专利名称：两性霉素b脂质体及制备方法
技术领域：
本发明涉及药物制剂及制备方法，具体涉及一种两性霉素B脂质体及制备方法。
背景技术：
两性霉素B是大环多烯类抗生素，目前在临床使用上是最有效的抗深部真菌感染的药物。近年来，深部真菌病的发病率有增高趋势，且病情大多严重，病死率高，特别在严重性疾病(如恶性肿瘤，血液病)基础上免疫功能明显下降，以及长期应用广谱抗生素、肾上腺皮质激素、或放疗、化疗时更易发生。但由于两性毒素有较严重的毒副作用，且临床的最大耐受量疗效不能发挥，因而限制了其的使用。为了减少两性霉素B的毒性与不良反应，国内外研究者将其改为脂质体，可在不降低疗效的基础上，减少其毒副作用。现有的脂质体处方设计较为复杂，且有些处方粒径难以保持在3μ以下，影响了疗效的发挥。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种辅料价廉易得，制备简便，包裹率高，脂质体粒径小，疗效稳定的新型两性霉素B脂质体。
本发明公开的两性霉素B脂质体由重量百分比为1.4-1.8％两性霉素B，50-89％卵磷脂，0.6-3.2％去氧胆酸钠和6-48％蔗糖组成，粒径≤1μ。
所述的卵磷脂选自从蛋黄中提取的天然卵磷脂，其氮含量≥17.0mg/mg，磷含量为3.5-4.0，酸值≤4.0，皂化值为170-210，碘值为60-70。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述脂质体的制备方法。
本发明公开的两性霉素B脂质体的制备包括下列步骤
按处方量称取卵磷脂加入无水乙醇溶解后，用旋转蒸发器成膜；另称取两性霉素B用氢氧化钠溶解，再将溶有去氧胆酸钠和蔗糖的磷酸缓冲液调pH至7-8后与卵磷脂混合，用高压均质泵粉碎，经0.22μ偏氟膜过滤，灌装，冷冻干燥即得。包裹率≥90％，粒径≤1μ。
本发明制备方法中所用磷酸缓冲液为pH7.04的磷酸缓冲液，如磷酸二氢钾和氢氧化钠缓冲液。
大量资料显示，包裹率高和粒径小是降低毒性，提高疗效的必要条件。本发明处方中选用的辅料去氧胆酸钠是普通两性霉素B制剂的辅料，经过几十年的临床使用，证明其有很好的水溶性，并能保证两性霉素B因天然磷脂成膜制成脂质体后的电荷互排性，增加电荷的互相排斥，经十多批数据及电镜照片证实，其脂质体呈双环结构。从而保证脂质体粒径≤1μ。
本发明脂质体为双层结构，该结构可增强药物的稳定性，使两性毒素B尽可能在疏水层中保留最大的含量，降低与机体中胆固醇的结合而增加对真菌细胞麦角固醇的结合，从而发挥最大杀菌能力。
用本发明脂质体进行有关毒理和药效试验，结果如下I毒理试验一、小鼠急性毒性试验(一)试验目的用本发明两性霉素B脂质体(L-AmpB)冻干制剂进行小鼠二种途径给药静脉和腹腔注射的急性毒性试验，观察动物反应情况，连续观察七天，记录动物毒性反应情况和死亡动物分布，并测定未包封脂质体两性毒素B(F-AmpB)静脉注射途径的急性毒性试验，计算出LD50值。
(二)试验结果1、给F-AmpB后，表现兴奋，抽搐，心跳和呼吸加快，直至死亡。2.55mg/kg给药后立即死亡4只，症状表现同上。
L-AmpB组7.0mg/kg于当天下午死一只，毒性表现症状呆滞，耸毛，呼吸及心跳加快而死亡，动物尸检，肉眼观察重要脏器未见明显病变，两者LD50测定结果见表1、表2。表1L-AmpB静脉注射LD50
表2F-AmpB静脉注射LD50
2、L-AmpB腹腔注射后小鼠表现呆滞，不食，呼吸快而急促，直至死亡。动物尸检主要器未见病变，根据死亡情况，求出LD50值，见表3。
表3F-AmpB静脉注射LD50
(三)结论1、静脉注射途径L-AmpB LD50为5.07(4.57-5.63)mg/kg。
F-AmpB LD50为2.61(2.41-2.81)mg/kg。
L-AmpB比F-AmpB的急性毒性小约2倍。
2、腹腔注射途径的LD50为43.63(38.86-49.01)mg/kg。
二、对肾功能的影响根据两性霉素B脂质体(L-AmpB)药效学的最大剂量3.0mg/kg及游离两性霉素B(F-AmpB)的最大耐受量(MTD)2.0mg/kg，经小鼠尾静脉注射，分别于给药后一天及七天进行肾功能检测，给药后七天，L-AmpB与F-AmpB的肌酐虽较对照组稍高，L-AmpB与对照组比较p＜0.05，F-AmpB与对照组比较p＜0.01，但均在正常范围，L-AmpB比F-AmpB大1.0mg/kg剂量，而血中肌肝L-AmpB比F-AmpB低。故对肾功能未产生影响。
