专利名称：基质金属蛋白酶抑制剂的脂质体靶向的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向癌症治疗，而且具体涉及小基质金属蛋白酶抑制剂在提高脂质体对癌细胞的靶向性，以及在增强其被所述细胞吸收的方面的用途。本发明从而提供了一种治疗癌症的方法，以及一种提高脂质体到肿瘤细胞的靶向性的方法，一种增强肿瘤细胞对脂质体的吸收的方法，一种利用脂质体选择性运送化疗试剂进入肿瘤细胞的方法。
背景技术：
基质金属蛋白酶(MMP)构成了一个能降解基质膜和胞外基质(ECM)，从而有助于组织重塑和细胞迁移的酶家族(Koivunen等，1999；Shapiro，1997)。MMP可被分成亚群，其中之一由IV型胶原酶或明胶酶，MMP-2和MMP-9组成。正常细胞例如滋养层细胞、铺骨细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞中明胶酶的表达被严格调控。与其它MMPs相似，明胶酶以失活方式被分泌(前MMP)，并且它们的激活需要蛋白水解切割。
明胶酶和其它MMP升高的或未加调控的表达可形成多种疾病的发病机理，包括肿瘤血管生成和转移、风湿性关节炎、多重硬化症和牙周炎。失活明胶酶的化合物因而可以为瘤和炎症紊乱提供潜在的治疗手段(Sorsa等，1994；Lauhio等，1991)。尽管许多MMP抑制剂被描述，明胶酶的特效抑制剂还不存在(Lauhio等，1991)。最近我们在随机噬菌体肽文库中筛选，目的是开发这种MMP亚群的选择性抑制剂。得到的活性最高的肽，缩写为CTT，发现能选择性的抑制所研究的MMP家族成员中MMP-2和MMP-9的活性(Koivunen等，1999)。CTT还在体外抑制内皮细胞和肿瘤细胞的迁移，也在小鼠模型体内抑制肿瘤的发展，显示了明胶酶在肿瘤入侵中的重要作用。
具有肿瘤异种移植物的小鼠中的实验表明CTT-展示噬菌体在给受试小鼠静脉注射后聚集在肿瘤的脉管系统中。噬菌体到肿瘤的靶向被CTT肽的共给药抑制(Koivunen等，1999)。这些结果提示CTT除了本身通过阻止癌细胞转移和血管生成，是有效的抗肿瘤试剂之外，还可用来将化疗试剂靶向到肿瘤。
在化学疗法中，只有很少一部分药物到达癌细胞，而其余药物就会损害正常组织。反作用可通过给予包囊在脂质体中的肿瘤药物而减少(Lasic等，1995)。改良的脂质体化合物已有描述，用以增强其稳定性并延长其循环周期(Tardi等，1996)。靶向肿瘤细胞的脂质体体内体外研究进展已有报道(Northfelt等，1996；Adlakha-Hutcheon等，1999)。通过衍生出带有识别靶细胞质膜抗原的特异抗体的脂质体可以达到增强的选择性，从而增加脂质体被细胞的吸收(Storm和Crommelin，1998)。因为MMP-2(Toth等，1997)和MMP-9(Brooks等，1996)与细胞表面特异受体结合，这些酶代表了脂质体识别扩散细胞，如肿瘤细胞和血管生成内皮细胞的潜在受体。
此外，自从1984年Sears经由酰胺连接键偶联了羧基PEG并纯化了大豆磷酸脂乙酰胺(PE)(Sears，1984)以来，与单甲氧基聚乙二醇(PEG)配合的磷脂已经得到广泛的应用。PEG添加到脂质体表面后吸引水层环绕该脂质体。该水层防止各种各样的血浆蛋白(调理素)吸附于脂质体表面，所以脂质体不会被网状内皮组织系统识别和吸收。
发明概述本发明是以某些MMP抑制肽提高脂质体到癌细胞的靶向性和增强其被所述细胞吸收的发现为基础的。
因此，本发明指向了具有环状基序C(X)yHWGFXXC(序列识别号1或3)的肽化合物或具有线性基序S(X)yHWGFXXS(序列识别号4或5)的肽化合物(其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3)，在提高脂质体到肿瘤细胞的靶向性，或者在增强脂质体被肿瘤细胞吸收方面的应用。
本发明进一步的目的是相应的方法，也就是一种提高脂质体到患者肿瘤细胞的靶向的方法，一种增强肿瘤细胞对脂质体的吸收的方法，其中将至少一种具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽化合物，或者一种具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽化合物(其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3)与脂质体混合，并将获得的混合物给予患者。
本发明还有另一个目的是提供一种利用脂质体选择性运送化疗试剂进入患者肿瘤细胞的方法，其中将至少一种具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽化合物，或者一种具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽化合物(其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3)与脂质体混合，并将获得的混合物给予患者。
本发明因而提供了一种治疗患者癌症的方法，其通过获得携带至少一种化疗试剂的脂质体，将该脂质体与至少一种选自具有环状基序C(X)yWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽的肽化合物(其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3)混合，并将获得的混合物给予患者。
在本发明进一步优选的具体实施方式
中，上述方法是通过在肽化合物与脂质体混合之前将聚乙二醇附着到脂质体上，优选附着在脂质体表面进行的。
本发明更进一步的目的是一种诊断方法，其中所述的肽化合物被用来将标记靶向到可疑肿瘤。可将放射性或磁性标记吸附于C(X)yHWGFXXC肽、或脂质体内部、或脂质体表面，它被C(X)yHWGFXXC肽靶向到肿瘤部位。肿瘤诊断是静脉注射标记过的肽或肽脂质体，并用γ成像或放射自显影检测。
