保留天然变应原的免疫原性并具减弱的变应原性的重组杂合变应原构建体的制作方法

专利名称：保留天然变应原的免疫原性并具减弱的变应原性的重组杂合变应原构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组杂合蛋白质，其具有天然构象并且含有至少一个导入支架蛋白质的抗原肽序列。本发明还涉及编码重组胡蜂杂合蛋白质的重组核酸和载体，以及含有该重组载体的细胞。这些重组杂合蛋白质可用于引起免疫应答而不引起变应原应答，因此特别可用于变态反应的治疗。
背景技术：
具遗传易感性的个体会对多种环境来源的抗原变得敏感(过敏)，即对个体所暴露的变应原敏感。当以前被致敏的个体再次暴露于相同或同源变应原时，就会发生变态反应。变态反应包括枯草热、rhinoconductivitis、鼻炎和哮喘至由于例如蜜蜂或大黄蜂蜇刺或昆虫叮咬引起的全身过敏反应和死亡。该反应立即发生并可以由多种变应原引起，所述变应原例如来自草、树、杂草、昆虫、食物、药物、化学物质和香料中的化合物。
变应原的生化方面由蜜蜂和胡蜂的昆虫叮咬引起的变态反应经常发生。胡蜂(vespid)包括大黄蜂(hornet)、小黄蜂(yellowjacket)和黄蜂(wasp)(Golden等人，1989，美洲医学协会会报(Am.Med.Assoc.)262240)。易感人群暴露于微量的毒液蛋白质就可以被致敏；胡蜂一次叮咬即向皮肤内注入少至2-10μg的蛋白质(Hoffman和Jacobson，1984，变态反应年鉴(Ann.Allergy)52276)。
北美洲有许多种的大黄蜂(长黄胡蜂属，Dolichovespula)、小黄蜂(黄胡蜂属，Vespula)和黄蜂(马蜂属，Polistes)(Akre等人，1980，“北美墨西哥的小黄蜂”，552号农业手册(Agriculture Handbook)，美国农业部)。胡蜂具有相似的毒液组成(King等人，1978，生物化学(Biochemistry)，175165；King等人，1983，分子免疫学(Mol.Immunol.)20297；King等人，1984，(Arch.Biochem.Biophys.)2301；King等人，1985，变态反应与临床免疫学杂志(J.Allergy and Clin.Immunol.)75621；King，1987，变态反应临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)79113；Hoffman，1985，变态反应与临床免疫学杂志(J.Allergy andClin.Immunol.)75611)。它们的毒液均含有三种主要的毒液变应原磷脂酶(37kD)、透明质酸酶(43kD)和至今不知其生物学功能的抗原5(23kD)。
除上述昆虫毒液变应原外，几种主要变应原的完整氨基酸序列也已报道，它们来自不同的草(Perez等人，1990，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26516210；Ansari等人，1989，生物化学(Biochemistry)268665；Silvanovich等人，1991，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2661204)、树花粉(Breiteneder，1989，EMBO J.81935；Valenta等人，1991，科学(Science)，253557)、野草花粉(Rafnar等人，1991，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2661229；Griffith等人，1991，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.96296)、螨(Chua等人，1988，实验医学杂志(J.Exp.Med.)167175)、猫的皮屑(Griffith等人，1992，基因(Gene.)113263)和霉菌(Aruda等人，1990，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1721529；Hah等人，1991，变态反应与临床免疫学杂志(J.Allergy andClin.Immunol.)87327)。这些主要变应原是10-40kD的蛋白质，它们具有相差很大的生物功能。几乎所有已知序列的变应原与我们环境中的其他蛋白质都具有不同程度的序列相似性。几乎所有已知变应原的全面列表都可以在万维网的网站allergen.org上查到，该列表由世界卫生组织(WHO)和国际免疫学标准协会(IUIS)变应原命名分会主办。
变应原的T细胞知B细胞表位对蛋白质的抗体应答需要T辅助细胞和B淋巴细胞以及抗原呈递细胞(APC)的共同协作。B细胞的抗原受体是膜结合抗体(Ab)分子，其识别并直接结合免疫原。T细胞的抗原受体(TCR)仅仅识别并结合抗原肽-MHC家II类分子的复合体。免疫原首先由APC加工成肽，所述肽与MHC II类分子相连被呈递到APC表面(Unanue，1992，现代免疫学评论(Current Opinion in Immunol)463)。因为MHC分子在个体中具有高度多态性，故它们具有不同的抗原肽结合特异性(Rothbard和Gefter，1991，免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)9527)。这是用于免疫应答的遗传调节的一种机制。
当抗原受体结合APC表面的肽-MHC复合体后，T辅助细胞被活化。活化的T细胞分泌淋巴因子。在小鼠中(Street和Mosmann，1991，FASEBJ.5171)以及明显地在人中(Wierenga等人，1990，免疫学杂志(J.Immunol)1444651；Parronchi等人，1991，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)84538)，可以根据T辅助细胞的淋巴因子产生模式将T辅助细胞分成不同的类型。T辅助细胞主要分为两类Th1细胞(产生IL-2和IFN-γ)和Th2细胞(产生IL-4和IL-5)。这些淋巴因子反过来影响抗原活化的B细胞分化并增殖发育成浆细胞，从而分泌出不同同种型的抗体。IL-4是一种已知可影响IgE合成的淋巴因子。(Finkelman等人，1990，免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)8303)。
据认为，尽管蛋白质分子的所有可接近表面都可被B细胞抗原受体识别为表位，但并不一定所有的表位都以相同的机率被识别(Benjamin等人，1984，免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)267)。蛋白质的B细胞表位有两种类型拓扑型和线型。拓扑型由空间临近但序列上不一定临近的氨基酸残基组成。线型仅仅由序列上临近的氨基酸残基组成。Ag-Ab复合体的X射线晶体学数据表明它们的互补结合区域的大小有16-17个氨基酸残基(Amit等人，1986，科学(Science)233747)。与其他的蛋白质抗原相同，磷脂酶可能具有这两种类型的B细胞表位或只具有其中一种类型。胡蜂抗原5s具有这两种类型的B细胞表位。蜜蜂毒液蜂毒素似乎只具有一种线型的B细胞表位(King等人，1984，免疫学杂志(J.Immunol.)1332668)。
由于蛋白质的T细胞表位是在APC的溶酶体中被蛋白酶加工而成的肽，故这些T细胞表位只含有线性类型(Unanue，1992，Curr.Op.Immunol.463)。对与MHC II类分子结合的天然加工的抗原肽的分析表明它们的大小从约13个到17个氨基酸残基，但对刺激T细胞增殖应答的合成肽-MHC II类分子复合体的分析揭示它们最小可为约8个氨基酸残基(参见Rudensky等人，1991，自然(Nature)353622)。研究表明T细胞表位遍布整个蛋白质分子，并且依赖于所免疫宿主的MHC单元型，它们可以是主要或次要决定簇。(Roy等人，科学(Science)244572；Gammon等，1987，免疫学评论(Immunol.Rev.)9853；O’Hehir等人，1991，免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)967)。
已经知道，即发型超敏反应是由变应原特异的IgE的存在而引起的。IgE在循环系统中出现，并且结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的特异性IgE-Fc受体。通过变应原，与细胞结合的IgE发生交联，从而导致组胺、白细胞三烯和能够引起变态反应症状的其它化学介质的释放。IgE是不同同种型免疫球蛋白中的一种。如上所述，T细胞分泌的淋巴因子影响B细胞中的同种型转换事件。
因为Th2细胞在决定B细胞的同种型转换事件中起主要作用，几种变应原的T细胞抗原表位已经被绘制(参见O’Hehir等人，上述)。这些变应原包括豚草AmbIII、黑麦草Lol pI、猫Fel dI、小鼠尿液Mus mI、蠓Chi tI、蜜蜂毒液磷脂酶A2(Dhillon等人，1992，变态反应与临床免疫学杂志(J.Allergy and Clin.Immunol.)9042)和蜂毒素(Fehlner等人，1991，免疫学杂志(J.Immunol.)146799)。这些数据并没有揭示出任何罕见或常见的结构特征。然而，因为这些数据收集自不同单元型的人和小鼠，所以从这些数据得到的结论值得肯定。
T细胞和B细胞应答的调节通常宿主可以通过克隆缺失和无变应性对自身蛋白质的显性B细胞表位和T细胞表位产生耐受。但这种耐受在特定环境下会被破坏(Gammon等人，1991，Immunol.Today 12193；Basten等人，1991，免疫学评论(Immunol.Rev.)1225)。有人提出，在自身免疫原性疾病中，这种自身耐受在遭遇与宿主蛋白质相似的外来蛋白质时受到破坏。因此变应原与自体蛋白质的序列相似性值得更深入细致的研究。
成熟B细胞响应多价抗原被激活，这些抗原能交联细胞表面的Ig受体(DeFranco，1987，细胞生物学年评(Ann.Rev.Cell Biol.)3143)，然而这些成熟B细胞在对单价抗原应答时会被赋予无变应性(Basten等人，1991，上述)。T细胞的抗原活化不仅需要TCR与肽-MHC复合体整合，而且需要TCR与APC表面的其它共刺激信号整合。(Schwartz，1990，科学(Science)，2481349；Jenkins和Miller，1992，FASEB J.62428)。在缺乏共刺激信号情况下TCR与肽-MHC复合体的相互作用可导致T细胞无变应性。
小鼠或大鼠实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)是一个已充分研究的多发性硬化模型。许多研究已经鉴定出髓鞘碱性蛋白的免疫显性T细胞决定簇，其可用于诱导此病症。对应于髓鞘碱性蛋白的免疫显性表位的肽可以诱导动物对同一肽抗原或完整髓鞘碱性蛋白产生耐受。诱导耐受的相同肽也可以在正在发生的自体免疫应答中诱导T细胞的无变应性(Gaur等人，1992，科学(Science)2591491-1494)。
早期研究显示免疫原的物理状态和免疫路径是决定免疫应答结果的重要变量。从现今所了解的方面看，这些变量可以在很大程度上影响抗原呈递，从而使T细胞和B细胞活化或无变应性。
免疫疗法一种治疗变应性疾病的方法是利用免疫疗法，其涉及向患者重复皮下注射刺激性变应原。对大多数进行免疫疗法的患者而言，最开始变应原特异的IgG水平将升高。在IgG上升后变应原特异的IgE水平逐渐降低(Norman，1993，现代免疫学评论(Current Op.Immunol.)5968)。接受治疗的患者的T细胞细胞因子谱也表现出变化IL-4和IL-5水平降低，而IFN-γ水平升高(Secrist等人，1993，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1782123)。
研究显示与利用低剂量变应原相比，利用高剂量变应原时免疫疗法对症状减轻更有效。然而，患者中出现不期望的全身变态反应的潜在危险会限制变应原的有效剂量。由于利用天然变应原的免疫疗法会引起不期望的全身反应，因此对用于免疫疗法的具减弱变应原活性的修饰变应原的研发一直被人们所关注(T.P.King，1993，“支气管哮喘”，E.B.Weiss和M.Stein编辑，Little Brown，波士顿，43-49页；R.E.O’Hehir等人，1991，上述引文)。
变应原性依赖于多价变应原和嗜碱性粒细胞或肥大细胞上结合的IgE抗体间的相互作用。因此，蛋白质的变应原性的减弱可以通过降低其B细胞表位密度实现。蛋白质的B细胞表位密度的降低可通过几种途径完成。由于大多数B细胞表位是不连续类型，即依赖于蛋白质的天然构象，因此一种方法是通过利用化学处理或片断化使变应原部分或完全变性(Takatsu等人，1975，免疫学杂志(J.Immunol)1151469；Pesce等人，1990，Int Arch Allergy Appl Immunol)9288；Vrtala等人，1997，J Clin Invest991673)。例如，对来自豚草花粉的主要变应原的尿素处理导致不可逆变性，引起不连续B细胞表位丧失而保留连续B细胞和T细胞表位(Takatsu等人，1975，免疫学杂志(J Immunol)1151469)。利用完全变性的豚草变应原对患者进行免疫治疗显示，尽管受治疗患者的外周血单核细胞确实对抗原刺激表现出减弱的增殖应答，但针对天然变应原的特异IgE和IgG水平却没有变化(Norman等人，1980，变态反应临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)66336)。也有人提出使用部分变性的变应原。例如重组的螨变应原，其缺少参与维持蛋白质天然构象的半胱氨酸残基(Smith等人，1996，分子免疫(Mol Immunol)33399；T.Takai等人，1997，自然生物技术(Nature Biothechnology)15754)。
已有两篇报道涉及利用T细胞表位肽调节变应原特异性的免疫应答。其中一篇提及利用来自猫主要变应原Fel dI的两个肽对小鼠进行皮下注射来降低对Fel dI完整分子的T细胞应答(Briner等人，1993，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)907608-12)。另一篇涉及利用来自螨主要变应原Der pI的肽进行鼻内治疗来抑制首次实验小鼠或致敏小鼠的变应原特异应答(Hoyne等人，1993，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1781783-1788)。
这些发现提示了T细胞肽作为免疫治疗试剂的用途，原因在于它们缺少不连续B细胞表位，故T细胞肽类似变性的变应原。几种变应原的显性T细胞肽已在患者中测试；并观察到细胞因子水平变化但抗体水平没有变化(Muller等人，1998，变态反应临床免疫学杂志(J Allergy ClinImmunol)101747；Simons等人，1996，国际免疫学(Int Immunol)81937；Creticos等人，1997，变态反应临床免疫学杂志(J Allergy ClinImmunol)99401；Marcotte等人，1997，变态反应临床免疫学杂志(JAllergy Clin Immunol)99405)。重要的是，利用尿素变性的变应原和T细胞肽得到的这些临床结果表明对修饰的变应原而言，不连续B细胞表位和连续B细胞和T细胞表位的保留是有效调节抗体和细胞免疫应答所必需的。
减少变应原的B细胞表位的可接近性(可及性)的第二种方式涉及利用甲醛或戊二醛处理(Marsh，1971，Int Arch Allergy Appl Immunol 41199；Patterson等人，1973，免疫学杂志(J Immunol)1101413)或通过与非免疫原性聚合物结合(King等人，1979，实验医学杂志(J ExpMed)149424)使变应原多聚化。戊二醛聚合的抗原在小鼠中有不同于天然抗原的加工方式，并且它们由分泌促Th1应答的细胞因子的抗原呈递细胞加工(Gieni等人，1993，免疫学杂志(J Immunol)150302)。这种用于改善免疫治疗的第二种方法曾利用豚草花粉变应原尝试过，得到与利用天然变应原时相类似的免疫学结果(Norman等人，1982，变态反应临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)70248；Norman，1984，变态反应临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)73787)。这种方法的一个局限是当变应原被修饰以达到变应原性降低大于100倍时，经常会发生不连续B细胞表位的几乎完全丧失。
第三种方式是通过定点诱变选择性改变变应原的B细胞表位的接触型氨基酸残基。如果B细胞表位的关键性接触残基已知，这将是一种有用的方法。例如，在桦主要变应原中，一个氨基酸残基谷氨酸突变成丝氨酸破坏了其与小鼠抗体的结合，且导致与来自过敏患者血清库的IgE的结合降低40％(Mirza等人，2000，免疫学杂志(J Immunol.)165331)。不同程度的降低也许反映小鼠抗体和人IgE分别为单克隆和多克隆起源。
因为任何一种单元型的MHC II类分子均可以在自己的结合沟中结合多种肽，因此通过利用其它肽对与MHC分子结合的变应原来源的T细胞表位进行抑制，可能可以调节T细胞应答。例如，在H-2k小鼠中，本身不具免疫原性的小鼠溶菌酶肽可以抑制对鸡卵清溶菌酶的T细胞应答(Adorini和Nagy，1990，今日免疫学(Immunol.Today)1121)。另一个例子是利用流感HA肽体外抑制对螨变应原的T细胞应答(O’Hehir等人，1991，变态反应临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)871120)。
因此，对免疫原或变应原的免疫应答部分依赖于宿主基因构成、免疫路径和模式及免疫原/变应原本身。变应原对IgE免疫应答结果的决定程度还未知。每一变应原必须有多少B细胞表位和T细胞表位？是否变应原的免疫显性B细胞表位和T细胞表位被不同个体或所有易感个体识别？是否存在促进B细胞中的IgE类转换事件的T细胞表位？变应原与宿主蛋白质的抗原交叉反应是否会对回答为什么某些蛋白质比其他蛋白质具有更大的变应原性有一定帮助？对多价变应原的免疫耐受是否能通过单独或组合利用B细胞表位或T细胞表位处理而诱导产生？king的美国专利号5,593,877、5,612,209、5,804,201、6,106,844、6,270,763和6,287,559以及美国专利申请系列号09/166,205公开了编码胡蜂毒液蛋白质的cDNA的分离和由此cDNA编码的蛋白质的推导氨基酸序列。这些cDNA使得大量胡蜂毒液蛋白质的表达和纯化成为可能以供免疫治疗使用。但是，序列不能提供胡蜂毒液蛋白质的天然结构信息。因此，这些cDNA和推导的氨基酸序列不能提供不连续表位的信息。通过此推导的胡蜂毒液氨基酸序列也不能预测存在于重组产生的胡蜂毒液蛋白质表面的表位。因此，这些cDNA和推导的氨基酸序列单独并不能准确预测出胡蜂毒液蛋白质的哪些区域或哪些肽可作为刺激B细胞介导的免疫应答的有效免疫原。这些cDNA和推导的氨基酸序列单独也不能预测出胡蜂毒液蛋白质表面的表位密度，而这是决定胡蜂毒液蛋白质交联细胞表面IgE分子的潜力以及由此其变应原性的重要因素。
因此，本领域需要确定怎样修饰变应原蛋白质天然结构中的B细胞表位才能产生提高治疗效果的设计。
本领域也需要提供这样的变应原蛋白质，其刺激B细胞介导的免疫应答，但不刺激IgE介导的变态反应。具体地，本领域需要提供具有降低的表位密度的变应原，其能有效刺激B细胞产生IgG，但不能有效地与结合在例如但并不限于肥大细胞或嗜碱粒细胞表面上的天然变应原特异性IgE抗体交联。
本领域也需要提供在免疫疗法中有效的具有无交叉反应性的B细胞表位的杂合蛋白质。尤其需要提供存在变应原肽表位序列的杂合蛋白质，此变应原肽表位序列的构象使得其可接近免疫细胞表面受体和可溶性蛋白质(特别是抗体)。
因此，本领域需要试剂、药物组合物以及方法用于在不引起变态反应(例如过敏性休克)的基础上产生IgG B细胞应答以抵御变应原。
于此引用的参考文献不应理解为承认其是本发明的现有技术。
发明概要本发明提供了制备修饰的变应原的新方法。修饰的变应原为杂合体，其由目的“客”变应原的小部分和同源但具弱交叉反应的“宿主”蛋白质的大部分组成。这些同源“宿主”蛋白质作为支架来维持目的“客”变应原的天然结构，从而使目的“客”变应原的构象依赖型B细胞表位得以在杂合体中保留，但其密度降低。具有大于30％序列同一性且功能相似的同源蛋白质已知具有非常相似的三维结构(Chothia等人，1990，生物化学年评(Annual Review Biochem)591007；Russell，1994，分子生物学杂志(J Mol Biol)244332)，这样就可产生各种客/宿主蛋白质。
因此，本发明涉及具有减弱的变应原性但保持免疫原性的重组变应原，例如胡蜂毒液变应原。因此，本发明提供变应原蛋白质、与变应原表面可及部位相对应的肽表位序列、含有插入到宿主支架的相应结构区域的这些肽表位序列的杂合蛋白质、编码这些条合构建体的核酸，以及可用于刺激具减弱的变应性应答的、针对变应原的治疗性免疫应答的方法，即变应原免疫疗法。具体地，本发明重组杂合蛋白质、核酸和方法使得可以在不触发基于IgE的变态反应(如急性过敏反应)的基础上刺激基于B细胞的变应原应答。
本发明杂合蛋白质以天然构象存在。在一个实施方案中，杂合蛋白质在天然构象中含有至少一个变应原肽表位序列。更特别地，支架蛋白质与变应原肽表位序列所来源的天然蛋白具有相同的天然构象。
在某些实施方案中，本发明杂合蛋白质含有融合肽，例如信号肽或用于纯化的柄(handle)。在其它实施方案中，本发明杂合蛋白质可以含有蛋白酶作用位点，以便例如以切下此纯化柄。相应地，本发明杂合蛋白质含有变应原肽表位序列、支架蛋白质序列，以及任选地单独的或联合的融合序列和蛋白酶作用位点。
重组肽表位序列在该序列所来源的天然蛋白质中位于表面。在特定实施方案中，变应原肽在天然蛋白质的环区。
应该意识到，杂合蛋白质可以含有一个以上的导入支架蛋白质序列的肽表位序列。
本发明涉及这样的杂合蛋白质，其中肽抗原来源于变应原蛋白质而支架蛋白质是与天然变应原蛋白质有大于或等于30％序列同一性的异源蛋白质。在特定的方面，肽抗原和支架蛋白质均来自胡蜂毒液蛋白质。更具体地，肽抗原和支架蛋白质均来自胡蜂毒液Ag 5s。
在一个实施方案中，本发明肽表位序列的特征为具有约6到50个氨基酸，且对小鼠B细胞应答具抗原性(B细胞表位)。更具体而言，在本发明实施例中，本发明变应原肽表位序列来自Ag 5肽，其选自NNYCKIKC(SEQ ID1)；NNYCKIKCLKGGVHTACK(SEQ ID2)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKP(SEQ ID3)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVV(SEQ ID4)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQ(SEQ ID5)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILK(SEQ ID6)；QVGQNVALTGSTAAKYDDPVKLVKMWEDEVKDYNPKKKFSGNDFLKTG(SEQ ID NO7)；HYTQMVWANTKEVGCGSIKYIQEKWHKHYLVCNYGPSGNFKNEELYQTK(SEQ ID NO8)LKPNCGNKVVV(SEQ ID NO9)；LTGSTAAKYDD(SEQ ID NO10)；PKKKFSGND(SEQ ID NO11)IQEKWHK(SEQ ID NO12)；和FKNEELYQTK(SEQ ID NO13)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILKEHND(SEQ ID NO93)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILK
EHNDFRQKIAR(SEQ ID NO94)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILKEHNDFRQKIARGLETRGNPGPQPPAKNMKN(SEQ ID NO95).
本发明还涉及分离的表达载体，其含有与本发明核酸可操作连接的启动子。本领域技术人员可商业获得的多种启动子均可用于本发明该方面。所述启动子的例子包括但并不限于SV40的早期启动子、hCMV的立即早期启动子、腺病毒早期启动子、痘苗病毒早期启动子、多瘤病毒早期启动子、SV40病毒晚期启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒晚期启动子、多瘤病毒晚期启动子、lac-trp系统、TAC系统、TRC系统、λ噬菌体的主要操纵基因和启动子区域、fd外壳蛋白的调节区域、3-磷酸甘油酸激酶启动子、酸性磷酸酶启动子或酵母α交配因子启动子等等。适用于此处并且还易于为技术人员得到的表达载体的多个例子如下所述。
本发明也提供制备编码本发明变应原杂合蛋白质的核酸的方法。该方法包括将编码变应原蛋白质的肽表位序列的核苷酸序列导入编码与该变应原蛋白质结构同源的支架蛋白质的核苷酸序列中。编码肽表位序列的核苷酸序列以符合读框的方式导入编码支架蛋白质的核苷酸序列中，并且其所处位置使得在变应原杂合蛋白质中肽表位序列存在于杂合蛋白的表面可及区域并与该肽表位序列在变应原蛋白质中的位置相对应。在一个这样的实施方案中，将编码支架蛋白质的核苷酸序列突变以导入编码肽表位序列的核苷酸序列。在另一这样的实施方案中，编码肽表位序列的核苷酸序列通过用核酸内切酶处理含有编码肽表位序列的核苷酸序列与编码支架蛋白的核苷酸序列的核酸然后将来自于此的片段相连接而导入。如果有必要，可以利用本领域标准技术将限制性内切酶位点导入含有这些序列的核酸中。
本发明还涉及产生本发明杂合蛋白质的方法，其通过表达本发明的分离的核酸分子实施。这种产生方法为诊断和治疗所需的杂合蛋白质提供了丰富来源。产生杂合蛋白质的本发明该方法的一个例子是培养利用本发明表达载体转化或转染的宿主细胞，以使宿主细胞产生本发明杂合蛋白质。优选地，由此产生的本发明杂合蛋白质从培养物、宿主细胞或两者中回收。
本发明还涉及在治疗变应原特异性变应性疾病中有效的药物组合物。具体地，本发明涉及这样的药物组合物，其含有本发明杂合蛋白质或编码这种杂合蛋白质的核酸(优选表达载体)以及其可药用载体。本发明还包括药物组合物，其含有多种本发明杂合蛋白质或含有编码这多种杂合蛋白质的一个或多个核酸。
自然地，本发明涉及治疗变应原特异性变应性疾病的方法，其包括施用治疗有效量的本发明药物组合物。本发明药物组合物可以通过任何途径并且特别是通过口、肺、鼻、局部或肠胃外途径施用。其它给药途径也是可以的。
本发明另一个特定目的是提供治疗个体中变应原特异性变态反应的方法，其中将治疗变应原特异性变应性疾病的药物组合物施用给个体。
而且，本发明还涉及调节哺乳动物对免疫原的免疫应答的药物组合物，其中该药物组合物包含可用于调节哺乳动物对免疫原的免疫应答的上述本发明变应原杂合蛋白质(或编码这种蛋白质的核酸)和它的可药用载体。
因此，施用这种药物组合物可调节免疫系统识别和攻击免疫原的能力。在一个具体的实施方案中，施用这种药物组合物后，哺乳动物免疫系统识别和攻击免疫原的能力比施用之前该个体的免疫系统识别和攻击此免疫原的能力得到提高。
缩写Dol m Dolichovespula maculata 白斑脸大黄蜂(white faced hornet)Dol a D.arenaria 黄色大黄蜂(yellow hornet)Pol a Polistes annularis 黄蜂(wasp)Pol e P.exclamans 黄蜂(wasp)Ves m Vespula maculifrons 额斑黄胡蜂(yellowjacket)Ves v V.vulgaris 常见黄胡蜂(yellowjacket)PCR聚合酶链式反应
RACE cDNA末端快速扩增TCR 抗原的T细胞受体附图简述

图1Ves v 5cDNA[SEQ ID NO14]和氨基酸[SEQ ID NO16]序列。左边的编号指核苷酸的位置，右边的编号指氨基酸的位置。
图2Pol a 5cDNA[SEQ ID NO15]和氨基酸[SEQ ID NO17]序列。左边的编号指核苷酸的位置，右边的编号指氨基酸的位置。
图3Ves v 5(V)[SEQ ID NO16]和Pol a 5(P)[SEQ ID NO17]的氨基酸比较。
图4示意性显示Ag 5s以及杂合体的序列。杂合体上给出的残基编号参照Ves v 5的残基编号。
图5A-BVes v 5同源蛋白质的比对，所述蛋白来自以下昆虫的毒液额斑黄胡蜂(Vespula maculifrons)[Ves m 5，SEQ ID NO63]、常见黄胡蜂(Vespula vulgaris)[Ves v 5，SEQ ID NO64]、重黄胡蜂(Vespulaflavopilosa)[Ves f 5，SEQ ID NO65]、树黄胡蜂(Vespula pensylvanica)[Ves p 5，SEQ ID NO66]、德国黄胡蜂(Vespula germanica)[Ves g 5，SEQID NO67]、Vespula vidua[Ves vi 5，SEQ ID NO68]、Vespula squamosa[Ves s 5，SEQ ID NO69]、Dolichovespula maculata [Dol m Sa，SEQ IDNO70]、Dolichovespula arenaria[Dol a 5，SEQ ID NO71]、Dolichovespula maculata[Dol m 5b，SEQ ID NO72]、金环胡蜂(Vespamandarinia)[Vesp m 5，SEQID NO73]、黄边胡蜂(Vespa erabro)[Ves c5.01，SEQ ID NO74]、黄边胡蜂[Ves c 5.02，SEQ ID NO75]、Polistesfuseatus[Pol f 5，SEQ ID NO76]、Polistes exclamans[Pol e 5，SEQ IDNO77]、Polistes annularis[Pol a 5，SEQ ID NO78]、红外来火蚁(Solenopsis invieta)[Sol i 3，SEQ ID NO79]和黑外来火蚁(Solenopsisrichteri)[Sol r 3，SEQ ID NO80]。
图6A-BAg 5s以及杂合体的SDS凝胶图谱图7Ves v 5以及杂合体的圆二色(CD)谱。
图8A-C利用天然Ves v 5特异性小鼠抗体的抑制ELISA，利用(A)分离自BALB/c小鼠并耗竭了Pol a-交叉反应性抗体的Ves v 5特异性抗体，(B)来自ASW/n小鼠的抗血清和(C)来自P/J小鼠的抗血清。
图9A-C利用来自小黄蜂敏感患者的血清进行的抑制ELISA。
图10A-C固相Ves v 5或杂合体上小鼠Ves v 5特异性单克隆抗体的结合。
图11A-CVes v 5、Pol a 5以及杂合体的组胺释放测定试验。
图12A-BVes v 5样蛋白的比对。比对的蛋白质为Ves v 5[SEQ IDNO81]、Sol i 3[SEQ ID NO82]、番茄(Lycopersicon esculentum)p14a[SEQID NO83]、裂褶菌(Schizophyllum commune)SC7[SEQ ID NO84]、人胰蛋白酶抑制剂[SEQ ID NO85]、人glipr[SEQ ID NO86]、珠毒蜥(Heloderma horridum)helothermine[SEQ ID NO87]和人TPX-1[SEQID NO88]。
发明详述本发明涉及具有减弱的变应原性但保持免疫原性的重组变应原杂合蛋白质构建体、编码这些变应原的核酸分子，以及在变态反应的诊断和治疗中这种变应原的使用方法。本发明杂合蛋白质含有导入支架蛋白质序列中的表面(例如环或转角区域)肽表位序列。本发明杂合蛋白质、核酸和方法使得可以在不触发基于IgE的变应性应答的基础上刺激抵御变应原的基于B细胞的应答。在特定实施方案中，重组杂合蛋白质含有融合至支架蛋白质(尤其是Pol a 5)的胡蜂毒液表面或环状肽抗原(尤其来自Ves v 5)。
本发明还涉及含有如下核酸分子的表达载体，所述核酸分子包括具减弱的变应原性但保持免疫原性的变应原杂合蛋白质，本发明还涉及通过表达和回收此杂合蛋白质而生产本发明杂合蛋白质的方法。
本发明也提供可以有效治疗变应原特异的变应性疾病的药物组合物，其包含本发明杂合蛋白质或编码这种杂合蛋白质的核酸载体；并提供治疗这种变应性病症的方法，包括施用治疗有效量的这种药物组合物。
本发明杂合蛋白质也可用于变应原特异的变应性病症的诊断。
本发明部分基于下述发现，即将来自小黄蜂(Vespula vulgaris)抗原5的表面可及区域的序列插入到Polistes annularis抗原5的相应区域产生了杂合构建体，该构建体保持亲本蛋白质的免疫原性但表现出显著减弱的变应原性。而且，导入序列的最优位置是由Ves v 5的晶体结构确定的表面可及位点，尤其是环状和转角区域。
早期工作建立的那些杂合构建体，其中四分之一到三分之一的变应原蛋白质被导入同源支架蛋白质的相应区域。然而，这些杂合构建体缺少本发明的优势和改进。
在患者中的临床研究和利用实验动物的测试显示，针对小黄蜂和纸巢蜂的毒液蛋白质的特异抗体具有有限的交叉反应(Lichtenstein等人，1979，变态反应临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)645；Lu等人，1993，免疫学杂志(J Immuol)1502823)。这些观察构成了本发明优选实施方案的基础。优选的“客”变应原抗原5为Ves v 5，它是23kd的小黄蜂毒液蛋白质。优选的作为支架蛋白质的同源宿主变应原为Pol a 5，它是与Ves v 5大小相似的纸巢峰(paper wasp)的毒液蛋白质。Ves v 5和Pol a 5有59％的序列同一性(图3)。两者均可在酵母中表达，并且重组蛋白质显示出具有天然蛋白质的天然构象(Monsalve等人，1999，蛋白质表达纯化(Protein Exp.Purif.)16410)。
Ves v 5和Pol a 5的杂合体的免疫化学结果已有报道。这些杂合体的序列示意性显示在图4中。杂合体PV1-46、PV109-155和PV156-204分别含有Ves v 5分子的第一个1/4段氨基酸序列(即第1-46位氨基酸)、第三个1/4段氨基酸序列(即第109-155位氨基酸)和最后1/4段氨基酸序列(即第156-204位氨基酸)，它们连同Pol a 5分子的一部分共同构成完整的杂合体Ag 5分子。含有Ves v 5分子的第二个1/4段氨基酸序列的杂合体没有制备，因为在该区域Ves v 5和Pol a 5的序列高度相同(参见图3)。与PV156-204相比，杂合体PV1-155具有Ves v 5和Pol a 5的氨基端和羧基端片段的相反排列。
杂合体PV1-8、PV1-18、PV1-24、PV1-32、PV22-32、PV115-125、PV142-150、PV176-182和PV195-204设计成含有Ves v 5的表面环状或转角区域。这些杂合体含有Ves v Ag 5的第7-32位氨基酸，这些氨基酸替代Pol a Ag 5的同源区域。
可预料地，同源蛋白质相应区域，尤其是在表面可及区域(如环状区域和转角区域)中的转换可以使天然结构得以保持。表面可及区域(尤其是环状区域和转角区域)在保持结构的同时倾向于表现出更大的灵活度以及更好的对变化的耐受性。在定向进化中也有相对应的方法，其中同源酶重组产生新的具功能的酶嵌合体。
术语“变应原杂合蛋白质”指重组或合成蛋白质，其具有支架蛋白质的天然结构，但含有一个或多个来自变应原的序列。变应原与支架蛋白质结构同源，因此允许将变应原序列导入支架蛋白质的相应位置。“相应位置”是指在一级序列中的同一位置或在天然结构中的同一拓扑位置。变应原序列选自变应原的表面可及区域并插入到支架蛋白质的相应表面可及区域。因为在天然构象中蛋白质的B细胞表位位于可接近的表面，故来自变应原的序列在导入到支架蛋白质中后可以作为B细胞表位，因此它们被称为变应原蛋白质的“肽表位序列”。
与本发明相关的表述“减弱的变应原性”是指在设计测量这种变应原性的体外测定试验中，分子或抗原表现出明显降低的变应原活性。这种“体外测定试验”为本领域熟知，包括例如但并不限于变应原敏感患者或实验动物在受该变应原攻击后其嗜碱性粒细胞的组胺释放测定试验。此外，这里使用的“活性”可以指能指示分子或抗原的变应原性的任何可测量的参数或结果，例如但并不限于在测定中获得的最大应答或在测定中为得到指定结果所需的抗原的量或浓度。
术语“保持免疫原性”(以任何语法形式出现)是指杂合蛋白质可引起免疫应答(尤其是IgG主导的体液免疫)，此免疫应答可与天然变应原或支架蛋白(或两者)引起的免疫应答相比而且大于它们引起的变应性(IgE)免疫应答。杂合体特异的IgG会与存在于变应原和支架蛋白质的表位发生交叉反应。这种IgG应答能封闭IgE结合，因此降低或阻碍变态反应。另外，杂合蛋白质可以引起T细胞无变应性和其他变态反应抑制性免疫应答。
根据本发明，如果进行比对后，两个蛋白质表现出至少约30％的氨基酸同一性，那么这些蛋白质是“同源的”，所述氨基酸同一性可通过利用本领域已知的程序确定，上述程序的例子包括但并不限于Gap、Bestfit和BLAST程序。更优选同源蛋白质展现至少约50％的氨基酸同一性。然而，在特定实施方案中，变应原蛋白质与支架蛋白质不具有大于70％的序列相同性，以便降低高度交叉反应的可能性，这种高度交叉反应可能将导致杂合蛋白质具有程度不可接受的变应原性。更高的序列相同性是可以接受的，尤其当插入支架蛋白质的肽表位序列与其所替代的支架蛋白质的相应序列非常不相同时——例如小于50％的同一性以及优选地小于30％的同一性。
当两个蛋白质由于一级序列的相似性而采用相似的核心二级和三级结构以至于它们的三维结构可以几乎完全地(大于70％)重叠叠合时，它们在结构上同源。然而，它们的表面三级结构可能不相同。
在本发明优选的实施方案中，将来自变应原的肽表位序列插入或替换“支架”蛋白质的序列。相应地，本发明“支架蛋白质”为包括变应原表位序列的蛋白质，上述变应原表位序列可以是插入序列或作为支架蛋白质的同源(相应)序列的替换序列。支架蛋白质表现出天然构象。变应原和支架可互换位置；这些术语用于表示导入“支架”的序列的来源(来自“变应原”)。虽然是不同的群体，但由于“变应原”与“支架”同源，因此都可充当变应原。因此，如果将“支架蛋白质”的表面可及序列导入另一结构同源蛋白质中，则该“支架蛋白质”也是“变应原”。
术语“天然构象”包括由非重组的，即天然的蛋白质、多肽或抗原在其天然环境中表现出的功能构象或它们在可保持所述天然环境中的功能构象的条件下经纯化后表现出的功能构象。天然构象可以通过例如但并不限于确定蛋白质的圆二色谱测量。天然构象也可通过测定酶活性确定。本领域技术人员应该理解，在天然非重组蛋白质的功能构象未知的情况下，“天然构象”包括可重复地表现出非随机确定构象的重组蛋白质形式，其中所述非随机确定构象包括在正确折叠的功能性蛋白质中常见的二级结构元件，例如但并不限于α螺旋和β折叠元件。而且正如熟知的，利用重组技术可以将附加的氨基酸在不破坏蛋白质的天然构象的情况下连接到蛋白质的氨基或羧基末端。这种附加的氨基酸可以是短的多肽“标签”，其一般长度为1-25个氨基酸并且一般是无序的，附加的氨基酸也可以是更长的多肽，其可以形成单独的结构域并且本身可以为有序或无序的。
术语“表面暴露氨基酸”指定位于三维结构的表面的氨基酸残基，当变应原处于溶液中时，此氨基酸残基的至少一个原子的至少一部分可以接触到周围溶剂。优选地，处于三维结构中的此氨基酸残基有至少20％的溶剂(水)可及性(accessibility)，更优选至少30％，再更优选至少40％并且最优选至少50％的可及性。
术语“溶剂可及性”定义为分子中可接近如下球体的面积，所述球体具有可与溶剂(水，r＝1.4_)分子相比的半径。
“变应原”有它的普通含义，即它指任何可以引起变态反应(例如组胺释放至过敏性休克)的蛋白质样分子。变应原为大家所熟知；本说明书表8中列出具代表性的群体。本发明变应原的例子可以适宜地是吸入型变应原，例如来自树、草、药草、真菌、屋尘螨、蟑螂和动物毛发及皮屑。重要的来自树、草、药草的花粉变应原为来自下述分类学目的变应原壳斗目(Fagales)、木犀目(Oleales)和松目(Pinales)(包括桦树属(Betula)、桤木属(Alnus)、榛属(Corylus)、鹅耳枥属(Carpinus)和木犀榄属(Olea))、禾草目(Poales)(包括例如黑麦草属(Lolium)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)和黑麦属(Secale)的草)、菊目(Asterales)和荨麻目(Urticales)(包括豚草属(Ambrosia)和蒿属(Artemisia)的药草)。重要的来自真菌的吸入型变应原为来自链格孢属(Alternaria)和枝孢属(Cladosporium)的那些。其它重要的吸入型变应原来自尘螨属(Dermatophagoides)的屋尘螨(house dust mite)、来自蟑螂及哺乳动物如猫、狗和马。此外，本发明的重组变应原可以是毒液变应原的突变体，所述毒液变应原包括来源于蛰刺或叮咬类昆虫的那些，例如其可以来自分类目膜翅目(Hymenoptera)的昆虫，包括蜜蜂(蜜蜂总科(Apidae))、黄蜂(胡蜂总科)和蚂蚁(蚁总科(Formicoidae))。具体的变应原成分包括例如壳斗目的Bet v 1(B.verrucosa，桦属)、Aln g 1(欧洲桤木(Alnus glutinosa)，桤木属)、Cor a 1(欧洲榛(Corylus avelana)，榛属)和Car b 1(欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)，鹅耳枥属)。其它还有Cry j 1(松目)、Amb a 1和2、Artv 1(菊目)、Par j 1(荨麻目)、Ole e 1(木犀目)、Ave e 1、Cyn d 1、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1和5、Pas n 1、Phl p 1和5、Poa p 1、2和5、Secc 1和5以及Sor h 1(各种草本植物花粉)、Alt a 1和Cla h 1(真菌)、Derf 1和2、Der p 1和2(屋尘螨，分别为粉尘螨(D.farinae)和户尘螨(D.pteronyssinus))、Lep d 1和2(害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor)，储藏物螨类(storage mite))；Bla g 1和2、Per a 1(蟑螂，分别为德国小蠊(Blatellagermanica)和美洲大蠊(Periplaneta americana))、Fel d 1(猫)、Can f 1(狗)、Equ c 1、2和3(马)、Apis m 1和2(蜜蜂)、Ves v 1、2和5、Pol a 1、2和5(所有黄蜂)和Soli 1、2、3和4(火蚁)。该术语也包括在上述“背景”中所描述的所有例子。
例如，术语“胡蜂毒液变应原”是指在胡蜂毒液中发现的蛋白质，在被该昆虫蛰刺后易感人群就会被致敏。虽然大部分抗原具有和特异IgG类抗体反应的特性，但变应原还具有与IgE型抗体反应的特性。IgE型抗体负责介导变应性病症的症状，即即发型超敏反应。
于此使用的术语“胡蜂”按照变应原领域的习惯用法使用，并且是指属于世界范围的胡蜂科(Vespidae)的昆虫，即包括大黄蜂、小黄蜂和纸巢峰的社会性黄蜂。具体地，胡蜂包括胡蜂亚科(Vespinae)和马蜂(Polistinae)亚科。更具体地，胡蜂包括胡蜂属(Vespa Linnaeus)、黄胡蜂属(VespulaThomson)、长黄胡蜂属(Dolichovespula Rohwer)和马蜂属(PolistesLatreille)。黄胡蜂属中的种包括但并不限于德国黄胡蜂(V.germanica(Fab.))、V.squamosa(Drury)、额斑黄胡蜂(Buysson)、重黄胡蜂(Jacobson)、常见黄胡蜂(V.vulgaris(L.))和树黄胡蜂(V.pensylvanica(Saussure))。马蜂属中的种包括但并不限于P.annularis(Linnaeus)、P.exclamans(Viereck)、P.metricus(Say)、P.fuscatus(Fabricius)、P.apachus(Saussure)。长黄胡蜂属中的种包括但并不限于D.maculata(L.)和D.arenaria(Fab.)。胡蜂属中的种包括但并不限于黄边胡蜂(V.crabro(L.))和东方胡蜂(V.orientalis(Linnaeus))。
常见黄胡蜂的分类学地位如下目膜翅目(Hymenoptera)亚目细腰亚目(Apocrita)部针尾部(Aculeata)总科胡蜂总科(Vespoidea)科胡蜂科(Vespidae)亚科胡蜂亚科(Vespinae)属黄胡蜂属(Vespula)种组常见黄胡蜂种组种常见黄胡蜂Polistes annularis的分类学地位如下目膜翅目亚目细腰亚目部针尾部总科胡蜂总科科胡蜂科亚科马蜂亚科(Polistinae)族马蜂族(Polistini)属马蜂属(Polistes)亚属Aphanilopterus种annularis
于此使用的术语“免疫调节”是指在B细胞或T细胞水平上增高或降低抗原特异性免疫应答的能力。免疫调节活性可以在例如T细胞增殖测定中通过测定抗体的产生、淋巴因子的产生或T细胞应答检测。特别地，除影响B细胞应答外，本发明免疫调节多肽可以结合T细胞表面的分子并影响T细胞应答。
于此使用的短语“免疫系统相关疾病或病症”是指可引起个体免疫应答或影响免疫系统对免疫原应答的能力的疾病或病症。因此，免疫系统相关疾病或病症的例子包括病原性疾病或病症、病毒性疾病或病症(例如HIV、单纯疱疹病毒或乳头瘤病毒)、自体免疫疾病(例如关节炎或狼疮)。
变应原结构的确定蛋白质的三维结构可以通过本领域公知的物理方法确定，包括而并不限于X-射线晶体学、核磁共振光谱学和电子晶体学等。优选地，蛋白质的三维结构通过X射线晶体学来确定。还优选这些技术产生5_或更好的分辨率，在这样的分辨率下能获得蛋白质多肽主链中的α碳原子的踪迹，这就可以确定蛋白质的二级结构特征，如α螺旋和β折叠结构元件。更优选以2_或更好的分辨率确定蛋白质三维结构，在这样的分辨率下能确定出氨基酸侧链的位置。特定变应原的结构已为大家公知，如表9所示。这些或其它变应原的结构可以利用上述标准技术确定。
蛋白质的三维结构还可以通过与结构已通过物理方法经验地得出的同源蛋白质进行比较而推断，例如通过比对和比较两者的氨基酸序列来推断。比较和比对氨基酸序列的方法为本领域所公知，并且包括例如但并不限于Pileup、Gap、BestFit和Compare程序(Genetic Computer Group，Madison，WI)。通过这种比对和比较可以鉴定出氨基酸高度相同或相似的区域，这些区域在同源蛋白质中可能采用相似或相同的构象。由此，一旦确定了一种蛋白质的三维结构，就可以确定许多同源蛋白质的三维结构，这样就可以鉴定出同源蛋白质的表面和环状区域。
与内部氨基酸的变化造成的影响程度相比，位于蛋白质的表面和环状区域中的氨基酸的变化对蛋白质的三维结构和功能的影响程度要轻些。因此，与内部残基相比，同源蛋白质中表面和环状区域的氨基酸残基一般保守性差一些。然而，本领域普通技术人员应当意识到，表面和环状区域在同源蛋白质的天然构象中会占据相同的相对位置。因此，表面区域和环状区域为同源蛋白质内的“保守元件”或“同源元件”。
另外，各种光谱学技术可以用于结构评价，尤其用于证实杂合蛋白质是否保留变应原和支架蛋白质的天然结构。这些技术包括但并不限于圆二色谱、核磁共振波谱分析(尤其比较低分辨率)、中子衍射分析、荧光光谱分析(和其它光吸收和透射光谱技术)等等。特别地，对光谱相似度的评价可以指示杂合蛋白质采取天然构象的程度。在这种类型的分析中优选圆二色谱。
分子生物学技术根据本发明可以使用本领域常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分阐释，参见例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，“分子克隆实验室手册”(“Molecular Cloninga LaboratoryManual”)，第二版(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(这于此称为“Sambrook等人，1989”)；“DNA克隆实用方法”(“DNACloninga Practical Approach”)，第一卷和第二卷(D.N.Glover主编，1985)；“寡核苷酸合成”(“Oligonucleotide Synthesis”)(M.J.Gait主编，1984)；“核酸杂交”(“Nucleic Acid Hybridization”)，[B.D.Hames和S.J.Higgins主编(1985)]；“转录和翻译”(“Transcription AndTranslation”)，[B.D.Hames和S.J.Higgins主编(1984)]；“动物细胞培养”(“Animal Cell Culture”)，[R.I.Freshney主编(1986)]；“固定化细胞和酶”(“Immobilized Cells And Enzymes”)，[IRL出版社，(1986)]；B.Perbal，“分子克隆实用指南”(“A Practical Guide To MolecularCloning”)(1984)。本发明相关的其它技术可以在下述文献中找到King的美国专利号5,593,877、5,612,209、5,804,201、6,106,844和美国专利申请系列号08/484,388、08/474,853和09/166,205以及Monsalve等人1999，蛋白质表达纯化(Protein Expr.Purif.)16410。
“核酸分子”是指以单链形式或双链螺旋形式存在的核糖核苷(包括腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；又称为“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(腺嘌呤脱氧核苷、鸟嘌呤脱氧核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷或胞嘧啶脱氧核苷；又称为“DNA分子”)的磷酸酯多聚体形式。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋都是可能的。术语核酸分子，以及特别是DNA或RNA分子仅仅是指分子的一级和二级结构，并不限定任何特定的三级结构。因此，该术语包括在尤其是线状或环状DNA分子、限制性片段、病毒、质粒和染色体中存在的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，于此描述的序列按照一般习惯给出，即仅沿DNA的非转录链(即具有与mRNA同源的序列的那条链)以5’到3’方向给出序列。“重组DNA分子”是已接受分子生物学操作的DNA分子。
在适宜的温度和溶液离子强度条件(参见Sambrook等人，上述)下，当核酸分子的单链形式可以退火结合另一核酸分子时，该核酸分子与此另一核酸分子就是“可杂交的”，上述另一核酸分子例如cDNA、基因组DNA或RNA。温度和离子强度条件决定杂交的“严紧性”。为初步筛选同源核酸分子，可以使用相应于55℃的Tm的低严紧性杂交条件，例如5×SSC，0.1％SDS，0.25％脱脂奶粉并且不含甲酰胺；或者30％甲酰胺，5×SSC，0.5％SDS。与较高的Tm相对应的中等严紧杂交条件为例如40％甲酰胺及5×或6×SSC。与最高Tm相对应的高严紧杂交条件为例如50％甲酰胺及5×或6×SSC。杂交需要两个核酸分子含有互补序列，但依赖于杂交的严紧度，碱基之间可以有错配。用于核酸分子杂交的适当严紧度依赖于核酸分子的长度和分子互补的程度以及本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有这些序列的核酸分子的杂合体的Tm就越大。核酸分子杂交的相对稳定性(与较高的Tm相对应)按以下顺序降低RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂合体而言，已经推导出计算Tm的公式(参见Sambrook等人，上述，9.50-0.51)。对与较短的核酸分子(即寡核苷酸)杂交而言，错配发生的位置更为重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等人，上述，11.7-11.8)。优选可杂交核酸分子的最小长度为至少约10个核苷酸；更优选长度为至少约20个核苷酸，甚至更优选至少约30个核苷酸；并且最优选至少约40个核苷酸。