三、对家兔耳静脉的刺激性观察三组家兔给予静脉注射L-AmpB及F-AmpB的剂量均为1.0mg及溶剂对照组，每天一次静脉滴注，连续七天，进行观察和作组织学检查，L-AmpB及溶剂组相同未见有明显刺激反应，而F-AmB组三只家兔耳静脉均见血管壁不完整，有血栓形成。
四、对兔红血球溶血试验L-AmpB按不同剂量，加入2％兔红血球悬液中，37℃放置30min、60min、120min、180min，对兔红血球无溶血作用。
五、对豚鼠的过敏试验经致敏注射后的豚鼠，随机分为两组，经14天及21天分别给予决定性注射L-AmpB，两组动物均未见有过敏现象。
II药效及药动学试验一、对小鼠全身性感染白色念珠菌的治疗作用L-AmpB与F-AmpB相等剂量(1.0mg/kg)的存活率分别为55％和35％，虽有差异，但P＞0.05，而将L-AmpB的剂量提高到3.0mg/kg或2.0mg/kg时，可明显增加疗效，存活率85％和75％，与F-AmpB1.0mg/kg相比较P＜0.01。将各组存活的动物继续饲养60天后，取肾组织制备匀浆，仅有L-AmpB3.0mg/kg组，经真菌培养为阴性，而其它各组真菌培养均为阳性。表明L-AmpB对感染白色念珠菌小鼠的药效作用比游离两性霉素B更为有效，与文献报道用合成膜材料制备的L-AmpB基本一致。
二、L-AmpB对小鼠颅内感染新型隐球菌的实验治疗作用L-AmpB与L-FmpB对新型球菌感染保护试验，以半数有效量(ED50)表示，试验结果L-AmpBED50为0.8252mg/kg，F-AmpB的ED50为0.8373mg/kg，两者ED50相似，但F-AmpB 3.0mg/kg组，尾静脉注射48小时内动物全部死亡，而L-AmpB无死亡，提示L-AmpB毒性较小。
三、L-AmpB治疗皮肤利什曼病L-AmpB成为内脏、粘膜及皮肤利什曼病的有效药物，L-AmpB比F-AmpB毒性较低，小单层带负电荷脂质体体外试验(利什曼病原体培养及鼠利什曼病)，F-AmpB比L-AmpB的活性大3-6倍，在体内BALB/c皮肤感染模型，通过静脉L-AmpB6.25mg/kg和50mg/kg疗效呈剂量相关性，在无毒性剂量的F-AmpB也无疗效，故提示L-AmpB可以用于治疗皮肤利什曼病。
四、L-AmpB治疗鼠组织胞浆菌病L-AmpB进行实验治疗能够很好耐受，其原因是L-AmpB药浓度主要集中在感染部位，提示在临床上L-AmpB可治疗组织胞浆菌病。
五、L-AmpB体外抗菌实验结果L-AmpB对体外抗真菌活性测定，根据方法学不同，抗真菌效力的定量试验有明显不同。本实验对10属15种107株致病菌抗菌活性，是用不琼脂稀释法测定MIC，结果显示AmpB体外抗真菌谱及MIC与文献报道基本一致，与L-AmpB在抗菌范围及敏感程度相平行。
综上所述L-AmpB3.0mg/kg对小鼠全身性感染白色念珠菌的动物模型有明显的疗效，且可取得根治效果，L-AmpB和F-AmpB对小鼠颅内感染新型隐球菌保护实验结果，以ED50两者相近，但相同3.0mg/kg的剂量组，F-AmpB组48小时内动物全部死亡，而L-AmpB均无死亡，显示毒性较小，体外抗真菌活性两者示显示有差异。
六、药动学研究为了较深入地了解L-AmpB在动物体内的药时行为，采用HPLC方法测定血药浓度，结果表明L-AmpB与F-AmpB均符合三室开放模型，其中L-AmpB的T1/2较F-AmpB1/2长三倍多，在各个取样时间点上的血液，L-AmpB较F-AmpB高3-5倍。
七、单层L-AmpB兔的药动学及安全研究给20只兔静脉注射单层L-AmpB0.5，1.0，5和10μg/kg，另12只兔给予F-AmpB0.5，1.0和1.5mg/kg(iv)，但F-AmpB高剂量组，2只兔发生急性心脏毒性而死亡；单剂量L-AmpB1.0mg/kg血清峰浓度Cmax26±2.4μg/ml及AUC0-∞60±16μg.h/ml，而单剂量F-AmpB1.0mg/kg，Cmax很低4.7±0.2μg/ml，L-AmpB与F-AmpB相比P＜0.001，以及F-AmpB AUC0-∞较低30.6±2.2μg.h/ml，两者相比P＝0.07；给予L-AmpB5.0μg/kg，Cmax(287±14μg/ml)及AUC0-∞(2223±246μg.h/ml)。
