专利名称：凝血酶衍生物及其制造方法,去水凝血酶衍生物及其制造方法,血小板凝聚诱导组合物 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝血酶衍生物及其制造方法，去水凝血酶衍生物及其制造方法、使用该凝血酶衍生物的血小板凝聚诱导组合物、血小板凝聚诱导方法、临床检查药、临床检查方法、使用该去水凝血酶衍生物的血栓形成抑制剂、吸附体及其制造方法及使用该吸附体的精制了的血液凝固第VIII因子的制造方法。
背景技术：
近年，作为防止血栓形成物质的合成方法，开发了如下方法，即，如特开平11-49800号公报记载的在作为丝氨酸蛋白酶的活性化血液凝固因子上与苯基甲基磺酰氟(PMSF)等的抑制剂反应，将存在于活性部位的丝氨酸残基转换成去氢丙氨酸，使丝氨酸蛋白酶活性失活仅维持与基质的结合能的方法(称为去水化)，或者通过基因重组操作使使丝氨酸蛋白酶活性消失的方法。使用这些方法处理凝血酶而得到的去水凝血酶具有竞争地抑制活性化血液凝固因子和基质反应的效果，可以期待着作为凝血酶基质(活性化血液凝固因子、血纤维蛋白原等)吸附体的配位体的利用和作为血栓形成抑制剂的利用。
可是，由于该去水凝血酶只是通过化学处理和基因操作使丝氨酸蛋白酶活性失活，对于基质的结合能是与未处理的凝血酶基本上没有变化，所以用去水凝血酶作为配位体的亲和色谱从混合凝血酶基质(血液凝固第V、第VIII、第XI、第XIII因子、血纤维蛋白原、蛋白质C等)的血浆等的液体选择性地吸附、回收血液凝固第VIII因子是困难的。另外，虽然去水凝血酶具有作为抗血栓剂的功能，但是为了显示与上述的抗血栓剂相同的抗血栓效果必须加大使用量，所以其在使用上则受到了限制。
另外，在诊断血小板功能异常中，必须测定血小板凝聚能，在测定时凝血酶作为血小板凝聚诱导物质使用，但由于凝血酶即使在血小板凝聚以外也会诱起血纤维蛋白原的活性化，所以存在纤维的凝聚块对于测定血小板凝聚能有坏影响的问题。
有鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，积极加以研究创新，以期创设一种新的结构及其方法，使其更具有实用性。经过不断的研究、设计，并经反复试作样品及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一种新的作为活性化血液凝固因子的凝血酶，或者将凝血酶去水化了的去水凝血酶，使用通过化学，或者基因操作修饰使凝血酶基质(血液凝固第VIII因子)的选择性提高的凝血酶或去水凝血酶衍生物及含有凝血酶衍生物作为成分的血小板凝聚诱导物质及临床检查药及将该去水凝血酶作为配位体的吸附体，或以去水凝血酶衍生物作为主要成分，且抗血栓性能高的血栓形成抑制剂。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提出的一种凝血酶衍生物，该凝血酶的羧基被修饰了。
本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
前述的凝血酶衍生物，其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
前述的凝血酶衍生物，其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
前述的凝血酶衍生物，其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
前述的凝血酶衍生物，其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种去水凝血酶衍生物，该去水凝血酶的羧基被修饰了。
本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
前述的去水凝血酶衍生物，其中所述的其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
前述的去水凝血酶衍生物，其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
前述的去水凝血酶衍生物，其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
前述的去水凝血酶衍生物，其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种凝血酶衍生物的制造方法，用于制作前述的凝血酶衍生物，其主要是修饰凝血酶的羧基。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
前述的凝血酶衍生物的制造方法，其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
前述的凝血酶衍生物的制造方法，其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
前述的凝血酶衍生物的制造方法，其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
前述的凝血酶衍生物的制造方法，其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种去水凝血酶衍生物的制造方法，用于制作前述的去水凝血酶衍生物，其主要是修饰去水凝血酶的羧基。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
前述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
