专利名称：重组人干扰素包涵体的高效复性液及复性方法
技术领域：
本发明属生物制药领域。本发明涉及用于重组人干扰素包涵体复性的复性液及其使用方法。
美国FDA于1986年首先批准基因工程IFNα2a(Roche公司生产)和IFNα2b(Schering公司生产)投放市场，中国学者侯云德等首创的IFNα1b也于1996年上市。随后国内许多研究单位研制开发了α2a、α2b和γ型等干扰素产品。目前，由于IFN蛋白质表达量低，生产工艺复杂，以及表达物的生物活性较低，导致生产成本高，药品价格昂贵，消费者使用干扰素的实际市场远远小于可以达到的规模。干扰素的社会和经济效益远未发挥。
当外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在细胞内聚集在一起，形成大小0.5～1μm的折光小体，即包涵体。尽管包涵体的形成原因尚不完全清楚，但它的形成却能有效地抵抗细胞内蛋白酶的水解作用，并易于与细胞其他成分分离，极大地方便表达产物的纯化。目前通过一些常规的方法即可得到较纯的包涵体。包涵体内大部分成分(约50％以上)是目的蛋白，这些蛋白质的一级结构是正确的，但没有经过正确折叠形成天然的高级结构，因而缺乏生物学活性。因此，包涵体必须首先要被解散，分成单个目的蛋白，再使目的蛋白重新折叠成天然空间构型，才能得到具有生物学活性的目的蛋白。包涵体通常不溶于一般的水溶液，只溶于含变性剂(如盐酸胍，脲)的溶液。但溶于变性液的包涵体蛋白完全失去了折叠构型，只保留一级结构和共价键。除去变性剂，让变性蛋白产生折叠，获得天然空间构型，恢复其生物活性的过程，就是蛋白质的复性。
目前蛋白质复性通常有两种方法。一是稀释法，稀释溶有蛋白的变性液，溶液中变性剂浓度足够低时，蛋白质开始复性；二是透析法，用透析、超滤等手段除去变性剂。稀释法操作液体量太大，同时蛋白质浓度太小，为后续的提纯蛋白增加困难，增加生产成本。透析法对设备要求较高，增加了设备投入，同时操作时间较长，可能导致蛋白质沉淀。专利文献CN1299872A《人α2b型干扰素的基因合成、表达质粒构建及产物的制法》采用透析法复性，比活为1×108IU/mg。
包涵体经目前的复性方法处理后，只有20％左右目的蛋白分子(汪家政等，蛋白质技术手册，科学出版社，2001年，p31)得到正确的空间构型，获得生物学活性，大部分宝贵的目的蛋白因为不能复性而不能利用。复性率较低的主要原因是，在重组蛋白的复性过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适而无法形成正确的次级键等。复性效率、复性成本是制约基因药物生产和成本的一个关键性的难题。
本发明的技术方案是适当改变常规复性溶液的复性剂、离子强度和复性方法时，可使重组人IFN包涵体的复性率达到40％以上，是目前常用方法的2～3倍。
本发明用于重组蛋白质复性的复性液由Tris-HCl、EDTA、还原型谷胱苷肽、氧化型谷胱苷肽、L-精氨酸以及双蒸水或去离子水组成。具体地说，本发明的蛋白质复性溶液(以下均以1升溶液计)由100毫升0.05-0.20mol Tris-HCl液，pH7.0～8.5、0.44～0.60mol EDTA，pH7.5～8.5、1.2～2.55mmol还原型谷胱苷肽、0.1～0.31mmol氧化型谷胱苷肽、0.4～0.60mol L-精氨酸，余量为双蒸水或去离子水组成。优选Tris-HCl为0.08～0.15mol，pH7.5～8.3；更优选Tris-HCl为0.10mol，pH8.0。优选EDTA为0.45～0.55mol，pH7.5～8.3；最佳为pH为8.0。优选还原型谷胱苷肽为1.8～2.44mmol，最佳为2.0mmol；氧化型谷胱苷肽优选为0.17～0.26，最佳为0.2mmol；L-精氨酸优选为0.44～0.55mol，最佳为0.50mol。
本发明复性液适用于重组蛋白质的复性，特别适用于重组人干扰素的复性。
