒理学研究未见报道。
发明内容
本发明提供了一种从药用植物红豆杉，尤其是云南红豆杉Taxusyunnanensis Cheng et L.K.Fu、美丽红豆杉Taxus chinensis var.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu等红豆杉中提取、分离的具有抗糖尿病活性的毒性低的天然植物提取物，所述提取物的主要有效成分为myo-肌醇衍生物类化合物，含量可达60％以上。
本发明还提供了一种从药用植物红豆杉中提取具抗糖尿病的植物提取物的方法，所述方法包括用溶剂提取，得浸膏，将浸膏经两相萃取，柱层析，收集含有myo-肌醇衍生物类化合物的流份，浓缩、过滤、干燥，得到植物提取物粉末。其中提取所用的有机溶剂例如是乙醇、甲醇、丙酮和它们的含水物等，两相萃取所用的溶剂是水不相溶性有机溶剂，例如乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚。所述层析例如为大孔树脂柱层析、葡聚糖G或改性葡聚糖柱层析、纤维素柱层析、活性炭柱层析。最终产物为晶状粉末，主要有效成分为myo-肌醇衍生物类化合物，含量可达60％以上，甚至75％以上。
本发明还提供了一种含有上述提取物以及一种或多种辅助剂和/或赋型剂的药物组合物。所述药物组合物可以被制备成针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等药物剂型。
本发明进一步提供了上述提取物用于制备治疗糖尿病的药物的用途。所述药物能显著降糖尿病高血糖、抑制肝糖原分解和葡萄糖的吸收、降低血脂以及改善自由基代谢和保护胰岛β细胞，而且其毒性极低。所述药物可用于预防和治疗糖尿病及其糖尿病性心脑血管方面并发症，其它与糖代谢紊乱有关的疾病，改善自由基代谢，预防和治疗II型糖尿病以及糖尿病性心脑血管并发症。
更具体地说，本发明所述从药用植物红豆杉中提取防治抗糖尿病的植物提取物的方法包括将红豆杉的根，茎或叶等部位粉碎成粗粉；用例如乙醇、甲醇、丙酮、它们的含水物或它们的混合物等溶剂在0℃至回流的温度下，优选室温至回流的温度下，更优选在回流的温度下提取，所用溶剂的量优选为1∶1至20(重量/体积)，优选1∶2至10(重量/体积)，更优选1∶3至6(重量/体积)，优选提取1-5次；经减压浓缩得浸膏，将浸膏用水不相溶性有机溶剂(例如乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚)/水两相萃取，除去亲脂性有机层，所述萃取剂优选为1∶0.5至10(体积/体积)的有机溶剂/水；合并水层，滤过，用柱层析分离，所述层析例如为大孔树脂柱层析(例如D101型、MN-200型(PUROLITE)等)、葡聚糖G或改性葡聚糖柱层析(例如Sephadex-LH-20等)、纤维素柱层析以及活性炭柱层析，用相应的洗脱剂洗脱，同时监测洗脱液；收集含有myo-肌醇衍生物类化合物的流份，减压浓缩、静置、过滤得固形物，用例如乙醇、甲醇、丙酮、甲乙酮、它们的含水物或它们的混合物重结晶，干燥得植物提取物粉末。最终产物为晶状粉末，主要有效成分为myo-肌醇衍生物类化合物，含量达60％以上，甚至75％以上。
本发明所述方法中对柱层析洗脱液的监测可以是用以下方法取洗脱液10ml置圆底烧瓶中减压蒸干，加0.01mol/L的高碘酸钠溶液2ml使溶解后，移至一试管中，滴加浓硝酸一滴，溶解后，滴加硝酸银试液，有白色沉淀产生为正反应(注高碘酸根氧化植物提取物中的主要成分，其本身被还原为碘酸根，滴加硝酸银后，有白色碘酸银沉淀产生)。
本发明所述提取物的主要有效成分myo-肌醇衍生物类化合物的含量可以用下述高效液相(HPLC)方法检测含量测定 取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀硫酸-醋酐液(1∶50)0.65ml，置水浴加热20min，冷却至室温，加甲醇15ml，摇匀，加水至刻度，摇匀，得供试品溶液。HPLC色谱条件C18柱，5μm，4.6×250mm；检测波长220nm；进样20μl；流动相，甲醇-水(50∶50)，使用前经0.45μm有机滤膜抽滤并脱气，流速1.0ml/min.。
本发明所述植物提取物可与常规辅助剂和/或赋型剂混合，制备成各种剂型，用于预防或治疗糖尿病，尤其用于治疗II型糖尿病。针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等都为可供选择的药物剂型。
胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂等剂型可以含有一种或多种常用赋型剂-填料和增容剂如淀粉，微晶纤维等；粘合剂如羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等；致湿剂如甘油；崩解剂如碳酸钙等；吸收剂如高岭土等；润滑剂如滑石粉等。
药用赋型剂可以是固体、半固体、液体等各种形态的，配方辅助剂可以是各种类型的。
溶液剂可以含有一般的溶剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂等，如水、乙醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯等。
胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等剂型可以用已知的常规方法制备，可以将植物提取物与一种或多种赋型剂混合，制备剂型。
对于非肠道给药的剂型，溶液或乳剂度应是无菌和等渗的。
优选实施方案以下将在实施例中对本发明进行更为详尽的说明。但应理解这些实施例仅为说明之目的，而非用于限制本发明的范围。
实施例1植物提取物的制备1红豆杉粗粉60kg，以4倍体积90％乙醇回流提取三次，合并提取液浓缩成稠状溶液；用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用1∶1(体积/体积)的氯仿/H2O两相萃取，合并水层，滤过，上大孔树脂柱(D101型，国产)，以蒸馏水、含水乙醇(乙醇5％-20％)梯度洗脱，各洗脱液分别用鉴别试液鉴别，合并显正反应的洗脱液，于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，乙醇重结晶，过滤得晶状粉末，抽干，于70℃下干燥，得植物提取物(微黄色粉末)，收率0.10％。用HPLC方法进行检测，其中myo-肌醇衍生物类化合物含量达81％。
实施例2植物提取物的制备2红豆杉粗粉70kg，以3倍体积80％甲醇于50℃提取三次，合并提取液，浓缩成浆状溶液；用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用1∶1(体积/体积)的乙酸乙酯/H2O两相萃取，合并水层，滤过，上大孔树脂柱(MN-200型)，以蒸馏水、含水乙醇(乙醇5％-20％)梯度洗脱，各洗脱液分别用鉴别试液鉴别，合并显正反应的洗脱液，于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，丙酮重结晶，过滤得晶状粉末，抽干，于70℃下干燥，得植物提取物(类白色粉末)。收率0.12％。用HPLC方法进行检测，其中myo-肌醇衍生物类化合物含量达75％。
实施例3植物提取物的制备3红豆杉粗粉65kg，以4倍体积75％丙酮于45℃提取三次，合并提取液浓缩成稠状溶液；用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用二氯甲烷/H2O两相萃取，合并水层，滤过，上活性碳(药用规格)柱，以蒸馏水、含水乙醇(乙醇5％-30％)梯度洗脱，各洗脱液分别用鉴别试液鉴别，合并显正反应的洗脱液，于旋转蒸发仪中减压浓缩至干，甲醇重结晶，过滤得晶状粉末，抽干，于70℃下干燥，得植物提取物(淡微黄色粉末)，收率0.13％。用HPLC方法进行检测，其中myo-肌醇衍生物类化合物含量达66％。
实施例4胶囊剂的制备处方每粒0.2g，含植物提取物25mg。
微晶纤维素175g植物提取物25g1000粒首先将辅料于研磨容器中，之后加入植物提取物，研磨混合10-30分钟，至均匀止。将混匀的药粉，灌装于1号胶囊中，随机抽样每粒装量控制在0.2g。
实施例5片剂的制备植物提取物25g，微晶纤维素49g，硬脂酸镁1g，充分混合；混合物用单冲压片机压成直径6mm，重300mg的片剂，每片含植物提取物100mg。
实施例6颗粒剂的制备植物提取物20g，加玉米淀粉180g，充分混合，加适量乙醇(60％)制成软材，过12目筛造颗粒，经干燥后得颗粒剂，每1g颗粒剂含植物提取物100mg。
以下用按照实施例1所制得的植物提取物进行药效学实验和毒理学研究。
一、主要药效学实验(一)植物提取物对四氧嘧啶诱发小鼠血糖升高的影响1.实验材料昆明种小鼠，体重20-24g，雄性降糖灵(Phenformine，阳性对照)(江苏省金坛市制药厂)四氧嘧啶(美国Sigma公司)葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)2.实验方法[1，2]随机取出小鼠10只为正常组，其余小鼠尾静脉注射四氧嘧啶65mg/kg。根据血糖值分为5组，每组10只，其中一组作为模型对照组，另外4组分别按0.1ml/10g体重经口给予植物提取物25、50、100mg/kg和降糖灵75mg/kg，正常组及模型对照组给予等体积的蒸馏水，连续7天。取血，分离血清，以葡萄糖氧化酶法测定血糖，并对胰腺进行病理组织学检查。