在特定实施方案中，术语“标准杂交条件”是指55℃的Tm，并利用如上所述的条件。在优选实施方案中，Tm为60℃；在更优选实施方案中Tm为65℃。
DNA“编码序列”是指置于适当的调节序列的调节下时可以在体内转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的界线由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来源于真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，并且甚至合成的DNA序列。如果编码序列用于在真核细胞中表达，在该编码序列的3’端一般都具有多腺苷酸化信号和转录终止序列。
转录和翻译调节序列是DNA调节序列，如启动子、增强子、终止子等等，它们在宿主细胞中保证编码序列的表达。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是调节序列。
“启动子序列”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调节区域。为定义本发明，启动子序列在3’端以转录起始位点为边界并向上游(5’方向)延伸以包括为了以高于背景的可检测水平起始转录所需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内可以找到转录起始位点(可以例如，方便地通过S1核酸酶作图而确定)，以及用于结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核启动子通常但非总是包含“TATA”盒和“CAT”盒。
当编码序列在细胞中位于转录和翻译调节序列的“控制之下”或与它们“可操作连接”时，RNA聚合酶可以将编码序列转录成mRNA，而所述mRNA随后可翻译成由该编码序列编码的蛋白质。“信号序列”可以包括在编码序列之前，这种序列编码“信号肽”，位于多肽的N-末端，可以指导宿主细胞将多肽转运到细胞表面或将多肽分泌至培养基中。这些信号肽在输出后通常被细胞选择性地降解。可以发现，原核和真核生物的多种天然蛋白质与信号序列相连。
“核酸分子”是指以单链形式或双链螺旋形式存在的核糖核苷(包括腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；又称为“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(腺嘌呤脱氧核苷、鸟嘌呤脱氧核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷或胞嘧啶脱氧核苷；又称为“DNA分子”)的磷酸酯多聚体形式。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋都是可能的。术语核酸分子，以及特别是DNA或RNA分子仅仅是指分子的一级和二级结构，并不限定任何特定的三级结构。因此，该术语包括在尤其是线状或环状DNA分子、限制性片段、病毒、质粒和染色体中存在的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，于此描述的序列按照一般习惯给出，即仅沿DNA的非转录链(即具有与mRNA同源的序列的那条链)以5’到3’方向给出序列。“重组DNA分子”是已接受分子生物学操作的DNA分子。
在适宜的温度和溶液离子强度条件(参见Sambrook等人，上述)下，当核酸分子的单链形式可以退火结合另一核酸分子时，该核酸分子与此另一核酸分子就是“可杂交的”，上述另一核酸分子例如cDNA、基因组DNA或RNA。温度和离子强度条件决定杂交的“严紧性”。为初步筛选同源核酸分子，可以使用相应于55℃的Tm的低严紧性杂交条件，例如5×SSC，0.1％SDS，0.25％脱脂奶粉并且不含甲酰胺；或者30％甲酰胺，5×SSC，0.5％SDS。与较高的Tm相对应的中等严紧杂交条件为例如40％甲酰胺及5×或6×SSC。与最高Tm相对应的高严紧杂交条件为例如50％甲酰胺及5×或6×SSC。杂交需要两个核酸分子含有互补序列，但依赖于杂交的严紧度，碱基之间可以有错配。用于核酸分子杂交的适当严紧度依赖于核酸分子的长度和分子互补的程度以及本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有这些序列的核酸分子的杂合体的Tm就越大。核酸分子杂交的相对稳定性(与较高的Tm相对应)按以下顺序降低RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂合体而言，已经推导出计算Tm的公式(参见Sambrook等人，上述，9.50-0.51)。对与较短的核酸分子(即寡核苷酸)杂交而言，错配发生的位置更为重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等人，上述，11.7-11.8)。优选可杂交核酸分子的最小长度为至少约10个核苷酸；更优选长度为至少约20个核苷酸，甚至更优选至少约30个核苷酸；并且最优选至少约40个核苷酸。
在特定实施方案中，术语“标准杂交条件”是指55℃的Tm，并利用如上所述的条件。在优选实施方案中，Tm为60℃；在更优选实施方案中Tm为65℃。
DNA“编码序列”是指置于适当的调节序列的调节下时可以在体内转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的界线由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来源于真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，并且甚至合成的DNA序列。如果编码序列用于在真核细胞中表达，在该编码序列的3’端一般都具有多腺苷酸化信号和转录终止序列。
转录和翻译调节序列是DNA调节序列，如启动子、增强子、终止子等等，它们在宿主细胞中保证编码序列的表达。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是调节序列。
“启动子序列”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调节区域。为定义本发明，启动子序列在3’端以转录起始位点为边界并向上游(5’方向)延伸以包括为了以高于背景的可检测水平起始转录所需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内可以找到转录起始位点(可以例如，方便地通过S1核酸酶作图而确定)，以及用于结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核启动子通常但非总是包含“TATA”盒和“CAT”盒。
当编码序列在细胞中位于转录和翻译调节序列的“控制之下”或与它们“可操作连接”时，RNA聚合酶可以将编码序列转录成mRNA，而所述mRNA随后可翻译成由该编码序列编码的蛋白质。“信号序列”可以包括在编码序列之前，这种序列编码“信号肽”，位于多肽的N-末端，可以指导宿主细胞将多肽转运到细胞表面或将多肽分泌至培养基中。这些信号肽在输出后通常被细胞选择性地降解。可以发现，原核和真核生物的多种天然蛋白质与信号序列相连。
编码杂合蛋白质的核酸分子本发明涉及编码重组变应原杂合蛋白质的分离的核酸分子。本发明进一步涉及细胞系，所述细胞系稳定地含有编码变应原杂合蛋白质的重组核酸分子并能够表达这种核酸分子以产生该杂合蛋白质。这些核酸可由例如列在表8和于此公开的某些专利和专利申请中的变应原生成。
作为一个具体特定实例，本发明公开提供了胡蜂毒液蛋白质的完整核酸序列。具体地，本发明公开提供了胡蜂Ag5的核酸序列，尤其是Ves vAg5(SEQ ID NO14；参见图1)和Pol a Ag5(SEQ ID NO15；参见图2)的序列。本发明也提供了Ves v Ag5(SEQ ID NO16；参见图1)和Pol aAg5(SEQ ID NO17，参见图2)的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，为了获得本发明核酸分子，利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增如下DNA片段，该片段编码包含变应原肽表位序列或支架蛋白质的序列。能够代表本发明变应原蛋白质或支架蛋白质的寡核苷酸引物在PCR反应中用作引物。通常，这些引物由合成制备。PCR可以利用例如Perkin-Elmer cetus热循环仪和Taq聚合酶(GeneAmpTM)进行。
本发明核酸也可以通过限制性片段的克隆而获得，或者，本发明核酸可以通过核酸的体内或体外重组而获得。在一些情况下重组依赖于参与重组事件的核酸间的序列同源性，但在另一些情况下进行重组的核酸不需要包含明显的同源性，例如在“非常规”重组事件中。本领域普通技术人员明了，核酸重组可以是分子内或分子间事件。
除分离变应原蛋白质或支架蛋白质的DNA或cDNA之外，其它备选方案包括但并不限于依据此处提供的序列化学合成出基因序列本身。
上述方法并不旨在限制可获得本发明DNA的方法。
通过重组或者其它技术，用于获得本发明核酸的方法可以引起核酸相连处的核苷酸插入或缺失。在一个实施方案中，在编码抗原肽的核酸与编码支架蛋白质的核酸的连接处可以有核苷酸的插入或缺失。这些核酸完全在本发明范围之内。因此，本发明也包括这样的杂合蛋白质，其在肽表位序列与支架蛋白质序列的连接处有氨基酸的插入或缺失。
克隆的杂合蛋白质或其起始材料的核酸序列可以利用本领域公知的多种策略进行修饰(Maniatis，T.，1990，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。可以利用限制性内切酶在适当的位点将序列切开、如果需要的话进一步进行酶学修饰、分离并在体外连接。在产生编码杂合蛋白质的核酸时，应注意保证修饰的核酸与支架蛋白质仍在同一翻译阅读框内，且不能被翻译终止信号打断。
另外，编码变应原肽表位序列或支架蛋白质的核酸可以在体外或体内进行突变以产生和/或破坏翻译序列、起始序列和/或终止序列或者在编码区中造成变化和/或形成新的限制性内切酶位点或破坏原有位点，以促进进一步的体外修饰。本领域已知的任何诱变技术都可使用，包括但不限于体外定点诱变(Hutchinson等人，1978，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2536551；Zoller和Smith，1984，DNA 3479-488；Oliphant等人，1986，基因(Gene)44177；Hutchinson等人，1986，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83710)、TAB_接头的使用(Pharmacia)等等。定点诱变优选使用PCR技术进行(参见Higuchi，1989，《PCR技术DNA扩增的原理和应用》中的“利用PCR改造DNA”，H.Erlich主编，Stockton出版社，第6章，61-70页)。
本领域已知的大量载体-宿主系统可用于表达本发明DNA。可能的载体包括但不限于质粒或修饰的病毒，但是载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。这些载体包括但不限于噬菌体(例如λ噬菌体衍生物)或质粒(例如各种pBR322衍生物，如pUC、CR、pGEX载体，pmal-c，pFLAG等)。例如，在克隆载体中的插入可以通过将DNA片段连接至具有互补粘末端的克隆载体中而实现。在本发明优选的方面，PCR扩增的本发明核酸分子包含3’A核苷酸突出端，可以直接用于克隆到含有互补的T核苷酸突出端的pCR载体(Invitrogen公司，San Diego，CA)上。然而，如果克隆载体上不存在用于片断化DNA的互补性限制性位点，则可对DNA分子的末端作酶学修饰。或者，可以通过在DNA末端连上核苷酸序列(接头)而产生任何期望位点；这些连接上的接头可以包含编码限制性内切酶识别序列的特异的化学合成的寡核苷酸。在另一种可供选择的方法中，可以通过同聚物加尾修饰本发明DNA和切开的载体。重组分子可以通过转化、转染、感染和电穿孔等方法导入宿主细胞，由此产生该基因序列的许多拷贝。
在特定实施方案中，利用插有本发明DNA的重组DNA分子转化宿主细胞以产生多拷贝的该DNA。因此，大量获得DNA可以通过培养转化体、从转化体中将重组DNA分子分离，并且在必要时从分离的重组DNA中回收插入序列而实现。
编码SEQ ID NO1-13和93-95的Ves v 5多肽表位序列的核苷酸序列分别在SEQ ID NO18-30和96-98中给出。
变应原杂合蛋白质的表达编码杂合蛋白质或其免疫调节片断、衍生物或类似物的核苷酸序列可以插入适当的表达载体，即含有转录和翻译插入的蛋白质编码序列所必需的元件的载体。这些元件在此处称为“启动子”。因此，编码杂合蛋白质的核酸分子可操作地与启动子相连。表达载体也优选包括复制起点。必需的转录和翻译信号也可以由编码变应原或支架蛋白质的天然基因和/或其侧翼区域提供。潜在的宿主-载体系统包括但并不限于例如利用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等等)感染的哺乳动物细胞系统；例如利用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；诸如含有酵母载体的酵母等微生物；或者利用噬菌体、DNA、质粒DNA或柯斯质粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在强度和特异性上各有不同。依赖于所使用的宿主-载体系统，可以使用多种适当的转录和翻译元件中的任意一种。
在另外的实施方案中，本发明重组杂合蛋白质或其免疫调节片断、衍生物或类似物可通过将杂合蛋白质编码序列重组整合在染色体上后表达。在这一方面，可以使用多种扩增系统的任意一种来获得高水平的稳定基因表达(参见Sambrook等人，1989，上述，16.28节)。
可以在允许细胞表达杂合蛋白质的条件下，将重组载体转化的细胞在适当的细胞培养基中培养，所述重组载体含有编码杂合蛋白质的核酸分子。随后按照本领域公知的方法从培养物中回收表达的杂合蛋白质。这些方法将在下文中详述。
在另一实施方案中，可以使杂合蛋白质最初与多个氨基酸一起表达并且随后将该多个氨基酸从杂合蛋白质上切除。被去除的序列可以在杂合蛋白质序列的氨基或羧基末端。该序列可以在体内或体外去除。优选地，此序列通过蛋白酶在特异位点切割而去除，所述蛋白酶为例如信号肽酶、Xa因子、Kex2或二肽氨肽酶。编码这种含有将被蛋白酶切除的多肽的杂合蛋白质的重组DNA分子含有下述序列，该序列以符合读框的形式连接变应原杂合体的编码序列并编码待从杂合蛋白质上切除的肽。
在特定实施方案中，杂合蛋白质与含有约6个组氨酸残基的附加序列一起表达，例如这可利用pQE载体(QIAGEN，Chatsworth，CA)进行。组氨酸的存在使得可以利用Ni-螯合柱选择性分离重组蛋白质。这种柄还包括但并不限于FLAG、myc标签、GST等等。
在另一实施方案中，可以产生周质形式的杂合蛋白质(含有信号序列)，其可以使蛋白质输出至酵母周质或培养基。向周质或培养基中的输出可以促进表达蛋白质的正确折叠。
前述任何一种将DNA片断插入载体的方法都可以用于构建表达载体，所述表达载体含有由适当的转录/翻译调节信号和蛋白质编码序列组成的基因。这些方法包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。
编码杂合蛋白质或其免疫调节片断的核酸序列的表达可以被第二个核酸序列调节，这样，杂合蛋白质将在转化有该重组DNA分子的宿主中表达。例如，杂合蛋白质的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子元件调节，但是这些调节元件必须在选择用于表达的宿主中具有功能。可用于调节杂合蛋白质编码序列表达的启动子包括但并不限于CMV启动子、SV40早期启动子区域(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290304-310)、包含在Rous肉瘤病毒3’长末端重复中的启动子(Yamamoto等人，1980，细胞(Cell)22787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，美国国家科学院院报(Proc.Acid.Sci.U.S.A.)781441-1445)、金属硫蛋白基因调节序列(Brinster等人，1982，自然(Nature)29639-42)；用于原核表达载体的启动子例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院院报(Proc.Acid.Sci.U.S.A.)753727-3731)或者tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院院报(Proc.Acid.Sci.U.S.A.)8021-25)；也参见《科学美国人》中的“来自重组细菌的有用蛋白质”，1980，24274-79；来自酵母或其它真菌的启动子元件例如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及展现出组织特异性并已经在转基因动物中使用的动物转录调节区域。
另外，可以选择这样的宿主细胞系，其可以按照特定的期望方式调节插入序列的表达或者对基因产物进行修饰和加工。不同的宿主细胞具有其特征性的蛋白质翻译和翻译后加工和修饰机制(例如糖基化、切割[如信号序列])。可以选择适当细胞系或宿主系统以保证对所表达的外源蛋白质进行期望的修饰和加工。例如，可以通过在细菌系统中表达来产生非糖基化的核心蛋白质产物。然而，在细菌中表达的酶蛋白质可能不会正确折叠。可以通过在酵母中表达来产生糖基化产物。可以通过在昆虫细胞中表达来增加异源变应原杂合蛋白质进行天然糖基化和折叠的可能性。此外，不同载体/宿主表达系统也可能不同程度地影响加工反应，如蛋白水解酶裂解。
载体可以通过本领域已知的方法导入期望的宿主细胞，所述方法例如转染、电穿孔、微注射、转导、细胞杂交、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、使用基因枪或者DNA载体转移体(参见例如Wu等人，1992，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267963-967；Wu和Wu，1988，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26314621-14624；Hartmut等人，加拿大专利申请号2,012,311，1990年3月15日提交)。
cDNA和基因组序列都可以被克隆和表达。
此外，本发明杂合蛋白质或其片断、衍生物或类似物可以考虑通过合成制备，例如通过固相肽合成技术制备。
一旦重组杂合蛋白质被鉴定，其可以通过标准方法分离和纯化，所述标准方法包括层析(例如离子交换、亲合、大小排阻和反向层析)、离心、差异溶解或者其它的蛋白质纯化标准技术。
在特别的实施方案中，杂合蛋白质及其片断可以经改造而含有约6个组氨酸残基，这使得可以利用Ni-螯合柱选择性分离重组蛋白质。在一个优选的方面，该蛋白质通过反向层析进一步纯化。
在另一实施方案中，重组杂合蛋白质可以包括允许目的杂合蛋白质进行亲合纯化的附加序列，例如FLAG、MYC或GST(谷胱甘肽-S-转移酶)。例如，可以将杂合蛋白质的附加序列的特异性抗体固定于固相支持物(如溴化氰活化的琼脂糖)上，并用于纯化杂合蛋白质。在另一实施方案中，将附加序列的结合配偶体(例如受体或配体)固定并用于亲合纯化杂合蛋白质。
在一个实施方案中，杂合蛋白质(优选纯化的)不经进一步修饰即使用，即不经过裂解或其它方式去除附加在肽表位序列和支架蛋白质上的任何序列。在优选实施方案中，杂合蛋白质可治疗性地用于例如调节免疫应答。
在另一实施方案中，纯化的杂合蛋白质经处理裂解并去除附加于支架蛋白质上的任何序列。例如，当已经制备的杂合蛋白质含有蛋白酶敏感的裂解位点时，可以利用蛋白酶处理杂合蛋白质以裂解蛋白酶特异位点并释放杂合蛋白质。在特定实施方案中，通过用Xa因子处理以裂解杂合蛋白质。
在特别的实施方案中，本发明重组杂合蛋白质包括但无疑并不仅限于那些含有SEQ ID NO1-13或93-95的Ves v 5肽作为胡蜂毒液抗原的杂合蛋白质。
在特别的实施方案中，本发明重组胡蜂毒液杂合蛋白质包括但无疑并不仅限于那些含有SEQ ID NO17的Pol a 5蛋白质作为支架蛋白质的杂合蛋白质。
杂合蛋白质可以含有改变的表位或支架序列或含有改变的表位和支架序列，其中序列内的残基被其功能等价氨基酸残基替代，导致保守氨基酸替代。例如，序列内的一个或多个氨基酸残基可以被另一作为其功能等价物的具有相同极性的氨基酸替代，导致沉默改变。序列内的氨基酸的替代物可以选自该氨基酸所属种类的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
重组杂合蛋白质也在蛋白质水平上进行操作，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、还原和羧甲基化、用已知的保护基/封闭基团衍生化、蛋白酶裂解、连接至抗体分子或其它细胞配体等等。可以利用已知技术进行多种化学修饰，这包括但并不限于利用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；在衣霉素存在下进行代谢合成，等等。
在特定实施方案中，杂合蛋白质在昆虫细胞表达系统中(例如利用杆状病毒表达载体)表达。在优选实施方案中，利用适当的表达系统使杂合蛋白质在酵母(例如，不仅仅限于边斯德毕赤酵母(Picchia pastoris))中表达。正如上文所指出，这些表达系统应该产生具有“天然的”糖基化和结构的表达多肽，尤其是二级和三级结构的表达多肽。
本发明杂合蛋白质的活性测定免疫学中有多种可用于评价抗原的免疫调节活性的已知测定方法。例如可以测试杂合蛋白质结合至变应原或支架蛋白质特异性抗体的能力。优选地，这些在诊断测定中所检测的抗体为IgG或IgE类的。在真核表达系统且尤其是酵母细胞表达系统中产生的杂合蛋白质可能具有与抗体结合的正确结构。在细菌表达系统中表达的杂合蛋白质则可能不具正确结构，因此在用于诊断测定试验中进行抗体结合之前需要经过重折叠。
在另一实施方案中，本发明杂合蛋白质可以通过T细胞应答的增殖试验进行测试。为进行这种T细胞应答试验，用于产生该蛋白质的表达系统不应该影响蛋白质的免疫调节活性。通常，获取已致敏宿主的淋巴细胞。宿主可以是利用变应原、支架或杂合蛋白质(例如重组产生的胡蜂毒液Ag5)免疫的小鼠。
在一个实施方案中，从对变应原敏感的人中获取外周血白细胞。利用本领域公知的技术，对蛋白质的T淋巴细胞应答可以在体外测量。在一个特定实施方案中，T细胞应答通过测量3H-胸苷的掺入进行检测，所述掺入随着与增殖相关的DNA合成的增加而增加。
细胞增殖也可以利用MTT试验来检测(Mossman，1983，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)6555；Niks和Otto，1990，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)130140)。本领域已知的任何检测T细胞增殖的方法都可以用于本发明所生产的胡蜂蛋白质。
同样，根据本发明可以进行淋巴因子产生测定。在一个实施方案中，淋巴因子产生的测定利用免疫学或共刺激试验(参见例如Fehlner等人，1991，免疫学杂志(J.Immunol.)146799)或利用ELISPOT技术(Czerkinsky等人，1988，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)11029)实现。备选地，可以通过例如扩增(参见Brenner等人，1989，生物技术(BioTechniques)71096)或原位杂交(参见例如Kasaian和Biron，1989，免疫学杂志(J.Immunol.)1421287)来检测淋巴因子的mRNA。特别有意义的是那些个体，其T细胞产生与IgE同种型转换事件相关的淋巴因子，例如IL-4和IL-5(Purkeson和Isakson，1992，实验医学杂志(J.Exp.Med.)175973)。
因此，在一个优选的方面，本发明产生的杂合蛋白质可以与获取自变应原敏感个体的外周血淋巴细胞或者更优选地来自外周血淋巴细胞的细胞系用于体外试验，以检测通常与变应性应答相关的淋巴因子(例如IL-4)的分泌。这种测定可以指示出杂合蛋白质的哪一组分或哪些组分是造成变应性疾病的原因。
杂合蛋白质和核酸载体的治疗用途本发明提供了杂合蛋白质的丰富来源，例如通过重组技术产生。另外，杂合蛋白质也可以通过肽合成产生。
本发明预期杂合蛋白质在治疗性(药物)组合物中的用途，用于变应原特异性变应性疾病的疗法中，以治疗变应原特异性变应性疾病、免疫系统相关病症以及调节哺乳动物对免疫原的免疫应答。在特定实施方案中，根据本发明，Ves v 5和Pol a 5的杂合蛋白质或其衍生物或类似物被考虑用于诊断、治疗、医治和免疫应答的调节。
于此使用的短语“治疗有效量”是指足够治疗进行的量，该量优选使个体的免疫系统有效抗击免疫原的能力增加至少约30％，更优选至少约50％，最优选至少约90％。随着研究的进一步进行，可获得有关在不同患者中对调节免疫原的免疫系统应答适当的剂量水平的信息，并且，在考虑到接受者的治疗情况、年龄和一般健康状况的情况下，普通技术人员能够确定正确的剂量。
治疗方法本发明治疗组合物(参见下述)可以用于免疫疗法，也称为脱敏疗法。免疫疗法已经被证明在变应性疾病、尤其是昆虫变态反应中有效。可以在长时期内将变应原以逐渐增加的剂量经肠胃外施用。当患者敏感的一种或多种变应原已被特异地鉴定并且该疗法针对这些变应原时，这种疗法尤其有效。然而，这种方法具有潜在参与变态反应，尤其是过敏反应的缺陷。因此，杂合蛋白质的大量易得性对变态反应的免疫治疗非常重要，因为它们可以在不引起变态反应的前提下诱导对变应原的有效IgG应答。
正如发明背景中所讨论，当变应原用于免疫疗法时，变应原上B细胞表位的存在会引起令人不快的全身反应。因此，本发明的一个特别优势是能够提供不引起令人不快的全身反应的变应原多肽。
在一个实施方案中，可以皮下注射一种或多种杂合蛋白质以减少对天然分子的T细胞应答，例如这可参见Brine等人的描述(1993，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)907608-12)。
在另一实施方案中，可以经鼻内施用一种或多种杂合蛋白质以抑制首次接触者与已致敏个体的变应原特异性应答(参见例如Hoyne等人，1993，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1781783-88)。
施用本发明杂合蛋白质预期可以诱导强的抗变应原的B细胞(抗体)IgG应答，该应答将封闭IgE抗体，并且因此具有治疗作用。
这些结果也可以通过施用允许表达杂合蛋白质的载体，即通过基因治疗而获得。优选的载体(尤其对于体外和体内细胞试验)为病毒载体和非病毒载体，所述病毒载体例如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、杆状病毒、甲病毒(尤其是辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒病毒)以及其它具有期望的细胞向性的重组病毒。对体内或离体基因治疗而言，优选使用可药用载体，例如复制缺陷型病毒载体。含有本发明核酸的可药用载体可以进一步修饰以实现瞬时或稳定表达。于此使用的术语“可药用载体”包括但并不限于具有将核酸选择性定位和导入细胞的能力的载体或递送媒介。
因此，编码功能或突变蛋白或其多肽结构域片断的基因可以利用病毒载体或通过DNA的直接导入而实现体内、离体或体外导入。在靶组织中的表达可以通过将转基因载体定位至特定细胞实现，例如利用病毒载体或受体配体或者通过利用组织特异性启动子或者同时利用此两种来实现。定向基因递送在PCT出版号WO95/28494中描述。
通常用于体内或离体定向和治疗方法的病毒载体为基于DNA的载体和逆转录病毒载体。构建和使用病毒载体的方法为本领域公知(参见例如Miller和Rosman，生物技术(BioTechniques)，1992，7980-990)。优选地，病毒载体为复制缺陷型，即它们不能在靶细胞中自主复制。优选地，复制缺陷型病毒为最小病毒，即它仅仅保留对于包装基因组以产生病毒颗粒所必需的基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒型或缺陷型DNA病毒，例如但并不限于单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、甲病毒(尤其辛德比斯病毒)等等。优选那些完全或基本完全缺少病毒基因的缺陷型病毒。在导入细胞后缺陷型病毒并没有感染性。应用缺陷型病毒载体使得可以在特定局部区域中向细胞施用，而不用担心载体会感染其它细胞。因此，可以特异性地定向于特定组织。具体载体的例子包括但并不限于缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等人，分子细胞神经科学(Molec.Cell.Neurosci.)1991，2320-330)、缺少糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体或者其它缺陷型疱疹病毒载体(PCT出版号WO94/21807和WO92/05263)；减毒型腺病毒载体，例如Stratford-Perricaudet等人描述的载体(J.Clin.Invest.1992，90626-630；也参见La Salle等人，科学(Science)1993，259988-990)；缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等人，病毒学杂志(J.Virol.)1987，613096-3101；Samulski等人，病毒学杂志(J.Virol.)1989，633822-3828；Lebkowski等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)1988，83988-3996)；以及甲病毒载体，包括基于辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒病毒的载体(美国专利号5,091,309；PCT出版号WO 98/44132；Schlesinger和Dubensky，Curr.Opin.Biotechnol.1999，5434-9；Zaks等人，自然医学(Nat.Med.)1999，7823-7)。
有多个公司商业生产病毒载体，包括但并不限于Avigen，Inc.(Alameda，CA；AAV载体)、Cell Genesys(Foster City，CA；逆转录病毒、腺病毒、AAV和慢病毒载体)、Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)、Genvec(法国；腺病毒载体)、IntroGene(Leiden，荷兰；腺病毒载体)、MolecularMedicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、Norgen(腺病毒载体)、Oxford BioMedica(牛津、英国；慢病毒载体)和Transgene(Strasbourg，法国；腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒和慢病毒载体)。
在另一实施方案中，载体以裸DNA形式、通过脂质转染或者利用其它转染促进剂(肽、多聚体等等)体内导入。合成的阳离子脂可以用于制备脂质体，以用于体内转染编码标记的基因(Felgner等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1987，847413-7417；Felgner和Ringold，科学(Science)1989，337387-388；参见Mackey等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1988，858027-8031；Ulmer等人，科学(Science)1993，2591745-1748)。核酸转移使用的有用脂类化合物和组合物在PCT专利出版号WO 95/18863和WO96/17823以及美国专利号5,459,127中描述。为了进行定向，脂类可以化学偶联至其它分子(参见Mackey等人，前述)。导向肽(例如激素或神经递质)和蛋白质(例如抗体)或非肽分子可以被化学偶联至脂质体上。
其它分子也可以用于促进核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(例如PCT专利出版号WO95/21931)、来自DNA结合蛋白质的肽(例如PCT专利出版号WO96/25508)或者阳离子多聚体(例如PCT专利出版号WO95/21931)。
以裸DNA质粒形式将载体导入体内也是可能的。用于基因疗法的裸DNA载体可以通过本领域公知的方法导入所期望的宿主细胞，所述方法例如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的使用、DNA载体转移体的使用(参见例如Wu等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1992，267963-967；Wu和Wu，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1988，26314621-14624；加拿大专利申请号2,012,311；Williams等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1991，882726-2730)。也可以使用受体介导的DNA递送方法(Curiel等人，Hnm.Gene Ther.1992，3147-154；Wu和Wu，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1987，2624429-4432)。美国专利号5,580,859和5,589,466公开了在哺乳动物中不使用转染促进剂而递送外源DNA序列的方法。最近，已经描述一种相对低电压、高效率的DNA体内转移技术，称为电转移(Mir等人，C.P.Acad Sci.1988，321893；PCT出版号WO 99/01157、WO 99/01158和WO 99/01175)。
免疫系统相关疾病的治疗正如前述，本发明涉及杂合蛋白质，其可以用于治疗免疫系统相关疾病或病症，或者用于调节哺乳动物对免疫原的免疫应答。特别地，本申请者已发现，本发明杂合蛋白质可以在不引起变态反应的前提下引起免疫应答从而用于调节个体对多种免疫原的免疫应答。在一个特定的实施方案中，本发明杂合蛋白质调节个体免疫系统以使其增加抗击病原和病毒的能力，上述病原和病毒包括但并不限于HIV、单纯疱疹病毒或乳头瘤病毒。该方法包括给个体施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含由含有本发明DNA分子的分离的核酸分子所编码的多肽。
此外，已经发现，本发明杂合蛋白质、核酸和载体也可以应用于治疗免疫系统相关疾病或病症，或者与其相关的症状。于此使用的术语“免疫系统相关疾病或病症”是指可以唤起个体的免疫应答或者影响免疫系统对免疫原反应的能力的疾病或病症。可以利用本发明药剂和药物组合物治疗的免疫系统相关疾病或病症的例子包括但并不限于病原性疾病或病症；病毒性疾病或病症例如HIV、单纯疱疹病毒或乳头瘤病毒；或者自身免疫疾病例如关节炎或狼疮。
而且，本发明涉及治疗免疫系统相关疾病或病症或者其相关症状的方法，包括为治疗免疫系统相关疾病或病症给个体施用治疗有效量的药物组合物。所以，例如，如果免疫系统相关疾病或病症涉及HIV，则显著的临床变化将涉及到例如，在施用了本发明药物组合物的个体中与未施用前相比白细胞数量增加。监测个体的临床显著变化的其它这种例子对本领域普通技术人员而言十分明显。此外，随着研究的进一步进行，可以获得用于治疗不同患者的免疫系统相关疾病或病症或者相关症状的适当剂量水平的信息，并且，在考虑到接受者的治疗情况、年龄和一般健康状况的情况下，普通技术人员可以确定正确的剂量。可药用组合物的例子在下文中描述。
可药用组合物本发明的体内治疗组合物也可以含有适当的可药用载体、赋形剂、稀释剂和佐剂。于此使用的术语“可药用”优选指获得政府管理机构(特别是联邦政府或州政府管理机构)批准或者已在美国药典或其它公认的药典中列出可以用于动物且更尤其是用于人类。合适的药用载体描述在E.W.Martin的“Remington制药科学”(Remington’s Pharmaceutical Sciences)中。
这些可药用载体可以是无菌的液体，例如水和油，所述油包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物经静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油水溶液也可以作为液体载体使用，尤其是用于注射用溶液中。合适的药用赋形剂包括甘露醇、人血清白蛋白(HSA)、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、碳酸镁、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。这些组合物可以为溶液、悬液、片剂、药丸、胶囊、粉剂、缓释制剂等等形式。
这些组合物可以含有诊断或治疗有效量的活性化合物连同适量的载体，以形成可以给患者适当施用的形式。尽管静脉注射是非常有效的给药方式，其它方式例如注射、或者口服、经鼻或肠胃外给药也可以使用。
实施例1 Ag5杂合体cDNA的构建用于实施例的引物1-24在表1中列出。
Ves v 5 EA和KR构建体通过分别利用引物1(SEQ ID NO31)和3(SEQ ID NO33)或者2(SEQ ID NO32)和3(SEQ ID NO33)进行PCR扩增Ves v 5 cDNA模板(Lu等人，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)1502823)制备。Pol a 5 EA和KR构建体通过分别利用引物4(SEQ IDNO34)和6(SEQ ID NO36)或者5(SEQ ID NO35)和6(SEQ ID NO36)进行PCR扩增Pol a cDNA模板(Lu等人，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)1502823)制备。每一cDNA构建体都在5’端含有EcoRI或XhoI位点而在3’端含有XbaI位点。cDNA以EcoRI-XbaI或XhoI-XbaI片断的形式克隆至质粒载体pPICZαA(Invitrogen公司，San Diego，CA)。阳性克隆利用PCR鉴定。pPICZαA中的重组Ag 5和杂合体cDNA序列通过插入片断的DNA测序确证。其它构建体按照King等人的描述制备(2001，免疫学杂志(J.Immunol.)1666057-6065)。
(i)PV1-46。PV1-46杂合体通过在肽序列EH处将Ves v 5的氨基端序列和Pol a 5的羧基端序列结合而构建，肽序列EH分别存在于各蛋白质的氨基酸47-48位和49-50位。在Ves v 5中编码EH肽的核苷酸序列为GAG CAC，其对应于Bsi HKAI限制酶切割位点。
为方便PV1-46杂合体的构建，按照下述方法，利用PCR重叠延伸方法(Ho等，1989，Gene 7751)将49-50位氨基酸处编码Pol a 5EH肽的天然DNA序列(GAG CAT)突变成Bsi HKAI位点。第一步由两个单独的PCR组成。一个PCR中，利用引物4(SEQ ID NO34)和8(SEQID NO38)来扩增编码Pol a 5第1-53位残基的DNA，其中EH编码序列被转换为Bsi HKAI位点。在第二个PCR中，利用引物7(SEQ ID NO37)和6(SEQ ID NO36)来扩增编码Pol a 5第47-205位残基的DNA，其中EH编码序列被转换为Bsi HKAI位点。两个PCR都利用1-40ng Pol acDNA作为模板和各50pmole的有义和反义引物在含有0.2mM dNTP和5单位Taq聚合酶的100μl PCR缓冲液中进行。循环条件为95℃变性0.5分钟、55℃退火0.5分钟和72℃延伸2分钟，35个循环。这两个PCR的产物含有重叠区域。在重叠延伸方法的第二步中，第三个PCR利用头两个反应的纯化产物的混和物为模板并利用侧翼引物4(SEQ ID NO34)和6(SEQ ID NO36)进行，其产生具有将EH编码序列转变为Bsi HKAI位点的全长Pol a 5。
随后杂合体PV1-46编码cDNA通过将来自Ves v 5和修饰的Pol a 5cDNA的适宜Bsi HKAI片断连接至pPICZαA中而制备，方式正如以上针对Ag 5编码cDNA的描述。
(ii)PV109-155。PV109-155杂合体通过在肽序列KY处将Ves v 5的氨基端序列和Pol a 5的羧基端序列结合而构建，肽序列KY分别对应于各蛋白质的氨基酸106-107位和109-110位。两个Ag5s中KY肽由核苷酸序列AAA TAT所编码。为构建PV109-155，将适当的Ag5或杂合体cDNA的KY编码序列突变为编码肽序列KF的ApoI限制酶切割位点(AAA TTT)。这些单碱基突变利用实施例1中描述的PCR重叠延伸方法(Ho等人，1989，基因(Gene)7751)完成。在一组反应中，PV1-155cDNA的KY编码核苷酸序列通过利用诱变引物9(SEQ ID NO39)和10(SEQ ID NO40)实施PCR重叠方法来转变。在第二组反应中，Pola 5cDNA的KY编码核苷酸序列通过利用诱变引物11(SEQ ID NO41)和12(SEQ ID NO42)实施PCR重叠方法来转变。随后杂合体PV109-155编码cDNA通过用ApoI消化转变的Pol a 5和转变的PV1-155编码cDNA并将所得到的合适片断连接至pPICZαA中而制备。
(iii)PV1-155和PV156-204。Ves v 5和Pol a 5具有共同的EaeI限制性位点，其编码154-156位氨基酸残基。杂合体PV156-204和PV1-155编码cDNA通过将它们亲本cDNA的适当EaeI片断连接至pPICZαA中而制备。
(iv)PV1-8、PV1-18和PV195-204。这些杂合体利用Pol a 5的cDNA作为模板进行PCR制备。PV1-8利用引物2(SEQ ID NO32)和6(SEQ ID NO36)制备。PV1-18利用引物6(SEQ ID NO36)和13(SEQ ID NO43)制备。PV195-204利用引物4(SEQ ID NO34)和14(SEQ ID NO44)制备。将杂合体克隆至pPICZαA。
(v)PV1-24、PV1-32、PV1-39、PV1-50、PV1-57和PV1-70。这些杂合体利用实施例1中给出的PCR重叠延伸方法(Ho等人，1989，基因(Gene)7751)构建。对PV1-24而言，第一轮PCR利用引物1(SEQ ID NO31)和15(SEQ ID NO45)及Ves v 5cDNA作为模板以及引物6(SEQ ID NO36)和16(SEQ ID NO46)及Pol a 5cDNA作为模板进行。随后将这两个重叠的PCR产物纯化并在第三轮PCR中用作模板和侧翼引物1(SEQ ID NO31)和6(SEQ ID NO36)一起扩增产生PV1-24。对PV1-32而言，第一轮PCR利用引物1(SEQ ID NO31)和18(SEQ ID NO48)及Ves v 5cDNA作为模板以及引物6(SEQ ID NO36)和17(SEQ ID NO47)及Pol a 5cDNA作为模板进行。随后将这两个重叠的PCR产物纯化并在第三轮PCR中用作模板并利用侧翼引物1(SEQ IDNO31)和6(SEQ ID NO36)产生PV1-24。对PV1-39而言，第一轮PCR利用引物2(SEQ ID NO32)和19(SEQ ID NO49)及Ves v 5cDNA作为模板以及引物6(SEQ ID NO36)和20(SEQ ID NO50)及Pol a 5cDNA作为模板进行。随后将这两个重叠的PCR产物纯化并在第三轮PCR中用作模板并利用侧翼引物2(SEQ ID NO32)和6(SEQ ID NO36)产生PV1-39。对PV1-50而言，第一轮PCR利用引物2(SEQ ID NO32)和28(SEQ ID NO58)及Ves v 5cDNA作为模板以及引物6(SEQ IDNO36)和27(SEQ ID NO57)及Pol a 5cDNA作为模板进行。随后将这两个重叠的PCR产物纯化并在第三轮PCR中用作模板并利用侧翼引物2(SEQ ID NO32)和6(SEQ ID NO36)产生PV1-50。对PV1-57而言，第一轮PCR利用引物2(SEQ ID NO32)和30(SEQ ID NO60)及Ves v 5cDNA作为模板以及引物6(SEQ ID NO36)和29(SEQ IDNO59)及Pol a 5cDNA作为模板进行。随后将这两个重叠的PCR产物纯化并在第三轮PCR中用作模板并利用侧翼引物2(SEQ ID NO32)和6(SEQ ID NO36)产生PV1-57。对PV1-76而言，第一轮PCR利用引物2(SEQ ID NO32)和32(SEQ ID NO62)及Ves v 5cDNA作为模板以及引物6(SEQ ID NO36)和31(SEQ ID NO61)及Pol a 5cDNA作为模板进行。随后将这两个重叠的PCR产物纯化并在第三轮PCR中用作模板并利用侧翼引物2(SEQ ID NO32)和6(SEQ ID NO36)产生PV1-76。将杂合体cDNA克隆至pPICZαA。
(vi)PV22-32、PV115-125、PV142-150和PV176-182。这些构建体为杂合Ag 5s，其中短Ves v 5多肽代替完整全长Pol a 5上的同源序列。
利用实施例1中给出的PCR重叠延伸方法(Ho等人，1989，基因(Gene)7751)利用Ves v 5序列替代Pol a 5序列。第一组两个PCR中所用的模板DNA为Lu等人所述的Pol a cDNA(1993，免疫学杂志(J.Immunol.)1502823)。在PCR延伸方案中使用的上游和下游Pol a引物分别为引物4(SEQ ID NO22)和6(SEQ ID NO24)。最终产物克隆至pPICZαA。
编码Ves v 5插入序列的重叠引物对如下(a)PV22-32引物17(SEQ ID NO47)和18(SEQ ID NO48)；(b)PV115-125引物21(SEQ ID NO51)和22(SEQ ID NO52)；(c)PV142-150引物23(SEQ ID NO53)和24(SEQ ID NO54)以及(d)PV176-182引物25(SEQ ID NO55)和26(SEQ ID NO56)。PCR反应和循环条件如PV1-46中所描述的。
表1.制备Ves v和Pol a 5s以及它们的杂合体的引物引物序列(5’→3’)1 CGTGAATTCAACAATTATTGTAAAATAAAA(SEQ ID NO31)2 CGTCTCGAGAAAAGAAACAATTATTGTAAAATAAAA(SEQ ID NO32)3 CGTTCTAGATTACTTTGTTTGATAAAGTTC(SEQ ID NO33)4 CGTGAATTCGTTGATTATTGTAAAATAAAA(SEQ ID NO34)5 CGTCTCGAGAAAAGAGTTGATTATTGTAAAATAAAA(SEQ ID NO35)6 CGTTCTAGATTATTTTTTTGTATAAGGTAG(SEQ ID NO36)7 GTAAGCGAGCACAATCGGTTT(SEQ ID NO37)8 AAACCGATTGTGCTCGCTTAC(SEQ ID NO38)9 GTAGCAAAATTTCAGGTTGGA(SEQ ID NO39)10 TCCAACCTGAAATTTTGCTAC(SEQ ID NO40)
11ACCGCAAAATTTCCAGTTGGA(SEQ ID NO41)12TCCAACTGGAAATTTTGCGGT(SEQ ID NO42)13CGTGAATTCAACAATTATTGTAAAATAAAATGTTTGAAAGGAGGTGTCCATACTGCCTGCAAATATGGAGAA(SEQ ID NO43)14CGTTCTAGATTACTTTGTTTGATAAAGTTCCTCATTCTTAAAATTTCCAGCTGG(SEQ IDNO44)15GGCACAATTCTTGCTCGGTTTAAGACTTCCATA(SEQ ID NO45)16TATGGAAGTCTTAAACCGAGCAAGAATTGTGCC(SEQ ID NO46)17CTTAAACCGAATTGCGGTAATAAGGTAGTGGTATCGGTTGGTCCA(SEQ ID NO47)18TGGACCAACCGATACCACTACCTTATTACCGCAATTCGGTTTAAG(SEQ ID NO48)19TATGGTCTAACGAAACAAGAGAAAAAATTAATCGTA(SEQ ID NO49)20TACGATTAATTTTTTCTCTTGTTTCGTTAGACCATA(SEQ ID NO50)21TTAACAGGTAGCACGGCTGCTAAATACGATGATGTAGTCAGTCTA(SEQ ID NO51)22ATCATCGTATTTAGCAGCCGTGCTACCTGTTAACGCTATATTTTG(SEQ ID NO52)23CCTAAGAAAAAGTTTTCGGGAAACGACTTTGCTAAAATTGGC(SEQ ID NO53)24GTCGTTTCCCGAAAACTTTTTCTTAGGATTAAAATCTTTCAC(SEQ ID NO54)25ATTCAAGAGAAATGGCACAAACATTACCTCATA(SEQ ID NO55)26TTTGTGCCATTTCTCTTGAATATATTTTAGAGA(SEQ ID NO56)27GAGCACAATGACTTTAGACAAAAA(SEQ ID NO57)28TTTTTGTCTAAAGTCATTGTGCTC(SEQ ID NO58)29AAAATTGCACGAGGGTTGGAAACA(SEQ ID NO59)30TGTTTCCAACCCTCGTGCAATTTT(SEQ ID NO60)31AATATGAAAAATTTGGTATGGAAC(SEQ ID NO61)32GTTCCATACCAAATTTTTCATATT(SEQ ID NO62)将EA-或KR-系列的Ag5或杂合体编码cDNA分别利用限制性酶EcoRI或XhoI和XbaI消化，然后插入相同切割的pPICZαA载体(Invitrogen，San Diego，CA)。重组质粒在TOP10F’细胞中扩增。所有重组质粒的Ag 5编码序列经DNA测序确认。除在Ves v 5中观察到两个单核苷酸差异外，Ag 5编码序列与Genbank中的序列数据(Ves v Ag 5登录号M98858以及Pol a Ag 5登录号M98857)相对应。这些改变发生在579位和587位，并分别导致G变为A的沉默突变和T变为A的替代，上述T变为A的替代导致在氨基酸残基196位M至K的密码子改变。这两个核苷酸改变可能为昆虫的多态性而不是随机突变，因为使用的Ag 5cDNA是以与以前相同的方法(Lu等人，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)1502283)制备的。
实施例2 Ag 5s以及杂合体的表达与纯化利用限制酶Sac I切割将重组质粒(1-2μg)线性化，并且随后用于电穿孔法转化感受态巴斯德毕赤酵母KM71酵母细胞(约8×109细胞存在于40μl 1M山梨醇中)。用1M山梨醇将转化的细胞稀释至2ml并使其在不进行振荡的情况30℃复苏1小时，接着在200rpm振荡的条件下再培养1小时。然后将50μl或100μl小份培养物涂布于100mm YPDS培养基(含1.5mg/ml Zeocin)平板上以筛选多拷贝整合体(Invitrogen手册)。经3-4天孵育后挑取所选择的克隆并通过小量表达筛选来鉴定产生杂合蛋白质的菌落。小量表达使用与下文用于大量分离时相同的方法在50ml塑料管中进行，但其规模为大量分离时的1/30，培养液通过分泌蛋白质的SDS胶电泳来筛选。
所选克隆的酵母细胞在2个500ml瓶中30℃、250rpm定轨振荡生长至A600nm为10-12，其中每一个瓶中含有150ml pH 6.0磷酸盐缓冲液(其含有酵母氮源、生物素、甘油和组氨酸)。然后将细胞通过离心收集并重悬于100ml含有甲醇而非甘油的相同缓冲的培养基中。继续在30℃下250rpm振荡孵育4-6天并每天加入1ml 50％的甲醇。
