治疗阻塞性气道疾病的pde4抑制剂与抗胆碱能剂的组合的制作方法

专利名称：治疗阻塞性气道疾病的pde4抑制剂与抗胆碱能剂的组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的吸入组合，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。本发明进一步涉及药物组合物，包括给药装置，和这样一种组合的用途。
选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的组合(combination)可用于治疗阻塞性气道疾病与其他炎性疾病，特别是阻塞性气道疾病气喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和其他被增高的支气管反射、炎症、支气管反应性过高和支气管痉挛所恶化的阻塞性气道疾病。该组合尤其可用于治疗COPD。
可以用本发明治疗的具体疾病的实例包括呼吸疾病气喘、急性呼吸窘迫综合征、慢性肺炎性疾病、支气管炎、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺(气道)疾病和硅肺病，和免疫系统疾病，例如变应性鼻炎和慢性鼻窦炎。
3’，5’-环核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)包含一大类酶，分为至少七个不同的家族，它们在结构上、生物化学上和药理学上彼此不同。每个家族内部的酶统称为同工酶。总计十五种以上的基因产物都包括在这类中，进一步的多样性来自这些基因产物的不同剪接和转译后加工。本发明主要关心第四PDE家族的四种基因产物，即PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D。这些酶总称为PDE4同工酶家族PDE4s的同工型或亚型。
PDE4是以对第二信使环核苷酸，腺苷3’，5’-环一磷酸(cAMP)的选择性的高亲合性水解降解作用和对咯利普兰抑制作用的敏感性为特征的。近年来已经发现了大量选择性PDE4s抑制剂，在各种疾病模型中已经显示出来自该抑制作用的有益的药理学效果例如参见Torphy等，Environ.Health Perspect.102 Suppl.10，79-84，1994；Duplantier等，J.Med.Chem.39 120-125，1996；Schneider等，Pharmacol.Biochem.Behav.50 211-217，1995；Banner and Page，Br.J.Pharmacol.114 93-98，1995；Bamette等，J.Pharmacol.Exp.Ther.273674-679，1995；Wright等，“Differential in vivo and in vitro bronchorelaxantactivities of CP-80633，a selective phosphodiesterase 4 inhibitor”，Can.J.Physiol.Pharmacol.75 1001-1008，1997；Manabe等，“Anti-inflammatory andbronchodilator properties of KF 19514，a phosphodiesterase 4 and 1 inhibitor”，Eur.J.Pharmacol.332 97-107，1997；Ukita等，“Novel，potent，and selectivephosphodiesterase-4 inhibitors as antiasthmatic agentssynthesis and biologicalactivities of a series of 1-pyridylnaphthalene derivatives”，J.Med.Chem.421088-1099，1999。
抗胆碱能剂预防来自穿过副交感神经的脉冲的效果。这种作用来自它们通过阻断与毒蕈碱样胆碱能受体结合而抑制神经递质乙酰胆碱的作用的能力。至少存在三种类型的毒蕈碱样受体亚型。M1受体主要见于大脑和中枢神经系统的其他组织，M2受体见于心脏和其他心血管组织，M3受体见于平滑肌和腺组织。毒蕈碱样受体例如位于平滑肌上的神经效应器部位，确切而言M3毒蕈碱样受体位于气道平滑肌中。所以，抗胆碱能剂也可以被称为毒蕈碱样受体拮抗剂。
副交感神经系统在调节支气管舒肌紧张性中扮演重要角色，支气管收缩主要是副交感活性反射增加的结果，反射增加继而是由一组不同的刺激所导致的。
抗胆碱能剂在以部分可逆的气道狭窄为特征的慢性气道疾病、例如COPD和气喘的治疗中具有很长的使用历史，在肾上腺素的来临之前一直被用作支气管扩张剂。之后它们被β-肾上腺素能剂和甲基黄嘌呤所代替。不过，最近异丙托溴铵的引入已经引起抗胆碱能疗法在呼吸疾病治疗中的使用的复苏。在外周器官系统上存在毒蕈碱样受体，例如唾液腺和肠，因此全身活性的毒蕈碱样受体拮抗剂的使用受到副作用，例如口干和便秘的限制。因而，毒蕈碱样受体拮抗剂的支气管扩张作用和其他有益作用在理想情况下是由吸入剂产生的，后者在肺中的活性的治疗指数高于外周腔室。
抗胆碱能剂也部分地拮抗由组胺、缓激肽或前列腺素F2α所诱导的支气管收缩，这被认为反映了副交感传出参与了由这些药物引起的支气管反射。
现已惊人地发现，选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的组合在阻塞性气道疾病和其他炎性疾病的治疗中提供优于二者单独药物治疗的益处。该组合的优点是通过最适合于疾病病理学的机理、也就是毒蕈碱样受体拮抗作用，提供最佳的气道口径控制，以及提供对不适当的炎症的有效抑制作用。经由吸入途径给药抗胆碱能剂与选择性PDE4抑制剂的组合，实现了各自的益处，而没有所不希望的外周作用。进而，该组合导致意外的协同性，产生大于单用每类药物最大耐受剂量的功效。