有关使用本发明蛋白质复性溶液的具体实施方案如下，以重组IFN为例，说明重组蛋白质的分离、纯化、洗涤、复性。1.1原核宿主细胞，优选大肠杆菌(E.Coli BL21-DE3)以包涵体形式表达出所需的重组人IFN包涵体重组蛋白质，从培养物中按常规方法分离、提取和纯化所述蛋白质包涵体。1.2洗涤液1由Tris-HCl(pH7.5)、EDTA和NaCl(浓度为0.2M)和水组成。
洗涤液2由Tris-HCl(pH7.5)、EDTA(pH8.0)、NaCl(浓度为0.2M)和水组成。
6M尿素洗涤液由尿素(浓度为6M)、Tris-HCl(pH7.5)、EDTA、NaCl(浓度为0.2M)和水组成。
8M盐酸胍乙腚溶液由Tris-HCl(pH7.5)、盐酸胍乙腚(guanidine-HCl(8M))、EDTA和水组成。
洗涤液和6M尿素以及8M盐酸胍乙腚溶液是本领域技术人员已知的用于蛋白质包涵体分离、提取和纯化时所用的溶液。1.3举证性的分离、提取、纯化、溶解步骤如下1)裂解菌体按离心后的沉淀菌体湿重，每克湿菌加入20～25毫升预冷的细菌裂解液，充分悬浮和裂解菌体。
2)分离可溶性IFN和IFN包涵体将上述裂解物离心(4℃，17000转，60分钟)。收集含IFN包涵体的沉淀物。另外，还可按照《分子克隆手册》-实验指南(美·J.萨姆布鲁克等编，第二版，第845页，科学出版社出版)描述的方法进行。
3)纯化IFN包涵体步骤1将上步所得沉淀物充分悬浮混匀于洗涤液1，离心至液体清亮为止，弃上清，收沉淀。
4)纯化IFN包涵体步骤2将上步所得沉淀物悬浮于洗涤液1，再加入等体积新鲜配制的6M尿素洗涤液，搅拌，离心至液体清亮为止，弃上清，收沉淀。
5)纯化IFN包涵体步骤3将上步所得沉淀物悬浮混匀于洗涤液2，搅拌，离心至液体清亮为止，弃上清，收沉淀。
6)纯化IFN包涵体步骤4将上步所得沉淀物悬浮混匀于双蒸水或去离子水中洗涤，离心至液体清亮为止，弃上清，收沉淀。
7)纯化IFN包涵体步骤5将上步所得沉淀物再次悬浮混匀于双蒸水或去离子水中洗涤，离心至液体清亮为止，弃上清，收沉淀。此沉淀物的80％以上为重组人INF包涵体。
8)IFN包涵体的溶解将上步所得沉淀物放入8M盐酸胍乙腚溶液，溶解IFN包涵体，搅拌，离心至液体清亮为止，弃沉淀，收获含IFN的上清液。该收获物经薄层扫描检测，干扰素蛋白纯度可达到90％以上。1.4进行IFN蛋白复性步骤1)用8M盐酸胍乙腚溶液将1.3第8步的收获物稀释到浓度为10mg蛋白/毫升。
2)将上步所得溶液，例如如果是300mg溶液，则分3次加入到1升本发明复性液中，复性48小时。
3)将上步所得溶液离心(4℃，6000～8000转，60分钟)，收获上清液(干扰素蛋白纯度可达90％以上)。
本发明针对在重组人干扰素生产中包涵体复性率较低和制备过程复杂的问题，提出了能够显著提高复性率、设备要求非常简单的复性液配方及复性方法。这将会大大降低产品的生产成本，意味着巨大的社会效益和经济效益。
B复性液配制
实施例2人干扰素α2a基因表达产物的纯化及复性1)用于表达新型人干扰素α2a修饰重组基因的表达系统是E.coli原核表达系统，原始质粒为PBR32。采用常规培养条件和常规LB培养基。配制1升培养基，蛋白胨(Trypton)10克，酵母提取物(Yeast Extract)10克，氯化钠(NaCl)5克，双蒸水1000毫升。培养采用37℃恒温，振荡培养，以IPTG诱导剂诱导表达。从接种菌种到收获培养物的全过程时间为7小时，离心收获8.2克湿菌体。
2)复性液配制配制复性液1共3升。
3)按1.3所述方法初步纯化不溶性干扰素表达产物。
4)按1.4所述方法，用本实施例2)所述复性液，将溶解于8M盐酸胍乙腚溶液的干扰素α2a蛋白复性。
5)收获复性重组人干扰素α2a蛋白。经测定，总量为613毫克/升培养物，比活性1.15×108U/mg，经薄层扫描证实，纯度达90％以上，复性率为43％。实施例3人基因重组干扰素α2b的分离、纯化与复性1)用于表达新型人干扰素α2b修饰重组基因的表达系统是E.coli原核表达系统，原始质粒为PBR32。采用常规培养条件和常规LB培养基。配制1升培养基，蛋白胨(Trypton)10克，酵母提取物(Yeast Extract)10克，盐(NaCl)5克，双蒸水1000毫升。培养采用37℃恒温，振荡培养，以IPTG诱导剂诱导表达。从接种菌种到收获培养物的全过程时间为7小时，离心收获8.4克湿菌体。