前述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
前述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethylcarbodiimide-p-toluene sulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
前述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种血小板凝聚诱导组合物，其作为一成分含有前述的凝血酶衍生物。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种血小板凝聚诱导方法，其使用前述的凝血酶衍生物。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种临床检查药，其含有前述的凝血酶衍生物。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种临床检查方法，其使用前述的凝血酶衍生物。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种血栓形成抑制剂，其含有前述的去水凝血酶衍生物。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种吸附体，其是将去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体，该结合是通过去水凝血酶的羧基和不溶性载体的官能基的反应而形成的。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种吸附体，其是通过具有2个以上氨基的化合物的氨基和去水凝血酶的羧基的结合而导入氨基的去水凝血酶、与水不溶性载体结合的吸附体，该结合是通过导入该氨基的去水凝血酶含有氨基和不溶性载体的官能基的反应而形成的。
本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术措施来进一步实现。前述的吸附体，其中所述的具有2个以上氨基的化合物是乙二胺。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其使去水凝血酶的羧基和不溶性载体的官能基进行反应。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其通过使含有2个以上氨基的化合物的氨基和去水凝血酶的羧基的结合而导入氨基的去水凝血酶所含有的氨基和不溶性载体的官能基反应。
本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术措施来进一步实现。前述的去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其中所述的具有2个以上氨基的化合物是乙二胺。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种精制了的血液凝固第VIII因子的制造方法，其使用前述的吸附体。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术方案可知，为了达到前述发明目的，本发明的主要技术内容如下
本发明人对于凝血酶进行反复锐意地研究之后结果发现，修饰了凝血酶羧基的凝血酶衍生物选择性地降低了凝血酶基质中血纤维蛋白原的亲和性，即，抑制了从血纤维蛋白原向血纤维蛋白的变换，仅是特异地使血小板活性化。
另外，本发明人进而对于去水凝血酶进行反复锐意地研究结果发现，修饰了去水凝血酶的羧基的去水凝血酶衍生物相对地提高了对于血液凝固第VIII因子的特异的选择性，提高了抗血栓性。根据上述这些见解完成了本发明。
本发明是由以下的(1)～(14)技术手段所构成。
(1)、凝血酶的羧基被修饰了的凝血酶衍生物。
(2)、去水凝血酶的羧基被修饰了的去水凝血酶衍生物。
(3)、上述凝血酶衍生物的制造方法，其特征是修饰了凝血酶的羧基。
(4)、上述去水凝血酶衍生物的制造方法，其特征是修饰了去水凝血酶的羧基。
(5)、血小板凝聚诱导组合物，其是含有上述(1)记载的凝血酶衍生物。
(6)、血小板凝聚诱导方法，其是使用上述(1)记载的凝血酶衍生物。
(7)、临床检查药，其特征是含有上述(1)记载的凝血酶衍生物。
(8)、临床检查方法，其特征是使用上述(1)记载的凝血酶衍生物。
(9)、血栓形成抑制剂，其含有上述(2)记载的去水凝血酶衍生物。
(10)、吸附体，其是将去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体，该结合是通过去水凝血酶的羧基和不溶性载体的官能基的反应而形成的。
(11)、吸附体，其是将通过具有2个以上氨基的化合物的氨基和去水凝血酶的羧基的结合而导入氨基的去水凝血酶和、与水不溶性载体结合的，该结合是通过导入该氨基的去水凝血酶的含有氨基和不溶性载体的官能基的反应而形成的。
(12)、去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其特征是使去水凝血酶的羧基和不溶性载体的官能基进行反应。
(13)、去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其特征是使具有将含有2个以上氨基的化合物的氨基和去水凝血酶的羧基的结合而导入氨基的去水凝血酶所含有的氨基和不溶性载体的官能基反应。