本发明另一个目的是诊断或成像组合物，包括脂质体、至少一种选自由具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽和具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽组成的组的肽化合物(其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3)，以及一种可检测的标记。
可用于本发明目的的可检测的标记是放射性标记、磁性粒子或荧光标记。
本文下面将参照附图更详细的描述本发明。
图1A.浓度各自在85μM的CTT、CLP、STT和CWL肽对MMP-2活性的抑制，由酪蛋白酶谱学(zymography)评估。结果显示为消化的面积百分比，而未被抑制的MMP-2记作100％。误差条代表3个单独实验的标准偏差。
图1B.游离CTT(○)和结合到脂质体的CTT(●)对MMP-9的抑制，用材料和方法中所描述的荧光底物检测。磷脂的总浓度为200μMPOPC/POPE(80/20mol/mol)。数据点代表三份实验的平均值，条显示标准偏差。
图2.CTT(●)、CLP(■)及STT(▲)对eggPC单层的穿透，证据是将给定的肽加入水相后表面压(Δπ)的增加。所示数据为初始表面压(π0)的函数。
图3A.CTT Trp残基作为POPC/POPE(80/20mol/mol)浓度的函数的各向异性(r)。数据点代表5个测量值的平均数，误差条给出标准偏差。为提高信噪比，取15秒的信号进行平均。CTT的浓度为在PBS中的5μM且温度为37℃。
图3B.游离CTT肽(○)及其脂质体复合物(●)的Trp发射强度利用I-作为水溶性碰撞淬灭剂进行测量。数据点代表两个单独的测量。
图4A至4F.与PC/PE(80/20，摩尔比)脂质体(包囊荧光标记物以及靶向肽CTT)温育的U937、CHO及HT1080细胞摄取若丹明B的荧光显微影像，如图所示。图A和B表示U937细胞，其分别与含或不含CTT的脂质体温育。图C和D图示的为HT1080细胞的相同实验而图E和F为CHO细胞的相同实验(曝光时间延长10倍)。
图5A.图示肽对U937细胞吸收含若丹明B的脂质体(PC/PE，80/20摩尔比)的影响。总脂、若丹明B及肽浓度分别为200μM、2μM及100μM。数据通过比较若丹明荧光而标准化，所述若丹明荧光来自用添加了肽的脂质体温育的细胞(I)和用不含肽的脂质体温育的细胞(I0＝对照)。误差条代表标准偏差(n＝3)。
图5B.向包囊可溶性荧光标记物若丹明B的脂质体中加入CTT。测定HT1080细胞在与脂质体37℃或4℃温育30分钟后对这种荧光团的吸收。数据点是来自三份重复孔的平均值±SD。
图6.图示抗体对HT1080细胞吸收含若丹明B的脂质体(PC/PE，80/20摩尔比)的影响。结果显示为用添加了CTT肽的脂质体温育的细胞的若丹明荧光百分比，不含抗体的培养基中的记作100％。所用抗体为抗-MMP-2、抗-MMP-9，用抗-整联蛋白β3胞浆结构域的抗体作对照抗体。图示肽、阿霉素、抗体及脂质体(表示为总磷脂)的终浓度分别为85μM、0.2mM、20μg/ml及0.4μM。误差条代表4个单独实验的标准偏差。
图7.图示明胶酶抑制剂对HT1080细胞吸收含若丹明B的脂质体(PC/PE，80/20摩尔比)的影响。结果显示为用添加CTT肽的脂质体温育的细胞的若丹明荧光百分比，不含抗体的培养基中的记作100％。这里所用的抑制剂为TIMP-2(10μg/ml)。Marimastat(50μM)是MMP家族抑制人工合成的药物，EDTA为Zn2+螯合剂(500μM)，抑酶肽(1μg/ml)为丝氨酸蛋白酶抑制剂。图示肽、若丹明及脂质体(表示为总磷脂)的终浓度分别为85μM、0.2mM及0.4μM。误差条代表4个单独实验的标准偏差。
图8.CTT、CLP、STT和CWL对含阿霉素的脂质体诱导U937细胞致死的影响的比较，通过EthD-1荧光评估。细胞与包囊在脂质体(200μM总磷脂，PC/PE＝80/20，摩尔比)中的阿霉素(200ng/ml)和图示肽一起温育。图示肽、阿霉素及脂质体(表示为总磷脂)的终浓度分别为85μM、0.2mM及0.4μM。结果表示为RFI/RFI0，其中RFI0为无肽时与含阿霉素脂质体温育的细胞的数值。肽的浓度为85μM。条表示标准偏差(n＝3)。
图9.在短的诱导时间内，CTT-脂质体摄取与佛波酯的加入有关，它已知可刺激明胶酶表达，并通过该途径将明胶酶表达于细胞表面。当诱导时间延长时，明胶酶也位于培养基中。培养基中游离明胶酶的量增加，导致脂质体摄取被抑制。
图10.利用CTT-PEG-脂质体将细胞色素c靶向到HT1080细胞。细胞生存能力通过MTT试验测试，并且以590nm时的相对荧光强度给出。“无添加”指没有毒性药物时的细胞生存能力。“无脂质体的药物”指细胞色素c添加到不含脂质体的细胞上的情况。“未靶向的药物脂质体”是不含CTT的PEG化脂质体，而“CTT-药物脂质体”是CTT肽连接在PEG远端的PEG化脂质体。
图11A至11C.在裸鼠模型的KS肿瘤模型中，Tc99m-标记的CTT和/或脂质体到肿瘤的靶向。(A)有CTT的脂质体；(B)单独的标记CTT；(C)I-125-标记的脂质体。
发明内容
缩写CLP CLPGHWGFPSC(序列识别号7)CTT CTTHWGFTLC(序列识别号6)CWL CWLTFTHGTC(序列识别号9)DMEM Dulbecco′s改良的Eagle培养基DMSO 二甲亚砜DPPE 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPRho1，2-双十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-硫代氨甲酰
