专利名称：卵黄抗体冻干制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及卵黄抗体的冻干制剂及其制备方法。
背景技术：
卵黄抗体(Egg Yolk Immunoglobulins，IgY)指存在于禽蛋卵黄中的免疫球蛋白，其成分主要为IgG，具有与血清抗体相似的生物学活性。
卵黄抗体具有制备简单、易于大量获得、无污染、无毒副作用、使用后无残留等优点，同时禽类病原通常不感染哺乳动物，消除了卵黄抗体成为传染源的潜在危险，可应用于防治畜禽传染病。国内外研制的产肠毒素大肠埃希氏菌卵黄抗体、猪流行性腹泻病毒卵黄抗体等在临床应用中均取得明显的治疗效果。
现有技术使用卵黄抗体多采用收集高效价卵黄后直接注射的方法，使用过程存在诸多问题。因卵黄中脂类含量较高，非常粘稠，直接注射吸收困难，注射部位常形成干酪样结节。若将卵黄抗体稀释后注射，抗体效价又明显下降。
直接使用卵黄抗体的另一问题是，卵黄为高蛋白物质，极易腐败变质。因而提纯卵黄抗体制成易于应用和保存的剂型在使用过程中非常必要。目前卵黄抗体提纯方法有多种，如氯仿去脂法，聚乙二醇沉淀法，酸化水处理法等，每种方法均有不同缺点。如氯仿去脂会造成较严重环境污染；聚乙二醇虽对卵黄抗体回收率较高，然而残留聚乙二醇较难去除且成本较高；用酸化水处理方法，抗体回收后因稀释度较高效价降低明显。
综上，研制从卵黄中简便高效提纯卵黄抗体的方法并制备易于使用与保存的剂型成为卵黄抗体应用的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种易于使用与保存的卵黄抗体制剂，该制剂的制备方法应该简便、不造成较严重环境污染、抗体效价高且成本较低。
本发明制备了卵黄抗体的冻干制剂，包括二联或多价卵黄抗体冻干制剂。
所述卵黄抗体冻干制剂的制备方法是制备细菌或病毒免疫原，用于免疫非免疫产蛋鸡，收集该被免疫鸡所产鸡蛋，从其卵黄中提取出针对该免疫原的卵黄抗体；利用酸化蒸馏水去除上述卵黄中的脂类，再用少量氯仿去除残余不溶性物质，然后用超滤装置浓縮卵黄抗体液，最后将浓縮卵黄抗体液按比例混合后在冻干机上冻干，制成二联或多价卵黄抗体冻干制剂。
所述酸化蒸馏水为蒸馏水中加入少许盐酸调节pH值为5.0。
本发明用上述方法制备了抗产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)的三个菌型K88/K99/987P的多价卵黄抗体冻干制剂和抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)二联卵黄抗体冻干制剂。这两种卵黄抗体冻干制剂可用于治疗因相应病原所致的仔猪腹泻。
本方法的优点是既彻底去除了卵黄中的脂类，经浓縮得到了高效价的抗体，而且制备的卵黄抗体冻干制剂易于保存和运输、使用方便。本发明提供的二联或多价卵黄抗体冻干制剂适于临床上及时对腹泻仔猪治疗和预防。
具实施方式实施例1产肠毒素大肠埃希氏菌多价卵黄抗体冻干制剂1.材料1.1细菌和培养基 产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)的3个菌型K88/K99/987P，购自中国兽药监察所；培养3个菌型K88/K99/987P的培养基TSA、Minca、Slanetz为实验室自行配制。
1.2免疫用蛋鸡120日龄待开产非免疫蛋鸡，购自中国兽医监察所，按常规方法饲养。
1.3试剂由白油、司本80、硬脂酸铝和吐温80制备的油佐剂为本实验室自配；免疫刺激剂“吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂”购自医院；酸化蒸馏水为盐酸调节蒸馏水pH值为5.0而制备；氯仿为分析纯，北京化工厂生产。