本发明因此提供选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的吸入组合(combination)，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
进而，本发明提供用作药物的选择性PDE4抑制剂剂与抗胆碱能剂的吸入组合，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
进而，本发明提供选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的吸入组合，用于在阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的治疗中同时、先后或独立给药，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
进而，本发明提供药物组合物，包含选择性PDE4抑制剂、抗胆碱能剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，用于在阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的治疗中通过吸入途径给药，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
进而，本发明提供选择性PDE4抑制剂或抗胆碱能剂在药物制造中的用途，该药物用于在阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的治疗中通过吸入途径同时、先后或独立给药，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
进而，本发明提供治疗阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的方法，包括对需要这样治疗的哺乳动物通过吸入途径同时、先后或独立给药有效量的选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
进而，本发明提供吸入装置，用于在阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的治疗中同时、先后或独立给药选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
选择性PDE4抑制剂对PDE4同工酶的亲合性大于所有其他已知的PDE同工酶。优选地，与其对其他PDE同工酶的亲合性相比，根据本发明的选择性PDE4抑制剂对PDE4同工酶的亲合性至少大100倍。
适合用在本发明中的选择性PDE4抑制剂包括一般和具体公开在WO-A-96/39408中的化合物。
这类适合的PDE4抑制剂包括式(I)化合物
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1是H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C2-C4)链烯基、苯基、-N(CH3)2、(C3-C6)环烷基、(C3-C6)环烷基(C1-C3)烷基或(C1-C6)酰基，其中烷基、苯基或链烯基可以被至多两个-OH、(C1-C3)烷基或-CF3或者至多三个卤素取代；R2和R3各自独立地选自由H、(C1-C14)烷基、(C1-C7)烷氧基(C1-C7)烷基、(C2-C14)链烯基、(C3-C7)环烷基、(C3-C7)环烷基(C1-C2)烷基、饱和或不饱和的(C4-C7)杂环(CH2)n基团组成的组，其中n是0、1或2，其含有一个或两个氧、硫、磺酰基、氮和NR4作为杂原子，其中R4是H或(C1-C4)烷基；或式(II)基团 其中a是整数1至5；b和c是0或1；R5是H、-OH、(C1-C5)烷基、(C2-C5)链烯基、(C1-C5)烷氧基、(C3-C6)环烷氧基、卤素、-CF3、-CO2R6、-CONR6R7、-NR6R7、-NO2或-SO2NR6R7，其中R6和R7各自独立地是H或(C1-C4)烷基；Z是-O-、-S-、-SO2-、-CO-或-N(R8)-，其中R8是H或(C1-C4)烷基；Y是(C1-C5)亚烷基或(C2-C6)亚烯基，任选地被至多两个(C1-C7)烷基或(C3-C7)环烷基取代；其中每个烷基、链烯基、环烷基、烷氧基烷基或杂环基可以被1至14个、优选1至5个(C1-C2)烷基、CF3或卤代基团取代；R9和R10各自独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳基和(C6-C10)芳氧基组成的组。
优选的式I化合物包括这些，其中R1是甲基、乙基或异丙基，和这些，其中R3是(C1-C6)烷基、(C2-C6)链烯基、(C3-C7)环烷基、(C3-C7)环烷基(C1-C6)烷基或任选被1或2个基团取代的苯基，所述取代基选自H、-OH、(C1-C5)烷基、(C2-C5)链烯基、(C1-C5)烷氧基、卤素、三氟甲基、-CO2R6、-CONR6R7、-NR6R7、-NO2或-SO2NR6R7，其中R6和R7各自独立地是H或(C1-C4)烷基。
优选的各个式(I)化合物包括9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-苯基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；