利用以前报道的方法(Monsalve等人，1999，蛋白质表达纯化(ProteinExpr.Purif.)16410)通过在SE-纤维素(Sigma)上离子交换层析将Ag5s或它们的杂合体从培养液浓缩物中纯化出来。合并大约70％的主峰，利用C18硅胶柱反向层析脱盐并冻干。将重组Ag 5s或杂合体在0.01M醋酸铵缓冲液(pH 4.6)中溶解并于4℃贮存。重组蛋白质浓度利用280nm的光吸收确定，其中使用根据酪氨酸和色氨酸含量计算的摩尔消光。Ag 5s或杂合体的产量一般为每100ml 4天培养物中1-7mg。
重组Ag 5s或杂合体通过SDS胶电泳、N-末端测序分析和MALDI质谱鉴定。存在于0.01M pH4.6醋酸缓冲液中的0.2mg/ml重组蛋白质的CD光谱测定利用1mm光程长度的比色池在AVIV 62DS光谱仪上进行。
实施例3 重组胡蜂Ag5s以及杂合体的物理化学特征在酵母菌株KM71中表达的Ag5s以及杂合体蛋白质含有分泌信号肽。信号肽通过具有KR或KREAEAEF序列的肽连接至表达蛋白质。这两种类型的蛋白质分别命名为KR-和EA-系列。在从酵母细胞中分泌后，信号肽在KR序列(Kex 2蛋白酶位点)或两个EA序列(Ste 13二肽基氨肽酶位点)处被从分泌蛋白质上切除(Invitrogen手册)。
重组蛋白质从培养液中的分离利用SE-纤维素上离子交换层析完成，然后在C18-硅胶柱上反向层析，并且利用SDS胶电泳表征(图6)。几个杂合体表现为紧靠的双联体(doublet)，具有与天然Ves v 5相同的迁移率。正如杂合体PV1-155和PV156-204的N-末端测序和质谱数据所指示的，这些双联体与它们N-末端的不同加工程度相一致(表2)。
重组Ag 5s以及杂合体显示出与天然Ag 5s几乎相同的CD光谱(图7)。天然Ves v 5和EA-Ves v 5以及EA-PV1-46、EA-PV1-155和EA-PV156-204的光谱在约208nm存在最小值，并且在225nm出现肩(图7)。这些特性是有序特性的标志(Yang等人，1986，酶学方法(Methodsin Enzymology)130208)。在其它列于表II的杂合体中也观察到相似CD光谱(数据未显示)。来源于细菌的重组Ves v 5的CD光谱的最小值出现在约200nm处，这暗示其具有无序结构(Monsalve等人，1999，蛋白质表达纯化(Protein Expr.Purif.)16410)。
与天然Ag 5s相同，酵母来源的重组Ag 5s以及杂合体在酸或碱性缓冲液中可自由溶解。这与细菌来源的重组胡蜂Ag 5s不同，后者仅在酸性缓冲液中有自由溶解。
Ag 5s以及杂合体的质谱分析结果在表2中给出。EA-系列的Ag 5s在Kex2位点被有效裂解，而在两个Ste 13位点显示可变的裂解。因此，重组EA-系列蛋白质具有EAEAEF和EAEF的氨基末端序列，其中EF序列由用于将cDNA插入载体的EcoRI位点编码。这些数据与以前报道的结果(Monsalve等人，1999，蛋白质表达纯化(Protein Expr.Purif.)16410)相似。
重组ves v 5的EAEAEF序列已知可作为强的半抗原行使功能(Monsalve等人，1999，蛋白质表达纯化(Protein Expr.Purif.)16410)。因此，Ag 5s也以KR-系列杂合体形式表达。KR-系列蛋白质在Kex 2位点的裂解产生具有天然蛋白质的N-末端序列的重组蛋白质。KR-系列蛋白质Ves v 5、Pol a 5以及杂合体KR-PV1-24和KR-PV1-46的质谱分析显示，它们在Kex2位点和Kex2位点上游的2、7和9个残基处以不同的效率被裂解(表2)。KR-系列重组蛋白质的产量通常比EA-系列蛋白质的要稍微低一些。
表2重组胡蜂Ag 5s以及杂合体的质谱数据质量单位蛋白质推测的序列丰度1计算值 实测值EA-Ves v 5EAEAEF-Vv 80％ 23,954 23,947EAEF-Vv 20％ 23,754 23,752FA-Poi a 5EAEAEF-Pa 100％23,611 23,613EA-PV1-18 EAEF-PV 43％ 23,497 23,506EAEAEF-PV 36％ 23,697 23,698REAEAEF-PV21％ 23,871 23,827EA-PV1-18 EAEAEF-PV 100％23,697 23,701EA-PV1-32 EF-PV 60％ 22,964 22,930EAEF-PV 40％ 23,151 23,134EA-PV1-46 EAEF-PV 53％ 23,300 23,327EAEAEF-PV 47％ 23,500 23,515EA-PV1-46 EF-PV 10％ 23,099 23,109EAEF-PV 50％ 23,300 23,327EAEAEF-PV 40％ 23,500 23,515
EA-PV1-155 EF-PV 53％ 23,37523,334EAEF-PV 47％ 23,57523,533EA-PV22-32 EAEF-PV 55％ 23,13523,203EAEAEF-PV 45％ 23,33623,371EA-PV115-125EAEAEF-PV 100％23,87323,887EA-PV142-150EAEAEF-PV 100％23,59223,585EA-PV156-204EAEF-PV 59％ 23,77623,775EAEAEF-PV 41％ 23,93223,939EA-PV195-204EAEAEF-PV 70％ 23,70023,688REAEAEF-PV 30％ 23,87423,844KR-Ves v 5 Vv5 90％ 23,27723,274EEGVSLEKR-Vv10％ 24,30524,298KR-Ves v 5 Vv 95％ 23,27723,284EEGVSLEKR-Vv5％ 24,30524,300KR-Pol a 5 Pa 20％ 22,93422,951EEGVSLEKR-Pa80％ 23,96223,992KR-Pol a 5 Pa 10％ 22,93422,935EEGVSLEKR-Pa90％ 23,96223,962KR-PV1-24 PV 85％ 22,90322,897EEGVSLEKR-PV15％ 23,93123,933KR-PV146PV 70％ 22,82322,834KR-PV 30％ 23,10723,157KR-PV1-46 PV 60％ 22,82322,834KR-PV 40％ 23,10723,1571蛋白质丰度由质谱中样品的峰高估计。对于EA系列的EA-Ves v 5、EA-Pola 5、EA-PV3PV156-204和EA-VP3PV1-155样品的N-末端序列，它们的推定序列经Edman降解确认。
对于EA-PV1-18，EA-PV1-46，KR-Ves v 5，KR-Pol a和KR-PV1-46各显示了两个制品的结果。
氨基末端肽以SEQ lD NO命名如下EAEAEF[SEQ ID NO89]；EAEF[SEQ IDNO90]；REAEAEF[SEQ ID NO91]和EEGVSLEKR[SEQ ID NO92]。
实施例4 ELISA研究ELISA在96孔板中进行，所述96孔板板孔用存在于0.05M pH 8的Tris-HCl缓冲液中的4μg/ml Ag 5包被。结合的Ig G1利用2μg/ml生物素化的山羊抗小鼠IgG(γ1特异性)其后再利用2μg/ml亲合素-过氧化物酶缀合物检测(King等人，1995，免疫学杂志(J.Immunol)154577)。血清样品的抗体浓度通过它们的ELISA数据与Ves v 5特异性抗体的免疫亲合纯化样品的ELISA数据相比较而确定。
实施例5 杂合体的Ves v 5特异性B细胞表位天然Ves v 5特异性小鼠多克隆抗体利用在Ves v 5特异性免疫吸附剂上亲合层析从BALB/c血清中分离，并且通过过Pol a 5特异性免疫吸附剂将Pol a 5交叉反应抗体去除。免疫吸附剂利用CNBr活化的Sepharose 2B(Pharmacia)制备。小鼠Ves v 5特异性单克隆抗体按照King等人，1987，分子免疫学(Mol.Immunol)24857中所述方法获取。
Ves v 5特异性B细胞表位通过杂合体对小鼠Ves v 5特异性抗体与固相Ves v 5的结合的抑制来检测。将EA-和KR-Ves v 5作为固相抗原进行测试，得到类似结果。共测试5个小鼠抗血清样品3个来自BALB/c株系以及1个来自ASW/sn株系、1个来自于P/J株系。利用一个BALB/c血清样品得到的结果显示在图8A中。当用50或500μg/ml抑制剂的最高浓度测试时，两个N-端杂合体EA-PV1-46和EA-1-155显示最大抑制作用，达100％，与EA-或KR-Ves v 5的抑制作用一样。另外两个N-端杂合体KR-PV1-24和EA-PV1-32具有约60％的最大抑制作用，而最短的N-端杂合体EA-PV1-18的最大抑制作用为约20％。C-端杂合体EA-PV156-204的最大抑制作用为约15％。利用来自ASW/sn(图8B)和P/J(图8C)小鼠的抗血清进行抑制ELISA试验得到相似结果。
Ves v 5特异性B细胞表位还利用来自六个小黄蜂敏感患者的血清通过抑制分析进行了检测。从三个患者得出的数据显示在图9A-C。该结果与利用小鼠IgG获得的结果相似。
利用小鼠和人抗血清的ELISA抑制研究的结果显示Ves v 5的N-端区域具有免疫优势。
由于用于BALB/c小鼠抑制研究的Ves v 5特异性抗体样品已除去Pola 5交叉反应抗体并且没有检测到Pol a 5的抑制作用(图8A)，所以，所观察到的杂合体抑制作用并非由于分子的Pol a 5部分的交叉反应表位引起。与Ves v 5相比达到半最大抑制作用所需要的杂合体高浓度并不反映出杂合体的表位缺少Ves v 5的天然结构，因为缺少天然结构的来自细菌的重组Ves v5并不显示任何抑制作用(数据未显示)。
Ves v 5和杂合体在抑制活性上的差异可能与它们的表位密度有关。已知表位密度强烈地影响多价抗原和二价抗体的亲合常数(Hornick和Karush，1972，免疫化学(Immunochemistry)9325；Crothers和Metzger，1972，免疫化学(Immunochemistry)9341)。
图8和图9中的数据揭示Ves v 5的氨基端部分含有Ves v 5的免疫显性B细胞表位。这一发现通过利用一组17个Ves v 5特异性单克隆抗体进行测试而确认(King等人，1987，分子免疫学(Mol.Immunol)24857)。这些单克隆抗体是天然Ves v 5和来自酵母的重组蛋白质的特异性抗体，但是它们并不结合来自细菌的重组Ves v 5的变性形式(数据未显示)。ELISA结果显示一种单克隆抗体以相似的亲合性和最大的结合与EA-Ves v5和EA-PV1-46结合，并且其不与其它的任何N-或C-端杂合体结合(图10A)。另外4种单克隆抗体与EA-PV1-46有大大减少的最大结合，但它们不与任何更短的N-端杂合体结合；其中一个抗体的数据显示在图10B中。最后，一种单克隆抗体显示出与EA-PV1-32和EA-PV1-46具有大大减弱的结合以及与EA-PV1-18和EA-PV1-24具有中等程度的结合(图10C)。这些数据显示测试的17种单克隆抗体中有6种对Vesv 5的N-端区域有特异性。
实施例6 对杂合体的免疫应答2周一次向每组3或4只雌性BALB/c小鼠腹膜内注射存在于0.2ml磷酸缓冲盐水中的2μg免疫原和1μg明矾。Ag 5或杂合体特异性血清在第5周或之后收集。第5、7和9周收集的血清显示相似的抗体水平。
用杂合体免疫的小鼠产生杂合体(Pol a 5和Ves v 5)特异的抗体。血清样品的抗体水平在用Pol a 5吸附之前和之后测量以确定它们对Ves v 5的特异性。这些数据总结在表3A。利用天然、EA-或KR-Ves v 5免疫的小鼠具有几乎相同的抗体应答，并且仅KR-Ves v 5的抗体应答在表3A中给出。EA-PV1-46在A组小鼠中产生的抗体应答比KR-PV1-46在B组小鼠中产生的抗体应答要高一些。此差异可能是由于所用小鼠组的不同造成的。EA-PV1-18用于两组实验，而其在A组小鼠中产生的抗体应答高于其在B组小鼠中产生的抗体应答。
比较Pol a 5吸附前后表3中N-端杂合体特异性血清样品的抗体水平，结果显示，当在固相Ves v 5上测试时，抗体的30-80％对Ves v 5特异，并且当在固相杂合体上测试时这些值较小。在固相Ves v 5上检测到的Ves v 5特异性抗体的含量高于在固相杂合体上检测到的含量，这揭示大部分杂合体特异性抗体识别杂合体中Ves v 5和Pol a 5的重叠区域。表3A中A组的数据显示在3个N-端杂合体中，PV1-155具有与Ves v 5相同的免疫原性，PV1-46的免疫原性是Ves v 5的一半，而PV1-18的免疫原性是Ves v 5的1/9。B组中的数据显示PV1-46和1-32比PV1-24和1-18有更强的免疫原性。两组数据揭示，与2个较短的N端杂合体PV1-24和1-18相比，较长的N-端杂合体PV1-46和1-32刺激产生更高含量的Ves v 5特异性抗体和更低含量的Pol a 5特异性抗体。
表3A对胡蜂抗原5s以及杂合体的小鼠抗体应答固相上通过ELISA测得的血清中特异IgG量(mg/ml)2，3免疫原EA-Pol a 5组 EAVesv5 杂合体AKR-Ves v 5 8.9(8.5) 0.6 -KR-Pol a 5 2.8(1.0) 7.0 -EA-PV1-155 12.0 0.7 -EA-PV1-46 4.2(3.5) 1.9 7.6(5.6)EA-PV1-18 1.0(0.8) 6.9 6.9(0.7)EA-PV156-2041.6(0.6) 10.0 2.6(0.3)EA-PV195-2041.3(0.4) 14.0 10.0(0.3)BKR-Vesv515.0(14.0)0.2 -KR-PV1-46 0.6(0.5) 1.0 2.7(3.0)EA-PV1-32 0.9(0.7) 4.3 8.0(3.2)KR-PV1-24 0.4(0.3) 4.2 6.5(0.9)EA-PV1-18 0.4(0.3) 4.5 5.3(0.7)
1.经3次两周一次的腹膜内免疫原注射后在第7周收集血清。A组和B组分别研究。
2.抗体浓度由使30分钟内吸光度变化为1.0所需的血清浓度倒数来估计。在所用条件下，这一变化相应于纯化的Ves v 5特异性抗体的0.1μg/ml溶液。所估计的抗体浓度在重复测量时变化约40％。
3.括号中的值为利用0.2mg/ml EA-Pol a 5对1/500稀释的血清进行吸附后获得的值。
表3A中的结果显示Ves v 5的B细胞表位在其N-端区域。制备另外的Ves v 5和Pol a 5的杂合体并按上述方法检验小鼠中的免疫原性，以勾绘显性B细胞表位区域的N和C-端界线。结果在表3B中给出，其列出了对Ves v、Pol a或杂合体特异的IgG1含量，以及在利用Pa吸附后残余的特异性IgG1的百分比。
具有最低Ves v含量的杂合体PV1-8并不引起Ves v特异性抗体应答。除PV22-32外，所有其它杂合体均诱导0.4-4.5mg/ml的Ves v特异性Ab。Ves v含量＜PV1-32的杂合体对Ves v应答具中等特异性，因为它们的Ves v特异性抗体的34-81％和它们的杂合体特异性抗体的15-27％没有被Pol a 5吸附。Ves v含量＞PV1-39的杂合体较为特异，因为它们的Ves v 5特异性抗体的66-96％和它们的杂合体特异性抗体的91-100％没有被Pol a 5吸附。这些结果一起说明，此显性表位区域的C-端界线在32-39位残基之间。
Ves v含量＜PV1-32的杂合体显示2-4mg/ml的Pol a特异性抗体，而Ves v含量＞PV1-39的杂合体显示0.04-1.34mg/ml的Pol a特异性抗体。随着杂合体的Ves v含量从PV1-32向1-76升高，Pol a特异性应答出现进行性下降。这些结果一起说明显性表位的C-端界线延伸超过第39位残基，正如对杂合体的Ves v特异性应答所揭示的。
与PV1-32的应答相比，PV1-8和22-32缺少Ves v特异性抗体应答，这揭示显性表位区域的N-端界线在9-21位残基之间。
表3B对胡蜂抗原5s以及杂合体的小鼠抗体应答Ves v 5特异性 杂合体特异性IgG1；构建体小鼠组别 IgG1％Ves vPol a 5特异性IgG1 ％Ves vPol a 5 1 1.80mg/ml；64％ 4.50mg/mlVes v 5 4 10.7±3.2mg/ml 0.2±0.1mg/ml104±15％PV1-8 1 08.2mg/mlPV1-184 0.6±0.44mg/ml； 4.1±2.0mg/ml 7.5±4.5mg/ml；68±14％27±26％PV1-242 0.35±0.06mg/ml；2.26±0.50mg/ml5.86±1.30mg/ml；81±17％20±12％PV1-323 0.52±0.39mg/ml；3.77±1.89mg/ml6.82±3.46mg/ml；34±25％15±6％PV1-392 4.45±0.70mg/ml；1.72±0.06mg/ml8.25±1/87mg/ml；89±27％76±23％PV1-463 2.29±3.41mg/ml；1.18±0.96mg/ml7.57±7.33mg/ml；86±14％91±9％PV1-501 1.01mg/ml；94％ 0.44mg/ml 11.22mg/ml；90％PV1-571 0.67mg/ml；96％ 0.22mg/ml 11.88mg/ml；85％PV1-761 1.32mg/ml；92％ 0.04mg/ml 11.88mg/ml；92％PV22-32 1 0.04mg/ml；0％ 4.88mg/ml 6.31mg/ml；6％数据来自1-4组每组4只小鼠的第7周血样的平均值％Ves v表示在利用Pol a5吸附以后抗体的含量实施例7 T细胞应答增殖试验利用来自用胡蜂抗原5或杂合体免疫的小鼠的脾细胞进行。在5次两周一次的免疫后10天，将来自2-3只小鼠的脾细胞汇合并一式三份用于试验。脾细胞(4×105个)与测试抗原在0.2ml培养基中37℃和5％CO2条件下培养。在第三天加入氚示踪的胸苷(1μCi)，并在第四天确定胸苷的摄入量。结果以刺激指数值表示。
结果显示，杂合体EA-PV1-46、EA-PV1-155和EA-PV156-204诱导杂合体特异性以及胡蜂抗原5特异性T细胞应答(表4)。数据显示当刺激抗原为免疫原时获得最好的增殖应答。这可以通过比较在所测试的最高抗原浓度100μg/ml时的最大刺激指数值以及通过比较刺激指数值为4时所需的最低抗原浓度而明显看出。
表4胡蜂抗原5或杂合体刺激小鼠脾细胞增殖刺激Ag脾细胞特异于 EA-Ves v5 EA-Pol a 5 杂合体在100μg/ml Ag下的刺激指数KR-Ves v5 8.21.5-KR-Pol a 5 2.26.3-EA-PV1-155 6.12.25.0EA-PV1-46 6.08.013.5EA-PV1-18 2.35.06.1EA-PV156-2044.14.26.8EA-PV195-2041.78.64.1刺激指数为4时的Ag量(μg/ml)KR-Ves v 5 2.6＞100 -KR-Pol a 5 ＞100 16 -EA-PV1-155 11 ＞100 0.54EA-PV1-46 20 2.20.26EA-PV1-18 ＞100 47 19EA-PV156-20460 70 2.3EA-PV195-204＞100 8 82脾细胞的背景增殖为400-900cpm的3H-胸苷摄入量。
实施例8 重组胡蜂Ag 5s以及杂合体在患者中的变应原性变应原性测定利用组胺释放试验来进行，所述测定在利用Ag5或杂合体对来自10个小黄蜂敏感患者的嗜碱性粒细胞进行攻击后进行(Colombo等人，1995，变态反应临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Imm.)95565)。在表5中显示的患者/结果被分成两组。A组患者(n＝7)对Ves v 5比对Pol a 5敏感约1000倍；而B组患者(n＝3)对两种抗原5s具有大约相同的敏感度。
表5杂合体的组胺释放数据总结相对于Ves v 5的倒数活性组A 组B变应原患者数 平均值 范围患者数 平均值范围Ves v 5 7 1 13 11Pol a 5 7 1154330-5500 3 0.7 0.2-2PV1-155 3 1 1-2 2 11PV1-46 5 126 13-3300 2 0.7 0.1-5PV1-18 3 583 12-5000 2 24 3.0-200PV22-32 3 32072000-50002 66-20PV115-1253 32072000-50002 52-15PV142-1503 30002700-50002 52-15PV156-2046 11391000-30003 30.4-70PV195-2043 320750-5000 2 32 20.0-50每一组中一位患者的完整数据在图11中给出。
在所测试的3个N-端杂合体中，EA-PV1-155并没有显示出变应原性的减少。EA-PV1-46和1-18在A组患者中分别显示126和583倍的几何平均减少，以及在B组患者中分别显示0.7和24倍的减少。两个C-端杂合体EA-PV156-204和195-204的减少在A组患者中分别为1139和3207倍，而在B组患者中分别为3和32倍。
N和C-端杂合体在变应原性上的不同减少程度反映了它们的IgE抗体浓度和它们的表位密度。图6中的抑制ELISA数据揭示对Ves v 5的N-端区域比对其C-端区域有更高的人IgG抗体浓度，并且对于IgE抗体可能也是如此。与N-端杂合体EA-PV1-46相比C-端杂合体EA-PV156-204在变应原性上减少更大，造成此现象的另一因子可能是EA-PV156-204具有减少的表位密度，因为此C-端杂合体比N-端杂合体具有更少的Ves v 5表面可及残基。类似地，较短的N或C-末端杂合体PV1-18或PV195-204与它们各自较长的杂合体相比具有更少的变应原性，这也反映了表位密度的影响。
将来自细菌的重组Ves v 5的变应原性与天然Ves v 5和来自酵母的重组Ves v 5的变应原性做一下比较。在测试的3个患者中，来自细菌的重组蛋白质比天然蛋白质和来自酵母的重组蛋白质的效力减少约103倍(数据未显示)。这些数据确认了以前的观察针对变应原的大部分B细胞表位依赖于天然变应原的构象(King等人，2000，Int Arch Allergy 12399)。
来自细菌的重组Ves v 5的变应原性下降是由于构象依赖性B细胞表位的丧失而致，因为来自细菌的重组蛋白质的CD光谱显示其具有无序结构。然而，杂合蛋白质PV1-46或PV156-204的变应原性下降却是由于Ves v 5特异性表位的数目和密度的减少所致，因为其CD光谱显示它具有与Ves v 5相似的有序结构。杂合体PV1-46和PV156-204的表位数目和密度的减少与实施例5-7中给出的B细胞表位和免疫原性数据一致。
实施例9 重组Ves v 5的结晶Ves v 5晶体利用蒸气扩散技术在25℃下生长。为形成晶体，5μl 5mg/ml的Ves v 5与5μl 18％PEG6000、0.1M柠檬酸钠(pH6.0)混和，并相对于1ml 18％PEG6000、0.1M柠檬酸钠(pH6.0)进行平衡。X射线衍射数据在100K从天然Ves v 5晶体和引入重金属衍生物后的晶体收集，并且利用所述数据解析Ves v 5三维结构。Ves v 5的原子座标和结构因子已经放入蛋白质数据库(PDB)，其登录号为Q05110。Ves v 5的原子座标在表6中给出。
表6Ves v 5晶体座标REMARK FILENAME＝″brefinement.pdb″REMARK r＝0.215955 free_r＝0.298202REMARK DATE28-Oct-98 15:45:46 created by useranetteATOM 1 CB GLU1 17.077 51.793 23.662 1.00 41.80 APEPATOM 2 CG GLU1 16.595 52.047 25.081 1.00 43.97 APEPATOM 3 CD GLU1 15.167 51.580 25.310 1.00 44.74 APEPATOM 4 OE1 GLU1 14.367 51.640 24.352 1.00 46.38 APEPATOM 5 OE2 GLU1 14.845 51.156 26.444 1.00 43.48 APEPATOM 6 CGLU1 19.169 50.429 23.664 1.00 39.72 APEPATOM 7 OGLU1 19.733 49.575 24.358 1.00 40.19 APEPATOM 8 NGLU1 17.005 49.431 24.404 1.00 41.50 APEPATOM 9 CA GLU1 17.655 50.391 23.458 1.00 40.85 APEPATOM 10 NALA2 19.820 51.423 23.064 1.00 37.33 APEPATOM 11 CA ALA2 21.267 51.571 23.179 1.00 34.17 APEPATOM 12 CB ALA2 21.668 51.735 24.657 1.00 34.25 APEPATOM 13 CALA2 21.935 50.341 22.585 1.00 32.32 APEPATOM 14 OALA2 21.299 49.580 21.847 1.00 33.01 APEPATOM 15 NGLU3 23.215 50.148 22.899 1.00 29.81 APEPATOM 16 CA GLU3 23.956 48.991 22.402 1.00 26.33 APEPATOM 17 CB GLU3 24.948 49.413 21.325 1.00 30.89 APEPATOM 18 CG GLU3 25.246 48.320 20.303 1.00 35.96 APEPATOM 19 CD GLU3 24.029 47.468 19.973 1.00 38.25 APEPATOM 20 OE1 GLU3 23.428 47.678 18.891 1.00 39.27 APEPATOM 21 OE2 GLU3 23.681 46.586 20.793 1.00 37.45 APEPATOM 22 CGLU3 24.693 48.269 23.530 1.00 21.89 APEPATOM 23 OGLU3 25.780 48.679 23.959 1.00 20.16 APEPATOM 24 NALA4 24.093 47.180 23.995 1.00 17.32 APEPATOM 25 CA ALA4 24.652 46.382 25.080 1.00 15.71 APEPATOM 26 CB ALA4 23.796 45.141 25.302 1.00 12.64 APEPATOM 27 CALA4 26.103 45.970 24.862 1.00 14.17 APEPATOM 28 OALA4 26.816 45.710 25.827 1.00 11.99 APEPATOM 29 NGLU5 26.542 45.908 23.603 1.00 12.66 APEPATOM 30 CA GLU5 27.917 45.503 23.319 1.00 13.51 APEPATOM 31 CB GLU5 28.222 45.583 21.817 1.00 15.08 APEPATOM 32 CG GLU5 29.647 45.127 21.479 1.00 20.49 APEPATOM 33 CD GLU5 30.068 45.447 20.049 1.00 22.60 APEPATOM 34 OE1 GLU5 29.224 45.948 19.278 1.00 24.69 APEPATOM 35 OE2 GLU5 31.245 45.199 19.699 1.00 23.87 APEPATOM 36 CGLU5 28.949 46.339 24.065 1.00 12.46 APEPATOM 37 OGLU5 30.025 45.847 24.394 1.00 12.28 APEPATOM 38 NPHE6 28.616 47.596 24.343 1.00 11.87 APEPATOM 39 CA PHE6 29.546 48.491 25.022 1.00 11.93 APEP
ATOM40 CB PHE6 29.459 49.879 24.377 1.00 12.32 APEPATOM41 CG PHE6 29.706 49.857 22.887 1.00 14.45 APEPATOM42 CD1 PHE6 28.646 49.803 21.997 1.00 14.86 APEPATOM43 CD2 PHE6 31.001 49.811 22.381 1.00 14.25 APEPATOM44 CE1 PHE6 28.870 49.698 20.623 1.00 15.78 APEPATOM45 CE2 PHE6 31.236 49.705 21.008 1.00 13.92 APEPATOM46 CZ PHE6 30.166 49.648 20.131 1.00 13.36 APEPATOM47 CPHE6 29.378 48.556 26.537 1.00 10.13 APEPATOM48 OPHE6 29.892 49.463 27.201 1.00 9.26 APEPATOM49 NASN7 28.658 47.568 27.066 1.00 10.89 APEPATOM50 CA ASN7 28.411 47.422 28.498 1.00 7.63 APEPATOM51 CB ASN7 27.040 46.786 28.750 1.00 6.94 APEPATOM52 CG ASN7 25.897 47.774 28.658 1.00 5.91 APEPATOM53 OD1 ASN7 26.049 48.953 28.962 1.00 6.68 APEPATOM54 ND2 ASN7 24.735 47.286 28.240 1.00 2.00 APEPATOM55 CASN7 29.477 46.428 28.929 1.00 8.03 APEPATOM56 OASN7 29.712 45.448 28.223 1.00 7.49 APEPATOM57 NASN8 30.126 46.663 30.066 1.00 7.97 APEPATOM58 CA ASN8 31.155 45.735 30.536 1.00 9.65 APEPATOM59 CB ASN8 32.193 46.469 31.384 1.00 11.85 APEPATOM60 CG ASN8 33.241 45.531 31.961 1.00 13.69 APEPATOM61 OD1 ASN8 33.493 44.459 31.415 1.00 12.11 APEPATOM62 ND2 ASN8 33.858 45.935 33.071 1.00 12.79 APEPATOM63 CASN8 30.553 44.586 31.350 1.00 10.91 APEPATOM64 OASN8 30.397 44.690 32.564 1.00 11.39 APEPATOM65 NTYR9 30.225 43.490 30.674 1.00 10.20 APEPATOM66 CA TYR9 29.631 42.331 31.328 1.00 9.11 APEPATOM67 CB TYR9 28.956 41.431 30.287 1.00 8.55 APEPATOM68 CG TYR9 27.727 42.054 29.689 1.00 6.89 APEPATOM69 CD1 TYR9 27.798 42.805 28.517 1.00 8.12 APEPATOM70 CE1 TYR9 26.668 43.423 27.991 1.00 9.63 APEPATOM71 CD2 TYR9 26.498 41.932 30.318 1.00 7.93 APEPATOM72 CE2 TYR9 25.362 42.543 29.806 1.00 9.55 APEPATOM73 CZ TYR9 25.452 43.286 28.646 1.00 10.64 APEPATOM74 OH TYR9 24.325 43.893 28.149 1.00 11.41 APEPATOM75 CTYR9 30.628 41.509 32.131 1.00 10.32 APEPATOM76 OTYR9 30.237 40.584 32.840 1.00 8.46 APEPATOM77 NCYS1031.912 41.834 32.017 1.00 11.72 APEPATOM78 CA CYS1032.934 41.098 32.750 1.00 13.13 APEPATOM79 CCYS1032.832 41.404 34.240 1.00 14.57 APEPATOM80 OCYS1033.565 40.835 35.051 1.00 14.20 APEPATOM81 CB CYS1034.329 41.471 32.242 1.00 14.59 APEPATOM82 SG CYS1034.747 40.862 30.569 1.00 13.90 APEPATOM83 NLYS1131.913 42.300 34.593 1.00 15.58 APEPATOM84 CA LYS1131.706 42.695 35.982 1.00 17.16 APEPATOM85 CB LYS1131.514 44.213 36.073 1.00 17.37 APEPATOM86 CG LYS1132.805 45.020 35.908 1.00 19.88 APEPATOM87 CD LYS1133.879 44.549 36.872 1.00 19.32 APEPATOM88 CE LYS1135.252 44.994 36.442 1.00 22.07 APEPATOM89 NZ LYS1136.148 43.824 36.212 1.00 26.09 APEPATOM90 CLYS1130.503 41.987 36.600 1.00 18.39 APEPATOM91 OLYS1130.330 41.990 37.822 1.00 18.93 APEPATOM92 NILE1229.676 41.382 35.748 1.00 17.37 APEPATOM93 CA ILE1228.488 40.662 36.197 1.00 17.54 APEPATOM94 CB ILE1227.522 40.348 35.011 1.00 15.92 APEPATOM95 CG2 ILE1226.347 39.507 35.497 1.00 14.62 APEPATOM96 CG1 ILE1227.033 41.645 34.353 1.00 14.71 APEP
ATOM97 CD1 ILE1226.197 42.543 35.246 1.00 14.44 APEPATOM98 CILE1228.902 39.331 36.817 1.00 18.50 APEPATOM99 OILE1229.884 38.728 36.401 1.00 19.73 APEPATOM100 NLYS1328.144 38.884 37.813 1.00 19.79 APEPATOM101 CA LYS1328.391 37.605 38.468 1.00 21.47 APEPATOM102 CB LYS1328.978 37.811 39.871 1.00 24.55 APEPATOM103 CG LYS1328.349 38.959 40.664 1.00 29.46 APEPATOM104 CD LYS1329.139 39.272 41.934 1.00 32.01 APEPATOM105 CE LYS1329.966 40.546 41.786 1.00 34.07 APEPATOM106 NZ LYS1330.867 40.516 40.591 1.00 34.69 APEPATOM107 CLYS1327.051 36.867 38.555 1.00 20.70 APEPATOM108 OLYS1326.050 37.433 38.976 1.00 19.96 APEPATOM109 NCYS1427.029 35.611 38.132 1.00 20.06 APEPATOM110 CA CYS1425.808 34.831 38.176 1.00 20.78 APEPATOM111 CCYS1425.741 34.062 39.482 1.00 22.64 APEPATOM112 OCYS1426.724 33.994 40.218 1.00 22.31 APEPATOM113 CB CYS1425.752 33.875 36.987 1.00 19.10 APEPATOM114 SG CYS1425.352 34.724 35.422 1.00 16.84 APEPATOM115 NLEU1524.577 33.492 39.775 1.00 24.99 APEPATOM116 CA LEU1524.400 32.746 41.015 1.00 27.03 APEPATOM117 CB LEU1522.953 32.251 41.138 1.00 27.78 APEPATOM118 CG LEU1522.054 32.963 42.152 1.00 28.08 APEPATOM119 CD1 LEU1520.699 32.269 42.194 1.00 28.30 APEPATOM120 CD2 LEU1522.699 32.953 43.535 1.00 27.17 APEPATOM121 CLEU1525.365 31.574 41.090 1.00 27.24 APEPATOM122 OLEU1526.065 31.402 42.088 1.00 28.76 APEPATOM123 NLYS1625.410 30.774 40.033 1.00 28.73 APEPATOM124 CA LYS1626.300 29.621 40.005 1.00 30.04 APEPATOM125 CB LYS1625.679 28.478 39.201 1.00 31.71 APEPATOM126 CG LYS1624.162 28.401 39.271 1.00 32.24 APEPATOM127 CD LYS1623.562 27.757 38.009 1.00 33.96 APEPATOM128 CE LYS1624.536 27.738 36.820 1.00 33.82 APEPATOM129 NZ LYS1623.828 27.604 35.515 1.00 33.08 APEPATOM130 CLYS1627.659 29.966 39.417 1.00 30.04 APEPATOM131 OLYS1628.442 29.071 39.092 1.00 31.31 APEPATOM132 NGLY1727.933 31.261 39.273 1.00 29.07 APEPATOM133 CA GLY1729.214 31.698 38.744 1.00 27.07 APEPATOM134 CGLY1729.410 31.553 37.243 1.00 26.38 APEPATOM135 OGLY1728.448 31.552 36.472 1.00 25.25 APEPATOM136 NGLY1830.670 31.428 36.831 1.00 25.19 APEPATOM137 CA GLY1830.983 31.294 35.420 1.00 22.24 APEPATOM138 CGLY1831.139 32.655 34.771 1.00 20.24 APEPATOM139 OGLY1830.510 33.622 35.195 1.00 21.83 APEPATOM140 NVAL1931.974 32.735 33.743 1.00 16.65 APEPATOM141 CA VAL1932.212 33.989 33.040 1.00 15.58 APEPATOM142 CB VAL1933.516 33.896 32.222 1.00 15.68 APEPATOM143 CG1 VAL1933.884 35.254 31.649 1.00 13.84 APEPATOM144 CG2 VAL1934.633 33.364 33.108 1.00 15.09 APEPATOM145 CVAL1931.045 34.361 32.115 1.00 14.11 APEPATOM146 OVAL1930.622 33.562 31.278 1.00 14.03 APEPATOM147 NHIS2030.528 35.577 32.265 1.00 11.37 APEPATOM148 CA HIS2029.410 36.020 31.444 1.00 11.65 APEPATOM149 CB HIS2029.094 37.493 31.704 1.00 12.93 APEPATOM150 CG HIS2027.721 37.900 31.264 1.00 13.85 APEPATOM151 CD2 HIS2026.597 38.156 31.974 1.00 15.96 APEPATOM152 ND1 HIS2027.392 38.102 29.941 1.00 15.59 APEPATOM153 CE1 HIS2026.126 38.466 29.853 1.00 15.25 APEP
ATOM154 NE2 HIS2025.620 38.506 31.072 1.00 17.34 APEPATOM155 CHIS2029.679 35.811 29.961 1.00 11.56 APEPATOM156 OHIS2030.783 36.054 29.467 1.00 9.12 APEPATOM157 NTHR2128.650 35.355 29.260 1.00 12.15 APEPATOM158 CA THR2128.739 35.090 27.828 1.00 12.76 APEPATOM159 CB THR2127.349 34.686 27.287 1.00 13.90 APEPATOM160 OG1 THR2127.016 33.387 27.792 1.00 14.96 APEPATOM161 CG2 THR2127.336 34.658 25.756 1.00 13.84 APEPATOM162 CTHR2129.294 36.278 27.025 1.00 12.07 APEPATOM163 OTHR2130.102 36.090 26.111 1.00 8.89 APEPATOM164 NALA2228.873 37.490 27.380 1.00 10.72 APEPATOM165 CA ALA2229.312 38.698 26.693 1.00 11.63 APEPATOM166 CB ALA2228.311 39.816 26.925 1.00 12.20 APEPATOM167 CALA2230.706 39.156 27.102 1.00 13.47 APEPATOM168 OALA2231.200 40.178 26.621 1.00 13.74 APEPATOM169 NCYS2331.332 38.410 28.006 1.00 14.12 APEPATOM170 CACYS2332.683 38.715 28.460 1.00 14.19 APEPATOM171 CCYS2333.564 37.670 27.793 1.00 12.16 APEPATOM172 OCYS2334.725 37.909 27.497 1.00 13.84 APEPATOM173 CB CYS2332.782 38.599 29.995 1.00 12.96 APEPATOM174 SG CYS2334.454 38.855 30.695 1.00 14.19 APEPATOM175 NLYS2432.987 36.501 27.561 1.00 13.18 APEPATOM176 CA LYS2433.697 35.405 26.917 1.00 14.00 APEPATOM177 CB LYS2432.894 34.109 27.048 1.00 13.62 APEPATOM178 CG LYS2433.111 33.347 28.334 1.00 13.30 APEPATOM179 CD LYS2432.593 31.929 28.193 1.00 14.90 APEPATOM180 CE LYS2431.656 31.540 29.311 1.00 15.48 APEPATOM181 NZ LYS2432.009 30.188 29.830 1.00 21.39 APEPATOM182 CLYS2433.853 35.742 25.446 1.00 13.93 APEPATOM183 OLYS2434.917 35.578 24.861 1.00 14.28 APEPATOM184 NTYR2532.767 36.219 24.857 1.00 16.64 APEPATOM185 CATYR2532.737 36.585 23.448 1.00 17.22 APEPATOM186 CB TYR2531.736 35.684 22.719 1.00 18.12 APEPATOM187 CG TYR2531.716 34.245 23.217 1.00 16.13 APEPATOM188 CD1 TYR2530.600 33.727 23.879 1.00 18.60 APEPATOM189 CE1 TYR2530.574 32.404 24.332 1.00 15.87 APEPATOM190 CD2 TYR2532.810 33.403 23.021 1.00 16.98 APEPATOM191 CE2 TYR2532.794 32.081 23.469 1.00 14.73 APEPATOM192 CZ TYR2531.677 31.590 24.120 1.00 16.64 APEPATOM193 OH TYR2531.661 30.283 24.566 1.00 19.74 APEPATOM194 CTYR2532.339 38.060 23.336 1.00 18.24 APEPATOM195 OTYR2531.155 38.404 23.332 1.00 17.58 APEPATOM196 NGLY2633.340 38.929 23.250 1.00 19.90 APEPATOM197 CA GLY2633.086 40.358 23.182 1.00 22.78 APEPATOM198 CGLY2632.536 40.927 21.886 1.00 25.12 APEPATOM199 OGLY2632.260 42.125 21.815 1.00 26.30 APEPATOM200 NSER2732.362 40.092 20.867 1.00 26.19 APEPATOM201 CA SER2731.855 40.570 19.583 1.00 26.72 APEPATOM202 CB SER2732.960 40.435 18.522 1.00 25.95 APEPATOM203 OG SER2732.457 40.041 17.259 1.00 24.78 APEPATOM204 CSER2730.586 39.839 19.139 1.00 26.86 APEPATOM205 OSER2730.159 38.878 19.774 1.00 25.87 APEPATOM206 NLEU2829.979 40.312 18.053 1.00 29.54 APEPATOM207 CA LEU2828.766 39.695 17.518 1.00 30.96 APEPATOM208 CB LEU2827.793 40.769 17.021 1.00 33.13 APEPATOM209 CG LEU2828.127 42.217 17.391 1.00 34.56 APEPATOM210 CD1 LEU2829.022 42.812 16.319 1.00 34.22 APEP
ATOM211 CD2 LEU2826.843 43.03017.551 1.00 34.12 APEPATOM212 CLEU2829.142 38.76916.365 1.00 30.72 APEPATOM213 OLEU2828.277 38.22415.673 1.00 31.18 APEPATOM214 NLYS2930.448 38.60216.176 1.00 30.29 APEPATOM215 CA LYS2931.008 37.75915.124 1.00 29.17 APEPATOM216 CB LYS2932.490 38.10214.937 1.00 31.20 APEPATOM217 CG LYS2933.016 37.86613.534 1.00 32.99 APEPATOM218 CD LYS2934.528 37.78513.521 1.00 34.25 APEPATOM219 CE LYS2935.150 39.12113.885 1.00 35.23 APEPATOM220 NZ LYS2935.686 39.09815.273 1.00 37.84 APEPATOM221 CLYS2930.867 36.26915.444 1.00 27.53 APEPATOM222 OLYS2931.446 35.77216.413 1.00 25.87 APEPATOM223 NPRO3030.104 35.53014.621 1.00 27.59 APEPATOM224 CD PRO3029.362 36.01113.442 1.00 26.03 APEPATOM225 CA PRO3029.905 34.09114.840 1.00 25.87 APEPATOM226 CB PRO3028.982 33.67513.694 1.00 25.48 APEPATOM227 CG PRO3028.330 34.94913.245 1.00 24.87 APEPATOM228 CPRO3031.182 33.25314.871 1.00 25.41 APEPATOM229 OPRO3032.061 33.40414.018 1.00 26.47 APEPATOM230 NASN3131.273 32.37615.866 1.00 22.04 APEPATOM231 CA ASN3132.407 31.46916.030 1.00 21.43 APEPATOM232 CB ASN3133.061 31.62317.413 1.00 21.58 APEPATOM233 CG ASN3133.840 32.91117.564 1.00 23.13 APEPATOM234 OD1 ASN3134.581 33.31916.672 1.00 23.71 APEPATOM235 ND2 ASN3133.680 33.55818.713 1.00 25.47 APEPATOM236 CASN3131.817 30.07115.944 1.00 19.60 APEPATOM237 OASN3131.743 29.36516.948 1.00 18.51 APEPATOM238 NCYS3231.384 29.66714.756 1.00 18.76 APEPATOM239 CA CYS3230.779 28.34814.605 1.00 18.03 APEPATOM240 CCYS3231.690 27.31013.975 1.00 17.09 APEPATOM241 OCYS3231.234 26.46413.207 1.00 13.04 APEPATOM242 CB CYS3229.493 28.45613.792 1.00 17.35 APEPATOM243 SG CYS3228.253 29.52814.570 1.00 16.28 APEPATOM244 NGLY3332.974 27.37914.311 1.00 19.59 APEPATOM245 CA GLY3333.942 26.43313.786 1.00 21.31 APEPATOM246 CGLY3333.914 26.26912.278 1.00 22.56 APEPATOM247 OGLY3333.985 27.25011.532 1.00 22.89 APEPATOM248 NASN3433.812 25.02111.830 1.00 22.35 APEPATOM249 CA ASN3433.787 24.72410.409 1.00 23.03 APEPATOM250 CB ASN3434.531 23.41010.136 1.00 26.79 APEPATOM251 CG ASN3433.754 22.18710.581 1.00 31.53 APEPATOM252 OD1 ASN3433.028 22.22111.579 1.00 35.39 APEPATOM253 ND2 ASN3433.908 21.0889.840 1.00 32.88 APEPATOM254 CASN3432.377 24.6829.821 1.00 22.38 APEPATOM255 OASN3432.193 24.3518.647 1.00 21.38 APEPATOM256 NLYS3531.377 25.02910.629 1.00 19.97 APEPATOM257 CA LYS3530.007 25.05310.133 1.00 17.88 APEPATOM258 CB LYS3529.011 25.16611.289 1.00 17.85 APEPATOM259 CG LYS3529.323 24.27712.482 1.00 19.14 APEPATOM260 CD LYS3528.050 23.84713.179 1.00 18.82 APEPATOM261 CE LYS3528.196 23.88414.689 1.00 18.39 APEPATOM262 NZ LYS3529.499 23.32915.115 1.00 18.61 APEPATOM263 CLYS3529.879 26.2819.235 1.00 16.90 APEPATOM264 OLYS3530.557 27.2849.453 1.00 16.79 APEPATOM265 NVAL3629.029 26.2028.218 1.00 16.21 APEPATOM266 CA VAL3628.831 27.3427.330 1.00 15.62 APEPATOM267 CB VAL3628.560 26.9165.872 1.00 15.89 APEP