1.4实验仪器高速离心机为Beckman Coulter Avanti J-25型并配JA-10型转头；超滤装置为FILTRON中型盒式超滤系统，购自日本富士滤器公司；冷冻干燥机为Epsilon 2-60型小型冻干机。
2.方法2.1细菌免疫原制备 用少量灭菌生理盐水将冻干菌种K88、K99、987P稀释，用铂金耳挑取少量分别在TSA、Minca、Slanetz固体培养基上划线培养，然后挑取K88、K99、987P典型单个菌落接种5ml相应液体培养基，37℃振摇培养过夜后加入1500ml液体培养基中，37℃继续振摇培养过夜。细菌培养物经5000rpm×30min离心后收获菌体，用0.01MPBS(pH7.4)配制成1.0×1010/ml的菌体浓度，菌液中加入0.5％甲醛，37℃灭活24～48小时，其间振摇数次，经无菌检验合格后加入4％吐温-80充分混匀作为水相；白油与司班-80(96∶4)混合后加入2％硬脂酸铝，经溶化高压后作为油相与等量水相混合，充分乳化后制成菌体油乳剂灭活苗。
2.2免疫程序及方法初免前5天用“吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂”对每只鸡胸肌多点注射0.5mL，以刺激母鸡免疫反应。初免对每只鸡胸肌注射4点，每点0.2mL，颈部皮下注射0.2mL。于初免后2周进行二免，方法同初免，每点免疫剂量增加至0.3mL。二免后2周进行三免，每点免疫剂量增加至0.4mL。
2.3卵黄抗体效价检测 二免后1周开始，每周收集免疫蛋，分离出卵黄，采用琼脂扩散法进行抗体效价检测。在0.01MPBS(pH7.4)的溶液中加入8％NaCl和1.5％琼脂粉，加热融化后倒入平皿内，制成2～3mm厚的琼脂板，室温凝固后，4℃保存备用。卵黄用PBS作倍比稀释，稀释度分别为2×、4×、8×、16×、32×、64×。用打孔器将琼脂板打成七孔梅花型，酒精灯加热封底，周围孔加入不同稀释度的卵黄抗体，中间孔加入K88、K99、987P检测抗原，倒置平皿于37℃湿盒内反应24～72小时，直至沉淀线产生。以观察到沉淀线的抗体最大稀释倍数为检测样品的抗体效价。
2.4酸化蒸馏水处理取抗体效价≥1∶64的卵黄，加入10倍体积的酸化蒸馏水，充分匀浆后置4℃过夜，脂类物质在酸化蒸馏水作用下相互凝聚，可溶性蛋白溶于水中，通过10000rpm×30min离心，收集上清液。
2.5氯仿处理在酸化蒸馏水处理后的上清液中加入2％氯仿，充分振荡混匀后10000rpm×10min离心，可进一步去除脂类和不溶性蛋白，使上清液更加澄清，取上清液备用。
2.6超滤浓縮经酸化水和氯仿处理后收集的上清液在超滤装置上进行超滤浓縮，超滤装置为日本富士滤器公司生产的FILTRON中型盒式超滤系统，选用截留分子量为3万的低吸附超滤中型组合膜浓縮，起始频率为20Hz，工作频率为30Hz，浓縮后体积为原上清液体积的1/10，收集浓縮卵黄抗体液备用。
2.7多价卵黄抗体冻干制剂制备 将K88、K99、987P三种菌型相应的超滤浓縮卵黄抗体液分别用琼脂扩散试验测定抗体效价，然后用生理盐水稀释成1∶64的效价，最后将三种卵黄抗体液按1∶1∶1的比例配合混匀后分装于青瓶内，2.4ml/瓶，于冻干机上冻干，冻干过程温度变化为冻干室内温度由室温逐渐降低，2小时后降至最低-40℃，在此温度下维持1小时，然后按每小时升高5℃的速度逐渐升温，约需13小时升至室温，冻干的同时抽真空，最后在室温状态下维持5小时并压紧瓶塞，取出冻干样品，整个冻干过程结束。冻干后青瓶内为易溶于水的白色干粉，贮存于4℃备用。
实施例2猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒二联卵黄抗体冻干制剂1.材料1.1病毒猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，来自中国兽药监察所；猪流行性腹泻病毒(PEDV)，来自中国农业大学动物医学院。