9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(呋喃-2-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-吡啶基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(4-吡啶基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(3-噻吩基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；3-苄基-9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-丙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；3，9-二环戊基-5，6-二氢-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(1-甲基环己-1-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；3-叔丁基-9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-甲基苯基)-9H-比唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-甲氧基苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(噻吩-2-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；3-(2-氯苯基)-9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-碘苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-三氟甲基苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；和5，6-二氢-7-乙基-9-(4-氟苯基)-3-(1-甲基环己-1-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶；及其药学上可接受的盐和溶剂化物。
尤其优选用在本发明中的选择性PDE4抑制剂包括9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-噻吩基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶和9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-叔丁基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶及其药学上可接受的盐和溶剂化物。
适合用在本发明中的抗胆碱能剂包括异丙托品或氧托品盐。
噻托品盐(见EP418716B1)具有式(1.1)结构 其中X-是生理学上可接受的阴离子。
异丙托品盐(见EP 309464B1)具有式(1.2)结构 其中X-是生理学上可接受的阴离子。
氧托品盐(见EP 579615B1)具有式(1.3)结构 其中X-是生理学上可接受的阴离子。
适合的异丙托品和氧托品的盐形式的实例有氟化物F-；氯化物Cl-；溴化物Br-；碘化物I-；甲磺酸盐CH3S(＝O)2O-；乙磺酸盐CH3CH2S(＝O)2O-；甲基硫酸盐CH3OS(＝O)2O-；苯磺酸盐C6H5S(＝O)2O-；和对甲苯磺酸盐4-CH3-C6H5S(＝O)2O-。溴化物盐形式是优选的。
具体优选用在本发明中的选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的组合包括9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-噻吩基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物和异丙托品盐或其溶剂化物；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-叔丁基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物和异丙托品盐或其溶剂化物；9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-噻吩基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物和氧托品盐或其溶剂化物；及9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-叔丁基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物和氧托品盐或其溶剂化物。
按照本发明使用的选择性PDE4抑制剂或抗胆碱能化合物可以任选地采用药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。这样的盐可以是酸加成盐或碱盐。
适合的酸加成盐是从构成无毒盐的酸所生成的，其实例有盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、琥珀酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双氢萘酸盐。
适合的碱盐是从构成无毒盐的碱所生成的，其实例有钠、钾、铝、钙、镁、锌和二乙醇胺盐。
关于适合的盐的综述，参见Berge等，J.Pharm.Sci.，66，1-19，1977。
按照本发明使用的选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能化合物或其盐的药学上可接受的溶剂化物包括其水合物。
本发明的选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能化合物可以存在一种或多种多晶型。