3.结果与正常组相比，对照组小鼠血糖极显著升高(420.5±96.8mg/dl)。与对照组相比，植物提取物的小剂量组有降低高血糖的趋势，而中、大剂量组和降糖灵组极显著地降低四氧嘧啶诱发的高血糖，植物提取物的降糖作用呈剂量依赖性，植物提取物100mg/kg(113.7±40.9mg/dl)和植物提取物50mg/kg(225.3±80.3mg/dl)组的作用强于降糖灵75mg/kg组。病理组织学检查结果表明，与模型对照组相比，植物提取物各剂量组的胰岛数量和胰岛内细胞数量均明显增加，而降糖灵组胰岛数目和胰岛细胞数目略微增加。病理组织学检查证实了植物提取物的作用优于降糖灵。
(二)植物提取物对葡萄糖诱发的小鼠血糖升高的影响1.实验材料动物昆明种小鼠，体重20-23g，雌性降糖灵(Phenformine，阳性对照)(江苏省金坛制药厂)50％葡萄糖注射液(江苏常州国营武进制药厂)葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)
2.实验方法[4]取小鼠72只，随机分为6组，其中4组分别按0.1ml/10g体重经口给予植物提取物25、50、100mg/kg和降糖灵75mg/kg，正常组及模型对照组给予等体积的蒸馏水，连续7天。除正常组外，其余各组腹腔注射葡萄糖2g/kg，正常组注射等体积的生理盐水，注射后30、60、90、120分钟，测定血糖。
3.结果与正常组相比，模型对照组小鼠腹腔注射葡萄糖后30，60、90、120分钟，血糖极显著升高。与模型对照组相比，植物提取物的中小剂量组在腹腔注射葡萄糖后30，60、90分钟，显著降低葡萄糖诱发的高血糖；植物提取物的大剂量组和降糖灵组在腹腔注射葡萄糖后30，60、90、120分钟，极显著降低葡萄糖诱发的高血糖；植物提取物的作用基本呈剂量依赖性，植物提取物100mg/kg有极显著的的降糖作用(90分钟138.4±9.3mg/dl；正常组104.1±13.7mg/dl；对照组162.9±11.6mg/dl)，与降糖灵75mg/kg相当。
(三)植物提取物对肾上腺素诱发的小鼠血糖升高的影响1.实验材料动物昆明种小鼠，体重20-24g，雌性优降糖(Glibenclamide，阳性对照)(天津太平洋制药有限公司)盐酸肾上腺素注射液(武汉制药集团股份有限公司)葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)肝糖原测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)2.实验方法[3]取小鼠72只，随机分为6组，其中4组分别按0.1ml/10g体重经口给予植物提取物25、50、100mg/kg和优降糖10mg/kg，正常组及模型对照组给予等体积的蒸馏水，连续7天。除正常组注射等体积的生理盐水外，其余各组腹腔注射肾上腺素0.2mg/kg，注射后30分钟，测定血糖，同时取肝脏，以蒽酮法测定肝糖原。
3.结果与正常组相比，模型对照组小鼠血糖极显著升高。与模型对照组相比，植物提取物显著降低肾上腺素诱发的高血糖(25mg/kg，197.7±33.2mg/dl)。同时，模型对照组小鼠肝糖原极显著降低。与模型对照组相比，植物提取物极显著升高低下的肝糖原含量(25mg/kg，4.73±1.38mg/g肝组织)。
以上植物提取物药效研究结果表明植物提取物能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的高血糖，能显著降低肾上腺素诱发的高血糖，并使低下的肝糖原回升，能抑制葡萄糖的吸收，对葡萄糖引起的血糖升高有显著的耐糖作用，能保护胰岛β细胞，可用于治疗糖尿病。另外，四氧嘧啶大鼠和链脲霉素小鼠模型中，血糖、血清甘油三酯、胆固醇、丙二醛显著升高，血清胰岛素和超氧化物歧化酶活力显著降低。植物提取物能显著降低升高的血糖，血清甘油三酯、胆固醇、丙二醛含量，回升胰岛素水平和超氧化物歧化酶的活力(降糖灵无此作用)。
药效学实验方法参考文献1.武玉鹏等 胰康降血糖作用 中医药研究1997，13(1)57-592.徐淑云等主编 药理实验方法学 第二版 人民卫生出版社19941275-12783.张冰等 菊苣胶囊对小鼠血糖水平的影响 北京中医药大学学报1999，22(1)28-304.陈卫辉等 麦冬多糖对正常和实验性糖尿病小鼠血糖的影响 中国现代应用药学杂志1998，15(4)21-23二、急性毒性实验各取正常小鼠20只，雌雄各半，分别以口服和静脉注射植物提取物(高剂量已达允许的最大浓度和小鼠最大给药体积)方式进行急性毒性实验，结果动物无一死亡，健康情况良好、皮毛光泽、眼红明亮、活动度好。7天或14天后处死小鼠，肉眼观察主要脏器，均无异常。