(14)、精制了的血液凝固第VIII因子的制造方法，其特征是使用在上述(10)或(11)记载的吸附体。
本发明的凝血酶衍生物由于对血纤维蛋白原的亲和性下降，所以可以应用于血小板诱导组合物，进而作为临床检查用等的特异凝固反应试剂。另外，将去水凝血酶作成配位体，通过与羧基结合的亲和性色谱，对于血液凝固第VIII因子可以更高选择地进行精制，另外修饰了去水凝血酶的羧基的去水凝血酶衍生物，与以往的去水凝血酶比较用少量也可产生充分的抗血栓效果，所以可以利用于血栓形成抑制剂。
综上所述，本发明主要是提供一种降低血纤维蛋白原活性的凝血酶衍生物及其制造方法，以及降低血纤维蛋白原活性的去水凝血酶衍生物及其制造方法。还提供了凝血酶的羧基被修饰了的凝血酶衍生物。由于该凝血酶衍生物对于血纤维蛋白原的亲和性下降，所以作为血小板凝聚诱导组合物、进而临床检查用等的特异凝固反应试剂而利用。另外，将去水凝血酶作为配位体，通过与羧基结合的亲和色谱，可以高选择地精制血液凝固第VIII因子，另外修饰了羧基的去水凝血酶衍生物与以往的去水凝血酶比较少量就可以产生充分的抗血栓效果，所以可以利用在血栓形成抑制剂。
本发明提供了凝血酶衍生物及其制造方法，去水凝血酶衍生物及其制造方法、血小板凝聚诱导组合物、血小板凝聚诱导方法、临床检查药、临床检查方法、血栓形成抑制剂、吸附体及其制造方法、精制了的血液凝固第VIII因子的制造方法，其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品及制造方法中未见有类似的结构设计及方法公开发表或使用而确属创新，其不论在产品结构、制造方法或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有技术具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
图l是全血的凝血弹性描记图(TEG)。
图2是表示在实验例8中，添加10μl凝血酶后的血小板凝聚的变化(吸光度的变化)图。
图3是表示在实验例8中，添加100μl EDC修饰凝血酶后的血小板凝聚的变化(吸光度的变化)图。
图4是表示在实验例8中，添加10μl EDC修饰凝血酶后的血小板凝聚的变化(吸光度的变化)图。
图5A、图5B是表示对于实验例9得到的修饰凝血酶的血纤维蛋白原的凝固活性和氨基(胺)量的图。
图6是表示在实验例10中，添加各浓度的EDC修饰凝血酶后的血小板凝聚的变化(吸光度的变化)图。
具体实施例方式
以下结合附图及其较佳实施例，对本发明的具体结构、制造方法、步骤、特征及其功效，详细说明如后。
以下，详细地说明本发明。
若按照第1方式，本发明在于提供修饰了凝血酶或去水凝血酶的羧基的凝血酶或去水凝血酶衍生物。
本发明中修饰对象的去水凝血酶的制造方法没有特别限制，作为去水凝血酶，例如可举出特开平11-49800号公报所示的，使丝氨酸蛋白酶的丝氨酸活性残基部位和PMSF等的抑制剂进行反应后，在pH11以上进行碱处理，去水化得到的，或者，用基因重组等方法将凝血酶的活性丝氨酸残基置换成丙氨酸使氧活性消失的方法得到的。
对于去水凝血酶的精制方法没有特别限制，可利用以往公知的精制分离方法。具体地有以下的方法，即，使用在pH4～10的范围调节的缓冲液(也可以直接使用丝氨酸蛋白酶的去水化反应时使用的缓冲液)平衡化了的亲和色谱柱中通过去水凝血酶的溶液，将去水凝血酶选择地吸附在色谱载体后进行洗涤，除去其他的杂质。
然后，为了分离结合在亲和色谱载体的去水凝血酶，将丝氨酸蛋白酶抑制剂溶液或者具有脒基、胍基、苯基、长链烷基、精氨酸残基中至少1个以上的物质溶液调节成pH4～10，通入亲和色谱柱中，洗脱目的物质。然后，通过透析、超过滤、凝胶过滤等的方法除去上述的脱离液成分，可得到高纯度的去水凝血酶。
作为可用于本发明去水凝血酶的精制的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可举出苯基甲基磺酰氟(PMSF)、2-苯基乙烷-1-磺酰氟、甲磺酰氟及对甲苯磺酰基(甲磺酰基)氟等的各种磺酰基氟，进而，甲磺酰氯、二异丙基氟磷酸(DFP)、3，4-二氯异香豆素(3，4-DCI)、L-1-氯-3-[4-甲磺酰胺基]-7-氨基-2-庚酮-盐酸(TLCK)及L-1-氯-3-[4-甲磺酰胺基]-4-苯基-2-丁酮(TPCK)等。
修饰如上述得到的去水凝血酶或凝血酶具有的羧基，可得到凝血酶或去水凝血酶衍生物。在此所说的修饰是指修饰凝血酶或去水凝血酶具有的羧基的一部分或全部的意思，作为其修饰方法，优选的是亚胺结合或氨基结合的，例如有如下方法，即，使凝血酶或去水凝血酶具有的羧基的一部分或全部与亚胺结合的方法、使凝血酶或去水凝血酶具有的羧基的一部分或全部与具有氨基的物质结合的方法及使凝血酶或去水凝血酶具有的羧基的一部分或全部与亚胺及具有氨基的物质结合后，修饰该羧基的方法。作为具有氨基的物质，对于化合物、来自天然的物质等没有特别限制，但更优选的是可增加羧基周边的立体体积。另外，对于这些的反应方法，可以使用以往已知的方法。
上述使用的亚胺没有特别限制，但可使用碳化二亚胺、更优选的是使用式R1N＝C＝NR2表示的碳化二亚胺衍生物。在上述式中，R1及R2表示甲基、乙基、环己基等的碳原子数1～15的链状或环状烷基、(2-吗啉代乙基)-对甲苯基甲磺酸盐、(3-二甲基氨基丙基)盐酸盐等。此时，R1及R2也可以相同或也可以不同。更具体地作为碳化二亚胺衍生物，可举出二环己基碳化二亚胺(以下，称为“DCC’)[C6H11-N＝C＝N-C6H11]、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}[CH3CH2-N＝C＝N-(CH2)3N+H(CH3)Cl-](以下，称为“EDC’)及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}(以下，称为“CMC”)等。这些碳化二亚胺衍生物可单独使用或以2种以上的混合物形态使用。其中，特别优选地使用作为水溶性碳化二亚胺的EDC及CMC。