本发明的选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂(以下称为“本发明化合物”)可以含有一个或多个不对称的碳原子，因此存在两种或多种立体异构型。当这样一种化合物含有链烯基或亚烯基时，还可以存在顺式/反式(或Z/E)异构。本发明包括本发明化合物的各个立体异构体，酌情和其个别的互变异构型，及其混合物。
非对映异构体或顺反式异构体的分离可以通过常规技术实现，例如本发明化合物或其适合的盐或衍生物的立体异构体混合物的分级结晶、色谱或H.P.L.C.。本发明化合物的个别对映体还可以从对应的光学纯中间体制备，或者通过拆分制备，例如使用适合的手性载体进行对应的外消旋物的H.P.L.C.，或者通过非对映异构盐的分级结晶加以制备，该盐是通过对应的外消旋物与适合的旋光活性酸或碱的反应而生成的，视情况而定。
本发明还包括本发明化合物或其药学上可接受的盐的所有适合的同位素变体。本发明化合物或其药学上可接受的盐的同位素变体被定义为其中至少一个原子被原子序数相同但原子质量不同于自然界常见的原子质量的原子所代替。可以结合在本发明化合物及其药学上可接受的盐中的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如分别为2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31p、32p、35S、18F、36Cl。本发明化合物及其药学上可接受的盐的某些同位素变体，例如其中结合有3H或14C等放射性同位素的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究。氚、即3H和碳-14、即14C同位素是特别优选的，因为它们容易制备和检测。进而，被氘、即2H等同位素取代因代谢稳定性更高可以提供某些治疗上的优点，例如体内半衰期增加或剂量需求减少，因此在有些情况下可能是优选的。
可以用本发明组合治疗的疾病种类包括但不限于气喘、慢性或急性支气管收缩、慢性支气管炎、小气道阻塞、肺气肿、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、具有慢性支气管炎、肺气肿或与之有关的呼吸困难的COPD、和以不可逆的进行性气道阻塞为特征的COPD。
气喘用本发明治疗剂组合治疗的最重要的呼吸疾病之一是气喘，这是一种慢性的、日益普遍的世界范围病症，是以间歇性可逆的气道阻塞、气道反应性过高和炎症为特征的。气喘的原因尚有待确定，但是气喘的最普遍的病理表现是气道的炎症，这即使在轻微气喘患者的气道中也可能是显著的。这种炎症驱使反射性气道事件，导致血浆蛋白外渗、呼吸困难和支气管收缩。基于支气管的活组织检查和灌洗研究，已经清楚地显示了气喘牵涉肥大细胞、嗜曙红细胞和T淋巴细胞浸润到患者气道中。特应性气喘患者中的支气管泡灌洗(BAL)显示有白介素(IL)-3、IL-4、IL-5和粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)的活化，这提示了T辅助细胞2(Th-2)样T细胞群的存在。
本发明的治疗剂组合可用于治疗特应性与非特应性气喘。术语“特应性”表示针对对普通环境抗原的I型(即时)过敏反应的形成的遗传素因。最普遍的临床表现是变应性鼻炎，而支气管气喘、特应性皮炎和食物过敏不太常见。因此，本文所用的表达方式“特应性气喘”与“变应性气喘”(也就是支气管气喘在敏感患者中的变应性表现)规定为同义的。本文所用的术语“非特应性气喘”用来表示所有其他气喘，尤其是本质性或“真正的”气喘，它是由各种因素激起的，包括激烈运动、刺激性粒子、心理压力等。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)本发明的治疗剂组合进一步可用于治疗COPD或COAD，包括慢性支气管炎、肺气肿或与之有关的呼吸困难。COPD是以不完全可逆的、进行性气道阻塞为特征的。慢性支气管炎与大软骨气道中粘膜下层粘液分泌腺体的增生和肥大有关。杯状细胞增生、粘膜与粘膜下层炎性细胞浸润、水肿、纤维变性、粘液栓塞和增加了的平滑肌都见于末端与呼吸细支气管。已知小气道是主要的气道阻塞部位。肺气肿是以肺泡壁的破坏和肺弹性的丧失为特征的。也已经认定大量危险因素与COPD的发病率有关。吸烟与COPD之间的联系已得到充分的确定。其他危险因素包括暴露于煤灰和各种遗传因素。参见Sandford等，“Genetic risk factors for chronic obstructive pulmonarydisease”，Eur.Respir.J.10 1380-1391，1997。COPD的发病率正在增加，已成为工业化国家人口的沉重经济负担。COPD本身在临床上也存在广泛的差异，从没有能力丧失的简单慢性支气管炎到严重的能力丧失状态伴有慢性呼吸衰竭。
COPD是以气道炎症为特征的，这也是气喘的情况，但是见于患者支气管泡灌洗液和唾液中的炎性细胞是嗜中性白细胞和巨噬细胞，而非嗜曙红细胞。升高了的炎性介质水平也见于COPD患者，包括IL-8、LTB4和TNF-α，已经发现这类患者的支气管的表面上皮和上皮下膜被T淋巴细胞和巨噬细胞所浸润。利用β-激动剂和抗胆碱能支气管扩张剂可以提供COPD患者的症状缓解，但是疾病的进展仍然没有改变。已经使用茶碱治疗COPD，但是没有取得多大的成功，部分原因是有产生所不希望的后果的倾向。类固醇也没有能够成为令人满意的COPD治疗剂，因为它们作为抗炎剂而言是相对无效的。
因此，本发明治疗剂组合治疗COPD及其有关的阻塞性气道疾病的用途代表了本领域的显著进步。关于利用本发明治疗剂组合达到所需治疗目的的方式，本发明不限于任何特定的作用方式或任何假设。
支气管炎和支气管扩张按照上述为本发明治疗剂组合所具有的特定的和不同的抑制活性，它们可用于治疗任何类型、病因或发病机理的支气管炎，例如包括急性支气管炎，它具有短暂的但是严重的病程，是由着凉、吸入刺激性物质或急性感染所导致的；卡他性支气管炎，它是急性支气管炎的一种形式，伴有大量粘液脓性排出物；慢性支气管炎，它是支气管炎的一种长期延续方式，伴有或多或少的在静止阶段后复发的趋势，是由急性支气管炎的反复发作或慢性全身病引起的，是以咳嗽的发作、少痰或多痰和肺组织的继发改变为特征的；干性支气管炎，它是以粘痰的大量分泌为特征的；传染性气喘性支气管炎，它以气喘患者支气管痉挛症状形成继发呼吸道感染而著称的综合征；增生性支气管炎，它是与排痰性咳嗽有关的支气管炎。