2)配制复性溶液复性液1共3升。
3)按1.3所述方法初步纯化不溶性干扰素表达产物。
4)按1.4所述方法，用本实施例2)所述复性液，将溶解于8M盐酸胍乙腚溶液的干干扰素α2b蛋白复性。
5)收获重组人干扰素α2b蛋白，经测定，复性后IFN蛋白总量为861毫克/升培养物，比活性1.31×108U/mg，经薄层扫描证实，纯度达到90％以上，复性率为41％。实施例4人干扰素α2a基因表达产物的纯化及复性基本按实施例1所述步骤进行，不同的是用复性液2。
培养所得湿菌体8.1克，复性后获得人干扰素α2a蛋白575毫克/升培养物，比活性达1.16×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率为42％。实施例5人基因重组干扰素α2b的分离、纯化与复性基本上按实施例2所述分离纯化大肠杆菌表达的人干扰素α2b，不同的是，在复性过程中使用复性液2。
培养所得湿菌体8.0克，复性后获得人干扰素α2b蛋白915毫克/升培养物，比活性达1.30×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率44％。实施例6人干扰素α2a基因表达产物的纯化及复性基本按实施例1所述步骤进行，不同的是用复性液3。
培养所得湿菌体8.1克，复性后获得人干扰素α2a蛋白575毫克/升培养物，比活性达1.16×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率为42％。实施例7人基因重组干扰素α2b的分离、纯化与复性基本上按实施例2所述分离纯化大肠杆菌表达的人干扰素α2b，不同的是，在复性过程中使用复性液3。
培养所得湿菌体8.0克，复性后获得人干扰素α2b蛋白915毫克/升培养物，比活性达1.30×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率44％。实施例8人干扰素α2a基因表达产物的纯化及复性基本按实施例1所述步骤进行，不同的是用复性液4。
培养所得湿菌体8.1克，复性后获得人干扰素α2a蛋白575毫克/升培养物，比活性达1.16×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率为42％。实施例9人基因重组干扰素α2b的分离、纯化与复性基本上按实施例2所述分离纯化大肠杆菌表达的人干扰素α2b，不同的是，在复性过程中使用复性液4。
培养所得湿菌体8.0克，复性后获得人干扰素α2b蛋白915毫克/升培养物，比活性达1.30×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率44％。实施例10人干扰素α2a基因表达产物的纯化及复性基本按实施例1所述步骤进行，不同的是用复性液5。
培养所得湿菌体8.1克，复性后获得人干扰素α2a蛋白575毫克/升培养物，比活性达1.16×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率为42％。实施例11人基因重组干扰素α2b的分离、纯化与复性基本上按实施例2所述分离纯化大肠杆菌表达的人干扰素α2b，不同的是，在复性过程中使用复性液5。
培养所得湿菌体8.0克，复性后获得人干扰素α2b蛋白915毫克/升培养物，比活性达1.30×108IU/mg，经薄层扫描证实，纯度为90％以上，复性率44％。实施例12测定重组人干扰素蛋白质的复性效果对实施例1-4的复性效果进行测定。
1)蛋白含量测定采用Bradford比色法测定重组人IFNα2a、IFNα2b复性液中的蛋白含量方法a)分别在两组试管各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA；5、10、15、20ul)以复性液补足至100ul，同时分别以两管100ul的复性液作空白对照。