在本发明中，凝血酶或去水凝血酶的羧基的用亚胺的修饰条件是根据使用的去水凝血酶或修饰物质(亚胺)的种类和量以及其他条件等而不同，只要是可将凝血酶或去水凝血酶的羧基修饰到所希望的程度的条件就没有特别限制。对于凝血酶或去水凝血酶的羧基修饰的优选的一个实施方式记载如下。即，首先用适当的pH缓冲液透析凝血酶或去水凝血酶后，添加修饰物质，在0～50℃、优选的是4～25℃、特别优选的是室温下，搅拌0.5～24小时、优选的是1～7小时。此时，作为使用的缓冲液，只要是加入从pH3～9、优选的是pH4～7的缓冲液任意选出的就可以。作为这样的缓冲液，例如可举出1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸-磷酸钠缓冲液、琥珀酸-氢氧化钠缓冲液、苯二酸钾-氢氧化钠缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、生理的盐类溶液或者古德(Good’s)的缓冲液等。另外，修饰物质的添加量，只要是可将凝血酶或去水凝血酶的羧基修饰到所希望的程度的量就没有特别限制，但优选的是对于凝血酶或去水凝血酶是过量存在，例如，优选的是在上述缓冲液中，以0.01M～5M、更优选的是0.1～2M左右的浓度存在的。
另外，在本发明中，可认为凝血酶或去水凝血酶的羧基通过亚胺(碳化二亚胺衍生物)的修饰，羧基按照以下所示地被修饰。
反应式 在本发明中，凝血酶或去水凝血酶的羧基的修饰，也可使用具有氨基的物质进行。通过具有这样的氨基的物质的修饰可将凝血酶或去水凝血酶的羧基(-COOH)变换成酰胺基(-CO-NHR)。此时，凝血酶或去水凝血酶的羧基的修饰，也可单独使用具有氨基的物质进行，但优选的是将具有氨基的物质及亚胺基组合使用。后者时，可以在用亚胺修饰凝血酶或去水凝血酶的羧基后，或者也可同时加入到凝血酶或去水凝血酶的羧基的亚胺的修饰工序中。
本发明使用的具有氨基的物质，只要是可将凝血酶或去水凝血酶的羧基(-COOH)变换成酰胺基(-CO-NHR)的话，对于化合物、来自天然的物质等没有特别限制，但最好是增加羧基周边的立体体积的。具有氨基的物质的具体例子，可举出乙二胺、三羟基氨基甲酯、羟基胺、乙醇胺、氯化铵等。其中，优选的是乙二胺、三羟基氨基甲酯。另外，对于这些的反应的方法可使用以往公知的方法。具有氨基的物质可单独使用或者以2种以上的混合物的形态使用。
在本发明中，凝血酶或去水凝血酶的羧基的用亚胺及具有氨基的物质的修饰条件是根据使用的去水凝血酶或修饰物质(亚胺及具有氨基的物质)的种类和量以及其他条件等而不同，只要是可将凝血酶或去水凝血酶的羧基修饰到所希望的程度的条件就没有特别限制。对于凝血酶或去水凝血酶的羧基修饰优选的1个实施方式记载如下。即，首先用适当的pH缓冲液透析凝血酶或去水凝血酶，除去夹杂物后，添加修饰物质，在0～50℃、优选的是4～25℃、特别优选的是室温下，搅拌0.5～24小时、优选的是1～7小时。此时，作为可使用的缓冲液，只要是加入从pH3～9、优选的是pH4～7的缓冲液任意选出的就可以。作为这样的缓冲液，例如可举出1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸-磷酸钠缓冲液、琥珀酸-氢氧化钠缓冲液、苯二酸钾-氢氧化钠缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、生理的盐类溶液或者古德缓冲液等。另外，亚胺及具有氨基的物质的添加量，只要是可将凝血酶或去水凝血酶的羧基修饰到所希望的程度的量就没有特别限制，但亚胺的添加量，优选的是对于凝血酶或去水凝血酶过量存在的，例如，优选的是在上述缓冲液中是0.01M～5M、更优选的是0.1～2M的。另外，具有氨基的物质的添加量，优选的是对于凝血酶或去水凝血酶过量存在的，例如，优选的是在上述缓冲液中是0.1M～5M、更优选的是0.5～2M的。
另外，在本发明中，可认为凝血酶或去水凝血酶的羧基的通过用亚胺(碳化二亚胺衍生物)及具有氨基的物质的修饰，羧基如下式所示地被修饰。
反应式 在本发明中，上述的凝血酶衍生物，其特征是通过将凝血酶的羧基的一部分或全体与亚胺结合，或者，凝血酶与亚胺及具有氨基的化合物结合，选择性地降低与血纤维蛋白原的亲和性，抑制从血纤维蛋白原向血纤维蛋白的变换，仅是将血小板特异地活性化。为此，本发明的凝血酶衍生物作为血小板凝聚诱导物质，进而作为临床检查药，特别是为了监视血小板的正常性的检查药是有用的。
另外，在本发明中，上述的去水凝血酶衍生物，其特征是通过将去水凝血酶的羧基的一部分或全体与亚胺结合，或者，通过将去水凝血酶与亚胺及具有氨基的化合物结合，对于含有血液凝固第VIII因子的血液凝固因子和血小板等一些的作用或者影响提高对于血液凝固第VIII因子的选择的亲和性；及改善抗血栓性。因此，本发明的去水凝血酶衍生物，对于吸附体，特别是血液凝固第VIII因子的精制用的吸附体；及作为血栓形成抑制剂，特别是血液凝固第VIII因子，特异的血栓形成抑制剂是有用的。
按照第2方式，本发明是将修饰了凝血酶的羧基的凝血酶衍生物作为成分的血小板凝聚诱导物质及临床检查药。本发明的凝血酶衍生物通过修饰降低血纤维蛋白原的亲和性，可控制由于凝血酶的血纤维蛋白形成，所以可不受血纤维蛋白析出的影响，仅特异地产生血小板凝聚作用。另外，活用该特性，可作为血栓症等的临床检查用试剂使用。