利用本领域已知的许多不同模型可以确定和证明本发明治疗剂组合治疗特应性气喘或非特应性气喘、COPD或其他慢性炎性气道疾病的用途，这些模型抑制气道中的反射事件，包括血浆外渗和支气管解痉模型，如下所述。
支气管扩张活性——cAMP不仅牵涉在平滑肌松弛中，而且对气道平滑肌增生产生总体抑制影响，二者都可能来自本发明的PDE4组分升高cAMP。气道平滑肌肥大和增生可以受到cAMP的调制，这些病状是慢性气喘的常见形态特征。
体外支气管解痉活性——在下列试验程序中证明本发明治疗剂组合导致豚鼠气管平滑肌松弛的能力。将豚鼠(350-500g)用硫喷妥钠(100mg/kg i.p.)处死。切开气管，切除长2-3cm的切片。沿下一软骨板的横断面横切气管，得到深3-5mm的组织环。近侧和远侧的环弃去。将各环垂直固定在不锈钢支架上，其中一个固定在器官浴的底部，另一个连接于等距传感器。将环浸在37℃Krebs溶液浴(组成μMNaHCO325；NaCl1 13；KCl 4.7；MgSO4.7H2O1.2；KH2PO41.2；CaCl22.5，葡萄糖11.7)中，用O2/CO2(95∶5，v/v)脱气。用电场刺激以这种方式制备的环，使其收缩。为了确认解痉活性，将本发明的供试治疗剂组合溶于生理盐水，按5min间隔加入到器官浴中，数量递增，得到累积的浓度-效果曲线。
在上述试验模型中，本发明的治疗剂组合在0.001至1.0μM的浓度范围下抑制了电场刺激的豚鼠气管环制备物的收缩。
臭氧诱发的支气管反应性过高模型——通过测定对豚鼠肺响应活性的影响，证明了本发明治疗剂组合预防气道对有害刺激的响应性增加、也称支气管反应性过高。按照Yeadon等，1992，Pulm.Pharmacology，5，101-112的方法预处理和准备成年豚鼠(300-600g)。在基础状态下和在各种导致肺力学改变的干预之后监测气道对各种刺激的响应性。在攻击之前不同时间，将供试物i.t.给药或者借助气雾剂给药。对照动物的臭氧预处理导致肺响应性的3-100x增加，而本发明的治疗剂组合以剂量相关性方式阻滞了这种增加。
在上述试验模型中，本发明的治疗剂组合在0.001至0.3mg/kg i.t.的剂量范围下表现出抗炎活性。
人支气管松弛——在除去之后3天内得到在癌症手术期间切开的人肺样本。切除小支气管(内径≈2-5mm)，切成小段，置于装有胎牛血清(FCS)的2ml液氮贮存安瓿内，其中含有1.8M二甲基亚砜(DMSO)和0.1M蔗糖作为低温保护剂。将安瓿置于聚苯乙烯盒子内(11×11×22cm)，在保持在-70℃的低温冰箱内缓慢冷冻，平均冷却速率为0.6℃/min。3-15小时后，将安瓿转移至液氮(-196℃)中，贮存备用。在使用前，使组织暴露于-70℃达30-60min，然后将安瓿置于37℃水浴中，在2.5min内融化。然后，将支气管小段置于含有37℃Krebs-Henseleit溶液(μMNaCl 118，KCl 4.7，MgSO41.2，CaCl21.2，KH2PO41.2，NaHCO325，葡萄糖11，EDTA 0.03)的盘子中清洗，切成环，悬浮在10ml器官浴中，在约1g的预负载下记录等径张力。施加电场刺激，诱发张力进一步增加，已知这会诱导气道样本神经的活化，经由乙酰胆碱和其他天然介质的释放产生张力。通过累积的加入生成浓度-响应曲线，在前一浓度已经产生最大效果时加入后一浓度。在浓度-响应曲线结束时加入罂粟碱(300μM)，诱导支气管环的完全松弛。这种效果被视为100％松弛。
在上述试验模型中，本发明的治疗剂组合在0.001至1.0μM的浓度范围下产生人支气管环制备物的浓度相关性松弛，优选的实施方式是在5.0nM至500nM的浓度范围下有活性。
辣椒碱诱导的支气管收缩的抑制——将在实验之前自由饮水进食的雄性Dunkin-Hartley豚鼠(400-800g)用戊巴比妥钠(100mg/kg i.p.[腹膜内])麻醉。根据直肠温度计，利用加热垫使动物维持在37℃，经由气管插管(约8ml/kg，1Hz)通以空气与氧(45∶55v/v)的混合物。利用与符合呼吸泵的差示压力传感器连接的呼吸速度描记器监测气管处的换气。利用差示压力传感器，经由胸内插管直接监测胸腔内的压力变化，以便能够测量和显示气管与胸腔之间的压力差异，利用数字电子呼吸分析仪，从气流和跨肺压力的这些测量结果计算每一呼吸周期的气道耐受性(R1cmH2O/l/s)和顺应性(Cddyn)。利用压力传感器从颈动脉记录血压和心率。
当基础耐受性和顺应性都稳定时，利用辣椒碱的静脉内大丸剂诱导支气管痉挛的急性发作。将辣椒碱溶于100％乙醇，用磷酸盐缓冲盐水稀释。当对辣椒碱的响应稳定时给药本发明的供试治疗剂组合，这是在2-3次这样的给药后计算得到的，间隔10min。在气管内或十二指肠内滴注或者静脉内大丸剂注射之后，历经1-8小时评估支气管痉挛的逆转。评估支气管解痉活性，为辣椒碱输注后最初的、最大耐受性(RD)的抑制％。ED50值代表导致辣椒碱诱导的耐受性增加减少50％的剂量。作用的持续时间被定义为支气管痉挛被减少50％或以上的时间，按分钟计。对血压(BP)和心率(HR)的影响是以ED20值表示的，也就是在给药后5min测量的减少BP或HR达20％的剂量。
在上述试验模型中，本发明的治疗剂组合在0.001至0.1mg/kg i.t.[气管内]的剂量范围下表现出支气管扩张活性。进而，i.t.给药的组合对支气管痉挛表现出至少为加合性的抑制效果，每种组分单独能够抑制50％以上所观察到的对照响应。
LPS诱导的肺嗜中性白细胞增多——肺内嗜中性白细胞的募集和活化被视为COPD和严重气喘的重要病理特征。所以，动物中这些终点之一或之二的抑制提供了本发明实用性的支持证据。