ATOM268 CG1 VAL3628.474 28.1504.990 1.00 14.85 APEPATOM269 CG2 VAL3629.663 26.0005.374 1.00 17.84 APEPATOM270 CVAL3627.636 28.1497.820 1.00 13.37 APEPATOM271 OVAL3626.530 27.6317.949 1.00 11.50 APEPATOM272 NVAL3727.882 29.4228.095 1.00 13.37 APEPATOM273 CA VAL3726.857 30.3378.573 1.00 15.79 APEPATOM274 CB VAL3727.506 31.4509.424 1.00 16.40 APEPATOM275 CG1 VAL3726.487 32.5219.765 1.00 16.09 APEPATOM276 CG2 VAL3728.096 30.84710.681 1.00 13.21 APEPATOM277 CVAL3726.067 30.9717.422 1.00 16.67 APEPATOM278 OVAL3726.557 31.8736.738 1.00 18.09 APEPATOM279 NVAL3824.843 30.4927.211 1.00 16.92 APEPATOM280 CA VAL3823.991 31.0206.149 1.00 17.73 APEPATOM281 CB VAL3822.662 30.2296.051 1.00 15.03 APEPATOM282 CG1 VAL3821.770 30.8204.976 1.00 15.83 APEPATOM283 CG2 VAL3822.953 28.7785.740 1.00 17.06 APEPATOM284 CVAL3823.704 32.4806.486 1.00 17.90 APEPATOM285 OVAL3823.852 33.3725.645 1.00 18.01 APEPATOM286 NSER3923.305 32.7137.731 1.00 15.41 APEPATOM287 CA SER3923.019 34.0528.214 1.00 14.21 APEPATOM288 CB SER3921.857 34.6747.438 1.00 14.70 APEPATOM289 OG SER3920.721 33.8377.467 1.00 14.28 APEPATOM290 CSER3922.679 34.0069.700 1.00 14.75 APEPATOM291 OSER3922.636 32.93610.308 1.00 12.05 APEPATOM292 NTYR4022.444 35.17910.278 1.00 14.22 APEPATOM293 CA TYR4022.111 35.27211.686 1.00 14.10 APEPATOM294 CB TYR4023.397 35.17912.530 1.00 15.42 APEPATOM295 CG TYR4024.239 36.43812.583 1.00 14.41 APEPATOM296 CD1 TYR4023.921 37.47213.464 1.00 15.34 APEPATOM297 CE1 TYR4024.711 38.60513.563 1.00 16.41 APEPATOM298 CD2 TYR4025.375 36.57511.790 1.00 14.36 APEPATOM299 CE2 TYR4026.179 37.71211.879 1.00 17.60 APEPATOM300 CZ TYR4025.842 38.72312.771 1.00 18.38 APEPATOM301 OH TYR4026.639 39.84112.896 1.00 19.23 APEPATOM302 CTYR4021.360 36.56911.969 1.00 13.71 APEPATOM303 OTYR4021.456 37.52611.201 1.00 13.53 APEPATOM304 NGLY4120.602 36.59013.061 1.00 12.13 APEPATOM305 CA GLY4119.857 37.78313.418 1.00 13.27 APEPATOM306 CGLY4118.381 37.65613.102 1.00 13.46 APEPATOM307 OGLY4117.968 36.72612.419 1.00 14.55 APEPATOM308 NLEU4217.586 38.60113.590 1.00 12.94 APEPATOM309 CA LEU4216.150 38.58113.365 1.00 12.38 APEPATOM310 CB LEU4215.421 38.30214.676 1.00 11.85 APEPATOM311 CG LEU4215.462 36.85815.170 1.00 9.57 APEPATOM312 CD1 LEU4215.279 36.82816.682 1.00 10.07 APEPATOM313 CD2 LEU4214.374 36.06314.475 1.00 9.98 APEPATOM314 CLEU4215.651 39.89512.791 1.00 12.90 APEPATOM315 OLEU4216.066 40.96813.223 1.00 13.81 APEPATOM316 NTHR4314.758 39.80811.816 1.00 12.41 APEPATOM317 CA THR4314.200 41.00611.210 1.00 13.32 APEPATOM318 CB THR4313.412 40.6939.919 1.00 11.63 APEPATOM319 OG1 THR4312.195 40.02810.254 1.00 12.20 APEPATOM320 CG2 THR4314.222 39.8048.994 1.00 11.85 APEPATOM321 CTHR4313.249 41.63712.208 1.00 13.30 APEPATOM322 OTHR4312.801 40.99013.161 1.00 12.67 APEPATOM323 NLYS4412.939 42.90411.977 1.00 14.11 APEPATOM324 CA LYS4412.050 43.64012.851 1.00 14.99 APEP
ATOM325 CB LYS4411.975 45.10012.3791.00 16.22 APEPATOM326 CG LYS4410.594 45.66712.1521.00 18.80 APEPATOM327 CD LYS4410.567 47.15712.4891.00 19.36 APEPATOM328 CE LYS449.655 47.91511.5521.00 21.90 APEPATOM329 NZ LYS4410.430 48.71410.5701.00 20.87 APEPATOM330 CLYS4410.672 42.98512.9231.00 13.76 APEPATOM331 OLYS4410.083 42.91013.9991.00 14.04 APEPATOM332 NGLN4510.162 42.48711.7981.00 12.41 APEPATOM333 CA GLN458.84 9 41.83911.8061.00 11.51 APEPATOM334 CB GLN458.334 41.64610.3701.00 10.79 APEPATOM335 CG GLN457.063 40.81610.2461.00 10.70 APEPATOM336 CD GLN455.812 41.53810.7431.00 12.43 APEPATOM337 OE1 GLN455.696 42.76310.6501.00 12.72 APEPATOM338 NE2 GLN454.869 40.77211.2741.00 11.44 APEPATOM339 CGLN458.917 40.49612.5481.00 10.87 APEPAT0M340 OGLN457.987 40.12313.2671.00 9.48 APEPATOM341 NGLU4610.024 39.77912.3821.00 9.10 APEPATOM342 CA GLU4610.207 38.49613.0591.00 9.69 APEPATOM343 CB GLU4611.511 37.84512.6101.00 8.84 APEPATOM344 CG GLU4611.366 36.91611.4071.00 9.10 APEPATOM345 CD GLU4612.710 36.53410.8061.00 9.37 APEPATOM346 OE1 GLU4613.723 37.15811.1731.00 7.41 APEPATOM347 OE2 GLU4612.755 35.6079.966 1.00 10.21 APEPATOM348 CGLU4610.217 38.66614.5821.00 10.14 APEPATOM349 OGLU469.708 37.81715.3101.00 10.51 APEPATOM350 NLYS4710.807 39.76115.0571.00 10.08 APEPATOM351 CA LYS4710.865 40.04216.4861.00 9.91 APEPATOM352 CB LYS4711.675 41.31816.7491.00 9.24 APEPATOM353 CG LYS4713.167 41.19116.4591.00 7.94 APEPATOM354 CD LYS4713.906 42.50916.7101.00 9.13 APEPATOM355 CE LYS4715.411 42.36116.4981.00 11.45 APEPATOM356 NZ LYS4716.127 43.67516.4311.00 11.96 APEPATOM357 CLYS479.43 8 40.22916.9841.00 10.20 APEPATOM358 OLYS479.027 39.62617.9691.00 10.41 APEPATOM359 NGLN488.689 41.06516.2751.00 11.41 APEPATOM360 CA GLN487.299 41.36616.6021.00 11.75 APEPATOM361 CB GLN486.759 42.40915.6241.00 11.16 APEPATOM362 CG GLN485.254 42.60715.6691.00 12.11 APEPATOM363 CD GLN484.767 43.51514.5561.00 12.60 APEPATOM364 OE1 GLN485.301 44.60614.3591.00 10.04 APEPATOM365 NE2 GLN483.758 43.06513.8161.00 11.92 APEPATOM366 CGLN486.420 40.12316.5631.00 12.69 APEPATOM367 OGLN485.488 39.99317.3531.00 13.53 APEPATOM368 NASP496.716 39.21915.6331.00 12.63 APEPATOM369 CA ASP495.964 37.97715.4871.00 11.04 APEPATOM370 CB ASP496.290 37.32214.1441.00 14.99 APEPATOM371 CG ASP495.578 37.99012.9811.00 17.72 APEPATOM372 OD1 ASP494.518 38.62013.2001.00 18.74 APEPATOM373 OD2 ASP496.082 37.87811.8441.00 19.80 APEPATOM374 CASP496.285 36.99816.6151.00 9.65 APEPATOM375 OASP495.433 36.21117.0201.00 9.33 APEPATOM376 NILE507.519 37.03417.1071.00 8.25 APEPATOM377 CA ILE507.916 36.15218.2031.00 8.01 APEPATOM378 CB ILE509.454 36.13218.3871.00 7.72 APEPATOM379 CG2 ILE509.823 35.41619.6931.00 7.19 APEPATOM380 CG1 ILE5010.103 35.41017.2031.00 6.44 APEPATOM381 CD1 ILE5011.582 35.68717.0411.00 4.97 APEP
ATOM382 CILE507.256 36.621 19.499 1.00 8.14 APEPATOM383 OILE506.805 35.808 20.303 1.00 7.29 APEPATOM384 NLEU517.191 37.938 19.679 1.00 8.57 APEPATOM385 CA LEU516.571 38.529 20.854 1.00 9.76 APEPATOM386 CB LEU516.733 40.055 20.836 1.00 9.57 APEPATOM387 CG LEU516.509 40.844 22.139 1.00 12.08 APEPATOM388 CD1 LEU517.509 40.401 23.216 1.00 9.69 APEPATOM389 CD2 LEU516.659 42.333 21.861 1.00 10.85 APEPATOM390 CLEU515.091 38.172 20.863 1.00 10.95 APEPATOM391 OLEU514.571 37.664 21.861 1.00 12.16 APEPATOM392 NLYS524.423 38.427 19.739 1.00 10.41 APEPATOM393 CA LYS522.994 38.156 19.601 1.00 10.29 APEPATOM394 CB LYS522.520 38.535 18.196 1.00 10.94 APEPATOM395 CG LYS521.066 38.956 18.132 1.00 14.35 APEPATOM396 CD LYS520.258 38.029 17.236 1.00 16.34 APEPATOM397 CE LYS52-0.870 38.780 16.543 1.00 17.57 APEPATOM398 NZ LYS52-2.107 38.817 17.374 1.00 17.77 APEPATOM399 CLYS522.627 36.709 19.893 1.00 9.70 APEPATOM400 OLYS521.553 36.432 20.419 1.00 9.63 APEPATOM401 NGLU533.508 35.780 19.540 1.00 10.85 APEPATOM402 CA GLU533.249 34.366 19.799 1.00 11.95 APEPATOM403 CB GLU534.261 33.491 19.057 1.00 13.57 APEPATOM404 CG GLU533.957 31.996 19.089 1.00 15.51 APEPATOM405 CD GLU532.525 31.651 18.695 1.00 20.29 APEPATOM406 OE1 GLU531.876 32.439 17.971 1.00 21.72 APEPATOM407 OE2 GLU532.044 30.577 19.111 1.00 21.86 APEPATOM408 CGLU533.362 34.120 21.294 1.00 12.09 APEPATOM409 OGLU532.568 33.382 21.878 1.00 11.99 APEPATOM410 NHIS544.357 34.750 21.910 1.00 12.11 APEPATOM411 CA HIS544.580 34.610 23.340 1.00 11.34 APEPATOM412 CB HIS545.829 35.399 23.769 1.00 9.29 APEPATOM413 CG HIS547.089 34.584 23.817 1.00 7.76 APEPATOM414 CD2 HIS547.695 33.933 24.840 1.00 9.61 APEPATOM415 ND1 HIS547.895 34.394 22.716 1.00 6.60 APEPATOM416 CE1 HIS548.941 33.663 23.056 1.00 5.37 APEPATOM417 NE2 HIS548.844 33.370 24.340 1.00 7.30 APEPATOM418 CHIS543.365 35.143 24.092 1.00 10.89 APEPATOM419 OHIS542.844 34.492 24.983 1.00 10.22 APEPATOM420 NASN552.913 36.331 23.703 1.00 12.43 APEPATOM421 CA ASN551.784 36.982 24.356 1.00 13.65 APEPATOM422 CB ASN551.791 38.473 23.991 1.00 12.77 APEPATOM423 CG ASN552.950 39.232 24.655 1.00 12.31 APEPATOM424 OD1 ASN553.3 96 38.871 25.747 1.00 7.53 APEPATOM425 ND2 ASN553.436 40.280 23.993 1.00 9.40 APEPATOM426 CASN550.413 36.347 24.097 1.00 13.82 APEPATOM427 OASN55-0.457 36.355 24.973 1.00 13.31 APEPATOM428 NASP560.221 35.795 22.907 1.00 12.69 APEPATOM429 CA ASP56-1.036 35.134 22.572 1.00 12.59 APEPATOM430 CB ASP56-1.049 34.675 21.111 1.00 12.80 APEPATOM431 CG ASP56-1.359 35.787 20.143 1.00 13.37 APEPATOM432 OD1 ASP56-1.902 36.825 20.565 1.00 13.48 APEPATOM433 OD2 ASP56-1.059 35.615 18.945 1.00 15.39 APEPATOM434 CASP56-1.153 33.899 23.450 1.00 10.48 APEPATOM435 OASP56-2.224 33.577 23.953 1.00 10.14 APEPATOM436 NPHE57-0.046 33.191 23.604 1.00 9.15 APEPATOM437 CA PHE57-0.047 31.989 24.418 1.00 11.09 APEPATOM438 CB PHE571.272 31.227 24.252 1.00 12.68 APEP
ATOM439 CG PHE571.261 29.863 24.884 1.00 11.85 APEPATOM440 CD1 PHE570.346 28.899 24.471 1.00 12.69 APEPATOM441 CD2 PHE572.150 29.549 25.903 1.00 12.28 APEPATOM442 CE1 PHE570.316 27.642 25.067 1.00 11.80 APEPATOM443 CE2 PHE572.132 28.296 26.508 1.00 12.07 APEPATOM444 CZ PHE571.216 27.342 26.092 1.00 12.36 APEPATOM445 C PHE57-0.267 32.346 25.890 1.00 10.66 APEPATOM446 O PHE57-1.012 31.664 26.597 1.00 11.28 APEPATOM447 N ARG580.360 33.423 26.349 1.00 8.83 APEPATOM448 CA ARG580.204 33.830 27.738 1.00 10.25 APEPATOM449 CB ARG581.107 35.024 28.057 1.00 7.50 APEPATOM450 CG ARG582.483 34.615 28.530 1.00 7.56 APEPATOM451 CD ARG583.478 35.755 28.446 1.00 7.29 APEPATOM452 NE ARG583.391 36.649 29.601 1.00 8.58 APEPATOM453 CZ ARG584.025 36.450 30.750 1.00 7.65 APEPATOM454 NH1 ARG584.797 35.388 30.908 1.00 8.61 APEPATOM455 NH2 ARG583.892 37.318 31.738 1.00 9.84 APEPATOM456 C ARG58-1.246 34.170 28.032 1.00 9.76 APEPATOM457 O ARG58-1.793 33.733 29.042 1.00 11.57 APEPATOM458 N GLN59-1.874 34.932 27.141 1.00 10.78 APEPATOM459 CA GLN59-3.270 35.321 27.314 1.00 9.25 APEPATOM460 CB GLN59-3.621 36.464 26.368 1.00 11.30 APEPATOM461 CG GLN59-3.388 37.870 26.937 1.00 14.86 APEPATOM462 CD GLN59-3.254 37.924 28.457 1.00 15.40 APEPATOM463 OE1 GLN59-2.306 38.508 28.976 1.00 20.39 APEPATOM464 NE2 GLN59-4.203 37.328 29.171 1.00 16.19 APEPATOM465 C GLN59-4.233 34.156 27.107 1.00 8.85 APEPATOM466 O GLN59-5.275 34.084 27.753 1.00 8.65 APEPATOM467 N LYS60-3.900 33.240 26.209 1.00 9.28 APEPATOM468 CA LYS60-4.765 32.084 25.999 1.00 9.29 APEPATOM469 CB LYS60-4.190 31.170 24.919 1.00 11.77 APEPATOM470 CG LYS60-5.097 29.999 24.555 1.00 12.61 APEPATOM471 CD LYS60-4.357 28.678 24.660 1.00 12.86 APEPATOM472 CE LYS60-3.849 28.205 23.310 1.00 10.33 APEPATOM473 NZ LYS60-4.535 26.970 22.830 1.00 12.74 APEPATOM474 C LYS60-4.840 31.329 27.320 1.00 9.51 APEPATOM475 O LYS60-5.922 31.017 27.816 1.00 7.72 APEPATOM476 N ILE61-3.671 31.049 27.887 1.00 9.04 APEPATOM477 CA ILE61-3.570 30.348 29.161 1.00 9.87 APEPATOM478 CB ILE61-2.075 30.101 29.536 1.00 10.78 APEPATOM479 CG2 ILE61-1.970 29.598 30.973 1.00 10.13 APEPATOM480 CG1 ILE61-1.428 29.152 28.507 1.00 9.94 APEPATOM481 CD1 ILE61-1.212 27.720 28.980 1.00 10.64 APEPATOM482 C ILE61-4.254 31.141 30.283 1.00 9.04 APEPATOM483 O ILE61-4.980 30.571 31.092 1.00 9.20 APEPATOM484 N ALA62-4.041 32.454 30.314 1.00 8.91 APEPATOM485 CA ALA62-4.628 33.308 31.350 1.00 9.06 APEPATOM486 CB ALA62-4.090 34.729 31.209 1.00 5.84 APEPATOM487 C ALA62-6.165 33.327 31.363 1.00 11.19 APEPATOM488 O ALA62-6.794 33.581 32.397 1.00 12.79 APEPATOM489 N ARG63-6.769 33.053 30.214 1.00 12.40 APEPATOM490 CA ARG63-8.219 33.050 30.096 1.00 10.93 APEPATOM491 CB ARG63-8.618 33.627 28.736 1.00 10.77 APEPATOM492 CG ARG63-8.043 35.012 28.505 1.00 12.79 APEPATOM493 CD ARG63-8.608 35.684 27.278 1.00 15.66 APEPATOM494 NE ARG63-7.868 36.904 26.968 1.00 17.96 APEPATOM495 CZ ARG63-7.346 37.179 25.777 1.00 20.00 APEP
ATOM496 NH1 ARG63-7.483 36.321 24.7721.00 19.36 APEPATOM497 NH2 ARG63-6.679 38.313 25.5901.00 22.72 APEPATOM498 C ARG63-8.827 31.661 30.2851.00 10.92 APEPATOM499 O ARG63-10.036 31.489 30.1791.00 12.37 APEPATOM500 N GLY64-7.986 30.677 30.5751.00 12.22 APEPATOM501 CA GLY64-8.475 29.325 30.7801.00 11.71 APEPATOM502 C GLY64-8.985 28.685 29.5091.00 13.26 APEPATOM503 O GLY64-9.950 27.911 29.5401.00 14.03 APEPATOM504 N LEU65-8.331 28.998 28.3911.00 11.24 APEPATOM505 CA LEU65-8.711 28.463 27.0951.00 10.84 APEPATOM506 CB LEU65-8.747 29.581 26.0441.00 10.48 APEPATOM507 CG LEU65-9.602 30.803 26.3961.00 8.01 APEPATOM508 CD1 LEU65-9.278 31.946 25.4701.00 13.03 APEPATOM509 CD2 LEU65-11.074 30.450 26.2911.00 10.77 APEPATOM510 C LEU65-7.764 27.361 26.6441.00 12.39 APEPATOM511 O LEU65-7.998 26.719 25.6251.00 12.90 APEPATOM512 N GLU66-6.686 27.147 27.3871.00 11.27 APEPATOM513 CA GLU66-5.754 26.094 27.0231.00 12.09 APEPATOM514 CB GLU66-4.365 26.361 27.6101.00 11.39 APEPATOM515 CG GLU66-3.327 25.308 27.2451.00 12.91 APEPATOM516 CD GLU66-3.362 24.941 25.7741.00 13.85 APEPATOM517 OE1 GLU66-2.689 25.629 24.9881.00 18.33 APEPATOM518 OE2 GLU66-4.054 23.971 25.4011.00 12.27 APEPATOM519 C GLU66-6.323 24.799 27.5751.00 12.38 APEPATOM520 O GLU66-6.214 24.512 28.7641.00 12.85 APEPATOM521 N THR67-6.943 24.022 26.6961.00 13.75 APEPATOM522 CA THR67-7.553 22.769 27.0911.00 13.16 APEPATOM523 CB THR67-8.562 22.295 26.0181.00 13.92 APEPATOM524 OG1 THR67-7.858 21.894 24.8301.00 14.81 APEPATOM525 CG2 THR67-9.524 23.413 25.6711.00 11.42 APEPATOM526 C THR67-6.548 21.652 27.3681.00 13.63 APEPATOM527 O THR67-6.875 20.682 28.0491.0O 14.84 APEPATOM528 N ARG68-5.326 21.793 26.8611.00 13.12 APEPATOM529 CA ARG68-4.301 20.770 27.0421.00 11.47 APEPATOM530 CB ARG68-3.222 20.914 25.9671.00 13.83 APEPATOM531 CG ARG68-3.715 20.741 24.5381.00 13.10 APEPATOM532 CD ARG68-2.626 21.128 23.5421.00 13.89 APEPATOM533 NE ARG68-2.317 22.556 23.5901.00 12.94 APEPATOM534 CZ ARG68-1.244 23.111 23.0331.00 11.20 APEPATOM535 NH1 ARG68-0.372 22.351 22.3831.00 10.56 APEPATOM536 NH2 ARG68-1.042 24.420 23.1351.00 5.87 APEPATOM537 C ARG68-3.631 20.746 28.4151.00 11.74 APEPATOM538 O ARG68-3.420 21.789 29.0321.00 10.94 APEPATOM539 N GLY69-3.295 19.536 28.8671.00 11.61 APEPATOM540 CA GLY69-2.641 19.334 30.1471.00 14.23 APEPATOM541 C GLY69-2.565 17.857 30.5181.00 16.11 APEPATOM542 O GLY69-2.998 17.001 29.7471.00 16.74 APEPATOM543 N ASN70-2.006 17.551 31.6871.00 16.09 APEPATOM544 CA ASN70-1.896 16.172 32.1561.00 17.23 APEPATOM545 CB ASN70-0.439 15.704 32.1321.00 18.05 APEPATOM546 CG ASN70-0.310 14.203 32.2911.00 20.68 APEPATOM547 OD1 ASN70-1.204 13.452 31.8941.00 20.26 APEPATOM548 ND2 ASN700.80613.752 32.8741.00 20.67 APEPATOM549 C ASN70-2.452 16.025 33.5781.00 16.86 APEPATOM550 O ASN70-1.717 15.739 34.5231.00 15.70 APEPATOM551 N PRO71-3.770 16.204 33.7381.00 16.37 APEPATOM552 CD PRO71-4.467 16.046 35.0261.00 16.71 APEP
ATOM553 CA PRO71-4.713 16.522 32.663 1.00 16.24 APEPATOM554 CB PRO71-5.962 15.777 33.086 1.00 16.30 APEPATOM555 CG PRO71-5.928 15.906 34.614 1.00 16.81 APEPATOM556 C PRO71-4.999 18.012 32.491 1.00 16.23 APEPATOM557 O PRO71-4.638 18.837 33.338 1.00 16.06 APEPATOM558 N GLY72-5.666 18.342 31.392 1.00 13.86 APEPATOM559 CA GLY72-6.042 19.720 31.143 1.00 14.67 APEPATOM560 C GLY72-7.437 19.902 31.716 1.00 14.79 APEPATOM561 O GLY72-8.030 18.935 32.192 1.00 16.06 APEPATOM562 N PRO73-8.000 21.115 31.695 1.00 13.41 APEPATOM563 CD PRO73-9.343 21.354 32.253 1.00 13.38 APEPATOM564 CA PRO73-7.412 22.347 31.164 1.00 14.44 APEPATOM565 CB PRO73-8.621 23.250 30.976 1.00 13.74 APEPATOM566 CG PRO73-9.519 22.850 32.113 1.00 12.91 APEPATOM567 C PRO73-6.412 22.977 32.129 1.00 13.52 APEPATOM568 O PRO73-6.271 22.537 33.268 1.00 13.30 APEPATOM569 N GLN74-5.713 24.004 31.658 1.00 12.54 APEPATOM570 CA GLN74-4.782 24.723 32.506 1.00 11.28 APEPATOM571 CB GLN74-3.708 25.433 31.672 1.00 10.31 APEPATOM572 CG GLN74-2.658 24.505 31.043 1.00 9.27 APEPATOM573 CD GLN74-2.070 23.484 32.024 1.00 12.07 APEPATOM574 OE1 GLN74-1.558 23.838 33.087 1.00 10.98 APEPATOM575 NE2 GLN74-2.137 22.210 31.654 1.00 12.44 APEPATOM576 C GLN74-5.707 25.736 33.170 1.00 11.59 APEPATOM577 O GLN74-6.710 26.139 32.579 1.00 12.75 APEPATOM578 N PRO75-5.393 26.158 34.401 1.00 10.76 APEPATOM579 CD PRO75-4.230 25.770 35.221 1.00 10.45 APEPATOM580 CA PRO75-6.254 27.128 35.092 1.00 10.89 APEPATOM581 CB PRO75-5.876 26.948 36.561 1.00 10.78 APEPATOM582 CG PRO75-4.430 26.540 36.515 1.00 9.92 APEPATOM583 C PRO75-6.077 28.571 34.642 1.00 10.22 APEPATOM584 O PRO75-5.017 28.955 34.170 1.00 11.44 APEPATOM585 N PRO76-7.123 29.394 34.782 1.00 11.88 APEPATOM586 CD PRO76-8.461 29.107 35.327 1.00 13.85 APEPATOM587 CA PRO76-6.968 30.791 34.365 1.00 13.97 APEPATOM588 CB PRO76-8.383 31.373 34.440 1.00 12.73 APEPATOM589 CG PRO76-9.284 30.245 34.830 1.00 14.35 APEPATOM590 C PRO76-6.000 31.507 35.315 1.00 14.80 APEPATOM591 O PRO76-5.672 30.987 36.382 1.00 14.45 APEPATOM592 N ALA77-5.553 32.697 34.930 1.00 15.36 APEPATOM593 CA ALA77-4.617 33.458 35.745 1.00 16.81 APEPATOM594 CB ALA77-3.264 33.531 35.050 1.00 15.29 APEPATOM595 C ALA77-5.111 34.864 36.034 1.00 18.21 APEPATOM596 O ALA77-5.946 35.414 35.315 1.00 18.77 APEPATOM597 N LYS78-4.578 35.447 37.095 1.00 19.69 APEPATOM598 CA LYS78-4.944 36.799 37.487 1.00 21.45 APEPATOM599 CB LYS78-5.453 36.779 38.934 1.00 19.28 APEPATOM600 CG LYS78-5.408 38.109 39.658 1.00 21.07 APEPATOM601 CD LYS78-5.939 37.969 41.078 1.00 22.93 APEPATOM602 CE LYS78-7.039 38.993 41.380 1.00 22.07 APEPATOM603 NZ LYS78-8.416 38.442 41.192 1.00 18.83 APEPATOM604 C LYS78-3.681 37.655 37.351 1.00 20.82 APEPATOM605 O LYS78-3.735 38.825 36.973 1.00 22.49 APEPATOM606 N ASN79-2.546 37.024 37.632 1.00 20.62 APEPATOM607 CA ASN79-1.225 37.650 37.596 1.00 20.96 APEPATOM608 CB ASN79-0.322 36.893 38.591 1.00 21.73 APEPATOM609 CG ASN790.895 37.696 39.041 1.00 26.41 APEP
ATOM610 OD1 ASN791.739 37.194 39.794 1.00 27.31 APEPATOM611 ND2 ASN790.995 38.941 38.586 1.00 30.92 APEPATOM612 C ASN79-0.570 37.649 36.199 1.00 20.23 APEPATOM613 O ASN790.658 37.679 36.109 1.00 20.51 APEPATOM614 N MET80-1.354 37.648 35.117 1.00 17.31 APEPATOM615 CA MET80-0.745 37.581 33.783 1.00 16.95 APEPATOM616 CB MET80-1.334 36.398 33.014 1.00 14.01 APEPATOM617 CG MET80-0.475 35.941 31.848 1.00 10.95 APEPATOM618 SD MET801.001 35.032 32.360 1.00 10.66 APEPATOM619 CE MET800.309 33.392 32.631 1.00 9.65 APEPATOM620 C MET80-0.743 38.809 32.863 1.00 17.13 APEPATOM621 O MET80-1.785 39.236 32.377 1.00 17.76 APEPATOM622 N LYS810.450 39.343 32.602 1.00 16.19 APEPATOM623 CA LYS810.621 40.509 31.734 1.00 15.79 APEPATOM624 CB LYS811.360 41.626 32.480 1.00 19.28 APEPATOM625 CG LYS810.485 42.479 33.376 1.00 23.64 APEPATOM626 CD LYS811.283 42.976 34.581 1.00 29.37 APEPATOM627 CE LYS810.652 42.551 35.914 1.00 30.79 APEPATOM628 NZ LYS811.639 41.850 36.794 1.00 31.43 APEPATOM629 C LYS811.428 40.135 30.489 1.00 15.20 APEPATOM630 O LYS812.144 39.133 30.478 1.00 13.27 APEPATOM631 N ASN821.317 40.947 29.445 1.00 14.40 APEPATOM632 CA ASN822.047 40.695 28.214 1.00 14.06 APEPATOM633 CB ASN821.442 41.492 27.059 1.00 15.84 APEPATOM634 CG ASN820.081 40.970 26.636 1.00 19.06 APEPATOM635 OD1 ASN82-0.837 41.746 26.366 1.00 20.37 APEPATOM636 ND2 ASN82-0.058 39.649 26.579 1.00 20.55 APEPATOM637 C ASN823.496 41.107 28.400 1.00 11.87 APEPATOM638 O ASN823.800 41.968 29.226 1.00 11.67 APEPATOM639 N LEU834.384 40.483 27.633 1.00 10.14 APEPATOM640 CA LEU835.809 40.789 27.684 1.00 9.10 APEPATOM641 CB LEU836.648 39.577 27.272 1.00 9.30 APEPATOM642 CG LEU836.373 38.230 27.935 1.00 9.01 APEPATOM643 CD1 LEU837.077 37.119 27.178 1.00 10.20 APEPATOM644 CD2 LEU836.843 38.283 29.378 1.00 10.62 APEPATOM645 C LEU836.104 41.919 26.718 1.00 7.69 APEPATOM646 O LEU835.285 42.254 25.866 1.00 7.01 APEPATOM647 N VAL847.277 42.516 26.878 1.00 7.90 APEPATOM648 CA VAL847.736 43.585 26.004 1.00 9.09 APEPATOM649 CB VAL847.888 44.947 26.765 1.00 9.60 APEPATOM650 CG1 VAL846.511 45.476 27.152 1.00 11.40 APEPATOM651 CG2 VAL848.753 44.788 28.003 1.00 8.85 APEPATOM652 C VAL849.088 43.110 25.479 1.00 8.16 APEPATOM653 O VAL849.720 42.245 26.086 1.00 7.18 APEPATOM654 N TRP859.524 43.637 24.343 1.00 9.08 APEPATOM655 CA TRP8510.807 43.222 23.801 1.00 8.24 APEPATOM656 CB TRP8510.844 43.412 22.283 1.00 7.78 APEPATOM657 CG TRP8512.054 42.789 21.623 1.00 7.96 APEPATOM658 CD2 TRP8512.162 41.460 21.092 1.00 6.06 APEPATOM659 CE2 TRP8513.459 41.330 20.544 1.00 5.27 APEPATOM660 CE3 TRP8511.290 40.366 21.023 1.00 5.63 APEPATOM661 CD1 TRP8513.260 43.392 21.384 1.00 6.75 APEPATOM662 NE1 TRP8514.104 42.522 20.737 1.00 5.69 APEPATOM663 CZ2 TRP8513.905 40.153 19.935 1.00 5.15 APEPATOM664 CZ3 TRP8511.736 39.192 20.414 1.00 3.85 APEPATOM665 CH2 TRP8513.035 39.099 19.879 1.00 3.87 APEPATOM666 C TRP8511.928 44.018 24.451 1.00 9.70 APEP
ATOM667 O TRP8511.790 45.214 24.713 1.00 12.63 APEPATOM668 N ASN8613.036 43.340 24.722 1.00 9.17 APEPATOM669 CA ASN8614.191 43.980 25.340 1.00 8.03 APEPATOM670 CB ASN8614.399 43.407 26.748 1.00 4.83 APEPATOM671 CG ASN8615.484 44.121 27.505 1.00 5.77 APEPATOM672 OD1 ASN8616.657 43.826 27.332 1.00 5.23 APEPATOM673 ND2 ASN8615.100 45.070 28.349 1.00 6.46 APEPATOM674 C ASN8615.450 43.789 24.474 1.00 7.66 APEPATOM675 O ASN8615.885 42.667 24.215 1.00 6.17 APEPATOM676 N ASP8716.028 44.899 24.030 1.00 8.98 APEPATOM677 CA ASP8717.213 44.866 23.179 1.00 9.94 APEPATOM678 CB ASP8717.548 46.278 22.695 1.00 10.21 APEPATOM679 CG ASP8716.602 46.757 21.622 1.00 9.93 APEPATOM680 OD1 ASP8716.065 45.902 20.901 1.00 10.59 APEPATOM681 OD2 ASP8716.392 47.980 21.498 1.00 11.15 APEPATOM682 C ASP8718.445 44.249 23.827 1.00 11.13 APEPATOM683 O ASP8719.271 43.651 23.141 1.00 11.97 APEPATOM684 N GLU8818.576 44.395 25.142 1.00 9.78 APEPATOM685 CA GLU8819.728 43.836 25.838 1.00 10.33 APEPATOM686 CB GLU8819.841 44.422 27.255 1.00 12.21 APEPATOM687 CG GLU8821.210 44.213 27.888 1.00 9.98 APEPATOM688 CD GLU8821.204 44.400 29.390 1.00 9.88 APEPATOM689 OE1 GLU8820.125 44.660 29.957 1.00 13.29 APEPATOM690 OE2 GLU8822.282 44.289 30.010 1.00 9.90 APEPATOM691 C GLU8819.660 42.314 25.912 1.00 9.04 APEPATOM692 O GLU8820.651 41.629 25.658 1.00 8.42 APEPATOM693 N LEU8918.491 41.789 26.269 1.00 8.21 APEPATOM694 CA LEU8918.305 40.343 26.367 1.00 7.65 APEPATOM695 CB LEU8916.881 40.016 26.824 1.00 7.64 APEPATOM696 CG LEU8916.499 40.394 28.254 1.00 6.63 APEPATOM697 CD1 LEU8915.111 39.904 28.549 1.00 5.53 APEPATOM698 CD2 LEU8917.487 39.785 29.237 1.00 7.49 APEPATOM699 C LEU8918.554 39.719 24.997 1.00 8.92 APEPATOM700 O LEU8919.214 38.689 24.885 1.00 7.56 APEPATOM701 N ALA9018.010 40.357 23.964 1.00 8.77 APEPATOM702 CA ALA9018.162 39.902 22.588 1.00 9.89 APEPATOM703 CB ALA9017.406 40.830 21.654 1.00 6.21 APEPATOM704 C ALA9019.640 39.849 22.197 1.00 9.83 APEPATOM705 O ALA9020.064 38.940 21.491 1.00 10.34 APEPATOM706 N TYR9120.415 40.821 22.672 1.00 10.22 APEPATOM707 CA TYR9121.846 40.894 22.380 1.00 10.21 APEPATOM708 CB TYR9122.426 42.203 22.921 1.00 11.27 APEPATOM709 CG TYR9123.921 42.329 22.730 1.00 13.72 APEPATOM710 CD1 TYR9124.458 42.653 21.487 1.00 14.77 APEPATOM711 CE1 TYR9125.837 42.747 21.301 1.00 16.40 APEPATOM712 CD2 TYR9124.802 42.104 23.788 1.00 14.30 APEPATOM713 CE2 TYR9126.178 42.195 23.614 1.00 14.06 APEPATOM714 CZ TYR9126.688 42.516 22.370 1.00 18.00 APEPATOM715 OH TYR9128.052 42.608 22.191 1.00 18.78 APEPATOM716 C TYR9122.620 39.714 22.967 1.00 11.02 APEPATOM717 O TYR9123.411 39.077 22.279 1.00 11.79 APEPATOM718 N VAL9222.397 39.432 24.244 1.00 10.38 APEPATOM719 CA VAL9223.075 38.325 24.903 1.00 8.66 APEPATOM720 CB VAL9222.785 38.319 26.427 1.00 8.13 APEPATOM721 CG1 VAL9223.488 37.142 27.095 1.00 5.04 APEPATOM722 CG2 VAL9223.267 39.622 27.046 1.00 6.97 APEPATOM723 C VAL9222.634 37.002 24.286 1.00 9.57 APEP