按照第3方式，本发明是提供血栓形成抑制剂，其是含有修饰去水凝血酶的羧基的去水凝血酶衍生物。在临床时，应该抑制血液凝固的病体很多，需要根据此时的状态给予血栓形成抑制剂，但本发明的血栓形成抑制剂是来自生理物质的，与含有以往的去水凝血酶的血栓形成抑制剂比较，用更少量就可显示对血液凝固抑制效果，所以从安全性、成本上看是理想的。
按照第4方式，本发明是在于提供吸附体，其是将去水凝血酶的羧基和水不溶性载体上的官能基结合而形成的。
作为本发明使用的载体，可使用公知的载体，但优选的是使用水不溶性载体。在本说明书中，所说的“水不溶性载体”是指构成载体的成分是非水溶性，或者进行交联反应等的处理将水溶性的物质作成水不溶性的物质构成的载体。具体地，可举出交联琼脂糖、纤维素、壳聚糖及聚丙烯酰胺等。这些中优选的是使用纤维素及交联琼脂糖。另外，对该不溶性载体的形状没有特别的限制，可以使用公知的形状，例如球状粒子状、中空丝状及膜状等的形状。
本发明中，水不溶性载体是球状粒子时，虽然没有必要是完全真球的形状，但是最好真球度高的形状。具体的是球状粒子的真球度优选的是0.9以上，更优选的是0.95以上。本说明书中，所说的“真球度”是指粒子的最小粒径(短径)对于最大粒径(长径)的比(＝短径/长径)，所以，该值越接近1.0则真球度越高，也就是说接近真球。
另外，在本发明中，水不溶性载体的形状是球状时，该水不溶性载体最好是球状纤维素。作为这样的水不溶性载体使用球状纤维素，可以使作为配位体的去水凝血酶的固定化变的容易，含有配位去水凝血酶的活性化血液凝固第VIII因子吸附体，其生体适合性及强度都提高。因此，本发明的吸附体作为活性化和/或非活性化血液凝固第VIII因子的吸附体是有效的。此外，这里所说的“生体适合性”语句是指将载体作为吸附体载体使用进行精制操作时，不从载体向生体溶解出有害物质的意思。
本发明中，水不溶性载体的形状是中空丝状时的中空丝状的载体，是指内部具有连续或者不连续的空洞的纤维状载体，例如，通过向纺丝液添加发泡剂，或者用特殊的器具等在内部形成空洞而得到的。
进而，在本发明中，水不溶性载体的形状是膜状时的膜状的载体，是市售的膜过滤器样的平板状，具有多孔，具有排出一定范围的超分子量。
本发明中，去水凝血酶的羧基固定在水不溶性载体的方法，可以使用以往公知的方法，例如，使用作为碳化二亚胺的EDC和、CMC，在水不溶性载体上结合氨基的方法，或者使去水凝血酶羧基与EDC或者CMC结合后，与乙二胺等的具有多个氨基的化合物缩合后，使导入的氨基和水不溶性载体上的N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide)(以下称为“NHS”)结合的方法。作为结合的方法，使用NHS的结合，在过剩活性基的封闭(blocking)时，也不影响作为配位体的去水凝血酶所具有的氨基，所以是优选的。
关于插入在水不溶性载体和配位体间的空隙没有特别的限制，可以适当选择具有环氧基、甲酰基等的公知化合物的适当长度的。
按照第5方式，本发明提供了使用第4方式的活性化凝固第VIII因子吸附体的活性化血液凝固第VIII因子的制造方法。通过使用该方法，几乎不吸附作为其他的凝血酶的血纤维蛋白原和、活性化凝固第V因子，选择地吸附活性化凝固第VIII因子，可以明显地降低地抑制构成免疫原的物质和、异种蛋白和病毒等的混入。
作为本发明的活性化血液凝固第VIII因子的制造方法，是将本发明的第4方式的活性化血液凝固第VIII因子吸附体充填到柱内，从其他的血液凝固因子等的含有的血浆成分、或者作为夹杂物混入了异种蛋白和病毒等所含有的血浆等的溶液，选择地吸附活性化血液凝固第VIII因子，高度地回收或者除去的方法。
实验例以下通过实验例具体地说明本发明。
实验例1去水凝血酶的合成将来自人血浆的凝血酶60mg溶解在含有0.15M的NaCl、0.1％PEG 50mM磷酸缓冲液(pH6.5)100ml。向该溶液中，每隔30分钟3次添加7％PMSF甲醇溶液100μl。将反应间的溶液保持在25℃。反应后的凝血酶的活性是1％以下。将PMS-凝血酶溶液注入到用含有0.1M NaCl、0.1％PEG 10mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡了的交联葡聚糖(Sephadex)G-25柱(菲尔玛什社制)，进行缓冲液的交换。
将上述溶液调整到4℃、120ml，添加1N NaOH反应12分钟使得最终浓度达到0.05M对于得到的溶液，添加3N NaCl 60ml，接着添加150ml甘油进行搅拌，用10倍量的含有1M NaCl、0.1％PEG的10mM磷酸缓冲液(pH6.5)透析上述溶液后，再次用含有0.1M NaCl、0.1％PEG的10mM磷酸缓冲液(pH6.5)透析。
实验例2去水凝血酶的精制用巴奥马斯(Biomax)10(微孔社制)浓缩实验例1得到的去水凝血酶溶液直到50ml，添加30mg对脒基苯基甲磺酰氟(APMSF)使残存的活性基失去活性。
进而，将得到的溶液添加在用含有0.1％PEG的5mM磷酸缓冲液平衡到pH6.5的苯甲酰脒琼脂糖柱中。用上述缓冲液洗净直到峰终止，通过含有0.1M NaCl的0.2M苯甲脒(pH6.5)洗脱，每次20ml分取60ml。测定各个的蛋白质，确认含在去水凝血酶内的馏分，将该馏分用含有0.1M NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH6.5)透析，除去溶液中的苯甲脒。该溶液中的蛋白质是30mg(收率50％)。
实验例3去水凝血酶的修饰将实验例2得到的去水凝血酶30mg用调整pH6.5的20mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、0.5M NaCl透析。透析后调整到30ml加入EDC并搅拌直到达到20mg/ml。在室温下反应3小时，作为去水凝血酶衍生物得到了修饰的去水凝血酶30mg。