将雄性Wistar-Albino大鼠(150-250g)或雄性Dunkin-Hartley豚鼠(400-600g)用单独或联合的供试物预处理，在简单的全身麻醉下吸入或者气管内(i.t.)滴注。化合物给药1-24小时后，动物受到细菌脂多糖(LPS)吸入气雾剂的攻击，足以在随后的1-24小时内诱导明显的肺嗜中性白细胞增多。计数支气管洗液中的细胞或者测定肺洗液或组织中的嗜中性白细胞产物，评估嗜中性白细胞增多。在这种试验系统中，本发明的治疗剂在0.0001至0.hng/kg i.t.的剂量范围下表现出抗炎活性。意外的是，i.t.给药的组合对炎症产生至少为加合性的效果，尽管两种组分之一本身都不产生显著的抗炎效果。进而，在如本发明那样联合使用时，利用更低的剂量能够观察到高剂量组分之一的等价抗炎效果，从而减少了所不希望的全身作用。
变应性豚鼠测定法——利用Dunkin-Hartley豚鼠(400-600g体重)评价本发明治疗剂组合对呼吸困难和支气管痉挛症状(即呼吸困难或吃力，肺耐受性增加)和炎症症状(即肺嗜中性白细胞增多和嗜曙红细胞增多)的治疗影响。
用在本试验中的结晶与冻干的V级卵清蛋白(EA)、氢氧化铝和马来酸美吡拉敏是商业上可得到的。攻击和随后的呼吸结果读取是在透明塑料盒中进行的，其内部尺寸为10×6×4英寸。盒盖和盒体是可以分开的。在使用时将二者用夹子紧紧夹在一起，用软橡胶垫圈维持盒子空间之间的气密密封。通过盒子空间的头端中心，经由气密密封插入雾化器，盒子的每个末端也具有出口。将呼吸速度描记器插入盒子的一个末端，与体积压力传感器连接，然后通过适当的连接器与dynograph连接。在雾化抗原的同时，出口是打开的，呼吸速度描记器与盒子空间是分离的。然后关闭出口，在记录呼吸方式期间连接呼吸速度描记器与盒子空间。在攻击时，将2ml 3％抗原的盐水溶液置于每支雾化器内，利用空气生成气雾剂，空气来自小型隔膜泵，在10psi下操作，流速8l/min。
皮下和i.p.注射含有1mg EA和200mg氢氧化铝的1ml盐水悬浮液，使豚鼠敏感化。在致敏后12与24天之间使用它们。为了消除响应中的组胺组分，在气雾剂攻击之前30min将豚鼠用2mg/kg美吡拉敏预处理。然后使豚鼠暴露于3％EA的盐水气雾剂达精确的1min，然后记录呼吸曲线达30min。随后，历经1-48小时测定mortem后的肺部炎症。从呼吸记录结果测量连续的呼吸困难持续时间。
本发明的供试治疗剂组合一般是在攻击之前0.5-4小时i.t.给药或借助气雾剂给药的。将化合物的组合溶于盐水或生物相容性溶剂。与载体处理的对照组相比，在它们减少呼吸困难和支气管痉挛症状的幅度和持续时间和/或肺部炎症的幅度的能力的基础上测定化合物的活性。在一系列剂量下评价本发明治疗剂组合的试验，推导出ED50，它被定义为抑制症状持续时间达50％的剂量(mg/kg)。
抗炎活性——借助对嗜曙红细胞或嗜中性白细胞活化的抑制作用，证明本发明治疗剂组合的抗炎活性。在本测定法中，从嗜曙红细胞数在0.06与0.47×109L-1之间的非特应性志愿者采集血样(50ml)。将静脉血收集到含有5ml柠檬酸三钠(3.8％，pH7.4)的离心管内。
在50ml离心管内，将抗凝处理后的血液用磷酸盐缓冲盐水(PBS，既不含钙也不合镁)稀释(1∶1，v∶v)，在15ml等渗Percoll(密度1.082-1.085g/ml，pH7.4)上分层。离心(30min，1000×g，20℃)后，小心地抽吸血浆/Percoll界面上的单核细胞，弃去。
将嗜中性白细胞/嗜曙红细胞/红细胞小片(体积约5ml)轻轻地重新悬浮在35ml等渗氯化铵溶液中(NH4Cl，155mM；KHCO3，10mM；EDTA，0.1mM；0-4℃)。15min后，将细胞在含有胎牛血清(2％，FCS)的PBS中洗涤两次(10min，400×g，4℃)。
利用磁细胞分离系统分离嗜曙红细胞和嗜中性白细胞。这种系统能够根据表面标记分离悬液中的细胞，包含一个永磁体，其中放置包括可磁化钢基质的柱子。使用前，将柱子用PBS/FCS平衡1小时，然后经由20ml注射器用冰冷的PBS/FCS逆向冲洗。21G皮下针头连接于柱子底部，使1-2ml冰冷的缓冲液从针头中流出。
粒细胞的离心之后，抽吸上清液，将细胞用100μl磁粒(抗-CD16单克隆抗体，与超磁粒子缀合)轻轻地重新悬浮。将嗜曙红细胞/嗜中性白细胞/抗-CD16磁粒混合物在冰上培养40min，然后用冰冷的PBS/FCS稀释至5ml。向柱子顶部缓慢引入细胞悬液，打开龙头，使细胞缓慢移动到钢基质。然后将柱子用PBS/FCS(35ml)洗涤，后者是被小心地加入到柱子顶部的，以避免扰乱已被捕集在钢基质内的磁标记嗜中性白细胞。在50ml离心管内收集未标记的嗜曙红细胞，洗涤(10min，400×g，4℃)。将所得小片重新悬浮在5mlHank氏平衡盐溶液(HBSS)中，以便能够在使用前评估细胞数和纯度。从磁体上取下分离柱，洗脱嗜中性白细胞部分。然后将柱子用PBS(50ml)和乙醇(无水)洗涤，贮存在4℃下。
利用微量细胞计数器计数全体细胞。向样本加入一滴溶原溶液，30秒后重新计数，以评估红细胞的污染。在Shandon Cytospin 2 cytospinner上制备cytospin血涂片(100μl样本，3min，500rpm)。将这些制备物染色，利用光学显微镜测定差示细胞数，检查至少500个细胞。借助台盼蓝的排除评估细胞活力。
将嗜曙红细胞或嗜中性白细胞稀释在HBSS中，吸移至96孔微量滴定板(MTP)，每孔1-10×103个细胞。每孔含有200μl样本，其中包含100μl细胞悬液；50μl HBSS；10μl硝酸双-N-甲基吖啶；20μl活化刺激物；和20μl试验化合物。
将样本与试验化合物或载体培养10min，然后加入活化刺激物fMLP(1-10μM)或C5a(1-100nM)的二甲基亚砜溶液，然后稀释在缓冲液中，以便所用最高溶剂浓度为1％(100μM试验化合物)。搅拌MTP，促进细胞与介质的混合，将MTP置于光度计中。历经20min同时测量每孔的总化学发光和瞬时分布，结果以任意单位表示，或者以在没有试验化合物的存在下fMLP诱导化学发光的百分率表示。将结果带入Hill方程，自动计算IC50值。