-N-6-四甲基若丹明ECM 胞外基质EGF 表皮生长因子eggPC 卵黄卵磷脂LUV 大单层囊泡MLV 多层囊泡MMP 基质金属蛋白酶NBD-PE1-酰基-2-((7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基)十二烷酰-1-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺NHS N-羟基硫代琥珀酰亚胺PA磷脂酰酸PC卵磷脂PE磷脂酰乙醇胺PEG 聚乙二醇POPC 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱POPE 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺RFI 相对荧光强度SDS 十二烷基磺酸钠STT STTHWGFTLS(序列识别号8)TIMP-2金属蛋白酶-2的组织抑制剂明胶酶抑制肽。三种肽被选择用于这个研究(表1)。CTT是近来描述的环状胶原酶抑制剂，它已表明靶向肿瘤(Koivunen等，1999)。STT是CTT相应的线性序列，其中末端的半胱氨酸被丝氨酸替代。第三个肽是CTT的类似物CLP，是利用Blast 1.4.11程序在SWISS-PROT和EMBL数据库中通过序列同源性查找发现的。因为我们的主要兴趣是CTT的保守部分，我们的查询序列是CXXHWGFTXC(序列识别号2)(Koivunen等，1999)。计算机查找显示了9个类似物，其中序列CLP是人类层粘连蛋白β-1链(LMB1)中EGF-7结构域的一部分。其余8个类似物中的3个是来自其它物种的层粘连蛋白，1个是来自免疫球蛋白重链，而4个是来自人和其它物种的噻嗪类化合物敏感型氯化钠协同运输蛋白。因为后面的这组与CTT具有较少的表观相似性，我们转而聚焦于CLP，层粘连蛋白EGF-7结构域的CTT相似序列。值得注意的是，所有三种肽(CTT、CLP和STT)均抑制MMP-2的活性，如通过酪蛋白酶谱学所评估的(图1)。在85μM CTT时抑制的程度接近70％。CLP也是一种强效的MMP-2抑制剂，在85μM肽时导致50％的抑制。线性CTT的类似物STT(85μM)使MMP-2的活性减少大约30％。类似的结果还可以从MMP-9得到。
与酪蛋白酶谱学的结果保持一致，当使用产荧光的肽作为底物通过明胶酶试验进行研究的时候，游离CTT以及与脂质体复合的CTT也抑制MMP-9(图1B)。CTT和CTT-脂质体的IC50值在两种试验中都是8μM。这些结果另外证明与CTT的一个表位相互作用的MMP-9结合到脂质膜后仍能与该酶相互作用。在这个试验中MMP-9(5nM)的完全抑制通过100μMEDTA螯合催化反应所需的Zn2+而获得。
与磷脂单层的相互作用。CTT的氨基酸组成自然的令人想到该肽是疏水的。因此有兴趣研究CTT是否与脂质结合。作为比较我们还研究了CLP和STT。为了这个目的，我们利用了存在于气/液界面上的磷脂单层，一种被广泛用来研究脂-蛋白相互作用以及蛋白对脂质单层侧向构造的影响的生物膜模型(Sderlund等，1999)。
注射于脂单层下的肽的穿透增加了表面压π，而未插入脂单层的肽不会引起表面压的变化。eggPC单层初始表面压(π0)在10和40mN/m之间变化，测量由于肽(终浓度为200μM)加入面下相(subphase)而致的表面压的增加(Δπ)(图2)。所有三种肽很容易的渗入单层膜，并且Δπ对π0的斜率性质上相似。在CTT、STT和CLP初始的单层包装压分别超过38、31、和33mN/m时，这些肽的膜穿透消失。
与脂质体的相互作用。上文使用eggPC脂单层的实验显示CTT、CLP和STT结合到膜上。这通过在浓度增加的脂质体存在的条件下测量CTT的Trp荧光发射各向异性来证实(图3A)。从而，脂质体不存在时r值为0.065，反映了溶液中所述肽的快速Brownian旋转扩散。然而，增加脂质体的浓度会引起r的渐进性增高，在230μM磷脂时测量值高达0.349。大约在CTT/磷脂的摩尔比接近5∶90时有明显的半数-最大效能。
固有的色氨酸荧光使得能够评估所述肽与脂质体的结合导致该荧光团微环境中可能的变化。在PBS中测量CTT Trp残基的I350/I330值为1.4，而LUV(0.5mM总磷脂)存在时，这个比率下降至1.00。因此在脂质体存在时Trp处于更加疏水的环境中，持续将CTT分配至脂质膜中。此外，I-对Trp的淬灭在脂质体存在时减少，并揭示CTT中的Trp只是部分的暴露于水溶性碰撞淬灭剂I-。在脂质体不存在和存在时的Stem-Volmer常数分别为0.0087和0.0034。
一些脂结合肽和蛋白可诱导脂质泡融合，为探讨这种可能性，标记和未标记的LUV在肽不存在和存在时混合，并且如早先的描述测量脂混合。然而在15分钟内，不仅CTT、STT而且CLP都没有造成NBD-PE荧光发射强度的可测量的变化，揭示了脂混合的缺乏，从而揭示了囊泡的半融合及融合的缺乏(数据未显示)。
对细胞吸收脂质体的影响。上面的资料显示CTT与磷脂结合而且CTT不造成脂质体融合。因此有兴趣研究CTT用于脂质体靶向的可能性。我们首先通过将荧光脂标记物DPPRho包容在如在材料和方法中描述的脂质体中来处理。随后向这些脂质体中加入CTT，接着他们被加入到用作明胶酶表达细胞模型的U937白血病细胞中。5分钟后洗这些细胞，细胞中的荧光用微量反应板阅读器测量。CTT促进了脂质体与U937细胞的结合，而且在CTT存在时大概有超过3.7倍的荧光标记物DPPRho结合到细胞上(数据未显示)。
然后我们继续研究CTT增强U937、CHO、NRK52E、HT1080细胞吸收包囊在脂质体中的水溶性荧光标记物若丹明B的能力。不含CTT的相同脂质体用作对照。在有CTT的脂质体加入细胞5分钟后，利用荧光显微镜可在细胞中观察到可溶性若丹明标记。CTT增强U937和HT1080摄取若丹明，但不增强CHO细胞(图4)。所有的U937和HT1080细胞都有荧光，但不同细胞的分布是不一样的，所以有的细胞比其它的发射出更多的荧光。MMP-2的表达和MMP-9一样对于脂质体吸收是必要的。因此，在我们的酶谱学分析中不表达明胶酶的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，在使HT1080和U937细胞的脂质体吸收明显增强的条件下不表现出CTT-脂质体的吸收。
脂质体包囊的若丹明的吸收由荧光板阅读器定量。较之于对缺乏所述肽的脂质体的吸收，U937细胞对脂质体包囊的若丹明的吸收被CTT增强3.6倍(图5A)。STT和CLP仅观察到较小的效果，而且与缺乏所述肽的脂质体比较起来信号太弱以至于没有统计学意义。拼凑的(scrambled)环状肽CWL在促进游离脂质体吸收方面也是无效的。相似的CTT对脂质体吸收的效果对于人HT1080纤维肉瘤和NRK52E大鼠肾上皮样细胞很明显(数据未显示)。CTT不能促进游离若丹明B的吸收。CTT只有在37℃才明显增强脂质体吸收而在4℃则不能，从而表明主动受体介导的细胞内吞作用牵涉其中(图5B)。TPA对CTT-脂质体吸收的作用分两个阶段，在短暂的暴露时间(15分钟)后脂质体的吸收增加，然而在延长温育(75分钟)后脂质体的吸收被抑制。这可以解释为明胶酶在低浓度时主要结合在细胞表面，而在高浓度时过量的明胶酶分布在胞外空间(Toth等，1997)。