ATOM724 O VAL9223.418 36.063 24.194 1.00 10.64 APEPATOM725 N ALA9321.376 36.933 23.858 1.00 9.31 APEPATOM726 CA ALA9320.854 35.722 23.238 1.00 9.67 APEPATOM727 CB ALA9319.349 35.848 23.030 1.00 8.26 APEPATOM728 C ALA9321.561 35.489 21.898 1.00 9.72 APEPATOM729 O ALA9321.954 34.366 21.581 1.00 10.89 APEPATOM730 N GLN9421.730 36.565 21.130 1.00 8.57 APEPATOM731 CA GLN9422.386 36.515 19.828 1.00 6.19 APEPATOM732 CB GLN9422.316 37.892 19.162 1.00 7.13 APEPATOM733 CG GLN9422.606 37.891 17.668 1.00 6.55 APEPATOM734 CD GLN9421.778 36.875 16.911 1.00 6.86 APEPATOM735 OE1 GLN9420.551 37.018 16.775 1.00 7.69 APEPATOM736 NE2 GLN9422.441 35.836 16.412 1.00 4.45 APEPATOM737 C GLN9423.843 36.082 19.946 1.00 7.41 APEPATOM738 O GLN9424.302 35.217 19.203 1.00 8.55 APEPATOM739 N VAL9524.574 36.699 20.868 1.00 7.81 APEPATOM740 CA VAL9525.971 36.357 21.089 1.00 6.18 APEPATOM741 CB VAL9526.551 37.112 22.327 1.00 8.06 APEPATOM742 CG1 VAL9527.899 36.523 22.728 1.00 8.13 APEPATOM743 CG2 VAL9526.716 38.583 22.011 1.00 7.34 APEPATOM744 C VAL9526.091 34.855 21.324 1.00 7.07 APEPATOM745 O VAL9526.949 34.199 20.737 1.00 3.91 APEPATOM746 N TRP9625.224 34.312 22.180 1.00 8.26 APEPATOM747 CA TRP9625.244 32.879 22.494 1.00 8.88 APEPATOM748 CB TRP9624.284 32.555 23.650 1.00 6.54 APEPATOM749 CG TRP9624.258 31.089 24.030 1.00 7.96 APEPATOM750 CD2 TRP9625.390 30.232 24.240 1.00 7.64 APEPATOM751 CE2 TRP9624.892 28.946 24.549 1.00 7.17 APEPATOM752 CE3 TRP9626.778 30.426 24.197 1.00 8.39 APEPATOM753 CD1 TRP9623.150 30.305 24.217 1.00 8.48 APEPATOM754 NE1 TRP9623.524 29.016 24.527 1.00 5.50 APEPATOM755 CZ2 TRP9625.734 27.859 24.812 1.00 6.91 APEPATOM756 CZ3 TRP9627.614 29.341 24.459 1.00 8.97 APEPATOM757 CH2 TRP9627.087 28.076 24.761 1.00 8.90 APEPATOM758 C TRP9624.867 32.033 21.281 1.00 8.85 APEPATOM759 O TRP9625.500 31.011 21.007 1.00 8.27 APEPATOM760 N ALA9723.827 32.453 20.566 1.00 7.57 APEPATOM761 CA ALA9723.390 31.721 19.381 1.00 9.88 APEPATOM762 CB ALA9722.182 32.415 18.742 1.00 4.36 APEPATOM763 C ALA9724.547 31.665 18.387 1.00 8.40 APEPATOM764 O ALA9724.777 30.647 17.734 1.00 8.69 APEPATOM765 N ASN9825.282 32.767 18.300 1.00 9.32 APEPATOM766 CA ASN9826.402 32.883 17.375 1.00 9.40 APEPATOM767 CB ASN9826.898 34.336 17.347 1.00 8.07 APEPATOM768 CG ASN9826.084 35.217 16.402 1.00 8.00 APEPATOM769 OD1 ASN9825.093 34.776 15.821 1.00 11.11 APEPATOM770 ND2 ASN9826.500 36.464 16.250 1.00 9.71 APEPATOM771 C ASN9827.568 31.926 17.647 1.00 9.78 APEPATOM772 O ASN9828.524 31.874 16.869 1.00 8.97 APEPATOM773 N GLN9927.492 31.160 18.733 1.00 8.27 APEPATOM774 CA GLN9928.556 30.212 19.051 1.00 9.27 APEPATOM775 CB GLN9928.774 30.120 20.572 1.00 10.68 APEPATOM776 CG GLN9929.117 31.452 21.241 1.00 9.08 APEPATOM777 CD GLN9930.119 32.266 20.444 1.00 10.60 APEPATOM778 OE1 GLN9931.195 31.780 20.107 1.00 11.69 APEPATOM779 NE2 GLN9929.772 33.511 20.146 1.00 12.17 APEPATOM780 C GLN9928.205 28.839 18.484 1.00 10.52 APEP
ATOM781 O GLN99 29.049 27.942 18.426 1.00 11.67 APEPATOM782 N CYS10026.959 28.690 18.047 1.00 11.03 APEPATOM783 CA CYS10026.474 27.439 17.470 1.00 12.62 APEPATOM784 C CYS10026.711 26.234 18.373 1.00 14.10 APEPATOM785 O CYS10027.113 25.166 17.906 1.00 13.71 APEPATOM786 CB CYS10027.126 27.182 16.108 1.00 12.51 APEPATOM787 SG CYS10026.639 28.321 14.766 1.00 13.92 APEPATOM788 N GLN10126.457 26.411 19.667 1.00 13.78 APEPATOM789 CA GLN10126.615 25.337 20.640 1.00 14.58 APEPATOM790 CB GLN10127.656 25.723 21.696 1.00 16.78 APEPATOM791 CG GLN10129.106 25.506 21.269 1.00 19.68 APEPATOM792 CD GLN10130.097 26.125 22.239 1.00 20.61 APEPATOM793 OE1 GLN10131.113 26.690 21.833 1.00 23.08 APEPATOM794 NE2 GLN10129.802 26.023 23.530 1.00 24.57 APEPATOM795 C GLN10125.272 25.098 21.323 1.00 14.56 APEPATOM796 O GLN10124.987 25.716 22.347 1.00 14.71 APEPATOM797 N TYR10224.457 24.201 20.767 1.00 12.66 APEPATOM798 CA TYR10223.131 23.911 21.326 1.00 14.54 APEPATOM799 CB TYR10222.469 22.721 20.610 1.00 13.93 APEPATOM800 CG TYR10221.015 22.531 21.012 1.00 13.05 APEPATOM801 CD1 TYR10220.033 23.418 20.574 1.00 11.54 APEPATOM802 CE1 TYR10218.710 23.295 20.990 1.00 10.81 APEPATOM803 CD2 TYR10220.632 21.505 21.881 1.00 13.43 APEPATOM804 CE2 TYR10219.298 21.373 22.307 1.00 13.52 APEPATOM805 CZ TYR10218.348 22.276 21.853 1.00 11.37 APEPATOM806 OH TYR10217.031 22.154 22.242 1.00 12.72 APEPATOM807 C TYR10223.123 23.636 22.824 1.00 14.75 APEPATOM808 O TYR10223.825 22.747 23.305 1.00 14.15 APEPATOM809 N GLY10322.303 24.399 23.548 1.00 15.34 APEPATOM810 CA GLY10322.194 24.241 24.988 1.00 13.83 APEPATOM811 C GLY10322.174 25.586 25.698 1.00 14.82 APEPATOM812 O GLY10322.051 26.627 25.050 1.00 13.51 APEPATOM813 N HIS10422.309 25.576 27.022 1.00 13.28 APEPATOM814 CA HIS10422.293 26.821 27.792 1.00 13.00 APEPATOM815 CB HIS10421.535 26.627 29.111 1.00 14.84 APEPATOM816 CG HIS10420.085 26.309 28.938 1.00 17.77 APEPATOM817 CD2 HIS10419.345 25.263 29.370 1.00 18.90 APEPATOM818 ND1 HIS10419.224 27.125 28.236 1.00 19.74 APEPATOM819 CE1 HIS10418.014 26.594 28.245 1.00 19.42 APEPATOM820 NE2 HIS10418.060 25.465 28.925 1.00 19.61 APEPATOM821 C HIS10423.689 27.322 28.116 1.00 10.17 APEPATOM822 O HIS10424.573 26.532 28.403 1.00 8.70 APEPATOM823 N ASP10523.890 28.635 28.058 1.00 10.86 APEPATOM824 CA ASP10525.188 29.197 28.417 1.00 12.42 APEPATOM825 CB ASP10525.400 30.590 27.794 1.00 10.99 APEPATOM826 CG ASP10524.172 31.463 27.875 1.00 11.97 APEPATOM827 OD1 ASP10523.054 30.914 27.966 1.00 14.08 APEPATOM828 OD2 ASP10524.324 32.705 27.844 1.00 11.83 APEPATOM829 C ASP10525.200 29.274 29.949 1.00 13.37 APEPATOM830 O ASP10524.145 29.250 30.592 1.00 13.12 APEPATOM831 N THR10626.395 29.361 30.522 1.00 14.55 APEPATOM832 CA THR10626.573 29.385 31.971 1.00 15.70 APEPATOM833 CB THR10628.032 29.051 32.322 1.00 17.02 APEPATOM834 OG1 THR10628.349 27.739 31.837 1.00 19.67 APEPATOM835 CG2 THR10628.244 29.101 33.815 1.00 19.92 APEPATOM836 C THR10626.181 30.661 32.712 1.00 14.86 APEPATOM837 O THR10625.648 30.598 33.826 1.00 14.67 APEP
ATOM838 N CYS10726.444 31.813 32.107 1.00 12.86 APEPATOM839 CA CYS10726.131 33.086 32.748 1.00 11.94 APEPATOM840 C CYS10725.608 34.112 31.741 1.00 11.28 APEPATOM841 O CYS10726.354 34.594 30.886 1.00 8.75 APEPATOM842 CB CYS10727.389 33.618 33.451 1.00 11.80 APEPATOM843 SG CYS10727.155 35.045 34.567 1.00 14.81 APEPATOM844 N ARG10824.324 34.448 31.857 1.00 10.42 APEPATOM845 CA ARG10823.694 35.408 30.956 1.00 10.25 APEPATOM846 CB ARG10822.656 34.703 30.080 1.00 7.60 APEPATOM847 CG ARG10821.299 34.525 30.746 1.00 6.23 APEPATOM848 CD ARG10820.458 33.460 30.047 1.00 4.46 APEPATOM849 NE ARG10821.066 32.136 30.118 1.00 8.96 APEPATOM850 CZ ARG10820.688 31.192 30.971 1.00 9.87 APEPATOM851 NH1 ARG10819.703 31.427 31.825 1.00 9.20 APEPATOM852 NH2 ARG10821.284 30.013 30.968 1.00 9.69 APEPATOM853 C ARG10823.015 36.575 31.667 1.00 10.62 APEPATOM854 O ARG10822.465 37.454 31.011 1.00 11.81 APEPATOM855 N ASP10923.051 36.583 32.998 1.00 10.19 APEPATOM856 CA ASP10922.421 37.644 33.784 1.00 9.53 APEPATOM857 CB ASP10922.737 37.457 35.267 1.00 11.00 APEPATOM858 CG ASP10922.049 36.248 35.864 1.00 10.30 APEPATOM859 OD1 ASP10921.137 35.704 35.213 1.00 8.82 APEPATOM860 OD2 ASP10922.420 35.839 36.984 1.00 12.03 APEPATOM861 C ASP10922.827 39.051 33.368 1.00 10.45 APEPATOM862 O ASP10923.931 39.274 32.878 1.00 11.18 APEPATOM863 N VAL11021.919 40.001 33.565 1.00 10.47 APEPATOM864 CA VAL11022.192 41.400 33.240 1.00 11.15 APEPATOM865 CB VAL11021.083 42.025 32.346 1.00 8.57 APEPATOM866 CG1 VAL11021.282 41.607 30.884 1.00 8.96 APEPATOM867 CG2 VAL11019.711 41.600 32.840 1.00 8.45 APEPATOM868 C VAL11022.263 42.168 34.564 1.00 12.34 APEPATOM869 O VAL11022.044 41.591 35.631 1.00 11.18 APEPATOM870 N ALA11122.567 43.460 34.493 1.00 12.60 APEPATOM871 CA ALA11122.670 44.283 35.691 1.00 14.41 APEPATOM872 CB ALA11123.192 45.665 35.329 1.00 14.98 APEPATOM873 C ALA11121.351 44.412 36.445 1.00 15.05 APEPATOM874 O ALA11121.348 44.491 37.665 1.00 17.05 APEPATOM875 N LYS11220.233 44.425 35.723 1.00 15.22 APEPATOM876 CA LYS11218.919 44.565 36.346 1.00 14.82 APEPATOM877 CB LYS11217.889 44.979 35.295 1.00 17.33 APEPATOM878 CG LYS11216.518 45.301 35.854 1.00 18.63 APEPATOM879 CD LYS11215.722 46.156 34.885 1.00 20.78 APEPATOM880 CE LYS11214.275 46.298 35.331 1.00 22.40 APEPATOM881 NZ LYS11213.378 46.775 34.230 1.00 24.78 APEPATOM882 C LYS11218.395 43.334 37.092 1.00 14.63 APEPATOM883 O LYS11217.763 43.462 38.138 1.00 15.19 APEPATOM884 N TYR11318.652 42.145 36.565 1.00 14.03 APEPATOM885 CA TYR11318.155 40.941 37.211 1.00 12.90 APEPATOM886 CB TYR11316.627 40.866 37.062 1.00 14.34 APEPATOM887 CG TYR11316.094 41.275 35.701 1.00 13.96 APEPATOM888 CD1 TYR11316.725 40.867 34.529 1.00 14.86 APEPATOM889 CE1 TYR11316.236 41.234 33.279 1.00 15.41 APEPATOM890 CD2 TYR11314.950 42.064 35.590 1.00 15.52 APEPATOM891 CE2 TYR11314.447 42.439 34.345 1.00 17.15 APEPATOM892 CZ TYR11315.098 42.021 33.192 1.00 18.32 APEPATOM893 OH TYR11314.619 42.406 31.958 1.00 20.11 APEPATOM894 C TYR11318.761 39.659 36.658 1.00 12.75 APEP
ATOM895 O TYR11319.592 39.685 35.742 1.00 9.39 APEPATOM896 N GLN11418.334 38.542 37.241 1.00 11.10 APEPATOM897 CA GLN11418.762 37.223 36.820 1.00 11.13 APEPATOM898 CB GLN11418.397 36.182 37.872 1.00 13.13 APEPATOM899 CG GLN11419.492 35.921 38.881 1.00 17.82 APEPATOM900 CD GLN11419.049 34.969 39.971 1.00 21.01 APEPATOM901 OE1 GLN11418.984 33.754 39.767 1.00 24.17 APEPATOM902 NE2 GLN11418.735 35.517 41.140 1.00 21.13 APEPATOM903 C GLN11417.969 36.977 35.549 1.00 10.94 APEPATOM904 O GLN11416.851 37.489 35.418 1.00 10.27 APEPATOM905 N VAL11518.529 36.195 34.626 1.00 8.78 APEPATOM906 CA VAL11517.879 35.936 33.339 1.00 6.98 APEPATOM907 CB VAL11518.679 36.628 32.204 1.00 8.14 APEPATOM908 CG1 VAL11518.037 36.358 30.868 1.00 9.82 APEPATOM909 CG2 VAL11518.750 38.125 32.461 1.00 6.98 APEPATOM910 C VAL11517.669 34.457 32.975 1.00 6.17 APEPATOM911 O VAL11518.581 33.634 33.093 1.00 4.78 APEPATOM912 N GLY11616.449 34.142 32.540 1.00 5.97 APEPATOM913 CA GLY11616.105 32.788 32.139 1.00 7.14 APEPATOM914 C GLY11616.364 32.568 30.654 1.00 7.72 APEPATOM915 O GLY11616.706 33.504 29.930 1.00 6.29 APEPATOM916 N GLN11716.195 31.337 30.186 1.00 8.62 APEPATOM917 CA GLN11716.456 31.058 28.780 1.00 9.69 APEPATOM918 CB GLN11717.980 31.001 28.550 1.00 8.96 APEPATOM919 CG GLN11718.419 30.465 27.179 1.00 8.07 APEPATOM920 CD GLN11719.935 30.331 27.046 1.00 7.90 APEPATOM921 OE1 GLN11720.507 29.288 27.360 1.00 10.49 APEPATOM922 NE2 GLN11720.586 31.386 26.575 1.00 7.02 APEPATOM923 C GLN11715.813 29.790 28.230 1.00 9.46 APEPATOM924 O GLN11715.713 28.775 28.920 1.00 8.69 APEPATOM925 N ASN11815.372 29.876 26.978 1.00 10.04 APEPATOM926 CA ASN11814.762 28.759 26.253 1.00 9.76 APEPATOM927 CB ASN11813.280 29.037 25.950 1.00 9.04 APEPATOM928 CG ASN11812.357 28.735 27.127 1.00 9.64 APEPATOM929 OD1 ASN11812.696 27.976 28.035 1.00 9.37 APEPATOM930 ND2 ASN11811.178 29.337 27.108 1.00 8.63 APEPATOM931 C ASN11815.526 28.674 24.926 1.00 9.88 APEPATOM932 O ASN11815.847 29.707 24.342 1.00 9.07 APEPATOM933 N VAL11915.836 27.464 24.465 1.00 10.24 APEPATOM934 CA VAL11916.533 27.288 23.188 1.00 9.82 APEPATOM935 CB VAL11918.021 26.811 23.340 1.00 9.70 APEPATOM936 CG1 VAL11918.764 27.684 24.349 1.00 11.24 APEPATOM937 CG2 VAL11918.072 25.344 23.749 1.00 11.10 APEPATOM938 C VAL11915.784 26.247 22.379 1.00 10.42 APEPATOM939 O VAL11915.116 25.380 22.939 1.00 7.84 APEPATOM940 N ALA12015.894 26.345 21.057 1.00 11.69 APEPATOM941 CA ALA12015.224 25.416 20.164 1.00 10.58 APEPATOM942 CB ALA12013.853 25.960 19.783 1.00 9.38 APEPATOM943 C ALA12016.065 25.203 18.913 1.00 11.91 APEPATOM944 O ALA12016.749 26.114 18.447 1.00 11.05 APEPATOM945 N LEU12116.005 23.999 18.363 1.00 11.80 APEPATOM946 CA LEU12116.762 23.707 17.164 1.00 10.62 APEPATOM947 CB LEU12118.219 23.423 17.534 1.00 12.00 APEPATOM948 CG LEU12119.162 23.065 16.383 1.00 14.58 APEPATOM949 CD1 LEU12119.914 24.310 15.937 1.00 14.77 APEPATOM950 CD2 LEU12120.124 21.975 16.830 1.00 16.44 APEPATOM951 C LEU12116.190 22.521 16.395 1.00 11.28 APEP
ATOM952 O LEU12115.744 21.54016.9891.00 8.33 APEPATOM953 N THR12216.183 22.63315.0691.00 9.47 APEPATOM954 CA THR12215.723 21.55114.2031.00 9.80 APEPATOM955 CB THR12214.282 21.76613.6911.00 8.73 APEPATOM956 OG1 THR12214.272 22.80112.7041.00 8.66 APEPATOM957 CG2 THR12213.357 22.13314.8381.00 11.47 APEPATOM958 C THR12216.666 21.50213.0091.00 9.64 APEPATOM959 O THR12217.232 22.52412.6161.00 9.15 APEPATOM960 N GLY12316.847 20.30812.4511.00 9.74 APEPATOM961 CA GLY12317.728 20.13711.3131.00 8.54 APEPATOM962 C GLY12317.048 19.32610.2281.00 8.95 APEPATOM963 O GLY12316.199 18.48210.5141.00 9.03 APEPATOM964 N SER12417.420 19.5808.979 1.00 7.43 APEPATOM965 CA SER12416.824 18.8747.857 1.00 9.14 APEPATOM966 CB SER12415.584 19.6427.393 1.00 10.09 APEPATOM967 OG SER12415.333 19.4596.016 1.00 11.96 APEPATOM968 C SER12417.827 18.7186.709 1.00 9.54 APEPATOM969 O SER12418.716 19.5516.537 1.00 10.56 APEPATOM970 N THR12517.693 17.6415.936 1.00 10.06 APEPATOM971 CA THR12518.591 17.4154.812 1.00 10.19 APEPATOM972 CB THR12518.513 15.9744.257 1.00 11.20 APEPATOM973 OG1 THR12517.142 15.5934.086 1.00 12.88 APEPATOM974 CG2 THR12519.218 15.0015.191 1.00 8.70 APEPATOM975 C THR12518.274 18.3693.676 1.00 9.96 APEPATOM976 O THR12519.081 18.5322.772 1.00 10.12 APEPATOM977 N ALA12617.103 18.9993.731 1.00 10.40 APEPATOM978 CA ALA12616.678 19.9552.705 1.00 11.31 APEPATOM979 CB ALA12615.169 19.8632.492 1.00 11.00 APEPATOM980 C ALA12617.060 21.3833.086 1.00 13.19 APEPATOM981 O ALA12617.116 21.7354.271 1.00 12.55 APEPATOM982 N ALA12717.314 22.2072.078 1.00 12.78 APEPATOM983 CA ALA12717.700 23.5902.315 1.00 15.72 APEPATOM984 CB ALA12718.471 24.1351.106 1.00 15.36 APEPATOM985 C ALA12716.496 24.4742.610 1.00 17.23 APEPATOM986 O ALA12716.080 25.2711.773 1.00 17.44 APEPATOM987 N LYS12815.941 24.3243.810 1.00 19.74 APEPATOM988 CA LYS12814.790 25.1104.251 1.00 19.25 APEPATOM989 CB LYS12813.481 24.3873.917 1.00 21.28 APEPATOM990 CG LYS12812.930 24.7212.527 1.00 26.82 APEPATOM991 CD LYS12812.083 25.9932.549 1.00 27.74 APEPATOM992 CE LYS12811.582 26.3651.152 1.00 27.56 APEPATOM993 NZ LYS12810.376 27.2581.191 1.00 24.53 APEPATOM994 C LYS12814.918 25.3115.760 1.00 20.56 APEPATOM995 O LYS12815.299 24.3846.488 1.00 18.95 APEPATOM996 N TYR12914.599 26.5176.224 1.00 19.02 APEPATOM997 CA TYR12914.712 26.8537.644 1.00 18.90 APEPATOM998 CB TYR12915.728 27.9857.812 1.00 17.17 APEPATOM999 CG TYR12917.060 27.6457.188 1.00 15.78 APEPATOM1000 CD1 TYR12917.319 27.9345.847 1.00 15.45 APEPATOM1001 CE1 TYR12918.519 27.5645.250 1.00 13.12 APEPATOM1002 CD2 TYR12918.043 26.9847.918 1.00 16.01 APEPATOM1003 CE2 TYR12919.250 26.6107.330 1.00 16.66 APEPATOM1004 CZ TYR12919.479 26.9005.994 1.00 15.93 APEPATOM1005 OH TYR12920.652 26.4955.404 1.00 11.93 APEPATOM1006 C TYR12913.384 27.2138.312 1.00 18.94 APEPATOM1007 O TYR12912.574 27.9807.775 1.00 19.85 APEPATOM1008 N ASP13013.178 26.6459.496 1.00 17.23 APEP
ATOM1009 CA ASP13011.953 26.844 10.259 1.00 16.64 APEPATOM1010 CB ASP13012.012 26.050 11.568 1.00 18.70 APEPATOM1011 CG ASP13011.399 24.677 11.446 1.00 18.76 APEPATOM1012 OD1 ASP13011.067 24.267 10.319 1.00 17.38 APEPATOM1013 OD2 ASP13011.253 24.005 12.489 1.00 20.96 APEPATOM1014 C ASP13011.615 28.285 10.588 1.00 14.91 APEPATOM1015 O ASP13012.489 29.111 10.831 1.00 14.08 APEPATOM1016 N ASP13110.317 28.557 10.584 1.00 16.25 APEPATOM1017 CA ASP1319.759 29.858 10.911 1.00 16.60 APEPATOM1018 CB ASP1318.255 29.834 10.571 1.00 19.29 APEPATOM1019 CG ASP1317.558 31.166 10.807 1.00 24.36 APEPATOM1020 OD1 ASP1318.036 31.978 11.630 1.00 27.58 APEPATOM1021 OD2 ASP1316.506 31.396 10.168 1.00 28.19 APEPATOM1022 C ASP1319.993 29.961 12.428 1.00 15.04 APEPATOM1023 O ASP1319.708 29.012 13.159 1.00 14.34 APEPATOM1024 N PRO13210.534 31.092 12.910 1.00 12.77 APEPATOM1025 CD PRO13210.950 32.276 12.139 1.00 12.42 APEPATOM1026 CA PRO13210.788 31.253 14.354 1.00 13.80 APEPATOM1027 CB PRO13211.197 32.722 14.492 1.00 13.81 APEPATOM1028 CG PRO13211.711 33.104 13.149 1.00 14.43 APEPATOM1029 C PRO1329.592 30.895 15.251 1.00 13.34 APEPATOM1030 O PRO1329.758 30.239 16.278 1.00 12.55 APEPATOM1031 N VAL1338.396 31.325 14.850 1.00 12.80 APEPATOM1032 CA VAL1337.170 31.054 15.591 1.00 12.13 APEPATOM1033 CB VAL1335.944 31.661 14.862 1.00 11.80 APEPATOM1034 CG1 VAL1334.653 31.032 15.364 1.00 10.96 APEPATOM1035 CG2 VAL1335.923 33.159 15.064 1.00 13.44 APEPATOM1036 C VAL1336.964 29.549 15.744 1.00 13.10 APEPATOM1037 O VAL1336.452 29.083 16.763 1.00 11.95 APEPATOM1038 N LYS1347.361 28.796 14.721 1.00 13.08 APEPATOM1039 CA LYS1347.227 27.341 14.738 1.00 14.09 APEPATOM1040 CB LYS1347.594 26.756 13.374 1.00 14.78 APEPATOM1041 CG LYS1347.716 25.238 13.367 1.00 17.92 APEPATOM1042 CD LYS1347.273 24.661 12.024 1.00 20.75 APEPATOM1043 CE LYS1347.454 23.147 11.974 1.00 21.88 APEPATOM1044 NZ LYS1347.979 22.704 10.646 1.00 22.20 APEPATOM1045 C LYS1348.125 26.734 15.805 1.00 13.26 APEPATOM1046 O LYS1347.775 25.732 16.437 1.00 12.31 APEPATOM1047 N LEU1359.289 27.343 15.990 1.00 12.25 APEPATOM1048 CA LEU13510.245 26.883 16.987 1.00 12.29 APEPATOM1049 CB LEU13511.604 27.551 16.755 1.00 11.92 APEPATOM1050 CG LEU13512.371 26.968 15.563 1.00 12.40 APEPATOM1051 CD1 LEU13513.673 27.703 15.354 1.00 10.11 APEPATOM1052 CD2 LEU13512.633 25.492 15.816 1.00 13.69 APEPATOM1053 C LEU1359.711 27.222 18.371 1.00 11.79 APEPATOM1054 O LEU1359.862 26.443 19.311 1.00 12.52 APEPATOM1055 N VAL1369.070 28.378 18.492 1.00 11.76 APEPATOM1056 CA VAL1368.507 28.805 19.773 1.00 11.55 APEPATOM1057 CB VAL1367.926 30.236 19.674 1.00 9.15 APEPATOM1058 CG1 VAL1367.043 30.531 20.874 1.00 9.61 APEPATOM1059 CG2 VAL1369.053 31.247 19.587 1.00 5.53 APEPATOM1060 C VAL1367.405 27.836 20.227 1.00 12.73 APEPATOM1061 O VAL1367.370 27.421 21.385 1.00 11.68 APEPATOM1062 N LYS1376.521 27.477 19.298 1.00 13.14 APEPATOM1063 CA LYS1375.422 26.554 19.563 1.00 12.46 APEPATOM1064 CB LYS1374.562 26.376 18.307 1.00 12.12 APEPATOM1065 CG LYS1373.866 27.659 17.847 1.00 16.24 APEP
ATOM1066 CD LYS1372.763 27.391 16.836 1.00 13.34 APEPATOM1067 CE LYS1371.560 28.297 17.064 1.00 16.29 APEPATOM1068 NZ LYS1370.433 27.565 17.706 1.00 12.20 APEPATOM1069 C LYS1375.939 25.198 20.031 1.00 12.60 APEPATOM1070 O LYS1375.183 24.406 20.589 1.00 13.30 APEPATOM1071 N MET1387.220 24.924 19.797 1.00 12.70 APEPATOM1072 CA MET1387.807 23.662 20.240 1.00 15.80 APEPATOM1073 CB MET1389.266 23.545 19.779 1.00 17.09 APEPATOM1074 CG MET1389.478 22.767 18.482 1.00 21.36 APEPATOM1075 SD MET13811.111 23.089 17.711 1.00 26.01 APEPATOM1076 CE MET13812.066 21.673 18.272 1.00 23.00 APEPATOM1077 C MET1387.755 23.665 21.768 1.00 15.35 APEPATOM1078 O MET1387.447 22.650 22.395 1.00 15.78 APEPATOM1079 N TRP1398.069 24.824 22.346 1.00 13.56 APEPATOM1080 CA TRP1398.069 25.035 23.791 1.00 10.21 APEPATOM1081 CB TRP1398.700 26.395 24.122 1.00 6.88 APEPATOM1082 CG TRP13910.112 26.582 23.589 1.00 7.62 APEPATOM1083 CD2 TRP13910.746 27.821 23.220 1.00 4.45 APEPATOM1084 CE2 TRP13912.051 27.507 22.784 1.00 4.04 APEPATOM1085 CE3 TRP13910.335 29.160 23.214 1.00 4.82 APEPATOM1086 CD1 TRP13911.037 25.606 23.367 1.00 6.61 APEPATOM1087 NE1 TRP13912.203 26.151 22.886 1.00 5.06 APEPATOM1088 CZ2 TRP13912.955 28.490 22.347 1.00 2.98 APEPATOM1089 CZ3 TRP13911.229 30.137 22.778 1.00 2.00 APEPATOM1090 CH2 TRP13912.525 29.795 22.351 1.00 4.18 APEPATOM1091 C TRP1396.628 24.997 24.312 1.00 11.53 APEPATOM1092 O TRP1396.350 24.419 25.365 1.00 11.91 APEPATOM1093 N GLU1405.723 25.622 23.557 1.00 11.23 APEPATOM1094 CA GLU1404.306 25.690 23.890 1.00 10.95 APEPATOM1095 CB GLU1403.538 26.427 22.798 1.00 9.60 APEPATOM1096 CG GLU1403.622 27.919 22.834 1.00 7.49 APEPATOM1097 CD GLU1402.893 28.544 21.666 1.00 8.80 APEPATOM1098 OE1 GLU1401.937 27.921 21.150 1.00 11.85 APEPATOM1099 OE2 GLU1403.277 29.654 21.259 1.00 12.42 APEPATOM1100 C GLU1403.672 24.321 24.038 1.00 11.65 APEPATOM1101 O GLU1402.891 24.089 24.960 1.00 13.93 APEPATOM1102 N ASP1413.993 23.423 23.112 1.00 12.05 APEPATOM1103 CA ASP1413.433 22.078 23.106 1.00 13.22 APEPATOM1104 CB ASP1413.850 21.346 21.833 1.00 12.72 APEPATOM1105 CG ASP1413.200 21.923 20.601 1.00 13.07 APEPATOM1106 OD1 ASP1412.240 22.706 20.747 1.00 12.10 APEPATOM1107 OD2 ASP1413.646 21.599 19.484 1.00 16.74 APEPATOM1108 C ASP1413.782 21.235 24.320 1.00 13.83 APEPATOM1109 O ASP1413.199 20.172 24.530 1.00 13.83 APEPATOM1110 N GLU1424.726 21.705 25.124 1.00 14.37 APEPATOM1111 CA GLU1425.110 20.974 26.323 1.00 13.86 APEPATOM1112 CB GLU1426.335 21.626 26.974 1.00 13.22 APEPATOM1113 CG GLU1427.619 21.449 26.158 1.00 13.31 APEPATOM1114 CD GLU1428.866 21.896 26.889 1.00 11.68 APEPATOM1115 OE1 GLU1428.749 22.706 27.829 1.00 14.70 APEPATOM1116 OE2 GLU1429.968 21.439 26.523 1.00 10.37 APEPATOM1117 C GLU1423.937 20.957 27.301 1.00 14.65 APEPATOM1118 O GLU1423.819 20.049 28.120 1.00 16.37 APEPATOM1119 N VAL1433.063 21.954 27.197 1.00 14.52 APEPATOM1120 CA VAL1431.904 22.071 28.084 1.00 14.56 APEPATOM1121 CB VAL1430.970 23.221 27.644 1.00 14.44 APEPATOM1122 CG1 VAL1430.210 22.834 26.376 1.00 12.33 APEP
ATOM1123 CG2 VAL143-0.005 23.548 28.769 1.00 10.75 APEPATOM1124 C VAL1431.057 20.809 28.237 1.00 16.78 APEPATOM1125 O VAL1430.399 20.631 29.258 1.00 16.28 APEPATOM1126 N LYS1441.059 19.942 27.228 1.00 17.87 APEPATOM1127 CA LYS1440.281 18.706 27.293 1.00 19.21 APEPATOM1128 CB LYS1440.257 18.025 25.913 1.00 21.23 APEPATOM1129 CG LYS1441.602 17.471 25.452 1.00 23.20 APEPATOM1130 CD LYS1441.578 15.949 25.346 1.00 25.43 APEPATOM1131 CE LYS1442.739 15.423 24.506 1.00 25.49 APEPATOM1132 NZ LYS1442.960 16.244 23.282 1.00 24.96 APEPATOM1133 C LYS1440.852 17.746 28.350 1.00 18.76 APEPATOM1134 O LYS1440.188 16.794 28.776 1.00 18.94 APEPATOM1135 N ASP1452.080 18.008 28.774 1.00 17.39 APEPATOM1136 CA ASP1452.743 17.180 29.778 1.00 18.35 APEPATOM1137 CB ASP1454.199 16.916 29.364 1.00 20.30 APEPATOM1138 CG ASP1454.316 15.942 28.195 1.00 20.35 APEPATOM1139 OD1 ASP1453.374 15.153 27.959 1.00 22.15 APEPATOM1140 OD2 ASP1455.359 15.966 27.510 1.00 21.64 APEPATOM1141 C ASP1452.714 17.829 31.173 1.00 17.37 APEPATOM1142 O ASP1453.069 17.192 32.164 1.00 15.03 APEPATOM1143 N TYR1462.284 19.090 31.240 1.00 17.14 APEPATOM1144 CA TYR1462.200 19.821 32.506 1.00 15.39 APEPATOM1145 CB TYR1462.368 21.320 32.264 1.00 14.76 APEPATOM1146 CG TYR1462.696 22.071 33.533 1.00 15.28 APEPATOM1147 CD1 TYR1463.992 22.053 34.065 1.00 14.62 APEPATOM1148 CE1 TYR1464.286 22.682 35.277 1.00 13.76 APEPATOM1149 CD2 TYR1461.705 22.743 34.242 1.00 14.99 APEPATOM1150 CE2 TYR1461.991 23.377 35.457 1.00 13.01 APEPATOM1151 CZ TYR1463.281 23.340 35.964 1.00 12.87 APEPATOM1152 OH TYR1463.563 23.958 37.162 1.00 12.82 APEPATOM1153 C TYR1460.906 19.580 33.294 1.00 16.31 APEPATOM1154 O TYR146-0.202 19.837 32.804 1.00 15.92 APEPATOM1155 N ASN1471.062 19.097 34.525 1.00 15.90 APEPATOM1156 CA ASN147-0.066 18.792 35.415 1.00 17.53 APEPATOM1157 CB ASN1470.265 17.551 36.248 1.00 17.07 APEPATOM1158 CG ASN147-0.851 17.172 37.193 1.00 18.14 APEPATOM1159 OD1 ASN147-1.885 17.835 37.242 1.00 19.58 APEPATOM1160 ND2 ASN147-0.651 16.096 37.949 1.00 15.35 APEPATOM1161 C ASN147-0.405 19.957 36.355 1.00 17.15 APEPATOM1162 O ASN1470.289 20.196 37.334 1.00 16.44 APEPATOM1163 N PRO148-1.499 20.677 36.082 1.00 17.84 APEPATOM1164 CD PRO148-2.462 20.508 34.981 1.00 16.74 APEPATOM1165 CA PRO148-1.854 21.805 36.951 1.00 19.69 APEPATOM1166 CB PRO148-2.982 22.504 36.189 1.00 17.29 APEPATOM1167 CG PRO148-3.588 21.436 35.367 1.00 17.85 APEPATOM1168 C PRO148-2.246 21.467 38.395 1.00 21.26 APEPATOM1169 O PRO148-2.040 22.285 39.289 1.00 22.85 APEPATOM1170 N LYS149-2.802 20.275 38.624 1.00 23.35 APEPATOM1171 CA LYS149-3.219 19.862 39.970 1.00 25.52 APEPATOM1172 CB LYS149-4.006 18.546 39.917 1.00 25.99 APEPATOM1173 CG LYS149-5.036 18.477 38.800 1.00 29.64 APEPATOM1174 CD LYS149-6.438 18.800 39.307 1.00 30.49 APEPATOM1175 CE LYS149-7.162 19.775 38.382 1.00 30.51 APEPATOM1176 NZ LYS149-8.401 20.351 39.004 1.00 30.17 APEPATOM1177 C LYS149-2.041 19.704 40.929 1.00 26.61 APEPATOM1178 O LYS149-2.153 19.082 41.993 1.00 27.31 APEPATOM1179 N LYS150-0.905 20.271 40.559 1.00 26.69 APEP