在上述试验方法中，本发明的治疗剂组合在0.0001μM至0.5μM的浓度范围下是有活性的，优选的实施方式是在0.1nM至100nM的浓度范围下是有活性的。
借助对血浆外渗至大鼠气道内的抑制作用，另外证明了本发明的治疗剂组合的抗炎活性。在这种测定法中，取气管组织，测定血浆渗漏的程度。这种测定法同样涉及气道的其他慢性炎性疾病，包括但不限于COPD，因此该部分没有赘述。
将Wistar白化病大鼠(150-200g)或Dunkin-Hartley豚鼠(450-600g)用戊巴比通钠麻醉，安装静脉和动脉插管。将与血浆蛋白质结合的伊凡斯蓝染剂i.v.给药(30mg/kg)。10min后，将试验物i.t.给药，10min后，将辣椒碱i.v.给药(3μg/kg)。30min后，除去气管组织，用甲酰胺提取过夜，在620nm下读取吸光度。在有些实验中，给药的顺序是相反的，以便在伊凡斯蓝和炎性刺激物之前将化合物给药。
在上述试验模型中，本发明的治疗剂组合在0.001至0.1mg/kg i.t.的剂量范围下表现出抗炎活性。
从上文可以看到，本发明的治疗剂组合可用于治疗炎性或阻塞性气道疾病或者其他牵涉气道阻塞的病症。确切而言它们可用于治疗支气管气喘。
鉴于它们的抗炎活性和它们对气道反应性过高的影响，本发明的治疗剂组合可用于治疗特别是预防性治疗阻塞性或炎性气道疾病。因而，通过长时间连续的规律性给药本发明的化合物组合可用于提供防止继发于阻塞性或炎性气道疾病的支气管收缩或其他症状发作的预先保护作用。本发明的化合物组合也可用于控制、改善或逆转这类疾病的基础状态。
考虑到它们的支气管扩张活性，本发明的治疗剂组合可用作支气管扩张剂，例如治疗慢性或急性支气管收缩，和用于阻塞性或炎性气道疾病的对症治疗。
本发明适用的阻塞性或炎性气道疾病包括气喘；尘肺病；慢性嗜曙红细胞性肺炎；慢性阻塞性气道或肺疾病(COAD或COPD)；和成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，以及气道反应性过高因其他药物疗法例如阿司匹林或β-激动剂疗法而恶化。
本发明的选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂可以被单独或联合给药，但是一般是与适合的药物赋形剂、稀释剂或载体混合给药的。
本发明的选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂优选地通过吸入给药，适宜以干粉吸入剂或气雾剂的形式从加压容器、泵、喷雾器、雾化器(atomiser)(优选为利用电子水力学产生微细烟雾的雾化器)或喷雾器(nebuliser)中释放出来，释放利用或者不用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134ATM[商标])或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EATM[商标])，二氧化碳、另外的全氟代烃，例如PerflubronTM或其他适合的气体。在加压气雾剂的情况下，借助计量释放的阀门可以确定剂量单位。加压容器、泵、喷雾器、雾化器(atomiser或nebuliser)可以含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇(任选为含水乙醇)或适合于分散、增溶或延时释放的试剂与推进剂的混合物作为溶剂，其中可以另外含有润滑剂，例如脱水山梨醇三油酸酯。用在吸入器或吹入器中的胶囊、泡眼和药筒(例如由明胶或HPMC制成)可以被配制成含有本发明化合物与适合的粉末基质和性能改进剂的粉末混合物，前者例如乳糖或淀粉，后者例如L-亮氨酸、甘露糖醇或硬脂酸镁。
在用在吸入用干粉制剂或混悬制剂之前，本发明化合物将被微粉化为适合于吸入提供的大小(通常认为小于5微米)。微粉化可以借助多种方法实现，例如螺旋喷射研磨、流化床喷射研磨或超临界流体结晶。
适合用在利用电子水力学产生微细烟雾的雾化器中的溶液制剂可以含有1μg至10mg本发明化合物，启动体积可以从1至100μl不等。典型的制剂可以包含活性化合物、丙二醇、无菌水、乙醇和氯化钠。
气雾剂或干粉制剂优选地是这样安排的，每计量的剂量或“每揿”含有1至4000μg本发明化合物，用于提供给患者。总的每日气雾剂剂量将在1μg至20mg的范围内，每天可以单剂量给药，或者更通常为均分的多剂量给药。
使用的选择性PDE4抑制剂抗胆碱能剂的优选重量比(w/w)将取决于所检查的特定组合。这是由于个别化合物的效力差异。无论如何，医师将决定每种化合物最适合于个别患者的实际剂量，它将因特定患者的年龄、体重和反应而异。
不言而喻，本文关于治疗的所有提法包括治愈、减轻和预防性处置。
权利要求
1.选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的吸入组合，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