明胶酶作为CTT-脂质体复合体的靶。我们进一步研究细胞表面结合的明胶酶是否是含CTT脂质体的受体。清洗细胞以除去可溶形式的明胶酶，接着在加入脂质体前与MMP抑制剂或特异性抗体预温育30分钟。这些实验表明HT1080细胞对CTT-脂质体复合体的内在化可部分的被MMP-9抗体有效阻止。特别的，两种这样的MMP-9抗体在一起使用时，完全阻止了脂质体包裹的荧光染料的内在化(图6)。抗体对MMP-2的抑制只是部分抑制。抗整联蛋白β1胞浆部分的抗体没有作用。这些结果表明抗MMP-9和抗MMP-2抗体对脂质体吸收的特异性封锁。
一组蛋白酶抑制剂的研究表明是MMP抑制剂而不是丝氨酸蛋白酶抑制剂阻止脂质体的吸收。MMP抑制剂TIMP-2和Marimastat、以及阳离子螯合剂EDTA每个都有相似的效果，造成脂质体到细胞的转运被抑制约50％(图7)。血清胰蛋白酶抑制剂或抑酶肽对于培养在10％胎牛血清中并已内在化脂质体的细胞没有显著的抑制效果。
阿霉素，一种广泛应用的抗癌药，已经被高效的包囊在脂质体中(Gokhale等，1996)。在U937培养物中研究CTT促进脂质体吸收和将该治疗试剂靶向到肿瘤细胞中去的功效。将CTT加入到脂质体溶液中达到200μM浓度，相应于CTT/脂摩尔比为～1∶2。然后将该溶液加入到U937细胞中，得到CTT和阿霉素的终浓度分别为85μM和0.4μM。所述合成肽和脂质体在高达本研究所用的浓度时对细胞没有毒性(数据未显示)。未加入CTT的脂质体被用作对照，用EthD-1试验来评估细胞死亡。24小时后，观察到比无CTT的脂质体增加4.1倍的细胞死亡(p＜0.001)(图8)。另外，抑制STT和CLP肽的明胶酶而非拼凑的CWL肽增强脂质体包囊的阿霉素的细胞致死效应，但程度低于CTT。因此，STT和CLP分别使死亡细胞数增加1.7和1.3倍(p＜0.01)。
PEG脂质体。我们还制备了PEG-脂质体，其中PEG-脂衍生物通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺氢氯化物连接在CTTHWGFTLC肽羧基末端(Grabarek和Gergely，1990)。DPPE与PEG(2000)通过一个氨基甲酸根连接，在其一个末端具有一个氨基基团。PEG-脂衍生物的应用延长了脂质体在体内的循环时间。它还把该肽锚定在脂质体表面，防止该肽与在血液循环中的脂质体结合。它可用于靶向肿瘤细胞、肿瘤血管、类风湿性关节炎和其他大量表达明胶酶的患病组织。最常用的PEG分子量是2,000和5,000，但是600到12,000范围的PEG也可使用。偶联物的脂类部分从饱和或不饱和PE到带有短链(C8)、中链(C14)和长链(C20)脂肪酸的胆固醇和神经酰胺多样化。在脂质一侧可使用无穷多样的脂质锚从PE到PA、心磷脂、胆固醇或神经酰胺。胺在这里作为功能团使用，但所有其它将肽或修饰肽连接到EG衍生物的反应基团同样也能使用，例如生物素、马来酰亚胺或羧基-NHS-酯。
CTT肽/脂质体被细胞吸收是以对加入佛波酯作出反应的方式进行的，已知加入佛波酯可刺激明胶酶表达(图9)。这表明明胶酶的表达水平与CTT-脂质体的吸收有关。在我们的研究中使用了中国仓鼠卵巢细胞，其在我们的明胶酶谱学试验中不表达高水平的明胶酶。我们的结果是在CHO细胞中不发生脂质体靶向。这令我们想到CTT-脂质体的吸收是依赖细胞类型的而且与该细胞类型的明胶酶表达水平有关。
脂质体靶向实验使用了在脂质体表面具有CTT肽和在脂质体内部具有若丹明的脂质体，所述实验揭示脂质体靶向在37℃能成功而在4℃不成功。这意味着在脂质体内在化时发生主动受体介导的内吞作用。
CTT-脂质体的吸收在短的诱导时间内与佛波酯的加入相关，已知加入佛波酯可刺激明胶酶表达，并通过该途径将明胶酶表达于细胞表面。当诱导时间延长时，明胶酶也位于培养基中。培养基中游离明胶酶的量增加，而脂质体摄取被抑制(图10)。
还进行了脂质体靶向的体内实验。图11A显示了用放射性标记的CTT-肽脂质体处理过的裸鼠的γ成像。CTT用锝-99m标记，它螯合在两个半胱胺酸残基之间。在尾静脉注射的30分钟后进行γ成像。瘤的位置(植入KS1767卡波西肉瘤)用箭头指示。图11B显示了没有脂质体的CTT-肽的γ成像，而图11C使用了没有CTT-肽的脂质体，用放射性碘-125-标记的BSA，包囊在脂质体内部。
实验材料和方法材料。卵黄卵磷脂(eggPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、阿霉素(亚德里亚霉素)、若丹明B及具有2.7mM KCl和0.137MNaCl、25℃时pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)购于Sigma，1-酰基-2-((7-硝基-2-1，3-苯并二唑-4-基)氨基)十二烷酰-1-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(NBD-PE)和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)购于Avanti(Birmingham，AL)。另一种荧光脂1，2-双十六烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-硫代氨甲酰-N-6-四甲基若丹明(DPPRho)及荧光探针啡啶鎓5，5′[1，2-乙二基双(亚氨基-3，1-丙二基)]双(3，8-二氨基-6-苯基)-二氯化物、二氢氯化物(EthD-1)来自Molecular Probes(Leiden，荷兰)。MMP-2购于BoehringerMannheim GmbH(德国)。Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM)和含Glutamax-1的RPMI 1640细胞培养基来自Gibco Life Technologies(Paisley，苏格兰)。磷脂贮液在氯仿中制备。以氯仿/甲醇/水(65∶25∶4，体积比)为溶剂在硅酸包被板上经薄层色谱检测脂纯度。在碘染色后或合适时检查板，荧光照明显示没有杂质。用高精度的电子称(Cahn Instruments，Inc.，Cerritos，CA，美国)通过重量检测无荧光的磷脂的浓度，而那些荧光磷脂类似物用分光光度法检测，用甲醇做溶剂，DPPRho在540nm时摩尔消光系数为ε＝93,000而NBD-PE在463nm时的摩尔消光系数为ε＝21,000。抗人MMP-9和MMP-2由Dr.Timo Sorsa惠赠(芬兰赫尔辛基大学医学化学和牙周病学系)。Marimastat获自British Biotech。TIMP-2以及MMP-2荧光底物MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg来自Calbiochem(La Jolla，CA，美国)。
序列同源性搜索。通过BLASTP 1.4.11 MP用国家生物信息中心推荐的短肽策略(同一性矩阵、字数1、预期值1000)寻找CTT(CTTHWGFTLC)(序列识别号6)的同系物。其他参数为默认值。我们的查询序列为CXXHWGFTXC(序列识别号2)。发现9个类似物，其中有人类层粘连蛋白β-1链前体的EGF-7结构域的一部分CLPGHWGFPSC(此处表示为CLP，序列识别号7)。还寻找了CLP的同系物，并与SWISS-PROT SIM程序比较。
合成肽。肽在Applied Biosystems 433 A(Foster City，CA，美国)自动合成仪上用Fmoc-化学反应合成。在含20％二甲亚砜(DMSO)的5％乙酸(pH6.0)中通过持续搅拌室温过夜温育形成二硫键(Domingo等，1995)。然后按1∶2的比例用0.1％三氟乙酸稀释，将肽上样到预先准备的反相HPLC柱进行乙腈梯度洗脱。用质谱法检测肽的同一性。本研究中所用肽和他们的氨基酸序列、各自的缩写汇编于表1表1.CTT、CLP、STT和CWL的氨基酸序列，保守残基为粗体。分子量在括弧中。
CTTCys-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys(1168)(序列识别号6)CLPCys-Leu-Pro-Gly-His-Trp-Gly-Phe-Pro-Ser-Cys(1203)(序列识别号7)STTSer-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Ser(1136)(序列识别号8)CWLCys-Trp-Leu-Thr-Phe-Thr-His-Gly-Thr-Cys(1168)(序列识别号9)明胶酶试验。用酪蛋白酶谱学测量不同的合成肽对MMP-9和MMP-2的抑制(Halinen等，1996)。MMP-9如上所述纯化(Sorsa等，1997)。随后MMP-2(2.5μg)或MMP-9(2.5μg)在含有2mg/ml酪蛋白的10％ SDS-PAGE中电泳。凝胶先用含Triton X-100的缓冲液洗去SDS，然后切成5片，浸入含肽(CTT、CLP、CWL或STT)的溶液中(85μM)。37℃温育48小时之后，凝胶用考马斯蓝染色、扫描，用图象分析定量消化区域(Global Lab Image 3.2，Data Translation Inc.and Acuity Imaging Inc.，Marlboro，MA，美国)。
MMP-9活性还用荧光肽底物MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg(Calbiochem，San Diego，CA，美国)测量。更具体的，50ng MMP-9在没有或有CTT或其脂质体复合物的情况下在PBS中室温预温育30分钟。随后荧光底物以终浓度0.1mM加入，继续在37℃温育15分钟，而后用微量滴定板阅读器以340nm激发光和390nm发射光来测量荧光强度。
肽与脂质单层的相互作用。肽穿过单分子脂质膜的情况使用磁力搅拌循环井测量(面下相体积400μl)。表面压(π)用连接到微量天平(其与PentiumPC相连)的Wilhelmy导线测量(μTroughS，Kibron Inc.，Helsinki，芬兰)。将脂质铺在氯仿(大约1mg/ml)中的气-液(PBS，pH7)界面上以达到不同的表面压，并使其平衡15分钟，然后将所示肽(4μl，水中10mg/ml并且CWL在DMSO中)加入面下相。π从加入肽后的初始表面压力(π0)开始的增加在大约20分钟内完成，将π0与肽结合到膜上后观察到的数值的差记作Δπ。所有的测量均在室温(～+24℃)进行。数据以Δπ对π0表示(Brockman，1999)。
脂质体的制备。脂质贮液在氯仿中混合得到所需组合物。溶剂在温和的氮流下除去，脂质剩余物随后减压保持至少2小时。多层脂质体的形成是在室温下将干脂质与含若丹明B(10μM)或阿霉素(1.8μM)的1ml PBS水合，从而把这些化合物包囊进脂质体中，得到1mM的脂质浓度。多层脂质体被反复冻/融5次以增强包囊性(Clifford等，1990)。用LiposoFastPneumatic气压操控的小体积搅拌器(Avestin，Ottawa，加拿大)19次挤压MLV通过100nm孔径的聚碳酸酯膜(Nucleapore，Pleasanton，CA，美国)得到大单层囊泡(LUV)。将囊泡经由过滤器挤出的压力是25psi(～170kPa)。在指定的时间，将肽(2mg/ml，在PBS中，除了CWL在DMSO中外)与LUV混合，使脂质和肽的终浓度分别为1mM和0.5mg/ml。