ATOM1180 CA LYS1500.262 20.186 41.408 1.00 27.83 APEPATOM1181 CB LYS1500.904 18.795 41.260 1.00 26.22 APEPATOM1182 CG LYS1502.205 18.718 40.495 1.00 25.69 APEPATOM1183 CD LYS1502.416 17.320 39.908 1.00 25.52 APEPATOM1184 CE LYS1502.140 16.214 40.922 1.00 24.65 APEPATOM1185 NZ LYS1500.695 15.847 40.971 1.00 23.30 APEPATOM1186 C LYS1501.218 21.320 41.062 1.00 29.22 APEPATOM1187 O LYS1501.504 21.577 39.895 1.00 31.30 APEPATOM1188 N LYS1511.681 22.023 42.088 1.00 30.63 APEPATOM1189 CA LYS1512.581 23.148 41.896 1.00 29.98 APEPATOM1190 CB LYS1513.134 23.622 43.244 1.00 30.75 APEPATOM1191 CG LYS1512.308 24.738 43.888 1.00 32.85 APEPATOM1192 CD LYS1512.605 26.093 43.246 1.00 32.11 APEPATOM1193 CE LYS1511.512 27.104 43.562 1.00 30.61 APEPATOM1194 NZ LYS1512.061 28.331 44.196 1.00 27.07 APEPATOM1195 C LYS1513.720 22.801 40.956 1.00 28.42 APEPATOM1196 O LYS1513.984 21.633 40.685 1.00 28.09 APEPATOM1197 N PHE1524.377 23.842 40.460 1.00 28.09 APEPATOM1198 CA PHE1525.494 23.719 39.539 1.00 27.23 APEPATOM1199 CB PHE1526.138 25.098 39.349 1.00 23.04 APEPATOM1200 CG PHE1527.486 25.064 38.687 1.00 21.73 APEPATOM1201 CD1 PHE1527.595 24.951 37.307 1.00 19.77 APEPATOM1202 CD2 PHE1528.646 25.171 39.442 1.00 21.08 APEPATOM1203 CE1 PHE1528.833 24.948 36.688 1.00 18.18 APEPATOM1204 CE2 PHE1529.894 25.169 38.832 1.00 20.33 APEPATOM1205 CZ PHE1529.986 25.057 37.447 1.00 20.45 APEPATOM1206 C PHE1526.543 22.708 39.996 1.00 28.98 APEPATOM1207 O PHE1526.821 21.736 39.293 1.00 29.79 APEPATOM1208 N SER1537.112 22.940 41.176 1.00 30.67 APEPATOM1209 CA SER1538.162 22.084 41.735 1.00 32.34 APEPATOM1210 CB SER1538.313 22.357 43.234 1.00 33.66 APEPATOM1211 OG SER1539.539 21.834 43.713 1.00 35.63 APEPATOM1212 C SER1537.990 20.581 41.522 1.00 31.88 APEPATOM1213 O SER1538.977 19.859 41.342 1.00 29.52 APEPATOM1214 N GLY1546.744 20.113 41.547 1.00 32.09 APEPATOM1215 CA GLY1546.488 18.694 41.373 1.00 31.42 APEPATOM1216 C GLY1546.124 18.282 39.962 1.00 31.52 APEPATOM1217 O GLY1545.317 17.371 39.771 1.00 31.82 APEPATOM1218 N ASN1556.719 18.941 38.973 1.00 30.65 APEPATOM1219 CA ASN1556.448 18.635 37.573 1.00 28.76 APEPATOM1220 CB ASN1555.796 19.842 36.893 1.00 27.64 APEPATOM1221 CG ASN1554.332 19.614 36.579 1.00 26.54 APEPATOM1222 OD1 ASN1553.991 18.873 35.652 1.00 25.37 APEPATOM1223 ND2 ASN1553.455 20.248 37.354 1.00 23.70 APEPATOM1224 C ASN1557.729 18.257 36.833 1.00 29.00 APEPATOM1225 O ASN1558.828 18.636 37.242 1.00 28.36 APEPATOM1226 N ASP1567.580 17.507 35.744 1.00 28.55 APEPATOM1227 CA ASP1568.714 17.071 34.933 1.00 28.23 APEPATOM1228 CB ASP1568.219 16.108 33.848 1.00 29.34 APEPATOM1229 CG ASP1569.251 15.058 33.474 1.00 30.85 APEPATOM1230 OD1 ASP1568.915 13.855 33.515 1.00 30.64 APEPATOM1231 OD2 ASP15610.396 15.434 33.133 1.00 32.06 APEPATOM1232 C ASP1569.399 18.281 34.284 1.00 27.76 APEPATOM1233 O ASP1568.971 18.746 33.230 1.00 27.49 APEPATOM1234 N PHE15710.464 18.789 34.897 1.00 28.19 APEPATOM1235 CA PHE15711.129 19.951 34.326 1.00 29.10 APEPATOM1236 CB PHE15711.963 20.705 35.387 1.00 32.07 APEP
ATOM1237 CG PHE15713.062 19.893 36.038 1.00 35.87 APEPATOM1238 CD1 PHE15714.226 19.555 35.330 1.00 36.99 APEPATOM1239 CD2 PHE15712.982 19.555 37.397 1.00 35.92 APEPATOM1240 CE1 PHE15715.297 18.901 35.966 1.00 36.12 APEPATOM1241 CE2 PHE15714.047 18.902 38.044 1.00 36.27 APEPATOM1242 CZ PHE15715.208 18.577 37.323 1.00 36.25 APEPATOM1243 C PHE15711.967 19.639 33.100 1.00 28.86 APEPATOM1244 O PHE15712.423 20.543 32.400 1.00 28.11 APEPATOM1245 N LEU15812.158 18.357 32.824 1.00 28.54 APEPATOM1246 CA LEU15812.928 17.962 31.653 1.00 28.65 APEPATOM1247 CB LEU15813.685 16.657 31.922 1.00 29.80 APEPATOM1248 CG LEU15815.217 16.660 31.842 1.00 28.78 APEPATOM1249 CD1 LEU15815.688 15.223 31.692 1.00 29.48 APEPATOM1250 CD2 LEU15815.706 17.507 30.669 1.00 26.31 APEPATOM1251 C LEU15811.962 17.773 30.488 1.00 27.95 APEPATOM1252 O LEU15812.375 17.501 29.366 1.00 30.04 APEPATOM1253 N LYS15910.671 17.932 30.763 1.00 26.29 APEPATOM1254 CA LYS1599.654 17.774 29.734 1.00 24.09 APEPATOM1255 CB LYS1598.801 16.542 30.039 1.00 23.00 APEPATOM1256 CG LYS1599.619 15.265 30.203 1.00 24.44 APEPATOM1257 CD LYS1598.749 14.035 30.403 1.00 23.01 APEPATOM1258 CE LYS1597.414 14.154 29.691 1.00 22.17 APEPATOM1259 NZ LYS1596.363 13.362 30.384 1.00 21.65 APEPATOM1260 C LYS1598.756 19.000 29.595 1.00 22.82 APEPATOM1261 O LYS1598.099 19.182 28.566 1.00 20.81 APEPATOM1262 N THR1608.731 19.845 30.623 1.00 21.93 APEPATOM1263 CA THR1607.889 21.041 30.590 1.00 19.90 APEPATOM1264 CB THR1606.684 20.884 31.554 1.00 17.71 APEPATOM1265 OG1 THR1607.163 20.721 32.894 1.00 17.45 APEPATOM1266 CG2 THR1605.856 19.670 31.182 1.00 14.19 APEPATOM1267 C THR1608.619 22.352 30.921 1.00 19.16 APEPATOM1268 O THR1608.005 23.419 30.937 1.00 20.80 APEPATOM1269 N GLY1619.925 22.270 31.160 1.00 17.07 APEPATOM1270 CA GLY16110.707 23.446 31.506 1.00 15.84 APEPATOM1271 C GLY16110.629 24.679 30.616 1.00 15.32 APEPATOM1272 O GLY16110.825 25.796 31.093 1.00 15.24 APEPATOM1273 N HIS16210.356 24.498 29.329 1.00 15.82 APEPATOM1274 CA HIS16210.274 25.637 28.421 1.00 14.73 APEPATOM1275 CB HIS16210.587 25.193 26.995 1.00 17.02 APEPATOM1276 CG HIS16211.979 24.675 26.823 1.00 20.85 APEPATOM1277 CD2 HIS16213.162 25.120 27.308 1.00 21.78 APEPATOM1278 ND1 HIS16212.268 23.554 26.076 1.00 23.37 APEPATOM1279 CE1 HIS16213.572 23.333 26.107 1.00 24.65 APEPATOM1280 NE2 HIS16214.136 24.269 26.848 1.00 24.25 APEPATOM1281 C HIS1628.893 26.277 28.486 1.00 13.27 APEPATOM1282 O HIS1628.753 27.497 28.413 1.00 11.88 APEPATOM1283 N TYR1637.875 25.442 28.628 1.00 11.72 APEPATOM1284 CA TYR1636.509 25.926 28.733 1.00 11.23 APEPATOM1285 CB TYR1635.550 24.750 28.924 1.00 10.40 APEPATOM1286 CG TYR1634.271 25.122 29.653 1.00 10.24 APEPATOM1287 CD1 TYR1633.369 26.028 29.095 1.00 10.55 APEPATOM1288 CE1 TYR1632.196 26.378 29.759 1.00 9.30 APEPATOM1289 CD2 TYR1633.970 24.576 30.898 1.00 6.58 APEPATOM1290 CE2 TYR1632.802 24.920 31.571 1.00 8.87 APEPATOM1291 CZ TYR1631.918 25.818 30.995 1.00 10.63 APEPATOM1292 OH TYR1630.745 26.143 31.635 1.00 10.74 APEPATOM1293 C TYR1636.387 26.863 29.937 1.00 10.06 APEP
ATOM1294 O TYR1635.919 27.994 29.820 1.00 10.02 APEPATOM1295 N THR1646.830 26.382 31.093 1.00 9.35 APEPATOM1296 CA THR1646.740 27.143 32.335 1.00 8.02 APEPATOM1297 CB THR1647.259 26.301 33.511 1.00 6.41 APEPATOM1298 OG1 THR1648.571 25.811 33.209 1.00 5.81 APEPATOM1299 CG2 THR1646.312 25.111 33.750 1.00 2.00 APEPATOM1300 C THR1647.422 28.513 32.327 1.00 8.62 APEPATOM1301 O THR1646.962 29.433 33.010 1.00 8.07 APEPATOM1302 N GLN1658.508 28.663 31.570 1.00 8.53 APEPATOM13 03 CA GLN1659.183 29.964 31.499 1.00 7.81 APEPATOM1304 CB GLN16510.598 29.837 30.930 1.00 7.00 APEPATOM1305 CG GLN16511.241 31.179 30.604 1.00 7.27 APEPATOM1306 CD GLN16511.537 32.023 31.840 1.00 7.94 APEPATOM1307 OE1 GLN16512.631 31.963 32.407 1.00 7.98 APEPATOM1308 NE2 GLN16510.566 32.815 32.257 1.00 5.43 APEPATOM1309 C GLN1658.370 30.902 30.609 1.00 7.95 APEPATOM1310 O GLN1658.363 32.113 30.811 1.00 8.38 APEPATOM1311 N MET1667.683 30.330 29.625 1.00 7.26 APEPATOM1312 CA MET1666.859 31.118 28.715 1.00 8.35 APEPATOM1313 CB MET1666.377 30.253 27.553 1.00 7.91 APEPATOM1314 CG MET1667.245 30.356 26.309 1.00 7.80 APEPATOM1315 SD MET1666.486 29.500 24.931 1.00 12.38 APEPATOM1316 CE MET1665.508 30.823 24.207 1.00 11.75 APEPATOM1317 C MET1665.654 31.746 29.409 1.00 6.47 APEPATOM1318 O MET1665.313 32.890 29.128 1.00 7.34 APEPATOM1319 N VAL1675.011 31.009 30.314 1.00 7.21 APEPATOM1320 CA VAL1673.847 31.550 31.018 1.00 7.06 APEPATOM1321 CB VAL1672.676 30.526 31.065 1.00 7.32 APEPATOM1322 CG1 VAL1672.295 30.107 29.654 1.00 3.76 APEPATOM1323 CG2 VAL1673.048 29.321 31.901 1.00 5.77 APEPATOM1324 C VAL1674.125 32.046 32.444 1.00 8.39 APEPATOM1325 O VAL1673.200 32.211 33.231 1.00 8.06 APEPATOM1326 N TRP1685.396 32.290 32.767 1.00 9.11 APEPATOM1327 CA TRP1685.793 32.784 34.089 1.00 8.50 APEPATOM1328 CB TRP1687.320 32.745 34.232 1.00 7.79 APEPATOM1329 CG TRP1687.806 32.690 35.657 1.00 9.67 APEPATOM1330 CD2 TRP1687.960 31.519 36.474 1.00 8.72 APEPATOM1331 CE2 TRP1688.452 31.946 37.725 1.00 10.18 APEPATOM1332 CE3 TRP1687.730 30.153 36.268 1.00 10.13 APEPATOM1333 CD1 TRP1688.200 33.747 36.430 1.00 8.39 APEPATOM1334 NE1 TRP1688.589 33.309 37.670 1.00 8.61 APEPATOM1335 CZ2 TRP1688.722 31.054 38.769 1.00 8.53 APEPATOM1336 CZ3 TRP1687.998 29.265 37.305 1.00 6.40 APEPATOM1337 CH2 TRP1688.488 29.721 38.539 1.00 9.27 APEPATOM1338 C TRP1685.294 34.213 34.275 1.00 8.27 APEPATOM1339 O TRP1685.782 35.136 33.627 1.00 8.24 APEPATOM1340 N ALA1694.324 34.392 35.167 1.00 7.85 APEPATOM1341 CA ALA1693.734 35.704 35.415 1.00 7.42 APEPATOM1342 CB ALA1692.668 35.585 36.476 1.00 6.86 APEPATOM1343 C ALA1694.715 36.805 35.797 1.00 9.10 APEPATOM1344 O ALA1694.525 37.968 35.433 1.00 10.62 APEPATOM1345 N ASN1705.758 36.436 36.531 1.00 9.55 APEPATOM1346 CA ASN1706.760 37.392 36.990 1.00 10.81 APEPATOM1347 CB ASN1707.557 36.792 38.158 1.00 10.24 APEPATOM1348 CG ASN1706.907 37.057 39.513 1.00 11.09 APEPATOM1349 OD1 ASN1705.758 37.497 39.598 1.00 11.64 APEPATOM1350 ND2 ASN1707.643 36.783 40.578 1.00 14.04 APEP
ATOM1351 C ASN1707.716 37.859 35.887 1.00 10.96 APEPATOM1352 O ASN1708.317 38.918 35.999 1.00 10.88 APEPATOM1353 N THR1717.866 37.071 34.830 1.00 10.69 APEPATOM1354 CA THR1718.741 37.472 33.733 1.00 9.90 APEPATOM1355 CB THR1719.002 36.308 32.757 1.00 8.82 APEPATOM1356 OG1 THR1719.738 35.278 33.430 1.00 10.00 APEPATOM1357 CG2 THR1719.793 36.790 31.541 1.00 6.32 APEPATOM1358 C THR1718.026 38.592 32.992 1.00 10.43 APEPATOM1359 O THR1716.842 38.468 32.669 1.00 11.58 APEPATOM1360 N LYS1728.736 39.680 32.715 1.00 11.90 APEPATOM1361 CA LYS1728.131 40.818 32.027 1.00 12.07 APEPATOM1362 CB LYS1728.176 42.054 32.934 1.00 13.23 APEPATOM1363 CG LYS1727.424 41.893 34.261 1.00 16.65 APEPATOM1364 CD LYS1725.905 41.830 34.074 1.00 18.48 APEPATOM1365 CE LYS1725.354 43.044 33.312 1.00 21.38 APEPATOM1366 NZ LYS1724.386 43.852 34.117 1.00 19.33 APEPATOM1367 C LYS1728.751 41.166 30.677 1.00 9.74 APEPATOM1368 O LYS1728.122 41.834 29.856 1.00 9.87 APEPATOM1369 N GLU1739.982 40.719 30.450 1.00 11.94 APEPATOM1370 CA GLU17310.684 41.005 29.198 1.00 13.45 APEPATOM1371 CB GLU17311.812 42.014 29.438 1.00 16.52 APEPATOM1372 CG GLU17311.752 42.721 30.778 1.00 21.67 APEPATOM1373 CD GLU17311.695 44.220 30.618 1.00 23.96 APEPATOM1374 OE1 GLU17311.727 44.679 29.455 1.00 24.88 APEPATOM1375 OE2 GLU17311.621 44.935 31.643 1.00 28.83 APEPATOM1376 C GLU17311.280 39.765 28.531 1.00 10.86 APEPATOM1377 O GLU17311.622 38.790 29.199 1.00 10.81 APEPATOM1378 N VAL17411.404 39.830 27.209 1.00 10.16 APEPATOM1379 CA VAL17411.968 38.741 26.416 1.00 9.96 APEPATOM1380 CB VAL17410.856 37.811 25.846 1.00 9.93 APEPATOM1381 CG1 VAL17410.099 38.519 24.740 1.00 7.96 APEPATOM1382 CG2 VAL17411.460 36.508 25.323 1.00 7.52 APEPATOM1383 C VAL17412.790 39.316 25.258 1.00 11.17 APEPATOM1384 O VAL17412.485 40.383 24.728 1.00 11.23 APEPATOM1385 N GLY17513.845 38.605 24.886 1.00 10.40 APEPATOM1386 CA GLY17514.692 39.045 23.797 1.00 8.75 APEPATOM1387 C GLY17515.337 37.813 23.211 1.00 9.59 APEPATOM1388 O GLY17515.882 36.991 23.949 1.00 6.65 APEPATOM1389 N CYS17615.291 37.685 21.885 1.00 8.02 APEPATOM1390 CA CYS17615.853 36.511 21.226 1.00 7.90 APEPATOM1391 C CYS17616.940 36.771 20.186 1.00 7.85 APEPATOM1392 O CYS17617.114 37.893 19.693 1.00 6.33 APEPATOM1393 CB CYS17614.721 35.701 20.582 1.00 6.21 APEPATOM1394 SG CYS17613.249 35.553 21.641 1.00 9.41 APEPATOM1395 N GLY17717.672 35.703 19.880 1.00 8.22 APEPATOM1396 CA GLY17718.737 35.744 18.895 1.00 10.14 APEPATOM1397 C GLY17718.618 34.466 18.085 1.00 10.70 APEPATOM1398 O GLY17718.182 33.446 18.623 1.00 8.40 APEPATOM1399 N SER17818.983 34.509 16.806 1.00 9.75 APEPATOM1400 CA SER17818.881 33.325 15.959 1.00 9.62 APEPATOM1401 CB SER17817.523 33.305 15.247 1.00 12.13 APEPATOM1402 OG SER17817.614 33.902 13.964 1.00 15.65 APEPATOM1403 C SER17819.999 33.227 14.921 1.00 8.56 APEPATOM1404 O SER17820.597 34.231 14.532 1.00 5.09 APEPATOM1405 N ILE17920.270 32.001 14.482 1.00 9.37 APEPATOM1406 CA ILE17921.310 31.744 13.498 1.00 9.01 APEPATOM1407 CB ILE17922.673 31.531 14.181 1.00 8.43 APEP
ATOM1408 CG2 ILE17922.625 30.29615.054 1.00 6.63 APEPATOM1409 CG1 ILE17923.774 31.41513.122 1.00 7.53 APEPATOM1410 CD1 ILE17925.093 32.03513.535 1.00 8.62 APEPATOM1411 C ILE17920.980 30.51712.650 1.00 10.87 APEPATOM1412 O ILE17920.506 29.49713.158 1.00 10.47 APEPATOM1413 N LYS18021.216 30.63211.347 1.00 10.60 APEPATOM1414 CA LYS18020.952 29.53610.430 1.00 11.05 APEPATOM1415 CB LYS18020.077 30.0189.2691.00 11.05 APEPATOM1416 CG LYS18018.745 30.5969.7241.00 13.07 APEPATOM1417 CD LYS18017.902 31.0488.5431.00 15.79 APEPATOM1418 CE LYS18016.580 31.6558.9961.00 14.81 APEPATOM1419 NZ LYS18015.620 31.8027.8621.00 16.66 APEPATOM1420 C LYS18022.291 29.0299.9201.00 10.53 APEPATOM1421 O LYS18023.137 29.8179.5051.00 12.20 APEPATOM1422 N TYR18122.490 27.7169.9551.00 9.11 APEPATOM1423 CA TYR18123.756 27.1669.5101.00 8.14 APEPATOM1424 CB TYR18124.786 27.30010.633 1.00 6.13 APEPATOM1425 CG TYR18124.460 26.48311.863 1.00 8.18 APEPATOM1426 CD1 TYR18124.984 25.20112.027 1.00 9.63 APEPATOM1427 CE1 TYR18124.706 24.45013.172 1.00 8.66 APEPATOM1428 CD2 TYR18123.643 26.99912.876 1.00 8.34 APEPATOM1429 CE2 TYR18123.360 26.25714.020 1.00 7.46 APEPATOM1430 CZ TYR18123.896 24.98614.161 1.00 8.38 APEPATOM1431 OH TYR18123.634 24.24415.293 1.00 8.05 APEPATOM1432 C TYR18123.695 25.7199.0221.00 7.08 APEPATOM1433 O TYR18122.728 25.0019.2621.00 7.97 APEPATOM1434 N ILE18224.743 25.3038.3231.00 8.25 APEPATOM1435 CA ILE18224.814 23.9487.8041.00 7.94 APEPATOM1436 CB ILE18225.011 23.9596.2931.00 9.43 APEPATOM1437 CG2 ILE18224.641 22.5995.7131.00 9.49 APEPATOM1438 CG1 ILE18224.147 25.0655.6801.00 9.61 APEPATOM1439 CD1 ILE18224.502 25.4294.2781.00 7.05 APEPATOM1440 C ILE18225.961 23.1848.4451.00 8.67 APEPATOM1441 O ILE18227.112 23.5888.3331.00 8.62 APEPATOM1442 N GLN18325.642 22.0849.1221.00 6.39 APEPATOM1443 CA GLN18326.657 21.2719.7761.00 7.60 APEPATOM1444 CB GLN18326.485 21.31311.304 1.00 8.26 APEPATOM1445 CG GLN18327.184 20.16012.059 1.00 11.17 APEPATOM1446 CD GLN18326.842 20.10513.560 1.00 10.23 APEPATOM1447 OE1 GLN18325.927 20.77914.029 1.00 13.96 APEPATOM1448 NE2 GLN18327.578 19.29314.304 1.00 9.47 APEPATOM1449 C GLN18326.603 19.8249.3081.00 6.95 APEPATOM1450 O GLN18325.653 19.0969.6021.00 4.41 APEPATOM1451 N GLU18427.624 19.4048.5761.00 6.92 APEPATOM1452 CA GLU18427.685 18.0258.1231.00 7.66 APEPATOM1453 CB GLU18427.885 17.1209.3491.00 9.14 APEPATOM1454 CG GLU18429.110 17.55110.172 1.00 8.94 APEPATOM1455 CD GLU18429.207 16.91211.558 1.00 12.48 APEPATOM1456 OE1 GLU18428.235 16.96312.340 1.00 13.16 APEPATOM1457 OE2 GLU18430.278 16.36111.869 1.00 15.28 APEPATOM1458 C GLU18426.447 17.6457.3161.00 6.36 APEPATOM1459 O GLU18425.858 16.5817.4931.00 4.35 APEPATOM1460 N LYS18526.089 18.5606.4171.00 8.43 APEPATOM1461 CA LYS18524.956 18.4515.5041.00 10.57 APEPATOM1462 CB LYS18525.054 17.1654.6851.00 12.55 APEPATOM1463 CG LYS18525.705 17.3713.3311.00 16.19 APEPATOM1464 CD LYS18526.930 16.4983.1731.00 20.18 APEP
ATOM1465 CE LYS18526.783 15.553 1.9901.00 22.27 APEPATOM1466 NZ LYS18525.360 15.182 1.7441.00 25.09 APEPATOM1467 C LYS18523.571 18.567 6.1311.00 10.92 APEPATOM1468 O LYS18522.566 18.219 5.5091.00 10.67 APEPATOM1469 N TRP18623.519 19.062 7.3621.00 10.21 APEPATOM1470 CA TRP18622.250 19.252 8.0391.00 9.13 APEPATOM1471 CB TRP18622.297 18.677 9.4611.00 8.92 APEPATOM1472 CG TRP18622.105 17.173 9.5631.00 7.23 APEPATOM1473 CD2 TRP18620.883 16.433 9.3801.00 7.44 APEPATOM1474 CE2 TRP18621.179 15.070 9.6241.00 7.10 APEPATOM1475 CE3 TRP18619.569 16.787 9.0361.00 7.24 APEPATOM1476 CD1 TRP18623.057 16.253 9.8951.00 7.55 APEPATOM1477 NE1 TRP18622.510 14.991 9.9341.00 7.21 APEPATOM1478 CZ2 TRP18620.209 14.061 9.5361.00 4.65 APEPATOM1479 CZ3 TRP18618.602 15.776 8.9501.00 5.07 APEPATOM1480 CH2 TRP18618.934 14.430 9.1981.00 4.34 APEPATOM1481 C TRP18622.029 20.757 8.0971.00 9.22 APEPATOM1482 O TRP18622.895 21.495 8.5471.00 10.78 APEPATOM1483 N HIS18720.876 21.214 7.6221.00 11.53 APEPATOM1484 CA HIS18720.555 22.637 7.6421.00 10.59 APEPATOM1485 CB HIS18719.773 23.005 6.3751.00 11.28 APEPATOM1486 CG HIS18720.381 22.455 5.1191.00 12.80 APEPATOM1487 CD2 HIS18720.511 21.183 4.6741.00 13.63 APEPATOM1488 ND1 HIS18720.984 23.254 4.1701.00 14.63 APEPATOM1489 CE1 HIS18721.463 22.497 3.1981.00 14.97 APEPATOM1490 NE2 HIS18721.189 21.236 3.4801.00 14.98 APEPATOM1491 C HIS18719.738 22.910 8.9041.00 8.99 APEPATOM1492 O HIS18718.636 22.408 9.0581.00 10.40 APEPATOM1493 N LYS18820.287 23.700 9.8171.00 10.12 APEPATOM1494 CA LYS18819.593 23.970 11.068 1.00 9.30 APEPATOM1495 CB LYS18820.403 23.413 12.251 1.00 10.66 APEPATOM1496 CG LYS18821.395 22.314 11.909 1.00 7.22 APEPATOM1497 CD LYS18821.627 21.422 13.118 1.00 8.34 APEPATOM1498 CE LYS18822.696 20.369 12.871 1.00 9.03 APEPATOM1499 NZ LYS18823.268 19.865 14.162 1.00 13.31 APEPATOM1500 C LYS18819.289 25.428 11.349 1.00 7.81 APEPATOM1501 O LYS18819.988 26.328 10.890 1.00 9.61 APEPATOM1502 N HIS18918.216 25.646 12.097 1.00 9.34 APEPATOM1503 CA HIS18917.823 26.977 12.532 1.00 9.56 APEPATOM1504 CB HIS18916.391 27.315 12.119 1.00 9.45 APEPATOM1505 CG HIS18916.033 28.756 12.331 1.00 11.25 APEPATOM1506 CD2 HIS18916.739 29.777 12.870 1.00 11.06 APEPATOM1507 ND1 HIS18914.822 29.291 11.946 1.00 13.10 APEPATOM1508 CE1 HIS18914.800 30.579 12.237 1.00 11.47 APEPATOM1509 NE2 HIS18915.950 30.900 12.799 1.00 12.33 APEPATOM1510 C HIS18917.911 26.904 14.049 1.00 9.30 APEPATOM1511 O HIS18917.265 26.060 14.671 1.00 9.01 APEPATOM1512 N TYR19018.717 27.781 14.635 1.00 10.00 APEPATOM1513 CA TYR19018.928 27.816 16.080 1.00 9.41 APEPATOM1514 CB TYR19020.433 27.745 16.343 1.00 11.08 APEPATOM1515 CG TYR19020.872 27.618 17.788 1.00 11.54 APEPATOM1516 CD1 TYR19020.017 27.124 18.777 1.00 11.05 APEPATOM1517 CE1 TYR19020.458 26.983 20.108 1.00 10.64 APEPATOM1518 CD2 TYR19022.173 27.971 18.157 1.00 11.80 APEPATOM1519 CE2 TYR19022.618 27.835 19.467 1.00 12.63 APEPATOM1520 CZ TYR19021.767 27.342 20.435 1.00 11.58 APEPATOM1521 OH TYR19022.257 27.190 21.713 1.00 12.58 APEP
ATOM1522 C TYR19018.337 29.076 16.716 1.00 8.19 APEPATOM1523 O TYR19018.803 30.184 16.456 1.00 6.34 APEPATOM1524 N LEU19117.313 28.895 17.549 1.00 7.47 APEPATOM1525 CA LEU19116.656 30.011 18.226 1.00 8.92 APEPATOM1526 CB LEU19115.151 30.001 17.926 1.00 8.75 APEPATOM1527 CG LEU19114.308 31.101 18.599 1.00 11.51 APEPATOM1528 CD1 LEU19114.540 32.444 17.916 1.00 9.71 APEPATOM1529 CD2 LEU19112.831 30.724 18.541 1.00 9.30 APEPATOM1530 C LEU19116.890 29.996 19.743 1.00 9.50 APEPATOM1531 O LEU19116.667 28.988 20.416 1.00 11.01 APEPATOM1532 N VAL19217.347 31.128 20.266 1.00 9.30 APEPATOM1533 CA VAL19217.629 31.291 21.690 1.00 10.13 APEPATOM1534 CB VAL19219.145 31.536 21.923 1.00 10.96 APEPATOM1535 CG1 VAL19219.387 32.044 23.344 1.00 11.81 APEPATOM1536 CG2 VAL19219.934 30.267 21.659 1.00 11.43 APEPATOM1537 C VAL19216.875 32.510 22.231 1.00 10.34 APEPATOM1538 O VAL19217.078 33.621 21.745 1.00 10.10 APEPATOM1539 N CYS19316.009 32.315 23.226 1.00 8.18 APEPATOM1540 CA CYS19315.276 33.442 23.810 1.00 8.37 APEPATOM1541 C CYS19315.600 33.609 25.296 1.00 8.44 APEPATOM1542 O CYS19315.514 32.650 26.061 1.00 6.27 APEPATOM1543 CB CYS19313.762 33.258 23.649 1.00 9.08 APEPATOM1544 SG CYS19313.062 33.556 21.985 1.00 8.61 APEPATOM1545 N ASN19415.978 34.826 25.694 1.00 8.32 APEPATOM1546 CA ASN19416.310 35.133 27.086 1.00 7.48 APEPATOM1547 CB ASN19417.582 35.991 27.149 1.00 8.69 APEPATOM1548 CG ASN19418.840 35.190 26.868 1.00 6.67 APEPATOM1549 OD1 ASN19418.772 33.995 26.596 1.00 9.58 APEPATOM1550 ND2 ASN19419.989 35.843 26.932 1.00 4.71 APEPATOM1551 C ASN19415.140 35.859 27.766 1.00 7.75 APEPATOM1552 O ASN19414.540 36.760 27.175 1.00 5.25 APEPATOM1553 N TYR19514.834 35.475 29.009 1.00 7.83 APEPATOM1554 CA TYR19513.699 36.047 29.749 1.00 7.00 APEPATOM1555 CB TYR19512.736 34.924 30.138 1.00 6.30 APEPATOM1556 CG TYR19512.180 34.180 28.949 1.00 8.42 APEPATOM1557 CD1 TYR19512.918 33.175 28.329 1.00 7.89 APEPATOM1558 CE1 TYR19512.436 32.510 27.219 1.00 8.54 APEPATOM1559 CD2 TYR19510.934 34.501 28.422 1.00 6.50 APEPATOM1560 CE2 TYR19510.438 33.835 27.300 1.00 8.99 APEPATOM1561 CZ TYR19511.199 32.837 26.707 1.00 8.08 APEPATOM1562 OH TYR19510.724 32.142 25.617 1.00 8.91 APEPATOM1563 C TYR19514.047 36.860 30.999 1.00 6.48 APEPATOM1564 O TYR19514.840 36.422 31.822 1.00 7.26 APEPATOM1565 N GLY19613.418 38.025 31.154 1.00 6.42 APEPATOM1566 CA GLY19613.709 38.867 32.303 1.00 6.88 APEPATOM1567 C GLY19612.558 39.431 33.131 1.00 8.03 APEPATOM1568 O GLY19611.649 40.075 32.596 1.00 8.29 APEPATOM1569 N PRO19712.541 39.157 34.445 1.00 6.50 APEPATOM1570 CD PRO19711.525 39.698 35.363 1.00 7.41 APEPATOM1571 CA PRO19713.536 38.343 35.153 1.00 6.68 APEPATOM1572 CB PRO19713.300 38.688 36.610 1.00 6.91 APEPATOM1573 CG PRO19711.856 39.041 36.672 1.00 6.39 APEPATOM1574 C PRO19713.266 36.868 34.854 1.00 6.69 APEPATOM1575 O PRO19712.255 36.537 34.238 1.00 6.02 APEPATOM1576 N SER19814.153 35.975 35.286 1.00 7.01 APEPATOM1577 CA SER19813.953 34.557 35.001 1.00 7.41 APEPATOM1578 CB SER19815.233 33.755 35.303 1.00 4.71 APEP