2.根据权利要求1所要求保护的组合，其中该选择性PDE4抑制剂是式(I)化合物 或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1是H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C2-C4)链烯基、苯基、-N(CH3)2、(C3-C6)环烷基、(C3-C6)环烷基(C1-C3)烷基或(C1-C6)酰基，其中烷基、苯基或链烯基可以被至多两个-OII、(C1-C3)烷基或-CF3或者至多三个卤素取代；R2和R3各自独立地选自由H、(C1-C14)烷基、(C1-C7)烷氧基(C1-C7)烷基、(C2-C14)链烯基、(C3-C7)环烷基、(C3-C7)环烷基(C1-C2)烷基、饱和或不饱和的(C4-C7)杂环(CH2)n基团组成的组，其中n是0、1或2，其含有一个或两个氧、硫、磺酰基、氮和NR4作为杂原子，其中R4是H或(C1-C4)烷基；或式(II)基团 其中a是整数1至5；b和c是0或1；R5是H、-OH、(C1-C5)烷基、(C2-C5)链烯基、(C1-C5)烷氧基、(C3-C6)环烷氧基、卤素、-CF3、-CO2R6、-CONR6R7、-NR6R7、-NO2或-SO2NR6R7，其中R6和R7各自独立地是H或(C1-C4)烷基；Z是-O-、-S-、-SO2-、-CO-或-N(R8)-，其中R8是H或(C1-C4)烷基；Y是(C1-C5)亚烷基或(C2-C6)亚烯基，任选地被至多两个(C1-C7)烷基或(C3-C7)环烷基取代；其中每个烷基、链烯基、环烷基、烷氧基烷基或杂环基可以被1至14个、优选1至5个(C1-C2)烷基、CF3或卤代基团取代；R9和R10各自独立地选自由H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳基和(C6-C10)芳氧基组成的组。
3.根据权利要求2所要求保护的组合，其中该选择性PDE4抑制剂是9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-噻吩基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-叔丁基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐和溶剂化物。
4.根据上述权利要求任意一项所要求保护的组合，其中该抗胆碱能剂是异丙托品或氧托品盐。
5.根据权利要求1所要求保护的组合，其中该选择性PDE4抑制剂是9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-噻吩基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物，该抗胆碱能剂是异丙托品盐或其溶剂化物；或者该选择性PDE4抑制剂是9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-叔丁基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物，该抗胆碱能剂是异丙托品盐或其溶剂化物；或者该选择性PDE4抑制剂是9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-(2-噻吩基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物，该抗胆碱能剂是氧托品盐或其溶剂化物；或者该选择性PDE4抑制剂是9-环戊基-5，6-二氢-7-乙基-3-叔丁基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶或其药学上可接受的盐或溶剂化物，该抗胆碱能剂是氧托品盐或其溶剂化物。
6.用作药物的根据上述任一权利要求所要求保护的组合。
7.根据权利要求1-5任一项所要求保护的组合，用于在阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的治疗中通过吸入途径同时、先后或独立给药。
8.药物组合物，包括选择性PDE4抑制剂、抗胆碱能剂，和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，用于在阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的治疗中通过吸收途径给药，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
9.根据权利要求8要求保护的药物组合物，其中选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂如同权利要求2-5任一项所定义。
10.选择性PDE4抑制剂或抗胆碱能剂在制备治疗阻塞性气道疾病或其他炎性疾病中通过吸入途径同时、先后或独立给药这两种药剂的药物中的用途，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
11.权利要求10要求保护的用途，其中选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂如同权利要求2-5任一项所定义。
12.治疗阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的方法，包括向需要这种治疗的哺乳动物通过吸入途径同时、先后或独立给药有效量的选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
13.根据权利要求12要求保护的方法，其中选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂如同权利要求2-5任一项所定义。
14.吸入装置，用于在阻塞性气道疾病和其他炎性疾病的治疗中同时、先后或独立给药选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
15.根据权利要求14的装置，其中选择性PDE4抑制剂和抗胆碱能剂如同权利要求2-5任一项所定义。
全文摘要
本发明涉及选择性PDE4抑制剂与抗胆碱能剂的组合，用于在阻塞性气道疾病或其他炎性疾病的治疗中通过吸入途径同时、先后或独立给药，其条件是该抗胆碱能剂不是噻托品盐。
文档编号A61K31/46GK1511042SQ02810498
公开日2004年7月7日 申请日期2002年5月24日 优先权日2001年5月25日
发明者迈克尔·耶顿, 约翰·W·沃森, 罗伊辛·A·阿姆斯特朗, A 阿姆斯特朗, W 沃森, 迈克尔 耶顿 申请人:美国辉瑞有限公司