实验例4去水凝血酶结合亲和色谱的制造将实验例2得到的去水凝血酶30mg用调整pH6.5的20mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、0.5M NaCl 10ml透析，添加氨基纤维素粒(氮社)20ml。再次将pH调整到6，加入EDC直到达到20mg/ml。在室温下反应6小时。
实验例5将实验例4得到的纤维素凝胶充填到柱中，用50mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液0.1M NaCl pH6进行平衡化。向该缓冲液中加入溶解了的康法科特F(化血研制)，用该缓冲液洗涤非吸附峰。进而，用50mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液0.3M NaCl pH6.5洗涤血纤维蛋白原之后，用50mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液0.1M NaCl 1M精氨酸盐酸盐pH6.5洗脱出血液凝固第VIII因子。除去混入的血纤维蛋白原，回收大约1000u/mg的血液凝固第VIII因子。
实验例6添加实验例3得到的衍生物，测定全血的凝血弹性描记图(TEG)，其结果表示在图1中。如图1所示，本发明的EDC修饰去水凝血酶依存浓度地延长了凝固。
实验例7向人血浆内添加实验例3的去水凝血酶衍生物(EDC修饰去水凝血酶)测定APTT(活性化部分促凝血酶原激酶时间)(表1)、PT(前凝血酶时间)(表2)。
表1
表2
从上述的表1及表2所表示的结果可以看出，作为本发明的去水凝血酶衍生物的EDC修饰的去水凝血酶对APTT有特异的依存浓度的血浆凝固时间的延长。此时，可认为APTT是与内因系凝固相关，PT是与外因系凝固相关时，作为本发明的去水凝血酶衍生物的EDC修饰的去水凝血酶，不仅是外因系，与内因系凝固相关而延长了凝固时间，这就暗示了这些作为血栓形成抑制剂是有用的。进而，从上述实验例5及下述的实验例11可以看出本发明的去水凝血酶衍生物由于与血液凝固第VIII因子特异的结合，所以作为对血液凝固第VIII因子的特异的血栓形成抑制剂是有用的。
实验例8将人的凝血酶4mg溶解在50mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液0.1M NaCl pH6.5 4ml中，添加100mgEDC反应3小时，作为凝血酶衍生物得到了EDC修饰的凝血酶。使用调整血小板数40万/μl的人多血小板浆(PRP)将上述物质作为诱导物质测定血小板凝聚。凝聚系为监视吸光度的下降(使用凝聚器阿古里特TE-500)。向PRP240μl内分别添加作为诱导物质的EDC修饰凝血酶10μl及100μl。作为对照使用10μM的凝血酶。
图2、图3及图4分别表示添加10μl凝血酶、100μl EDC修饰凝血酶、10μl EDC修饰凝血酶后的血小板凝聚的变化(吸收度的变化)的图。从图2、图3及图4可以看出，通过使用EDC修饰凝血酶与作为比较对照使用凝血酶的情况比较，可以进行干扰噪音少的监视。
更详细地说，凝血酶是血栓形成诱导物质，从来都是用来监视血小板正常性的血小板活性化物质。可是，如图2所示，在使用凝血酶时，在监视器中产生相当的干扰噪音。可以认为这些噪音，说明凝血酶不仅是活性化血小板，而且也引起了从血纤维蛋白原向血纤维蛋白的变换，所以，为了选择地正常监视血小板的正常性有必要从凝血酶除去血纤维蛋白原。与此相反，作为本发明的凝血酶衍生物的EDC修饰凝血酶，如图3及图4所示，在监视器中几乎不产生噪音，也就是，不引起血纤维蛋白原向血纤维蛋白的变换，只是特异地对血小板活性化。因此，在血小板的正常性监视中，就没有必要除去血纤维蛋白原。此外，用以下的考察，虽然不是限定本发明，但是本发明通过凝血酶衍生物来抑制从血纤维蛋白原向血纤维蛋白的变换(或者阻碍)，可认为凝血酶衍生物由于凝血酶的羧基的修饰而修饰了由于凝血酶对血纤维蛋白原的活性化部位。
因此认为，本发明的凝血酶衍生物，作为血小板诱导凝聚物质，临床检查药，特别是监视血小板正常性的检查药是有用的。
实验例9(1)乙二胺修饰凝血酶的配制将凝血酶添加到肝素柱中进行吸附，用1mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液0.5M NaCl pH6.5进行洗脱。将含有相同量的乙二胺的溶液(1M乙二胺-1Mm PIPES-0.5M NaCl pH6.5)与得到的含有凝血酶溶液(0.6mg/ml)混合。接着向其中添加EDC使得最终浓度达到20mg/ml，从添加EDC后经过2小时在室温下搅拌使其进行缩合反应，，从添加碳化二亚胺时(反应0分钟)开始，分别在1、15、30、60、90、120分钟后采取试样的一部分。
(II)乙二胺修饰凝血酶对血纤维蛋白原的凝固活性在上述的0分钟时、1分钟时、15分钟时、30分钟时、60分钟时、90分钟时、120分钟时的试样中加入等量的缓冲液(50mM NaHCO3、0.1M NaCl、pH8.0)停止缩合反应。
向得到的各个缓冲液300μl中加入血纤维蛋白原溶液(约0.1％)1ml，在室温下测定血纤维蛋白原的凝固时间。
将反应0分钟时的试样的凝固时间作为100％，表示各个试样的凝固活性时，该活性减少，反应60分钟后，其活性几乎丧失。结果表示在图5A中。
(III)乙二胺修饰凝血酶的氨基的定量在上述(I)的0分钟时、1分钟时、15分钟时、30分钟时、60分钟时、90分钟时、120分钟时的试样中加入少量的强碱溶液停止反应，使用0.5M NaCl-50mM NaOH溶液充分地进行透析，除去非结合乙二胺。