ATOM1579 OG SER19815.558 33.752 36.682 1.00 11.52 APEPATOM1580 C SER19812.765 33.927 35.717 1.00 7.39 APEPATOM1581 O SER19812.161 34.528 36.605 1.00 6.19 APEPATOM1582 N GLY19912.423 32.716 35.289 1.00 7.86 APEPATOM1583 CA GLY19911.332 31.977 35.893 1.00 8.49 APEPATOM1584 C GLY19911.894 30.622 36.274 1.00 8.12 APEPATOM1585 O GLY19913.110 30.450 36.306 1.00 8.44 APEPATOM1586 N ASN20011.022 29.670 36.570 1.00 9.40 APEPATOM1587 CA ASN20011.433 28.317 36.929 1.00 11.14 APEPATOM1588 CB ASN20012.344 27.742 35.844 1.00 11.38 APEPATOM1589 CG ASN20011.581 27.365 34.591 1.00 12.36 APEPATOM1590 OD1 ASN20010.360 27.478 34.550 1.00 13.35 APEPATOM1591 ND2 ASN20012.293 26.919 33.566 1.00 10.02 APEPATOM1592 C ASN20012.102 28.177 38.296 1.00 12.89 APEPATOM1593 O ASN20013.019 27.373 38.477 1.00 12.94 APEPATOM1594 N PHE20111.632 28.957 39.262 1.00 14.46 APEPATOM1595 CA PHE20112.157 28.890 40.622 1.00 16.00 APEPATOM1596 CB PHE20111.947 30.224 41.339 1.00 14.75 APEPATOM1597 CG PHE20112.805 31.338 40.811 1.00 13.67 APEPATOM1598 CD1 PHE20112.267 32.311 39.982 1.00 13.83 APEPATOM1599 CD2 PHE20114.151 31.421 41.157 1.00 17.70 APEPATOM1600 CE1 PHE20113.047 33.350 39.505 1.00 14.74 APEPATOM1601 CE2 PHE20114.948 32.460 40.685 1.00 17.45 APEPATOM1602 CZ PHE20114.394 33.427 39.857 1.00 17.09 APEPATOM1603 C PHE20111.347 27.786 41.304 1.00 16.58 APEPATOM1604 O PHE20110.124 27.876 41.385 1.00 16.44 APEPATOM1605 N LYS20212.026 26.755 41.797 1.00 18.81 APEPATOM1606 CA LYS20211.351 25.617 42.421 1.00 21.27 APEPATOM1607 CB LYS20212.386 24.588 42.883 1.00 25.00 APEPATOM1608 CG LYS20212.314 23.274 42.101 1.00 29.78 APEPATOM1609 CD LYS20213.215 22.197 42.698 1.00 31.92 APEPATOM1610 CE LYS20212.574 20.816 42.609 1.00 32.51 APEPATOM1611 NZ LYS20212.138 20.304 43.944 1.00 30.68 APEPATOM1612 C LYS20210.365 25.899 43.555 1.00 21.29 APEPATOM1613 O LYS2029.347 25.218 43.676 1.00 22.50 APEPATOM1614 N ASN20310.642 26.894 44.385 1.00 20.90 APEPATOM1615 CA ASN2039.726 27.190 45.485 1.00 22.00 APEPATOM1616 CB ASN20310.520 27.657 46.711 1.00 23.02 APEPATOM1617 CG ASN20311.274 28.953 46.466 1.00 23.60 APEPATOM1618 OD1 ASN20311.559 29.698 47.401 1.00 24.95 APEPATOM1619 ND2 ASN20311.605 29.223 45.209 1.00 25.38 APEPATOM1620 C ASN2038.656 28.232 45.134 1.00 20.82 APEPATOM1621 O ASN2038.096 28.877 46.025 1.00 20.77 APEPATOM1622 N GLU2048.363 28.384 43.845 1.00 16.60 APEPATOM1623 CA GLU2047.382 29.372 43.414 1.00 17.29 APEPATOM1624 CB GLU2048.093 30.550 42.737 1.00 17.84 APEPATOM1625 CG GLU2049.303 31.084 43.489 1.00 17.21 APEPATOM1626 CD GLU2049.801 32.408 42.937 1.00 17.35 APEPATOM1627 OE1 GLU2049.157 32.963 42.023 1.00 15.88 APEPATOM1628 OE2 GLU20410.842 32.895 43.422 1.00 17.79 APEPATOM1629 C GLU2046.298 28.842 42.475 1.00 17.89 APEPATOM1630 O GLU2046.383 27.727 41.963 1.00 16.49 APEPATOM1631 N GLU2055.283 29.672 42.251 1.00 19.78 APEPATOM1632 CA GLU2054.159 29.335 41.383 1.00 20.21 APEPATOM1633 CB GLU2052.851 29.854 41.992 1.00 23.42 APEPATOM1634 CG GLU2052.609 31.347 41.772 1.00 28.77 APEPATOM1635 CD GLU2052.874 32.176 43.022 1.00 32.85 APEP
ATOM1636 OE1 GLU2053.94231.984 43.660 1.00 31.69 APEPATOM1637 OE2 GLU2052.00833.019 43.364 1.00 32.48 APEPATOM1638 C GLU2054.34829.956 40.009 1.00 18.17 APEPATOM1639 O GLU2054.91831.039 39.891 1.00 15.97 APEPATOM1640 N LEU2063.86329.275 38.974 1.00 16.44 APEPATOM1641 CA LEU2063.98329.785 37.617 1.00 15.66 APEPATOM1642 CB LEU2063.27528.860 36.626 1.00 15.15 APEPATOM1643 CG LEU2063.86927.478 36.368 1.00 12.15 APEPATOM1644 CD1 LEU2063.18926.871 35.173 1.00 9.94 APEPATOM1645 CD2 LEU2065.37027.579 36.148 1.00 10.37 APEPATOM1646 C LEU2063.33331.155 37.561 1.00 15.68 APEPATOM1647 O LEU2063.92832.125 37.076 1.00 16.18 APEPATOM1648 N TYR2072.10531.217 38.065 1.00 14.52 APEPATOM1649 CA TYR2071.33232.451 38.090 1.00 15.05 APEPATOM1650 CB TYR2070.74232.746 36.705 1.00 12.49 APEPATOM1651 CG TYR207-0.046 31.604 36.083 1.00 12.80 APEPATOM1652 CD1 TYR207-1.379 31.365 36.441 1.00 13.16 APEPATOM1653 CE1 TYR207-2.113 30.327 35.856 1.00 12.28 APEPATOM1654 CD2 TYR2070.53330.774 35.120 1.00 14.06 APEPATOM1655 CE2 TYR207-0.195 29.731 34.528 1.00 14.10 APEPATOM1656 CZ TYR207-1.513 29.515 34.903 1.00 12.49 APEPATOM1657 OH TYR207-2.220 28.487 34.332 1.00 12.47 APEPATOM1658 C TYR2070.20632.331 39.113 1.00 14.67 APEPATOM1659 O TYR207-0.088 31.244 39.595 1.00 15.57 APEPATOM1660 N GLN208-0.425 33.453 39.432 1.00 15.61 APEPATOM1661 CA GLN208-1.523 33.466 40.393 1.00 15.81 APEPATOM1662 CB GLN208-1.733 34.892 40.896 1.00 14.83 APEPATOM1663 CG GLN208-2.440 34.994 42.231 1.00 16.28 APEPATOM1664 CD GLN208-2.843 36.418 42.564 1.00 16.96 APEPATOM1665 OE1 GLN208-2.074 37.364 42.352 1.00 16.63 APEPATOM1666 NE2 GLN208-4.051 36.581 43.086 1.00 16.21 APEPATOM1667 C GLN208-2.809 32.947 39.739 1.00 17.01 APEPATOM1668 O GLN208-3.243 33.469 38.717 1.00 14.76 APEPATOM1669 N THR209-3.422 31.921 40.316 1.00 19.39 APEPATOM1670 CA THR209-4.649 31.392 39.736 1.00 23.16 APEPATOM1671 CB THR209-4.792 29.877 39.953 1.00 23.21 APEPATOM1672 OG1 THR209-5.010 29.617 41.343 1.00 27.25 APEPATOM1673 CG2 THR209-3.559 29.151 39.496 1.00 23.39 APEPATOM1674 C THR209-5.873 32.063 40.340 1.00 25.33 APEPATOM1675 O THR209-5.868 32.455 41.505 1.00 25.28 APEPATOM1676 N LYS210-6.922 32.188 39.536 1.00 27.53 APEPATOM1677 CA LYS210-8.160 32.801 39.986 1.00 29.31 APEPATOM1678 CB LYS210-8.491 34.019 39.122 1.00 30.03 APEPATOM1679 CG LYS210-8.643 33.696 37.647 1.00 28.82 APEPATOM1680 CD LYS210-9.575 34.675 36.963 1.00 29.76 APEPATOM1681 CE LYS210-8.897 35.345 35.771 1.00 28.88 APEPATOM1682 NZ LYS210-9.500 36.669 35.437 1.00 28.04 APEPATOM1683 C LYS210-9.272 31.775 39.873 1.00 31.66 APEPATOM1684 OT1 LYS210-10.171 31.775 40.744 1.00 33.57 APEPATOM1685 OT2 LYS210-9.224 30.981 38.906 1.00 33.91 APEPATOM1686 OH2 WAT100128.321 31.884 30.023 1.00 4.99 AWATATOM1687 OH2 WAT10020.070 28.637 38.280 1.00 5.19 AWATATOM1688 OH2 WAT10039.574 34.984 40.199 1.00 6.03 AWATATOM1689 OH2 WAT100413.423 28.241 4.674 1.00 6.60 AWATATOM1690 OH2 WAT100525.593 14.211 8.905 1.00 9.08 AWATATOM1691 OH2 WAT1006-5.948 28.133 30.378 1.00 7.55 AWATATOM1692 OH2 WAT100713.729 27.746 30.599 1.00 8.15 AWAT
ATOM1693 OH2 WAT 100822.453 33.974 26.365 1.00 6.87 AWATATOM1694 OH2 WAT 100911.644 46.107 27.594 1.00 4.61 AWATATOM1695 OH2 WAT 1010-0.650 26.162 33.901 1.00 8.02 AWATATOM1696 OH2 WAT 10118.755 23.060 34.455 1.00 10.12 AWATATOM1697 OH2 WAT 101210.789 39.348 8.288 1.00 3.59 AWATATOM1698 OH2 WAT 101328.091 15.737 14.912 1.00 8.00 AWATATOM1699 OH2 WAT 101516.397 43.678 19.387 1.00 2.04 AWATATOM1700 OH2 WAT 101614.311 29.731 32.127 1.00 5.53 AWATATOM1701 OH2 WAT 10172.570 41.167 21.545 1.00 5.42 AWATATOM1702 OH2 WAT 101825.364 28.506 21.332 1.00 9.41 AWATATOM1703 OH2 WAT 101926.107 50.461 26.214 1.00 5.64 AWATATOM1704 OH2 WAT 102030.469 46.598 34.207 1.00 7.23 AWATATOM1705 OH2 WAT 102130.251 20.969 8.904 1.00 13.93 AWATATOM1706 OH2 WAT 1022-4.476 37.486 34.043 1.00 7.76 AWATATOM1707 OH2 WAT 102331.770 27.794 19.020 1.00 13.29 AWATATOM1708 OH2 WAT 102417.644 44.091 30.228 1.00 8.53 AWATATOM1709 OH2 WAT 1025-6.207 19.852 35.253 1.00 17.83 AWATATOM1710 OH2 WAT 102614.737 24.657 10.954 1.00 12.71 AWATATOM1711 OH2 WAT 10273.824 43.790 24.674 1.00 11.15 AWATATOM1712 OH2 WAT 10287.499 17.209 26.860 1.00 18.25 AWATATOM1713 OH2 WAT 10290.968 25.199 21.221 1.00 13.34 AWATATOM1714 OH2 WAT 103011.738 36.462 38.807 1.00 14.39 AWATATOM1715 OH2 WAT 10315.648 34.014 38.427 1.00 9.11 AWATATOM1716 OH2 WAT 10321.664 14.320 37.328 1.00 15.77 AWATATOM1717 OH2 WAT 103331.940 28.802 10.755 1.00 8.72 AWATATOM1718 OH2 WAT 10345.832 22.098 18.171 1.00 6.17 AWATATOM1719 OH2 WAT 103533.701 30.509 31.974 1.00 18.85 AWATATOM1720 OH2 WAT 103629.165 34.668 37.418 1.00 10.68 AWATATOM1721 OH2 WAT 1037-0.407 43.489 29.418 1.00 8.15 AWATATOM1722 OH2 WAT 103830.861 44.589 26.320 1.00 13.36 AWATATOM1723 OH2 WAT 10398.345 41.081 37.778 1.00 13.31 AWATATOM1724 OH2 WAT 104010.895 22.815 23.399 1.00 20.54 AWATATOM1725 OH2 WAT 104131.503 42.501 27.942 1.00 12.75 AWATATOM1726 OH2 WAT 1042-4.123 17.556 26.927 1.00 6.26 AWATATOM1727 OH2 WAT 104323.631 25.350 17.618 1.00 16.68 AWATATOM1728 OH2 WAT 1044-9.263 19.789 28.769 1.00 17.07 AWATATOM1729 OH2 WAT 10452.681 26.188 40.094 1.00 10.27 AWATATOM1730 OH2 WAT 10466.157 33.281 40.876 1.00 10.99 AWATATOM1731 OH2 WAT 10471.411 42.305 11.357 1.00 12.65 AWATATOM1732 OH2 WAT 104811.027 43.128 8.836 1.00 13.35 AWATATOM1733 OH2 WAT 10498.163 26.637 9.371 1.00 9.12 AWATATOM1734 OH2 WAT 105030.812 52.897 21.367 1.00 5.26 AWATATOM1735 OH2 WAT 1051-1.056 38.906 21.594 1.00 21.26 AWATATOM1736 OH2 WAT 105223.484 37.806 38.523 1.00 5.01 AWATATOM1737 OH2 WAT 105316.091 23.219 9.132 1.00 9.59 AWATATOM1738 OH2 WAT 105410.515 44.724 16.202 1.00 21.22 AWATATOM1739 OH2 WAT 10553.858 42.457 19.188 1.00 18.71 AWATATOM1740 OH2 WAT 105620.767 38.301 29.092 1.00 7.32 AWATATOM1741 OH2 WAT 105731.450 37.717 33.751 1.00 12.78 AWATATOM1742 OH2 WAT 1058-6.469 15.556 29.885 1.00 18.83 AWATATOM1743 OH2 WAT 105919.569 32.500 35.567 1.00 13.66 AWATATOM1744 OH2 WAT 106012.883 32.203 45.018 1.00 19.55 AWATATOM1745 OH2 WAT 106116.666 38.811 39.230 1.00 12.36 AWATATOM1746 OH2 WAT 10621.627 24.661 38.597 1.00 11.62 AWATATOM1747 OH2 WAT 1063-3.797 23.480 20.462 1.00 13.70 AWATATOM1748 OH2 WAT 106419.662 43.909 20.583 1.00 17.87 AWATATOM1749 OH2 WAT 106528.959 36.788 18.981 1.00 20.15 AWAT
ATOM1750 OH2 WAT 106615.034 47.186 24.909 1.00 7.01 AWATATOM1751 OH2 WAT 10671.479 45.140 16.462 1.00 15.19 AWATATOM1752 OH2 WAT 1068-9.159 26.374 32.728 1.00 10.66 AWATATOM1753 OH2 WAT 106918.343 40.026 15.719 1.00 11.74 AWATATOM1754 OH2 WAT 1070-4.926 34.883 22.765 1.00 5.57 AWATATOM1755 OH2 WAT 107111.439 44.250 34.445 1.00 17.87 AWATATOM1756 OH2 WAT 107222.346 33.157 38.515 1.00 15.02 AWATATOM1757 OH2 WAT 107316.431 21.026 -0.735 1.00 17.18 AWATATOM1758 OH2 WAT 107417.273 13.097 2.769 1.00 16.44 AWATATOM1759 OH2 WAT 107520.717 41.158 18.875 1.00 11.16 AWATATOM1760 OH2 WAT 107613.429 19.165 10.121 1.00 9.99 AWATATOM1761 OH2 WAT 107722.253 23.110 28.097 1.00 14.11 AWATATOM1762 OH2 WAT 1078-1.729 14.634 27.851 1.00 9.23 AWATATOM1763 OH2 WAT 107916.196 36.453 9.936 1.00 18.57 AWATATOM1764 OH2 WAT 108026.774 40.940 39.176 1.00 15.71 AWATATOM1765 OH2 WAT 108127.996 20.266 5.357 1.00 3.12 AWATATOM1766 OH2 WAT 108214.345 44.903 9.828 1.00 16.53 AWATATOM1767 OH2 WAT 1083-6.956 19.549 24.667 1.00 13.41 AWATATOM1768 OH2 WAT 10846.677 22.676 16.370 1.00 9.78 AWATATOM1769 OH2 WAT 108524.055 17.307 14.279 1.00 9.70 AWATATOM1770 OH2 WAT 108632.348 29.000 20.500 1.00 15.00 AWATATOM1771 OH2 WAT 1087-6.421 34.306 42.856 1.00 13.87 AWATATOM1772 OH2 WAT 108828.806 26.184 27.568 1.00 16.70 AWATATOM1773 OH2 WAT 10899.354 17.475 43.914 1.00 16.99 AWATATOM1774 OH2 WAT 109030.672 20.876 12.987 1.00 21.44 AWATATOM1775 OH2 WAT 1091-7.795 23.654 35.198 1.00 12.77 AWATATOM1776 OH2 WAT 10926.675 42.663 7.635 1.00 17.23 AWATATOM1777 OH2 WAT 109314.348 49.247 34.229 1.00 10.41 AWATATOM1778 OH2 WAT 1094-2.481 40.065 24.802 1.00 16.54 AWATATOM1779 OH2 WAT 1095-5.184 39.229 18.838 1.00 28.58 AWATATOM1780 OH2 WAT 1096-6.282 29.165 17.208 1.00 27.91 AWATATOM1781 OH2 WAT 10973.526 19.041 19.713 1.00 16.33 AWATATOM1782 OH2 WAT 1098-5.490 40.336 27.666 1.00 20.30 AWATATOM1783 OH2 WAT 10995.791 43.554 30.434 1.00 14.00 AWATATOM1784 OH2 WAT 110010.085 34.242 9.352 1.00 19.88 AWATATOM1785 OH2 WAT 110122.752 37.487 8.325 1.00 16.96 AWATATOM1786 OH2 WAT 110222.364 40.020 38.129 1.00 15.64 AWATATOM1787 OH2 WAT 110333.666 37.537 19.756 1.00 23.15 AWATATOM1788 OH2 WAT 110436.579 34.638 23.256 1.00 16.03 AWATATOM1789 OH2 WAT 110531.645 31.136 11.971 1.00 18.60 AWATATOM1790 OH2 WAT 110614.823 26.519 41.694 1.00 15.23 AWATATOM1791 OH2 WAT 110713.638 21.317 9.375 1.00 12.16 AWATATOM1792 OH2 WAT 110833.913 48.939 32.690 1.00 11.76 AWATATOM1793 OH2 WAT 11093 3.415 48.326 34.490 1.00 20.71 AWATATOM1794 OH2 WAT 1110-8.560 41.287 43.725 1.00 12.63 AWATATOM1795 OH2 WAT 111122.656 24.209 0.884 1.00 17.46 AWATATOM1796 OH2 WAT 11122.716 41.252 15.063 1.00 19.18 AWATATOM1797 OH2 WAT 111330.635 31.007 7.714 1.00 10.21 AWATATOM1798 OH2 WAT 111414.815 22.010 39.023 1.00 27.49 AWATATOM1799 OH2 WAT 111533.286 47.303 24.007 1.00 12.66 AWATATOM1800 OH2 WAT 111614.042 33.412 10.622 1.00 10.91 AWATATOM1801 OH2 WAT 111720.195 27.499 32.658 1.00 18.38 AWATATOM1802 OH2 WAT 111831.215 17.825 13.678 1.00 17.20 AWATATOM1803 OH2 WAT 111930.831 21.030 11.086 1.00 17.97 AWATATOM1804 OH2 WAT 112030.910 27.311 25.284 1.00 17.48 AWATATOM1805 OH2 WAT 11216.259 13.355 26.082 1.00 21.34 AWATATOM1806 OH2 WAT 112234.780 29.659 15.089 1.00 23.24 AWAT
ATOM1807 OH2 WAT 112333.170 28.242 23.488 1.00 16.58 AWATATOM1808 OH2 WAT 11240.913 40.672 41.455 1.00 17.75 AWATATOM1809 OH2 WAT 112525.393 36.689 42.266 1.00 22.18 AWATATOM1810 OH2 WAT 112621.923 40.748 15.035 1.00 20.08 AWATATOM1811 OH2 WAT 1127-1.339 28.433 21.094 1.00 17.33 AWATATOM1812 OH2 WAT 112822.058 28.769 33.380 1.00 22.93 AWATATOM1813 OH2 WAT 11292.232 23.035 17.663 1.00 13.73 AWATATOM1814 OH2 WAT 11304.834 40.228 40.117 1.00 39.84 AWATATOM1815 OH2 WAT 113116.182 27.937 1.692 1.00 9.10 AWATATOM1816 OH2 WAT 113236.696 43.322 33.662 1.00 14.41 AWATATOM1817 NA NAT 500 -4.312 15.332 28.374 1.00 11.67 ANATENDVes v 5氨基酸残基的溶剂可及性在表7中给出。
表7Ves v 5氨基酸的表面暴露编号 AA溶剂暴露3 E 0.8024 A 0.0605 E 0.3906 F 0.8687 N 0.4848 N 0.5559 Y 0.03310C 0.41211K 0.97812I 0.22513K 0.95114C 0.03815L 0.71416K 1.00017G 0.14318G 0.27519V 0.44520H 0.01621T 0.00022A 0.04923C 0.20924K 0.48925Y 0.28026G 0.35227S 0.15928L 0.42329K 0.79730P 0.23131N 0.39632C 0.05533G 0.429
34N 0.77535K 0.29736V 0.48937V 0.28038V 0.37939S 0.29140Y 0.59341G 0.16542L 0.12143T 0.42344K 0.97845Q 0.53846E 0.26447K 0.39648Q 0.59349D 0.30250I 0.00051L 0.19852K 0.61553E 0.17054H 0.00055N 0.11556D 0.44557F 0.02758R 0.00059Q 0.19860K 0.40761I 0.00062A 0.03363R 0.95664G 0.14865L 0.59366E 0.00567T 0.61068R 0.33569G 0.11070N 0.54971P 0.36372G 0.17073P 0.44074Q 0.00575P 0.20976P 0.23677A 0.02278K 0.77579N 0.23680M 0.06681K 0.58882N 0.50083L 0.016
84 V 0.46285 W 0.27586 N 0.16587 D 0.62188 E 0.24789 L 0.00590 A 0.05591 Y 0.11592 V 0.00593 A 0.00094 Q 0.15995 V 0.01196 W 0.07797 A 0.00098 N 0.00599 Q 0.027100C 0.027101Q 0.577102Y 0.687103G 0.110104H 0.549105D 0.022106T 0.429107C 0.000108R 0.203109D 0.093110V 0.044111A 0.500112K 0.824113Y 0.209114Q 0.423115V 0.011116G 0.011117Q 0.066118N 0.005119V 0.022120A 0.016121L 0.198122T 0.198123G 0.231124S 0.236125T 0.610126A 0.253127A 0.379128K 0.857129Y 0.352130D 0.220131D 0.495132P 0.033133V 0.137
134K 0.654135L 0.000136V 0.000137K 0.538138M 0.473139W 0.016140E 0.071141D 0.341142E 0.154143V 0.000144K 0.560145D 0.390146Y 0.044147N 0.165148P 0.214149K 0.868150K 0.604151K 0.753152F 0.071153S 0.302154G 0.192155N 0.121156D 0.379157F 0.819158L 0.714159K 0.533160T 0.000161G 0.077162H 0.231163Y 0.000164T 0.000165Q 0.011166M 0.000167V 0.000168W 0.005169A 0.011170N 0.429171T 0.000172K 0.451173E 0.165174V 0.000175G 0.000176C 0.016177G 0.000178S 0.016179I 0.000180K 0.214181Y 0.016182I 0.275183Q 0.231
184E 0.841185K 0.989186W 0.665187H 0.159188K 0.203189H 0.011190Y 0.000191L 0.000192V 0.000193C 0.000194N 0.000195Y 0.000196G 0.000197P 0.225198S 0.110199G 0.027200N 0.308201F 0.341202K 0.824203N 0.797204E 0.374205E 0.511206L 0.055207Y 0.082208Q 0.566209T 0.473210K 0.962实施例10 Ag 5s的比对来自黄胡蜂属、长黄胡蜂属、胡蜂属、马蜂属和Solenopsis(火蚁)的选定抗原5序列的比对在图12中显示。黄胡蜂属、长黄胡蜂属、胡蜂属和马蜂属都属于胡蜂科。该图也包括Ves v 5的二级结构元件。当仅仅考虑黄胡蜂属抗原5s时，观察到非常高度的表面保守性(图5)，残基的保守性几乎呈均匀的分布，仅有几个不保守残基分散于分子中。
相反，当比较来自黄胡蜂属和马蜂属的序列时，保守的表面局限在5个区域，它们分别具有392_2、589_2、589_2、673_2和1053_2的溶剂可及面积。溶剂可及性利用NACCESS程序计算(S.J.Hubbard和J.M.Thornton，1992，NACCESS(2.1.1版)生物化学和分子生物学系，UniversityCollege London)，使用的探针半径为1.4_。类似地，在黄胡蜂属和胡蜂属/长黄胡蜂属之间对应于在黄胡蜂属和马蜂属之间保守的这5个表面区域的5个表面区域也是保守的。对于后者，所述区域分别为280_2、496_2、730_2、803_2和1043_2。对第一表面区域起作用的残基主要来自B链的开端和螺旋IV，对第二表面区域起作用的残基主要来自A链以及螺旋II和B链之间的环。对第三表面区域起作用的残基主要来自螺旋I及其周围环境和螺旋II的末尾，对第四表面区域起作用的残基主要是N-端来源的，而第五表面区域的残基主要来自螺旋I的末尾和螺旋I与A链之间的环。
讨论蛋白质抗原-抗体复合体的晶体学研究表明表位的接触型残基可能包含抗原表面的多至17个残基，并且这些残基可以在肽链上彼此连续或不连续(Davies等人，1996，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)937)。用单克隆抗体对溶菌酶的表位作图显示该蛋白质的整个表面都具有潜在的抗原性(Newmann等人，1992，免疫学杂志(J.Immunol.)1493260)。因此，具有1/10至3/4小黄蜂抗原5的杂合体会比亲本分子具有较少的表位。
图7中的CD光谱数据揭示杂合体与胡蜂抗原5s具有非常相似(即使不是相同)的二级结构。图8和图9中使用Ves v 5特异性人和小鼠抗体得到的抑制数据和表3中使用杂合体特异性抗体得到的抗体结合数据揭示，杂合体具有与Ves v 5非常相似或相同的三级结构，因为这些抗体不与变性的Ves v 5结合。另外的证据来自利用17个天然Ves v 5特异性单克隆小鼠IgG1抗体得到的筛选结果，其中6个结合N-端杂合体PV1-46。因此，这些数据说明杂合体含有Ves v 5的不连续B细胞表位。
利用多克隆抗体得到的抑制数据和利用单克隆抗体得到的结合数据显示，Ves v 5的显性B细胞表位在其N-端区域。对Ves v 5的结构检测显示，位于N-端杂合体PV1-46中的几乎所有残基都是表面可及的(参见表7)。这与C-端杂合体PV156-204相反，在PV156-204中，仅一些Ves v 5的片断是表面可及的(参见表7)。这种在表面可及性上的差异可以解释抗原5的N-端区域的免疫优势。其他人已证实蛋白质的全部表面都具有潜在的抗原性，但具有高表面可及性和表面突出的区域是显性的(Newmann等人，1992，免疫学杂志(J.Immunol)1493260和Novotny等人，1996，Adv Prot Chem 49149)。
目前，绘制不连续表位的唯一已知方法是Ag-Ab复合体的X射线晶体学(Davies等人，1996，美国国家科学院院报(Proc.Natl Acad.Sci USA)937)，并且这需要拥有特异性单克隆抗体。已利用一系列小鼠-人杂合体绘制了CD39的不连续表位，小鼠和人CD39分子具有75％的序列同一性并且它们共同拥有有限的抗原交叉反应(Maliszewski等人，1994，免疫学杂志(J.Immunol)1533574)。这些利用CD39和抗原5得到的发现显示两个同源蛋白质的杂合体是一种绘制它们的不连续B细胞表位的有用方法。
我们利用杂合体Ag 5s得到的结果证实，杂合变应原的变应原性可以有一百至一千倍的减少，而其又保留天然变应原的免疫原性。杂合体在变应原性上的这种减少据认为主要是由于B细胞表位密度的下降所致。实施例中的每一杂合体都仅具有Ves v 5的B细胞和T细胞表位的一部分。然而，原则上，杂合体的混合物可以重建Ves v 5的完整表位文库。因此，可以重建所有表位以制备用作疫苗的修饰的变应原。我们的结果提示具有Ves v 5的20-30个残基的PV杂合体在变应原性上会有最大的减少但又保留Ves v 5的免疫原性。
许多变应原与不同来源的蛋白质具有序列同源性(Larsen等人，1996，变态反应临床免疫学杂志(J.Allergy Clin Immunol)97577)。例如，胡蜂Ag 5s与不同生物体(从真菌到人类)来源的多种细胞外蛋白质具有不同程度的序列同源性(参见图12)。已经知道，具有30％序列同一性的同源蛋白质可能具有相同或非常相似的结构(Chothia等人，1990，生物化学年评(Annual Review Biochem)591007和Russell等人，1994，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)244332)。因此，可以利用多种同源宿主蛋白质作为目的客变应原片断的支架来制备杂合体。
本发明并不限于此处描述的特定实施方案的范围。实际上，对本领域技术人员而言，根据上面的描述和附图，除了于此描述的之外，本发明的各种修饰是是显而易见的。这些修饰也应该在所附权利要求的范围之内。
于此引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其它材料均特此全部引入作为参考。
表8变应原
a克隆(C)或者蛋白(P)数据附录I参考文献1.Marsh，D.G.，和L.R.Freidhoff.1992.ALBE，变应原数据库.IUIS，Baltimore，MD，1.0版。
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表9.蛋白质数据库(PDB)中可得到其结构的变应原ID NO1A0K登记02-12-1997实验方法X-射线衍射分辨率2.20_标题 拟南芥抑制蛋白I分类 细胞骨架化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白；链无；工程化重组植物蛋白；生物单元单体ID NO1A9V登记10-4-1998实验方法核磁共振，10个结构标题 主要屋尘螨变应原Der P 2的三级结构，核磁共振，10个结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子螨变应原Der P 2；链无；工程化是；突变D1S；其他细节以增强N末端Met去除而制备的D1S突变株ID NO1AHK登记07-4-1997实验方法核磁共振，最小化平均结构标题 Der F 2，粉尘螨的主要螨变应原，核磁共振，最小化平均结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子Der F 2；链无；同物异名Der F II；工程化是ID NO1AHM登记07-4-1997实验方法核磁共振，10个结构标题 Der F 2，粉尘螨的主要螨变应原，核磁共振，10个结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子Der F 2；链无；同物异名Der F II；工程化是ID NO1B6F登记13-1-1999实验方法核磁共振，23个结构标题 桦属花粉变应原Bet V 1分类 植物蛋白化合物 Mol_Id1；分子主要花粉变应原Bet V 1-A；链A；工程化是；突变是ID NO1BBG登记24-4-1998实验方法核磁共振，最小化平均结构标题 来自三裂豚草V的豚草花粉变应原，核磁共振，最小化平均结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子花粉变应原5；链无ID NO1BJ7登记02-7-1998实验方法X-射线衍射分辨率1.80_标题 牛Lipocalin变应原Bos D 2分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子D 2；链无；同物异名皮屑主要变应原Bda20，皮肤变应原Bda20；工程化是；生物单元单体
ID NO1BMW登记27-7-1998实验方法核磁共振，38个结构标题 植物变应原中的一种III型纤连蛋白折叠来自梯牧草花粉的Phl Pii的溶液结构，核磁共振，38个结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子花粉变应原Phl P2；链无；同物异名Phl PII；工程化是；生物单元单体ID NO1BTV登记30-1-1997实验方法核磁共振，20个结构标题 Bet V 1的结构，核磁共振，20个结构分类 主要桦树花粉变应原化合物 Mol_Id1；分子Bet V 1；链无；工程化是ID NO1BV1登记08-7-1997实验方法X-射线衍射分辨率2.00_标题 桦属花粉变应原Bet V 1分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子Bet V 1；链无；同物异名主要花粉变应原Bet V 1-A；工程化是ID NO1BWH登记24-9-1998实验方法X-射线衍射分辨率1.80_标题 利用Ground Control生长的鸡蛋卵清溶菌酶的四方晶系的1.8A结构分类 水解酶化合物 Mod_Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名Gal D IV，变应原Gal D 4；Ec3.2.1.17ID NO1BWI登记24-9-1998实验方法X-射线衍射分辨率1.80_标题 利用Microbatch Oil Drop生长的鸡蛋卵清溶菌酶四方晶系的1.8A结构分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名Gal D IV，变应原Gal D4；Ec3.2.1.17ID NO1BWJ登记18-9-1998实验方法X-射线衍射分辨率1.80_标题 微重力生长的鸡蛋卵清溶菌酶四方晶系的1.8A结构分类 水解酶化合物 Mol Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名Gal D IV，变应原Gal D4；Ec3.2.1.17ID NO1CQA登记26-7-1996实验方法X-射线衍射分辨率2.40_标题 桦属花粉抑制蛋白分类 收缩蛋白质化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白；链无；工程化是
ID NO1E09登记15-3-2000实验方法核磁共振，22个结构标题 主要樱桃变应原Pru Av 1的溶液结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子Pru Av 1；链A；工程化是ID NO1EW3登记21-4-2000实验方法X-射线衍射分辨率2.30_标题 主要马变应原Equ C 1的晶体结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子变应原Equ C 1；链A；工程化是ID NO1F2K登记26-5-2000实验方法X-射线衍射分辨率2.30_标题 卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba Castellanii)抑制蛋白II的晶体结构，立方晶型分类 结构蛋白化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白II；链A，B；工程化是ID NO1FCQ登记19-7-2000实验方法X-射线衍射分辨率1.60_标题 蜜蜂毒液透明质酸酶的晶体结构(单斜晶系)分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子透明质酸葡糖胺酶；链A；同物异名透明质酸酶，Api M II；Ec3.2.1.35；工程化是
ID NO1FCU登记19-7-2000实验方法X-射线衍射分辨率2.10_标题 蜜蜂毒液透明质酸酶晶体结构(三角系)分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子透明质酸葡糖胺酶；链A；同物异名透明质酸酶，Api M II；Ec3.2.1.35；工程化是ID NO1FCV登记19-7-2000实验方法X-射线衍射分辨率2.65_标题 蜜蜂毒液透明质酸酶在与透明质酸四聚体的复合体中的晶体结构分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子透明质酸葡糖胺酶；链A；同物异名透明质酸酶，Api M II；Ec3.2.1.35；工程化是ID NO1FLQ登记15-8-2000实验方法X-射线衍射分辨率1.80_标题 用丙氨酸代替甘氨酸的鸡蛋卵清溶菌酶突变体分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名1，4--N-乙酰胞壁质酶C，变应原Gal D 4，Gal D IV；Ec3.2.1.17；工程化是；突变是ID NO1FLU登记15-8-2000实验方法X-射线衍射分辨率1.78_标题 用丙氨酸代替甘氨酸的鸡蛋卵清溶菌酶突变体分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名1，4--N-乙酰胞壁质酶C，变应原Gal D 4，Gal D IV；Ec3.2.1.17；工程化是；突变是ID NO1FLW登记15-8-2000实验方法X-射线衍射分辨率1.81_标题 用丙氨酸代替甘氨酸的鸡蛋卵清溶菌酶突变体分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名1，4--N-乙酰胞壁质酶C，变应原Gal D 4，Gal D IV；Ec3.2.1.17；工程化是；突变是ID NO1FLY登记15-8-2000实验方法X-射线衍射分辨率1.83_标题 用丙氨酸代替甘氨酸的鸡蛋卵清溶菌酶突变体分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名1，4--N-乙酰胞壁质酶C，变应原Gal D 4，Gal D IV；Ec3.2.1.17；工程化是；突变是ID NO1FN5登记21-8-2000实验方法X-射线衍射分辨率1.78_标题 用丙氨酸代替甘氨酸的鸡蛋卵清溶菌酶突变体分类 水解酶化合物 Mol_Id1；分子溶菌酶；链A；同物异名1，4--N-乙酰胞壁质酶C，变应原Gal D 4，Gal D IV；Ec3.2.1.17；工程化是；突变是ID NO1FSK登记11-9-2000实验方法X-射线衍射分辨率2.90_标题 一种单克隆IgG抗体Fab片段和桦属花粉主要变应原Bet V 1之间形成复合物分类 免疫系统化合物 Mol_Id1；分子主要花粉变应原Bet V 1-A；链A，D，G，J；同物异名Bet V I-A，Betvi变应原；工程化是Mol_Id2；分子免疫球蛋白轻链；链B，E，H，K；同物异名Bvl6 Fab-片段，Mopc21编码序列；工程化是Mol_Id3；分子抗体重链Fab；链C，F，I，L；同物异名单克隆抗体Mst2的重链；工程化是ID NO1G5U登记02-11-2000实验方法X-射线衍射分辨率3.10_标题 橡胶抑制蛋白Hevb8分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白；链A，B；工程化是ID NO1H6M登记19-6-2001实验方法X-射线衍射分辨率1.64_标题 鸡蛋卵清溶菌酶的共价糖基-酶中间体分类 水解酶(O-糖基)化合物 Mol_Id1；分子溶菌酶C；同物异名1，4--N-胞壁质酶C，变应原Gal D 4，Gal D IV；链A；Ec3.2.1.17；工程化是；突变是；其他细节共价2-氟壳二糖基酶中间体ID NO1JTI登记21-8-2001实验方法X-射线衍射分辨率2.30_标题 Pl-Pl′切割的卵清蛋白突变体R339T的环插入的结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子卵清蛋白；链A，B；工程化是；突变是ID NO1JTT登记22-8-2001实验方法X-射线衍射分辨率2.10_标题 抗原-抗体复合物中的简并界面分类 免疫系统，溶菌酶化合物 Mol_Id1；分子Vh单结构域抗体；链A；片段Vh区片段；工程化是Mol_Id2；分子溶菌酶；链L；片段酶；同物异名1，4--N-乙酰胞壁质酶C，变应原Gal D IV；Ec3.2.1.17ID NO1KOK登记19-9-2001实验方法X-射线衍射分辨率2.35_标题 酵母抑制蛋白，立方晶型分类 收缩蛋白质化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白；链A；工程化是
ID NO1KKC登记07-12-2001实验方法X-射线衍射分辨率2.00_标题 烟曲霉Mnsod的晶体结构分类 氧化还原酶化合物 Mol_Id1；分子二氧化锰歧化酶；链A，B，X，Y；同物异名Mnsod；Ec1.15.1.1；工程化是ID NO1KUR登记22-1-2002实验方法理论模型标题 山雪松花粉变应原Jun A 3的理论模型分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子变应原Jun A 3；链A；同物异名致病相关蛋白ID NO1PLM登记09-1-1998实验方法理论模型标题 和聚-L-脯氨酸复合的拟南芥属抑制蛋白1，理论模型分类 复合物(蛋白/肽)化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白1；链A；工程化是Mol Id2；分子聚-L-脯氨酸；链B；工程化是ID NO1PRQ登记18-8-1997实验方法X-射线衍射分辨率2.50_标题 卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba Castellanii)抑制蛋白la
分类 收缩蛋白质化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白la；链无；工程化是ID NO1QMR登记06-10-1999实验方法X-射线衍射分辨率2.15_标题 桦属花粉变应原Bet V 1突变体N28T，K32Q，E45S，P108G分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子主要花粉变应原Bet V 1-A；链A；同物异名BetV 1；工程化是；突变是ID NO1QNX登记25-10-1999实验方法X-射线衍射分辨率1.90_标题Ves V 5，一种常见黄胡蜂毒液变应原分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子Ves V 5；链A；同物异名抗原5；工程化是ID NO1WHO登记04-4-1997实验方法X-射线衍射分辨率1.90_标题 变应原Phl P 2分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子变应原Phl P 2；链无；同物异名Phl P II；工程化是ID NO1WHP
登记04-4-1997实验方法X-射线衍射分辨率3.00_标题 变应原Phl P 2分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子变应原Phl P 2；链无；同物异名Phl P II；工程化是ID NO2BBG登记24-4-1998实验方法核磁共振，30个结构标题 三裂豚草的豚草花粉变应原V，核磁共振，30个结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子花粉变应原5；链无ID NO3BBG登记24-4-1998实验方法核磁共振，2个结构标题 三裂豚草的豚草花粉变应原V的Multi-Conformer结构，核磁共振，2个结构分类 变应原化合物 Mol_Id1；分子花粉变应原5；链无ID NO3NUL登记27-11-1996实验方法X-射线衍射分辨率1.60_标题 拟南芥抑制蛋白I分类 肌动蛋白-结合蛋白化合物 Mol_Id1；分子抑制蛋白I；链无；工程化硒代甲硫氨酰基蛋白.