PEG-脂质体的制备。DPPE与PEG(2000)通过一个氨基甲酸根连接，在其一个末端具有一个氨基基团。PEG-脂衍生物通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺氢氯化物连接在CTTHWGFTLC肽羧基末端(Grabarek和Gergely，1990)。CTT-PEG-PE通过凝胶过滤来纯化。将4％CTT-PEG-PE加到16％POPE和80％POPC(mol/mol)中，同上面脂质体一样制备荧光光谱术。通过荧光光谱术研究CTT、STT、CLP及CWL的色氨酸残基在脂质体中的环境。在水中，Trp荧光峰的中心是在～350nm，而在疏水环境中的发射中心靠近330nm。因此，通过测量I350/I330(350nm和330nm时的发射比率)可以监测Trp微环境的变化(Lakowicz，1999)。用配有磁力搅拌、恒温透明容器区室的Perkin Elmer LS 50 B分光光度计记录色氨酸荧光。所有测量都是于37℃在5mM Hepes、0.1mM EDTA、pH7.4的缓冲液中进行的。激发带通和发射带通分别为10nm和10nm。激发波长为295nm，发射波谱在300到400nm范围内记录。CTT、STT、CLP和CWL的Trp发射波谱在有和无POPC/POPE(80/20，mol/mol)LUV的情况下记录，如显示的那样产生最终的脂质浓度10μM和100μM。
利用在激发和发射光波束中旋转的起偏镜以10nm带通测量作为浓度增加的脂质体的函数的CTT Trp残基的荧光偏振现象。结果表示为发射各向异性(Lakowicz，1999)，计算如下
r＝(III-I⊥)/(III+2I⊥)在这个等式中I⊥和III分别表示与起偏镜垂直和水平的发光强度。
用I-作为碰撞淬灭剂研究Trp暴露在水相的程度(Lakowicz，1999)。淬灭程度用下列等式计算F0/F＝1+k[Q]＝1+kqτ0[Q]其中F0和F为无或有淬灭剂Q时345nm处的Trp荧光强度，τ0为无该淬灭剂时的Trp荧光表现期，k是Stern-Volmer常数(将数据线性化后，由其斜率得到该常数)。CTT中(5μM)Trp及其淬灭剂的荧光在无和有POPC/POPE(80∶20，mol/mol)LUV(最终的脂浓度为0.5mM)的情况下测量。该结果根据PBS和脂质体引起的本底进行修正。
脂质混合试验。CTT、CLP、STT和CWL肽引起脂质体融合的能力可以通过测量脂质混合来评估，如早先所述(Struck等，1981)。简要的，将NBD-PE(X＝0.01)和DPPRho(X＝0.01)掺入脂质体(POPC/POPE，78/20，mol/mol)内。由于NBD-PE(供体)发射光谱和DPPRho(受体)吸收光谱的重叠，共振能在这些染料之间高效转移。随着含NBD-PE和DPPRho的脂质体与未标记的脂质体混合，观察到融合，其表现为由探针的稀释而引起的NBD-PE发射强度的增大。所用的NBD-PE激发波长和发射波长为430nm和530nm。所有的荧光测量在37℃进行。
细胞吸收脂质体的试验。为了研究不同肽对细胞吸收脂质体的影响，将若丹明-标记的磷脂类似物(DPPRho)掺入脂质体内作为示踪物，得到POPC/POPE/DPPRho(80∶19∶1，mol/mol)组合物。将所示肽与LUV混合，随后加入到微孔板培养的细胞中。在38℃温育5分钟后，用冷PBS将细胞洗三次，除去没有附着到细胞上的脂质体。与细胞结合的DPPRho的相对量用Tecan Spectrafluor Plus微量反应板阅读器(Tecan，Hombrechtigon，瑞士)，以535nm激发波长，595nm发射波长进行测定。
在其他系列实验中水溶性荧光标记物若丹明B被包囊进脂质体并测量其被细胞的吸收。用于若丹明B吸收的样品如下制备将含10μM若丹明B的60μl POPC/POPE(80/20，mol/mol，1mM)脂质体与补充有10％胎牛血清、Glutamax I、青霉素100U/ml和链霉素0.1mg/ml的300μl DMEM培养基混合。然后加入终浓度为8.5μM的肽。10μl(105细胞)含有所示细胞的培养基与LUV混合。37℃或+4℃温育15分钟后，没有附着在细胞上的脂质体用冷PBS冲洗三遍从96孔培养板上去掉。+4℃温度是用来作为非细胞内吞性脂质体吸收的对照(Oess和Hildt，2000)。与细胞结合的若丹明B的相对量用微量反应板阅读器测定，535nm为激发波长，595nm为发射波长。
我们还用佛波酯(TPA)(50nM)预温育细胞。预温育的时间从15到75分钟不等。用佛波酯(TPA)处理细胞可以提高MMP-9的表达和分泌(Toth等，1997)。结果表示为RFI＝I/I0，这里RFI是相对荧光强度，I0是没有肽的LUV中的2μM若丹明B(对照)的发射强度，I是被细胞吸收的肽-脂质体复合物中若丹明的发射光强度。所示抗体(αMMP-9和αMMP-2)和明胶酶抑制性复合物(TIMP-2，Marimastat及EDTA)对HT1080细胞吸收含若丹明B的脂质体(PC/PE，80/20摩尔比)的效果的实验如上进行。M-17抑制MMP-9结合底物并且这种抑制预期是由浓度决定。还不知道是否兔多克隆抗体可封阻人的MMP-2(Murphy等，1994)。所示的肽、阿霉素、抗体和脂质体的终浓度分别为85μM、0.2mM、20μg/ml及0.4μM。
细胞培养和荧光显微镜检。U937(ECACC 85011440)、HT1080(ECACC85111505)和CHO(ECACC 85050302)细胞用RPMI或DMEM培养基培养，培养基中补充10％胎牛血清、Glutamax I、青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)。培养细胞对含若丹明B的脂质体的吸收用荧光显微镜来检验。所用的是一个倒置荧光显微镜(Zeiss IM 35)，它装配有尼康特长工作距离物镜(20x)和(40x)。样品制备如若丹明吸收试验所述，稍作更改。因此，不经清洗将U937、HT1080和CHO细胞以及含若丹明的脂质体和在细胞培养基中的上述细胞转移到Nunclon 48孔板中。通过合适的波段滤波器(Melles-Griot)选择激发和发射波长分别在535nm和＞600nm范围传播。荧光图象用与电脑连接的Peltier-cooled数码相机(C4742-95，Hamamatsu，日本)观察，用由仪器制造商提供的软件(Hipic 5.0)操作。