b)每管各加入0.9ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，置室温2min。
c)用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值，对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线。
d)将待测样品用包涵体复性液稀释5倍，取100ul，重复上述步骤测A959，从BSA标准曲线中确定待测样品的蛋白浓度。
表1 标准浓度BSA溶液A595值
表2 重组人干扰素各样品浓度测定
2)重组人干扰素的蛋白纯度测定。
采用非还原型SDS-PAGE电泳凝胶薄层扫描法检定方法a)样品用2×SDS加样缓冲液按1∶1(V/V)处理；b)采用10％丙烯酰胺浓度的分离胶；c)上样量为15ul；d)脱色后的凝胶应存放于由脱色液和染色液配制的平衡液(A650＝0.1)中过夜，直至扫描测定。
e)对已脱色的凝胶以650nm波长扫描，测定主带(目的蛋白)及各副带(杂蛋白)中所含染料结合物的量，以此确定纯度。
表3 凝胶扫描数据
扫描结果显示该样品达到电泳级纯度，纯度计算值为100％，保守估计纯度大于90％。3)重组人干扰素抗病毒活性的效价测定采用国家药品质量控制标准规定的方法，测定干扰素抗病毒活性及抗病毒效价，以检定干扰素活性的标准细胞株(WISH细胞)和病毒株(VSV)，采用细胞病变抑制法进行检测，并以国家标准干扰素α2a参比品校准确定效价(IU/ml)。每一样品分别由两名质检人员独立重复一次，取平均值。样品及参比品以含7％牛血清的MEM培养液连续4倍稀释8个梯度，每个梯度各100微升(μL)平行4孔加入预先铺有WISH细胞的96孔细胞培养板，37℃、5％CO2培养24小时后，每孔以100TCID50 VSV攻毒，37℃、5％CO2培养24小时。观察记录各孔细胞病变情况，计算各样品效价，结果见表4。
表4 干扰素效价测定
注样品1、2、3、4分别取自实施例1、2、3、4。
权利要求
1.一种蛋白质复性溶液，其特征在于所述复性溶液(按1升溶液的终浓度计)由100毫升0.05-0.20mol Tris-HCl液，pH7.0～8.5、0.44～0.60mol EDTA，pH7.5～8.5、1.2～2.55mmol还原型谷胱苷肽、0.1～0.31mmol氧化型谷胱苷肽、0.4～0.60molL-精氨酸，余量为双蒸水或去离子水组成。
2.一种如权利要求1所述的蛋白质复性溶液，其特征在于Tris-HCl为0.08～0.15mol，pH7.5～8.3。
3.一种如权利要求1或2所述的蛋白质复性溶液，其特征在于L-精氨酸为0.44～0.55mol。
4.一种如权利要求1所述的蛋白质复性溶液，其特征在于Tris-HCl为0.10mol，pH8.0。
5.一种如权利要求1～4所述的任一蛋白质复性溶液，其特征在于L-精氨酸为0.50mol。
6.一种如权利要求1所述的蛋白质复性溶液，其特征在于Tris-HCl为0.10mol，pH8.0，EDTA为0.50mol，氧化型谷胱苷肽为0.2mmol，还原型谷胱苷肽为2.0mmol。
7.一种如权利要求1～6所述任一蛋白质复性溶液用于重组人干扰素包涵体复性的用途。
全文摘要
本发明属于生物制药领域,具体涉及用于重组人干扰素包涵体蛋白质的复性溶液及复性方法；其特征在于:所述复性溶液按1升的终浓度计,由100毫升0.05－0.20molTris－HCL液,pH7.0－8.5、0.44－0.60molEDTA,pH7.5－8.5、1.2－2.55mmol还原型胱苷谷肽、0.1－0.31mmol氧化型胱苷谷肽、0.4－0.60mol L－精氨酸,余量为双蒸水或去离子水组成。本发明的复性溶液及分步加样、一次复性的方法,使蛋白质的复性率大大提高,同时简化复性工艺及所需设备,从而大大提高目的蛋白的收获率,降低重组人干扰素的生产成本。
文档编号A61K38/21GK1422865SQ0214621
公开日2003年6月11日 申请日期2002年10月16日 优先权日2002年10月16日
发明者白宪鹤, 林雨霖 申请人:武汉柏傲生物工程有限公司