长期给L-AmpB5.0mg/kg/day×28day或F-AmpB1.0mg/kg/day×28day，L-AmpB每天峰浓度122.8±5.8μg/ml，谷浓度34.9±1.8μg/ml，而F-AmpB峰度降低仅1.766±0.11μg/ml，谷浓度0.46±0.04μg/ml，两者相比P≤0.001。长期给予L-AmpB5.0mg/kg/day，发现AmpB明显聚集在网状内皮系统的脏器，如肝脏239±39μg/g，比F-AmpB(1.0mg/kg/day)33±6μg/g大七倍，P＝0.002，但在肾脏药浓度L-AmpB(0.87±0.61μg/g)比F-AmpB(12.7±4.6μg/g)低14倍，L-AmpB发生肾毒性仅1/4，而F-AmpB所有的动物都发生肾毒性。肝转氨酶升高(肝毒性)，L-AmpB仅1只兔发生，故L-AmpB可以达到安全的较高峰浓度Cmax和AUC0-∞，并且降低肾毒性。
本品用1.0mg/kg及3.0mg/kg两种剂量给予大鼠静脉注射后，用HPLC法检测0.5h、4h及24h在一些脏器的组织分布结果显示L-AmpB3.0mg/kg组在各组织中的AmpB含量均比L-AmpB1.0mg/kg组高，0.5h肺内浓度最高，其次为肝4h时肝浓度最高，肺次之，再依次为脾、心、脑。24h的分布顺序肺、脾、肝、肾、心、脑。与文献报道合成膜材制备的L-AmpB分布基本相近。
L-AmpB的药动力体内代谢分布实验研究表明脂质体作为AmpB的载体，具有它的特点半衰期延长及AmpB分布在网状内皮系统较多，有利于对真菌病的治疗。
上述试验证明，本发明两性霉素B脂质体显著降低了原药的毒性，同时又保持了其抗真菌的药效。
图1 实施例1、两性霉素B脂质体激光粒度测试图
具体实施例方式实施例1
称取10g卵磷脂加入80ml无水乙醇，溶解后，用旋转蒸发器成膜；另称取两性霉素B 0.2g，用50ml0.04N氢氧化钠溶解，再将溶于0.2g去氧胆酸钠和2g蔗糖的磷酸缓冲液调pH至7-8，后与卵磷脂混合，用高压均质泵粉碎，经0.22μ偏氟膜过滤，灌装100支，冷冻干燥，即得，粒经＜0.412μ。两性霉素B脂质体激光粒度测试图(见图1)。
实施例2
称取14g卵磷脂加入100ml无水乙醇，溶解后，用旋转蒸发器成膜；另称取两性霉素B0.22g，用43m10.04N氢氧化钠溶解，再将溶于0.15g去氧胆酸钠和1.5g蔗糖的磷酸缓冲液调pH至7-8，后与卵磷脂混合，用高压均质泵粉碎，经0.22μ偏氟膜过滤，灌装100支，冷冻干燥，即得，粒经＜0.558μ。
实施例3
称取18g卵磷脂加入170ml无水乙醇，溶解后，用旋转蒸发器成膜；另称取两性霉素B0.24g，用55ml0.04N氢氧化钠溶解，再将溶于0.4g去氧胆酸钠和4g蔗糖的磷酸缓冲液调pH至7-8，后与卵磷脂混合，用高压均质泵粉碎，经0.22μ偏氟膜过滤，灌装100支，冷冻干燥，即得，粒经＜0.478μ。
权利要求
1.一种两性霉素B脂质体，其特征在于该脂质体由重量百分比为1.4-1.8％两性霉素B，50-89％卵磷脂，0.6-3.2％去氧胆酸钠和6-48％蔗糖组成，粒径≤1μ。
2.-种如权利要求1所述的脂质体，其特征在于其中所述的卵磷脂选自从蛋黄中提取的天然卵磷脂，其氮含量≥17.0mg/mg，磷含量为3.5-4.0，酸值≤4.0，皂化值为170-210，碘值为60-70。
3.一种如权利要求1所述的脂质体的制备方法，其特征在于该脂质体的制备包括下列步骤按处方量称取卵磷脂加入无水乙醇溶解后，用旋转蒸发器成膜；另称取两性霉素B用氢氧化钠溶解，再将溶有去氧胆酸钠和蔗糖的磷酸缓冲液调pH至7-8后与卵磷脂混合，用高压均质泵粉碎，经0.22μ偏氟膜过滤，灌装，冷冻干燥即得；包裹率≥90％，粒径≤1μ。
4.一种如权利要求3所述的脂质体的制备方法，其特征在于其中所述的磷酸缓冲液为pH7.04的磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明涉及两性霉素B脂质体及制备方法。本发明公开的两性霉素B脂质体由重量百分比为1.4－1.8％两性霉素B，50－89％卵磷脂，0.6－3.2％去氧胆酸钠和6－48％蔗糖组成。本发明还提供了该脂质体的制备方法。本发明新型两性霉素B脂质体辅料价廉易得，制备简便，包裹率高，脂质体粒径小，显著降低了原药的毒性，同时又保持了其抗真菌的药效。
文档编号A61P31/10GK1507854SQ02155190
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月17日 优先权日2002年12月17日
发明者张毓涛, 张晓航 申请人:上海医药(集团)总公司先锋药业公司