1.2免疫用蛋鸡同实施例1中1.2。
1.3试剂佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自中国兽药监察所；其它试剂同实施例1中1.3。
1.4实验仪器同实施例1中1.4。
2.方法2.1病毒免疫原制备1日龄未吃初乳仔猪，用牛奶人工哺乳，每两小时喂1次，观察1天后，分别取TGEV、PEDV病毒液口服攻毒，攻毒后12小时左右开始出现腹泻症状，继而出现严重的黄色水泻，仔猪厌食和极度消瘦，至48小时剖杀病猪，取出全部小肠组织，用于提取和纯化病毒。将小肠组织充分剪碎和研磨，加10倍体积0.01MPBS(pH7.4)稀释，反复冻融三次，5000rpm×30min离心，取上清液加入6％PEG6000和2％NaCl，置4℃过夜，5000rpm×30min离心，沉淀重悬于1/5原液体积的PBS中，再置4℃过夜，重悬液经12000rpm×30min离心后上清液即为纯化病毒液。纯化病毒液与等量弗氏完全佐剂充分乳化后制成初免用免疫原；与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后作为二免及三免用免疫原。
2.2免疫程序及方法同实施例1中2.2。
2.3卵黄抗体效价检测同实施例1中2.3，检测抗原改为TGEV和PEDV。
2.4酸化蒸馏水处理同实施例1中2.4。
2.6超滤浓縮同实施例1中2.5。
2.7二联卵黄抗体冻干制剂制备 将TGEV、PEDV相应的超滤浓縮卵黄抗体液分别用琼脂扩散试验测定抗体效价，然后用生理盐水稀释成1∶64的效价，最后将两种卵黄抗体液按1∶1的比例配合混匀后分装于青瓶内，2.4ml/瓶，于冻干机上冻干，冻干过程同实施例1中2 7。
权利要求
1.卵黄抗体冻干制剂。
2.权利要求1所述的卵黄抗体冻干制剂是抗产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)的三个菌型K88/K99/987P的多价卵黄抗体冻干制剂。
3.权利要求1所述的卵黄抗体冻干制剂是抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)二联卵黄抗体冻干制剂。
4.权利要求1-3中任一项权利要求所述的卵黄抗体冻干制剂的制备方法是制备免疫原，用于免疫非免疫产蛋鸡，收集该被免疫鸡所产鸡蛋，从其卵黄中提取出针对该免疫原的卵黄抗体；利用酸化蒸馏水去除上述卵黄中的脂类，再用少量氯仿去除残余不溶性物质，然后用超滤装置浓縮卵黄抗体液，最后将浓縮卵黄抗体液按比例混合后在冻干机上冻干，制成二联或多价卵黄抗体冻干制剂。
5.权利要求4所述的卵黄抗体冻干制剂的制备方法，所述酸化蒸馏水为蒸馏水中加入少许盐酸调节pH值为5.0。
全文摘要
本发明提供了卵黄抗体的冻干制剂，包括二联或多价卵黄抗体冻干制剂。所述卵黄抗体冻干制剂的制备方法是制备细菌或病毒免疫原，用于免疫非免疫产蛋鸡，收集该被免疫鸡所产鸡蛋，从其卵黄中提取出针对该免疫原的卵黄抗体；利用酸化蒸馏水去除上述卵黄中的脂类，再用少量氯仿去除残余不溶性物质，然后用超滤装置浓缩卵黄抗体液，最后将浓缩卵黄抗体液按比例混合后在冻干机上冻干，制成二联或多价卵黄抗体冻干制剂。本发明的方法彻底去除了卵黄中的脂类，经浓缩得到了高效价的抗体。本发明提供的卵黄抗体冻干制剂易于保存和运输、使用方便。
文档编号A61P1/12GK1509765SQ02156900
公开日2004年7月7日 申请日期2002年12月20日 优先权日2002年12月20日
发明者王金洛, 徐福洲, 宋维平, 杨兵 申请人:北京市农林科学院畜牧兽医研究所