由于该植物提取物毒性极低，无法测出小鼠口服和静脉注射的LD50。因此进一步测试小鼠一日口服植物提取物最大耐受量(＞37.0g/kg)，观察动物的反应，14天后处死，肉眼观察主要脏器。结果动物无一死亡，健康情况良好、皮毛光泽、眼红明亮、活动度好。14天后处死动物，肉眼观察各脏器，均无异常。结果表明，该植物提取物毒性极低或无毒。
权利要求
1.一种从红豆杉(Taxus spp)中提取的防治糖尿病的植物提取物，其特征在于主要有效成分为myo-肌醇衍生物类化合物，含量达60％以上。
2.根据权利要求1的植物提取物，其特征在于所述红豆杉是云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu)、南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu)。
3.一种从红豆杉(Taxus spp)中提取具抗糖尿病的植物提取物的方法，所述方法包括用溶剂提取，得浸膏，将浸膏经两相萃取，柱层析，收集含有myo-肌醇衍生物类化合物的流份，浓缩、过滤、干燥，得到植物提取物粉末。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述红豆杉是云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu)、南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu)。
5.根据权利要求3的方法，其特征在于提取所用的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮、它们的含水物或它们的混合物。
6.根据权利要求3的方法，其特征在于两相萃取所用的溶剂是水不相溶性有机溶剂。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于所用的有机溶剂是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚。
8.根据权利要求3的方法，其特征在所述层析为大孔树脂柱层析、葡聚糖G或改性葡聚糖柱层析、纤维素柱层析、活性炭柱层析。
9.根据权利要求3的方法，其特征在于植物提取物为晶状粉末，主要有效成分为myo-肌醇衍生物类化合物，含量达60％以上。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于植物提取物的主要有效成分myo-肌醇衍生物类化合物含量达75％以上。
11.根据权利要求3-10的方法所制备的提取物。
12.一种治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于含有权利要求1或2所述的植物提取物，与一种或多种辅助剂和/或赋型剂混合。
13.根据权利要求12的药物组合物，其特征在于其可以被制备成针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等药物剂型。
14.根据权利要求1或2的植物提取物用于制备治疗糖尿病的药物的用途。
15.根据权利要求14的用途，其特征在于所述药物能显著降糖尿病高血糖、抑制肝糖原分解和葡萄糖的吸收、降低血脂以及改善自由基代谢和保护胰岛β细胞，而且其毒性极低。
16.根据权利要求14的用途，其特征在于所述药物可用于预防和治疗糖尿病及其糖尿病性心脑血管方面并发症，其它与糖代谢紊乱有关的疾病，以及改善自由基代谢。
17.根据权利要求14的用途，其特征在于所述药物可用于预防和治疗II型糖尿病以及糖尿病性心脑血管并发症。
全文摘要
本发明涉及一种从红豆杉(Taxus spp)，尤其是云南红豆杉Taxusyunnanensis Cheng et L.K.Fu、美丽红豆杉Taxuschinensis var.mairei(Lemee et Levl)Cheng et L.K.Fu等中提取的防治糖尿病的植物提取物，其制备方法及其药物用途。植物提取物粉末主要成分myo－肌醇衍生物类化合物含量可达60％以上。
文档编号A61K31/337GK1488344SQ0214430
公开日2004年4月14日 申请日期2002年10月9日 优先权日2002年10月9日
发明者梁敬钰, 吴斐华, 鲍官虎, 程奇蕾 申请人:中国药科大学