序列表<110>洛克菲勒大学和ALK阿贝罗股份有限公司(The Rockefeller University ALKAbello)<120>保留天然变应原的免疫原性并具减弱的变应原性的重组杂合变应原构建体<130>2313/2H587WO0<150>US 60/272,818<151>2001-03-02<160>98<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>8<212>PRT<213>常见黄胡蜂(Vespula vulgaris)<400>1Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys1 5<210>2<211>18<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>2Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Leu Lys Gly Gly Val His Thr Ala1 5 10 15Cys Lys<210>3<211>24<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>3Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Leu Lys Gly Gly Val His Thr Ala1 5 10 15
Cys Lys Tyr Gly Ser Leu Lys Pro20<210>4<211>32<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>4Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Leu Lys Gly Gly Val His Thr Ala1 5 10 15Cys Lys Tyr Gly Ser Leu Lys Pro Asn Cys Gly Asn Lys Val Val Val20 25 30<210>5<211>39<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>5Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Leu Lys Gly Gly Val His Thr Ala1 5 10 15Cys Lys Tyr Gly Ser Leu Lys Pro Asn Cys Gly Asn Lys Val Val Val20 25 30Ser Tyr Gly Leu Thr Lys Gln35<210>6<211>46<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>6Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Leu Lys Gly Gly Val His Thr Ala1 5 10 15Cys Lys Tyr Gly ser Leu Lys Pro Asn Cys Gly Asn Lys Val Val Val20 25 30Ser Tyr Gly Leu Thr Lys Gln Glu Lys Gln Asp Ile Leu Lys35 40 45<210>7
<211>48<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>7Gln Val Gly Gln Asn Val Ala Leu Thr Gly Ser Thr Ala Ala Lys Tyr1 5 10 15Asp Asp Pro Val Lys Leu Val Lys Met Trp Glu Asp Glu Val Lys Asp20 25 30Tyr Asn Pro Lys Lys Lys Phe Ser Gly Asn Asp Phe Leu Lys Thr Gly35 40 45<210>8<211>49<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>8His Tyr Thr Gln Met Val Trp Ala Asn Thr Lys Glu Val Gly Cys Gly1 5 10 15Ser Ile Lys Tyr Ile Gln Glu Lys Trp His Lys His Tyr Leu Val Cys20 25 30Asn Tyr Gly Pro Ser Gly Asn Phe Lys Asn Glu Glu Leu Tyr Gln Thr35 40 45Lys<210>9<211>11<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>9Leu Lys Pro Asn Cys Gly Asn Lys Val Val Val1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>常见黄胡蜂
<400>10Leu Thr Gly Ser Thr Ala Ala Lys Tyr Asp Asp1 5 10<210>11<211>9<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>11Pro Lys Lys Lys Phe Ser Gly Asn Asp1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>12Ile Gln Ile Lys Trp His Lys1 5<210>13<211>10<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>13Phe Lys Asn Glu Glu Leu Tyr Gln Thr Lys1 5 10<210>14<211>615<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>14aacaattatt gtaaaataaa atgtttgaaa ggaggtgtcc atactgcctg caaatatgga60agtcttaaac cgaattgcgg taataaggta gtggtatcct atggtctaac gaaacaagag120aaacaagaca tcttaaagga gcacaatgac tttagacaaa aaattgcacg aggattggag180actagaggta atcctggacc acagcctcca gcgaagaata tgaaaaattt ggtatggaac240
gacgagttag cttatgtcgc ccaagtgtgg gctaatcaat gtcaatatgg tcacgatact300tgcagggatg tagcaaaata tcaggttgga caaaacgtag ccttaacagg tagcacggct360gctaaatacg atgatccagt taaactagtt aaaatgtggg aagatgaagt gaaagattat420aatcctaaga aaaagttttc gggaaacgac tttctgaaaa ccggccatta cactcaaatg480gtttgggcta acaccaagga agttggttgt ggaagtataa aatacattca agagaaatgg540cacaaacatt accttgtatg taattatgga cccagcggaa actttaagaa tgaggaactt600tatcaaacaa agtaa 615<210>15<211>618<212>DNA<213>Polistes annularis<400>15gttgattatt gtaaaataaa gtgtccaagt ggtatccata cagtctgcca atatggagaa60tcgacaaaac caagcaagaa ttgtgccggt aaagtaatca aatcggttgg tccaacggaa120gaggagaaaa aattaatcgt aagcgagcat aatcggttta gacaaaaagt tgcacagggg180ttggaaacaa gaggtaatcc tggaccacaa cctgctgcct cggacatgaa tgatttggta240tggaacgatg aattagcaca tatcgcgcaa gtatgggcca gccaatgcca atttctcgta300cacgacaaat gcaggaatac cgcaaaatat ccagttggac aaaatatagc gtatgcaggt360ggttctaact taccagatgt agtcagtcta atcaaacttt gggaaaacga agtgaaagat420tttaattaca atacaggaat aacaaaacaa aactttgcta aaattggcca ttacactcaa480atggtttggg gtaaaactaa agaaattggt tgtggatctc taaaatatat ggaaaataat540atgcaaaatc attacctcat atgtaattat ggaccagctg gaaattactt gggtcaacta600ccttatacaa aaaaataa 618<210>16<211>204<212>PRT
<213>常见黄胡蜂<400>16Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Leu Lys Gly Gly Val His Thr Ala1 5 10 15Cys Lys Tyr Gly Ser Leu Lys Pro Asn Cys G1y Asn Lys Val Val Val20 25 30Ser Tyr Gly Leu Thr Lys Gln Glu Lys Gln Asp Ile Leu Lys Glu His35 40 45Asn Asp Phe Arg Gln Lys Ile Ala Arg Gly Leu Glu Thr Arg Gly Asn50 55 60Pro Gly Pro Gln Pro Pro Ala Lys Asn Met Lys Asn Leu Val Trp Asn65 70 75 80Asp Glu Leu Ala Tyr Val Ala Gln Val Trp Ala Asn Gln Cys Gln Tyr85 90 95Gly His Asp Thr Cys Arg Asp Val Ala Lys Tyr Gln Val Gly Gln Asn100 105 110Val Ala Leu Thr Gly Ser Thr Ala Ala Lys Tyr Asp Asp Pro Val Lys115 120 125Leu Val Lys Met Trp Glu Asp Glu Val Lys Asp Tyr Asn Pro Lys Lys130 135 140Lys Phe Ser Gly Asn Asp Phe Leu Lys Thr Gly His Tyr Thr Gln Met145 150 155 160Val Trp Ala Asn Thr Lys Glu Val Gly Cys Gly Ser Ile Lys Tyr Ile165 170 175Gln Glu Lys Trp His Lys His Tyr Leu Val Cys Asn Tyr Gly Pro Ser180 185 190Gly Asn Phe Lys Asn Glu Glu Leu Tyr Gln Thr Lys195 200<210>17<211>205<212>PRT<213>Polistes annularis
<400>17Val Asp Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Pro Ser Gly Ile His Thr Val Cys1 5 10 15Gln Tyr Gly Glu Ser Thr Lys Pro Ser Lys Asn Cys Ala Gly Lys Val20 25 30Ile Lys Ser Val Gly Pro Thr Glu Glu Glu Lys Lys Leu Ile Val Ser35 40 45Glu His Asn Arg Phe Arg Gln Lys Val Ala Gln Gly Leu Glu Thr Arg50 55 60Gly Asn Pro Gly Pro Gln Pro Ala Ala Ser Asp Met Asn Asp Leu Val65 70 75 80Trp Asn Asp Glu Leu Ala His Ile Ala Gln Val Trp Ala Ser Gln Cys85 90 95Gln Phe Leu Val His Asp Lys Cys Arg Asn Thr Ala Lys Tyr Pro Val100 105 110Gly Gln Asn Ile Ala Tyr Ala Gly Gly Ser Asn Leu Pro Asp Val Val115 120 125Ser Leu Ile Lys Leu Trp Glu Asn Glu Val Lys Asp Phe Asn Tyr Asn130 135 140Thr Gly Ile Thr Lys Gln Asn Phe Ala Lys Ile Gly His Tyr Thr Gln145 150 155 160Met Val Trp Gly Lys Thr Lys Glu Ile Gly Cys Gly Ser Leu Lys Tyr165 170 175Met Glu Asn Asn Met Gln Asn His Tyr Leu Ile Cys Asn Tyr Gly Pro180 185 190Ala Gly Asn Tyr Leu Gly Gln Leu Pro Tyr Thr Lys Lys195 200 205<210>18<211>24<212>DNA<213>常见黄胡蜂
<400>18aacaattatt gtaaaataaa atgt 24<210>19<211>54<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>19aacaattatt gtaaaataaa atgtttgaaa ggaggtgtcc atactgcctg caaa 54<210>20<211>72<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>20aacaattatt gtaaaataaa atgtttgaaa ggaggtgtcc atactgcctg caaatatgga60agtcttaaac cg72<210>21<211>96<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>21aacaattatt gtaaaataaa atgtttgaaa ggaggtgtcc atactgcctg caaatatgga60agtcttaaac cgaattgcgg taataaggta gtggta 96<210>22<211>117<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>22aacaattatt gtaaaataaa atgtttgaaa ggaggtgtcc atactgcctg caaatatgga60agtcttaaac cgaattgcgg taataaggta gtggtatcct atggtctaac gaaacaa 117<210>23
<211>138<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>23aacaattatt gtaaaataaa atgtttgaaa ggaggtgtcc atactgcctg caaatatgga60agtcttaaac cgaattgcgg taataaggta gtggtatcct atggtctaac gaaacaagag120aaacaagaca tcttaaag 138<210>24<211>144<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>24caggttggac aaaacgtagc cttaacaggt agcacggctg ctaaatacga tgatccagtt60aaactagtta aaatgtggga agatgaagtg aaagattata atcctaagaa aaagttttcg120ggaaacgact ttctgaaaac cggc 144<210>25<211>147<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>25cattacactc aaatggtttg ggctaacacc aaggaagttg gttgtggaag tataaaatac60attcaagaga aatggcacaa acattacctt gtatgtaatt atggacccag cggaaacttt120aagaatgagg aactttatca aacaaag147<210>26<211>33<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>26cttaaaccga attgcggtaa taaggtagtg gta 33
<210>27<211>33<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>27ttaacaggta gcacggctgc taaatacgat gat 33<210>28<211>27<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>28cctaagaaaa agttttcggg aaacgac27<210>29<211>21<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>29attcaagaga aatggcacaa a 21<210>30<211>30<212>DNA<213>常见黄胡蜂<400>30tttaagaatg aggaacttta tcaaacaaag 30<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Ves v 5′EA的有义PCR primer 1<400>31cgtgaattca acaattattg taaaataaaa 30
<210>32<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Ves v 5′KR的有义PCR引物2<400>32cgtctcgaga aaagaaacaa ttattgtaaa ataaaa 36<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Ves v 3′下游反义PCR引物3<400>33cgttctagat tactttgttt gataaagttc 30<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Pol a 5′EA的有义PCR引物4<400>34cgtgaattcg ttgattattg taaaataaaa 30<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Pol a 5′KR的有义PCR引物5<400>35cgtctcgaga aaagagttga ttattgtaaa ataaaa 36
<210>36<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Pol a 3′下游反义引物6<400>36cgttctagat tatttttttg tataaggtag 30<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Pol a第49-50位氨基酸EH的诱变有义PCR引物7<400>37gtaagcgagc acaatcggtt t 21<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Pol a第49-50位氨基酸EH的诱变反义PCR引物8<400>38aaaccgattg tgctcgctta c 21<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Ves v ApoI转换的PCR引物9<400>39gtagcaaaat ttcaggttgg a 21
<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Ves v ApoI转换的PCR引物10<400>40tccaacctga aattttgcta c 21<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Pol a ApoI转换的PCR引物11<400>41accgcaaaat ttccagttgg a 21<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于Pol a ApoI转换的PCR引物12<400>42tccaactgga aattttgcgg t 21<210>43<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV1-18的有义PCR引物13<400>43
cgtgaattca acaattattg taaaataaaa tgtttgaaag gaggtgtcca tactgcctgc60aaatatggag aa72<210>44<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV195-204的反义PCR引物14<400>44cgttctagat tactttgttt gataaagttc ctcattctta aaatttccag ctgg 54<210>45<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV18-24和PV1-24的反义PCR引物15<400>45ggcacaattc ttgctcggtt taagacttcc ata 33<210>46<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV18-24和PV1-24的有义PCR引物16<400>46tatggaagtc ttaaaccgag caagaattgt gcc 33<210>47<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV22-32和PV1-32的有义PCR引物17<400>47cttaaaccga attgcggtaa taaggtagtg gtatcggttg gtcca45<210>48<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV22-32和PV1-32的反义PCR引物18<400>48tggaccaacc gataccacta ccttattacc gcaattcggt ttaag45<210>49<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV1-39的PCR引物19<400>49tatggtctaa cgaaacaaga gaaaaaatta atcgta 36<210>50<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV1-39的PCR引物20<400>50tacgattaat tttttctctt gtttcgttag accata 36<210>51<211>45<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PV115-125的有义PCR引物21<400>51ttaacaggta gcacggctgc taaatacgat gatgtagtca gtcta45<210>52<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV115-125的反义PCR引物22<400>52atcatcgtat ttagcagccg tgctacctgt taacgctata ttttg45<210>53<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV142-150的有义PCR引物23<400>53cctaagaaaa agttttcggg aaacgacttt gctaaaattg gc 42<210>54<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV142-150的反义PCR引物24<400>54gtcgtttccc gaaaactttt tcttaggatt aaaatctttc ac 42<210>55<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PV176-182的有义PCR引物25<400>55attcaagaga aatggcacaa acattacctc ata 33<210>56<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV176-182的反义PCR引物26<400>56tttgtgccat ttctcttgaa tatattttag aga 33<210>57<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PV1-50的反义PCR引物27<400>57gagcacaatg actttagaca aaaa 24<210>58<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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35 40 45Ser Gly Ala Gly Glu Asn Leu Ala Lys Gly Gly Gly Asp Phe Thr Gly50 55 60Arg Ala Ala Val Gln Leu Trp Val Ser Glu Arg Pro Ser Tyr Asn Tyr65 70 75 80Ala Thr Asn Gln Cys Val Gly Gly Lys Lys Cys Arg His Tyr Thr Gln85 90 95Val Val Trp Arg Asn Ser Val Arg Leu Gly Cys Gly Arg Ala Arg Cys100 105 110Asn Asn Asn Gly Trp Trp Phe Ile Ser Cys Asn Tyr Asp Pro Val Gly115 120 125Asn Trp Ile Gly Gln Arg Pro Tyr130 135<210>84<211>187<212>PRT<213>裂褶菌(Schizophyllum commune)<400>84Ser Pro Ala Pro Val Asp Val Asp Ala Arg Ala Pro Val Ala Leu Asp1 5 10 15Ser Arg Ser Ile Asp Ile Asp Ser Arg Ser Ala Asp Ala Leu Ala Asn20 25 30Arg Ala Ala Pro Pro Gln Ser Glu Ile Asp Gln Trp Leu Lys Ala His35 40 45Asn Asn Glu Arg Ala Gln His Gly Ala Val Ala Leu Val Trp Asn Gln50 55 60Thr Leu Ser Asp Lys Ala Ala Asp Trp Ala Ser Gln Cys Ile Trp Glu65 70 75 80His Ser Asn Ser Gly Gln Asn Leu Ala Ala Trp phe Ser Pro Gln Ala85 90 95Asn Lys Pro Met Asn Ile Ser Gln Gly Val Gly Gly Trp Asn Ala Glu100 105 110
Glu Pro Asp Tyr Asn Thr Thr Thr Tyr Ser Gly Ala Gly His Trp Thr115 120 125Gln Val Val Trp Lys Ser Thr Thr Ser Val Gly Cys Ala Ala Tyr Ser130 135 140Cys Pro Pro Gly Thr Leu Gly Arg Lys Pro Thr Asp Pro Trp Lys Thr145 150 155 160Leu Trp Tyr Tyr Val Cys Asn Tyr Tyr Arg Pro Gly Asn Val Ser Pro165 170 175Arg Asp Lys Tyr Tyr Pro Ile Asn Val Gln Pro180 185<210>85<211>239<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>85Ser Thr Val Val Leu Leu Asn Ser Thr Asp Ser Ser Pro Pro Thr Asn1 5 10 15Asn Phe Thr Asp Ile Glu Ala Ala Leu Lys Ala Gln Leu Asp Ser Ala20 25 30Asp Ile Pro Lys Ala Arg Arg Lys Arg Tyr Ile Ser Gln Asn Asp Met35 40 45Ile Ala Ile Leu Asp Tyr His Asn Gln Val Arg Gly Lys Val Phe Pro50 55 60Pro Ala Ala Asn Met Glu Tyr Met Val Trp Asp Glu Asn Leu Ala Lys65 70 75 80Ser Ala Glu Ala Trp Ala Ala Thr Cys Ile Trp Asp His Gly Pro Ser85 90 95Tyr Leu Leu Arg Phe Leu Gly Gln Asn Leu Ser Val Arg Thr Gly Arg100 105 110Tyr Arg Ser Ile Leu Gln Leu Val Lys Pro Trp Tyr Asp Glu Val Lys115 120 125
Asp Tyr Ala Phe Pro Tyr Pro Gln Asp Cys Asn Pro Arg Cys Pro Met130 135 140Arg Cys Phe Gly Pro Met Cys Thr His Tyr Thr Gln Met Val Trp Ala145 150 155 160Thr Ser Asn Arg Ile Gly Cys Ala Ile His Thr Cys Gln Asn Met Asn165 170 175Val Trp Gly Ser Val Trp Arg Arg Ala Val Tyr Leu Val Cys Asn Tyr180 185 190Ala Pro Lys Gly Asn Trp Ile Gly Glu Ala Pro Tyr Lys Val Gly Val195 200 205Pro Cys Ser Ser Cys Pro Pro Ser Tyr Gly Gly Ser Cys Thr Asp Asn210 215 220Leu Cys Phe Pro Gly Val Thr Ser Asn Tyr Leu Tyr Trp Phe Lys225 230 235<210>86<211>245<212>PRT<213>人<400>86Ala Asn Ile Leu Pro Asp Ile Glu Asn Glu Asp Phe Ile Lys Asp Cys1 5 10 15Val Arg Ile His Asn Lys Phe Arg Ser Glu Val Lys Pro Thr Ala Ser20 25 30Asp Met Leu Tyr Met Thr Trp Asp Pro Ala Leu Ala Gln Ile Ala Lys35 40 45Ala Trp Ala Ser Asn Cys Gln Phe Ser His Asn Thr Arg Leu Lys Pro50 55 60Pro His Lys Leu His Pro Asn Phe Thr Ser Leu Gly Glu Asn Ile Trp65 70 75 80Thr Gly Ser Val Pro Ile Phe Ser Val Ser Ser Ala Ile Thr Asn Trp85 90 95Tyr Asp Glu Ile Gln Asp Tyr Asp Phe Lys Thr Arg Ile Cys Lys Lys
100 105 1l0Val Cys Gly His Tyr Thr Gln Val Val Trp Ala Asp Ser Tyr Lys Val115 120 125Gly Cys Ala Val Gln Phe Cys Pro Lys Val Ser Gly Phe Asp A1a Leu130 135 140Ser Asn Gly Ala His Phe Ile Cys Asn Tyr Gly Pro Gly Gly Asn Tyr145 150 155 160Pro Thr Trp Pro Tyr Lys Arg Gly Ala Thr Cys Ser Ala Cys Pro Asn165 170 175Asn Asp Lys Cys Leu Asp Asn Leu Cys Val Asn Arg Gln Arg Asp Gln180 185 190Val Lys Arg Tyr Tyr Ser Val Val Tyr Pro Gly Trp Pro Ile Tyr Pro195 200 205Arg Asn Arg Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Ile Val Asn Ser Val Ile Leu210 215 220Ile Leu Ser Val Ile Ile Thr Ile Leu Val Gln Leu Lys Tyr Pro Asn225 230 235 240Leu Val Leu Leu Asp245<210>87<211>223<212>PRT<213>珠毒蜥(Heloderma horridum)<400>87Glu Ala Ser Pro Lys Leu Pro Gly Leu Met Thr Ser Asn Pro Asp Gln1 5 10 15Gln Thr Glu Ile Thr Asp Lys His Asn Asn Leu Arg Arg Ile Val Glu20 25 30Pro Thr Ala Ser Asn Met Leu Lys Met Thr Trp Ser Asn Lys Ile Ala35 40 45Gln Asn Ala Gln Arg Ser Ala Asn Gln Cys Thr Leu Glu His Thr Ser50 55 60
Lys Glu Glu Arg Thr Ile Asp Gly Val Glu Cys Gly Glu Asn Leu Phe65 70 75 80Phe Ser Ser Ala Pro Tyr Thr Trp Ser Tyr Ala Ile Gln Asn Trp Phe85 90 95Asp Glu Arg Lys Tyr Phe Arg Phe Asn Tyr Gly Pro Thr Ala Gln Asn100 105 110Val Met Ile Gly His Tyr Thr Gln Val Val Trp Tyr Arg Ser Tyr Glu115 120 125Leu Gly Cys Ala Ile Ala Tyr Cys Pro Asp Gln Pro Thr Tyr Lys Tyr130 135 140Tyr Gln Val Cys Gln Tyr Cys Pro Gly Gly Asn Ile Arg Ser Arg Lys145 150 155 160Tyr Thr Pro Tyr Ser Ile Gly Pro Pro Cys Gly Asp Cys Pro Asp Ala165 170 175Cys Asp Asn Gly Leu Cys Thr Asn Pro Cys Lys Gln Asn Asp Val Tyr180 185 190Asn Asn Cys Pro Asp Leu Lys Lys Gln Val Gly Cys Gly His Pro Ile195 200 205Met Lys Asp Cys Met Ala Thr Cys Lys Cys Leu Thr Glu Ile Lys210 215 220<210>88<211>222<212>PRT<213>人<400>88Lys Asp Pro Ala Phe Thr Ala Leu Leu Thr Thr Gln Leu Gln Val Gln1 5 10 15Arg Glu Ile Val Asn Lys His Asn Glu Leu Arg Lys Ala Val Ser Pro20 25 30Pro Ala Ser Asn Met Leu Lys Met Glu Trp Ser Arg Glu Val Thr Thr35 40 45
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<223>肽<400>89Glu Ala Glu Ala Glu Phe1 5
<210>90<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>90Glu Ala Glu Phe1<210>91<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>91Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe1 5<210>92<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>92Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg1 5<210>93<211>50<212>PRT<213>常见黄胡蜂<400>93Asn Asn Tyr Cys Lys Ile Lys Cys Leu Lys Gly Gly Val His Thr Ala1 5 10 15
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权利要求
1.具有减弱的变应原性但保留免疫原性的变应原杂合蛋白质，其含有变应原蛋白质的肽表位序列和与变应原蛋白质结构同源的支架蛋白质，其中杂合蛋白质具有天然构象，并且肽表位序列的存在位置为杂合蛋白质的表面可及区域并对应于其在变应原蛋白质中的位置。
2.权利要求1所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列在杂合蛋白质的环或转角区域。
3.权利要求1所述的杂合蛋白质，其中支架蛋白质与肽表位序列所来源的变应原具有至少50％的序列同一性。
4.权利要求1所述的杂合蛋白质，其中支架蛋白质与肽表位序列所来源的变应原蛋白质具有不超过70％的序列同一性。
5.权利要求1所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列长约6到约55个氨基酸。
6.权利要求5所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列长约6到约45个氨基酸。
7.权利要求6所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列长约6到约35个氨基酸。
8.权利要求7所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列长约6到约25个氨基酸。
9.权利要求8所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列长约6到约15个氨基酸。
10.权利要求1所述的杂合蛋白质，其还含有信号肽。
11.权利要求1所述的杂合蛋白质，其还含有蛋白酶作用位点。
12.权利要求1所述的杂合蛋白质，其为杂合胡蜂毒液变应原蛋白质。
13.权利要求12所述的杂合蛋白质，其为杂合胡蜂毒液抗原5蛋白质。
14.权利要求13所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列来自黄胡蜂属并且支架蛋白质来自马蜂属。
15.权利要求14所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列来自常见黄胡蜂种。
16.权利要求14所述的杂合蛋白质，其中支架蛋白质来自Polistesannularis种。
17.权利要求13所述的杂合蛋白质，其中肽抗原含有选自下述的序列NNYCKIKC(SEQ ID1)；NNYCKIKCLKGGVHTACK(SEQ ID2)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKP(SEQ ID3)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVV(SEQ ID4)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQ(SEQ ID5)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILK(SEQ ID6)；QVGQNVALTGSTAAKYDDPVKLVKMWEDEVKDYNPKKKFSGNDFLKTG(SEQ ID NO7)；HYTQMVWANTKEVGCGSIKYIQEKWHKHYLVCNYGPSGNFKNEELYQTK(SEQ ID NO8)LKPNCGNKVVV(SEQ ID NO9)；LTGSTAAKYDD(SEQ ID NO10)；PKKKFSGND(SEQ ID NO11)IQIKWHK(SEQ ID NO12)；和FKNEELYQTK(SEQ ID NO13)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILKEHND(SEQ ID NO93)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILKEHNDFRQKIAR(SEQ ID NO94)；NNYCKIKCLKGGVHTACKYGSLKPNCGNKVVVSYGLTKQEKQDILKEHNDFRQKIARGLETRGNPGPQPPAKNMKN(SEQ ID NO95)。
18.权利要求1所述的杂合蛋白质，其中肽表位序列含有保守的氨基酸改变。
19.权利要求18所述的杂合蛋白质，其中变体肽的特征为在体外测定试验中抗体对肽表位序列的结合减少至少50％，其中测定试验中变体存在的浓度不超过肽表位序列的浓度的10倍，并且测定试验测量肽表位序列对抗体的结合，所述抗体直接抗含有该肽表位序列的多肽。
20.编码权利要求1-19任意一项所述的变应原杂合蛋白质的核酸。
21.制备编码变应原杂合蛋白质的核酸的方法，所述方法包括将编码变应原蛋白质的肽表位序列的核苷酸序列导入编码与变应原蛋白质结构同源的支架蛋白质的核苷酸序列中，其中编码肽表位序列的核苷酸序列与编码支架蛋白质的核苷酸序列符合读框，并且其所在位置使得在变应原杂合蛋白质中肽表位序列的存在位置为杂合蛋白质的表面可及区域并对应于该肽表位序列在变应原蛋白质中的位置。
22.根据权利要求21所述的方法，其中将编码支架蛋白质的核苷酸序列突变以导入编码肽表位序列的核苷酸序列。
23.根据权利要求21所述的方法，其中编码肽表位序列的核苷酸的导入通过用核酸内切酶处理含有编码肽表位序列的核苷酸序列和编码支架蛋白质的核苷酸序列的核酸、将所得的片断连接来实现。
24.根据权利要求21所述的方法制备的核酸。
25.表达载体，其含有与启动子可操作连接的权利要求20的分离的核酸。
26.生产具有减弱的变应原性但保留免疫原性的变应原杂合蛋白质的方法，所述方法包括培养已经转化有权利要求25的表达载体的细胞，由此由该细胞产生杂合变应原。
27.权利要求26所述的方法，所述方法还包括从培养基、细胞，或者两者中回收杂合变应原。
28.治疗变应性疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的权利要求1所述的杂合蛋白质或权利要求25所述的表达载体，其中所述患者对变应原蛋白质或支架蛋白质或两者具有变应性。
29.权利要求28所述的方法，其中杂合蛋白质或表达载体通过口服、肺、鼻、局部或肠胃外途径施用。
30.药物组合物，其含有权利要求1所述的杂合蛋白质或权利要求25所述的表达载体和可药用稀释剂或载体。
31.设计具减弱的变应原性但保留免疫原性的杂合变应原的方法，所述方法包括(a)鉴定变应原的暴露于溶剂的表面；(b)鉴定与变应原结构同源的蛋白质；和(c)修饰与变应原结构同源的蛋白质的序列，以并入来自变应原的溶剂暴露表面的肽序列。
32.权利要求31所述的方法，其中所述溶剂暴露表面通过物理方法鉴定。
33.权利要求32所述的方法，其中所述物理方法为X射线晶体学。
34.权利要求31所述的方法，其中所述溶剂暴露表面通过将变应原的氨基酸序列与已知三维结构的结构同源蛋白质的氨基酸序列比较而鉴定。
35.权利要求31所述的方法，其中溶剂暴露表面含有环或转角区域。
全文摘要
本发明公开了保持天然构象的重组杂合蛋白质，其具有至少一个抗原肽序列导入支架蛋白质中。本发明也公开了编码杂合蛋白质的重组核酸和载体。杂合蛋白质保留免疫原性而展示减弱的变应原性。因此，此杂合蛋白质在变态反应的治疗中特别有用。
文档编号A61K48/00GK1610556SQ02809204
公开日2005年4月27日 申请日期2002年3月4日 优先权日2001年3月2日
发明者T·P·金, M·D·斯庞福特 申请人:洛克菲勒大学, Alk阿贝罗股份有限公司