在得到的各个试样溶液中加入0.1M Na2SO3，接着加入TNBS(三硝基苯磺酸)液，迅速地搅拌，5分钟后加入含有亚硫酸离子溶液停止反应。
测定420nm的吸光度(图5B的A420)对各个试样的氨基进行定量。
其结果表示在图5B中。随着缩合反应的时间经过吸光度增加，显示了向凝血酶的表面的乙二胺的缩合反应量的增加。此外，在凝血酶的表面由于存在着作为二羧酸的天冬氨酸和谷氨酸，所以通过上述(I)的处理在该羧基上缩合乙二胺的氨基。乙二胺由于有两个氨基，所以没有用在缩合反应的氨基与TNBS反应通过420nm的吸收进行定量。
从实验例9的结果看出，使用碳化二亚胺对凝血酶羧基的修饰反应是随着时间的经过而进行。这是由于碳化二亚胺对含有在凝血酶中的多个羧基的修饰是随着时间的经过而进行的，反应时间越长在凝血酶中的碳化二亚胺的修饰率越高。而且，通过该乙二胺修饰凝血酶对血纤维蛋白原的凝固活性，通过反应60分钟后的乙二胺修饰凝血酶完全消失。
另一方面，对血纤维蛋白原的凝固活性，从反应1分钟开始急剧地下降，与对应的氨基酸的定量值对比时，可以确认即使凝血酶的一部分被碳化二亚胺修饰也可以有效地得到对纤维蛋白质的凝固活性下降的效果。
实验例10将人体凝血酶4mg溶解在50mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液0.1M NaCl pH6.5 4ml中，添加100mg EDC反应3小时，作为凝血酶衍生物得到了EDC修饰的凝血酶。使用调整血小板数40万/μl的人多血小板浆(PRP)将上述物质作为诱导物质测定血小板凝聚。凝聚监视吸光度的下降(使用凝聚器阿古里特TE-500)。向PRP内分别添加作为诱导物质的EDC修饰凝血酶使浓度分别达到91.3nM、36.5nM、30.1nM、24.2nM、20.1nM、10.1nM。作为对照使用不加入EDC修饰凝血酶的(添加浓度0nM)。
图6表示添加各浓度的EDC修饰凝血酶后的血小板凝聚的变化(吸收度的变化)图。从图6可以看出，通过使用EDC修饰凝血酶的添加浓度越高，吸光度越急剧地上升，也就是，迅速地将血小板凝聚，因此，说明了EDC修饰凝血酶是依存浓度诱导血小板。
因此认为，本发明的凝血酶衍生物，作为血小板诱导凝聚物质，临床检查药，特别是监视血小板正常性的检查药是有用的。
实验例11本实验例中用以下的方法评价乙二胺修饰去水凝血酶的基质亲和性。
将实验例2得到的去水凝血酶用1mM的1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液0.5M NaCl pH6.5透析，将含有等量的乙二胺溶液(1M乙二胺、1MmPIPES、0.5M NaCl、Ph6.5)与得到的含有去水凝血酶溶液(0.6mg/ml)进行混合。接着，向其中添加EDC使得最终浓度达到20mg/ml，从添加EDC后经过2小时，在室温下搅拌使其进行缩合反应，反应后，将修饰去水凝血酶用0.5M碳酸氢钠、0.5M NaCl溶液(4℃)进行2次透析，得到乙二胺修饰去水凝血酶。
对于得到的乙二胺修饰去水凝血酶及作为比较的去水凝血酶，使用IAsys(日制产业)测定血纤维蛋白原(Fbgn)、血液凝固第VIII因子(FVIII)及血液凝固第V因子(FV)间的解离常数(Kd值)。其结果表示在表3中。
表3
如表3所示，乙二胺修饰去水凝血酶对于血液凝固第VIII因子保持着高的亲和性，但是对于血纤维蛋白原(Fbgn)及血液凝固第V因子(FV)，其亲和性与FVIII比较显著地下降数百分之1程度。从这些可以暗示了本发明的去水凝血酶衍生物的乙二胺修饰去水凝血酶对于血液凝固第VIII因子有特异结合的作用。
本发明的凝血酶衍生物由于对血纤维蛋白原的亲和性下降，所以可以应用于血小板诱导组合物，进而作为临床检查用等的特异凝固反应试剂。另外，将去水凝血酶作成配位体，通过与羧基结合的亲和性色谱，对于血液凝固第VIII因子可以更高选择地进行精制，另外修饰了去水凝血酶的羧基的去水凝血酶衍生物，与以往的去水凝血酶比较用少量也可产生充分的抗血栓效果，所以可以利用于血栓形成抑制剂。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种凝血酶衍生物，其特征在于该凝血酶的羧基被修饰了。
2.根据权利要求1所述的凝血酶衍生物，其特征在于其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
3.根据权利要求2所述的凝血酶衍生物，其特征在于其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
4.根据权利要求3所述的凝血酶衍生物，其特征在于其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
5.根据权利要求1～4中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
6.一种去水凝血酶衍生物，其特征在于该去水凝血酶的羧基被修饰了。
7.根据权利要求6所述的去水凝血酶衍生物，其特征在于其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
8.根据权利要求7所述的去水凝血酶衍生物，其特征在于其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
9.根据权利要求8所述的去水凝血酶衍生物，其特征在于其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride}及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