生存力试验。包囊阿霉素的肽-脂质体复合物如上所述制备，使肽、脂和阿霉素的终浓度分别为85μM、0.2mM和0.4μM，随后加入到10μl(105细胞)U937细胞样品中。用EthD-1检测细胞的死亡。这个荧光团是膜不渗透性的而且只有当结合到DNA上才能发光(Papadopoulos等，1994)。因此，EthD-1很容易进入死亡细胞并结合到他们的DNA上，其荧光强度与死亡细胞的数量有关。用微量反应板阅读器测量EthD-1的发射，激发用495nm而发射用635nm。用Student’s t-检验评估统计学意义。
体内脂质体靶向实验。BSA的碘化通过Iodogen 1，3，4，6-四氯-3，6-二苯基甘脲方法进行。简要的，100μl(10mg/ml)BSA和125I(50MBg)在包被了Iodogen的小瓶中混合。为分离游离Iodogen，用PD-10凝胶柱过滤反应产物。脂质体POPC/POPE(80∶20 mol/mol)的形成和碘化BSA的包囊如早先所述制备。由来自赫尔辛基大学医院的SL Karonen博士用99mTc标记CTT-肽。CTT和脂的注射浓度分别为8.5到85μM和0.2mM。由尾静脉注射而且体积由50μl to 200μl不等。肽的最终血浆浓度为0.085μM至17μM。
注射30分钟后进行γ成像。由连接到Odyssey计算机的Picker Prism1500XP单头γ相机(Picker Intemational，Highland Heights，OH)进行显微成像。重16到21g的25只NMRI裸鼠背部植入卡波西肉瘤。
序列列表独立文本对于序列识别号1到序列识别号5可变氨基酸Xaa在位点2(3，4，8，9，10)可以是任何氨基酸。
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序列表<110>利森蒂亚有限公司(Licentia Oy)<120>基质金属蛋白酶抑制剂的脂质体靶向<130>37868<140>
<141>
<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位点<222>(2)<223>可变氨基酸，在位点2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(3)<223>可变氨基酸，在位点3的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(8)<223>可变氨基酸，在位点8的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(9)<223>可变氨基酸，在位点9的Xaa可以是任意氨基酸<400>1Cys Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Cys1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位点<222>(2)<223>可变氨基酸，在位点2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(3)<223>可变氨基酸，在位点3的Xaa可以是任意氨基酸
<220>
<221>位点<222>(9)<223>可变氨基酸，在位点9的Xaa可以是任意氨基酸<400>2Cys Xaa Xaa His Trp Gly Phe Thr Xaa Cys1 5 10<210>3<211>11<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位点<222>(2)<223>可变氨基酸，在位点2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(3)<223>可变氨基酸，在位点3的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(4)<223>可变氨基酸，在位点4的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(9)<223>可变氨基酸，在位点9的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(10)<223>可变氨基酸，在位点10的Xaa可以是任意氨基酸<400>3Cys Xaa Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Cys1 5 10<210>4<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<221>位点<222>(2)<223>可变氨基酸，在位点2的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(3)<223>可变氨基酸，在位点3的Xaa可以是任意氨基酸
<220>
<221>位点<222>(8)<223>可变氨基酸，在位点8的Xaa可以是任意氨基酸<220>
<221>位点<222>(9)<223>可变氨基酸，在位点9的Xaa可以是任意氨基酸<400>4Ser Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Ser1 5 10<210>5<211>11<212>PRT<213>未知生物<220>
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<221>位点<222>(10)<223>可变氨基酸，在位点10的Xaa可以是任意氨基酸<400>5Ser Xaa Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa Ser1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>未知生物描述未知<400>6
Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys1 5 10<210>7<211>11<212>PRT<213>未知生物<400>7Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Phe Pro Ser Cys1 5 10<210>8<211>10<212>PRT<213>未知生物<400>8Ser Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys1 5 10<210>9<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述人工<400>9Cys Trp Leu Thr Phe Thr His Gly Thr Cys1 5 10
权利要求
1.肽化合物用于促进脂质体靶向肿瘤细胞的用途，所述肽化合物包含选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽的结构，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3。
2.肽化合物用于促进脂质体被肿瘤细胞吸收的用途，所述肽化合物包含选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽的结构，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，。
3.根据权利要求1或2的用途，其中的肽化合物选自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
4.根据权利要求1到3中任何一项的用途，其中的肿瘤细胞是表达基质金属蛋白酶的肿瘤细胞。
5.一种促进脂质体靶向患者肿瘤细胞的方法，包含步骤(a)使该脂质体与至少一种肽化合物混合，所述肽化合物选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，和(b)将得到的混合物给予患者。
6.一种促进脂质体被患者肿瘤细胞吸收的方法，包含步骤(a)使该脂质体与至少一种肽化合物混合，所述肽化合物选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，和(b)将得到的混合物给予患者。
7.根据权利要求5或6的方法，其中脂质体携带至少一种化疗试剂。
8.一种利用脂质体将化疗试剂选择性运送到患者肿瘤细胞的方法，包括步骤(a)使携带至少一种化疗试剂的脂质体与至少一种肽化合物混合，所述肽化合物选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，和(b)将得到的混合物给予患者。
9.根据权利要求7或8的方法，其中化疗试剂是阿霉素。
10.根据权利要求5到9中任何一项的方法，进一步包括将聚乙二醇(PEG)加入脂质体的步骤。
11.根据权利要求5到10中任何一项的方法，其中的肽化合物选自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
12.根据权利要求5到11中任何一项的方法，其中的肿瘤细胞是表达基质金属蛋白酶的肿瘤细胞。
13.一种治疗患者癌症的方法，包括步骤(a)获取携带至少一种化疗试剂的脂质体，(b)将该脂质体与至少一种肽化合物混合，所述肽化合物选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，和(c)将得到的混合物给予患者。
14.根据权利要求13的方法，进一步包括一个将聚乙二醇(PEG)加入脂质体的步骤。
15.根据权利要求13或14的方法，其中的肽化合物选自肽CTTHWGFTLC(序列识别号6)、CLPGHWGFPSC(序列识别号7)或STTHWGFTLS(序列识别号8)。
16.根据权利要求13到15中任何一项的方法，其中的化疗试剂是阿霉素。
17.一种检查患者疑似肿瘤的诊断方法，包括步骤(a)将该脂质体与至少一种肽化合物混合，所述肽化合物选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，(b)向混合物加入可检测的标记，(c)将标记的混合物给予患者，和(d)利用放射自显影成像或γ成像来检测所述标记。
18.根据权利要求17的方法，其中的肽化合物选自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
19.根据权利要求17的方法，其中的可检测的标记是放射性标记、磁性粒子或荧光标记。
20.一种用于实施权利要求17的方法的诊断或成像检测试剂盒，包括-脂质体，-至少一种选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽的肽化合物，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，和-一种可检测的标记。
21.根据权利要求20的诊断或成像检测试剂盒，其中的肽化合物选自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
22.根据权利要求20的诊断或成像检测试剂盒，其中可检测的标记是放射性标记、磁性粒子或荧光标记。
23.一种诊断或成像组合物，包括-脂质体，-至少一种选自具有环状基序C(X)yHWGFXXC的肽或具有线性基序S(X)yHWGFXXS的肽的肽化合物，其中X为任何氨基酸残基，y为整数2或3，和-一种可检测的标记。
24.根据权利要求23的诊断或成像组合物，其中的肽化合物选自肽CTTHWGFTLC、CLPGHWGFPSC或STTHWGFTLS。
25.根据权利要求23的诊断或成像合成物，其中可检测的标记是放射性标记、磁性粒子或荧光标记。
全文摘要
本发明涉及靶向肿瘤治疗，而且具体涉及小基质金属蛋白酶抑制剂在提高脂质体对癌细胞的靶向性，和增强其被所述的细胞吸收方面的用途。本发明从而提供了一种治疗肿瘤的方法，以及一种提高脂质体到肿瘤细胞的靶向性的方法，一种增强肿瘤细胞对脂质体的吸收的方法，一种脂质体选择性的运送化疗试剂进入肿瘤细胞的方法。
文档编号A61K9/127GK1531439SQ02807311
公开日2004年9月22日 申请日期2002年3月26日 优先权日2001年3月26日
发明者奥拉·佩纳特梅迪纳, 厄尔基·科伊武南, 帕沃·金努南, 科伊武南, 奥拉 佩纳特梅迪纳, 金努南 申请人:Ctt癌症靶向技术公司