10.根据权利要求6～9中任一权利要求所述的去水凝血酶衍生物，其特征在于其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
11.一种凝血酶衍生物的制造方法，用于制作权利要求1～5中任一权利要求所述的凝血酶衍生物，其特征在于修饰凝血酶的羧基。
12.根据权利要求11所述的凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
13.根据权利要求12所述的凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
14.根据权利要求13所述的凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride}及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluene sulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
15.根据权利要求11～14中任一权利要求所述的凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
16.一种去水凝血酶衍生物的制造方法，用于制作权利要求6～10中任一权利要求所述的去水凝血酶衍生物，其特征在于修饰去水凝血酶的羧基。
17.根据权利要求16所述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中使用亚胺进行该羧基的修饰。
18.根据权利要求17所述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中所述的亚胺是碳化二亚胺衍生物。
19.根据权利要求18所述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中所述的碳化二亚胺衍生物是从N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐{N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride}及N-环己基-N’-2-(4’-甲基-吗啉基)乙基碳化二亚胺-对甲磺酸盐){N-cyclohexyl-N’-2-(4’-methyl-morpholinium)ethyl carbodiimide-p-toluenesulphonate}组成的物质组中选择的一种物质以上。
20.根据权利要求16～19中任一权利要求所述的去水凝血酶衍生物的制造方法，其特征在于其中使用具有氨基的物质进行该羧基的修饰。
21.一种血小板凝聚诱导组合物，其特征在于作为一成分含有权利要求1～5中任一权利要求所记载的凝血酶衍生物。
22.一种血小板凝聚诱导方法，其特征在于其使用权利要求1～5中任一权利要求所记载的凝血酶衍生物。
23.一种临床检查药，其特征在于其舍有权利要求1～5中任一权利要求所记载的凝血酶衍生物。
24.一种临床检查方法，其特征在于其使用权利要求1～5中任一权利要求所记载的凝血酶衍生物。
25.一种血栓形成抑制剂，其特征在于其含有权利要求6～10中任一权利要求所记载的去水凝血酶衍生物。
26.一种吸附体，其是将去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体，其特征在于该结合是通过去水凝血酶的羧基和不溶性载体的官能基的反应而形成的。
27.一种吸附体，其是通过具有2个以上氨基的化合物的氨基和去水凝血酶的羧基的结合而导入氨基的去水凝血酶、与水不溶性载体结合的吸附体，其特征在于该结合是通过导入该氨基的去水凝血酶含有氨基和不溶性载体的官能基的反应而形成的。
28.根据权利要求27所述的吸附体，其特征在于其中所述的具有2个以上氨基的化合物是乙二胺。
29.一种去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其特征在于其使去水凝血酶的羧基和不溶性载体的官能基进行反应。
30.一种去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其特征在于通过使含有2个以上氨基的化合物的氨基和去水凝血酶的羧基的结合而导入氨基的去水凝血酶所含有的氨基和不溶性载体的官能基反应。
31.根据权利要求29所述的去水凝血酶和水不溶性载体结合的吸附体的制造方法，其特征在于其中所述的具有2个以上氨基的化合物是乙二胺。
32.一种精制了的血液凝固第VIII因子的制造方法，其特征在于其使用权利要求26～28中任一权利要求所记载的吸附体。
全文摘要
本发明提供一种降低血纤维蛋白原活性的凝血酶衍生物及其制造方法，以及降低血纤维蛋白原活性的去水凝血酶衍生物及其制造方法。还提供凝血酶的羧基被修饰了的凝血酶衍生物。由于该凝血酶衍生物对于血纤维蛋白原的亲和性下降，所以作为血小板凝聚诱导组合物、进而临床检查用等的特异凝固反应试剂而利用。另外，将去水凝血酶作为配位体，通过与羧基结合的亲和色谱，可以高选择地精制血液凝固第VIII因子，另外修饰了羧基的去水凝血酶衍生物与以往的去水凝血酶比较少量就可以产生充分的抗血栓效果，所以可以利用在血栓形成抑制剂。
文档编号A61P43/00GK1498226SQ02806790
公开日2004年5月19日 申请日期2002年3月19日 优先权日2001年3月19日
发明者细川和也 申请人:藤森工业株式会社, 智索股份有限公司