专利名称：用于预防或治疗体重过重的胃肠激素的制作方法
技术领域：
本发明涉及减轻哺乳动物体重的合成物和使用方法。
背景技术：
肥胖是发生率最高但缺乏有效治疗方法的疾病之一。它使人处于虚弱状态，降低了生活质量并显著增加了患其他疾病的风险。
在美国，目前有25％的成年人属于临床意义上的肥胖。据估计，肥胖直接导致美国的保健费用每年450亿美元，占总保健费用的8％。在欧洲，肥胖人数也日益增加。由于缺少新的方法，预测到2005年，20％的英国人将成为临床意义上的肥胖病人。医疗人员和健康权威正逐渐认识到肥胖是一种代谢疾病。但在长期的肥胖控制中，能与饮食控制和锻炼相结合应用的有效且安全的药物仍缺乏。
发明内容
本发明的目的是提供这类药物，并提供鉴定和进一步开发此类药物的方法。
前高血糖素原(preproglucagon)是一种160个氨基酸组成的多肽，它以组织特异性方式被激素原转换酶-1和-2切割而产生在中枢神经系统(CNS)和外周组织中具有不同功能的许多产物。在肠道和中枢神经系统中，前高血糖素原切割的主要转译后产物是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)，肠高血糖素和胃肠激素(oxyntomodulin，OXM)，如图A所示。到目前为止，OXM在中枢神经系统中的作用仍未被证明。
虽然GLP-1与GLP-2显示能抑制食物摄取，但未能证明不同的肽OXM有此作用。作为生物活性肽，OXM的重要性也未能证明。
与预计相反，现已令人惊奇地发现OXM肽能抑制食物摄取，和降低体重。
因此本发明第一方面是提供含OXM的合成物，用于哺乳动物体重过重的预防与治疗。
在本文中，术语“胃肠激素”与“OXM”一样，指含以下OXM肽序列或其类似物的任意合成物
OXM序列为本领域所熟知并有文字记录。本发明涉及本文引用的所有序列，具体包括以下的人OXM序列(与老鼠、大颊鼠和牛的OXM序列相同)His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala GlnAsp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr LysArg Asn Lys Asn Asn Ile Ala鮟鱇鱼的OXM序列如下His Ser Glu Gly Thr Phe Ser Asn Asp TyrSer Lys Tyr Leu Glu Asp Arg Lys Ala GlnGlu Phe Val Arg Trp Leu Met Asn Asn LysArg Ser Gly Val Ala Glu鳗鲡的OXM序列如下His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Asn Asp TyrSer Lys Tyr Leu Glu Thr Arg Arg Ala GlnAsp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Ser LysArg Ser Gly Gly Pro Thr本文中使用的术语OXM还涵盖任何含有以上OXM序列的类似物，其中1位上的组氨酸残基被保留，或者被携带阳电荷的芳香族部分或其衍生物所替代，其中，该部分优选为氨基酸，更优选组氨酸衍生物，以上OXM序列的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21或22位的氨基酸可单独地被其他任何所选氨基酸单独替代，但1位组氨酸除外。
此序列中任何一个或多个(可至22)a-氨基酸残基都可单独地被其他任何a-氨基酸残基所替代。如本领域所熟知，除组氨酸外的任何氨基酸残基都可被一个保守替代物所代替，即用一个相似化学类型的氨基酸来替代，例如，用一个疏水氨基酸来代替另一个疏水氨基酸。
如上所述，1-22位氨基酸均可被替代。除了以上替代选项外，也可用非必需或改造过的或者氨基酸的同分异构体来替代。例如，1-22位的氨基酸可用同分异构体(例如D-氨基酸)，或者改性氨基酸，例如正氨基酸(如己氨酸或戊氨酸)，或非必需氨基酸(例如牛磺酸)所替代。此外，1-22位氨基酸也可用通过其侧链连接的相应的或者不同的氨基酸(例如γ链谷氨酸)来替代。对于上述各种替代，1位上的组氨酸残基是不能改变的或如上述限定。
另外，除1位的组氨酸外(或如上所限定)，1、2、3、4或5位氨基酸残基可从OXM序列中去除。被去除的残基可以是任意2、3、4或5位的相邻残基或者完全分离的残基。
OXM序列的C末端可通过加入其它氨基酸残基或者其他部分来改性。可将上述OXM作为其相应的盐提供。药学上可接受的OXM盐及其类似物的例子包括衍生自有机酸，例如甲磺酸，苯磺酸和对-甲苯硫酸；衍生自无机酸，例如盐酸和硫酸等的盐；及甲基磺酸盐，苯磺酸盐，对-甲苯磺酸盐，盐酸和硫酸盐等；或衍生自碱，例如有机碱和无机碱的盐。适用于形成本发明合成物的盐的无机碱的例子包括氢氧化物，碳酸盐和氨、锂、钠、钙、钾、铝、铁、镁、锌等的重碳盐酸。这种盐也可用适当的有机碱形成。适合于形成具有本发明合成物的药学上可接受的碱加成盐的这种碱包括无毒性，并足以形成盐的有机碱。这样的有机碱为本领域所熟知，可包括氨基酸，如精氨酸和赖氨酸，单、双、或三羟基烷基胺，例如单-，双-和三乙胺，胆碱，单-，双-和三烷基胺，如甲胺，二甲胺，和三甲胺；胍；N-甲葡萄糖胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙(撑)二胺；N-苯甲基苯乙胺；tris(羟甲基)；氨基甲烷等。
此类盐可以本领域熟知方法按常规制备。所述碱性化合物的酸加成盐可通过将游离碱性化合物溶解在水中，或者水酒精溶液，或者其他含有所需酸的适当溶剂中而制备。当OXM含有酸性功能基因时，所述合成物的碱性盐可通过使所述合成物与适当的碱反应而制备。酸性或碱性盐可直接分离或者通过浓缩溶液，例如通过蒸发来获得。OXM也可以溶于溶剂或者水合形式存在。
可将本发明的OXM共轭于一个或多个，例如脂类，糖，蛋白质或者多肽。OXM可通过结合于一个组群连接(例如通过共价或离子键)而共轭，或者与其缔结。当OXM结合于该组群时，共轭键最好不要通过C或N末端的氨基酸。可将OXM共轭于一聚合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇聚；氧乙烯-聚氧丙烯共聚物；多糖如纤维素、纤维素衍生物、壳聚糖、阿拉伯胶、刺梧桐树胶、瓜耳树胶、黄原胶、黄芪胶、褐藻酸、角叉莱胶、琼脂糖和帚叉藻聚糖、右旋糖苷、淀粉、淀粉衍生物、聚酯、聚胺、聚酐和聚邻酯。
OXM也能被化学改性。具体地，OXM的氨基酸侧链、的N末端和/或C末端能被改性。例如，可使OXM进行一次或多次烷化，二硫化物形成，金属络合，酰化，酯化，酰胺化，硝化，酸处理，碱处理，氧化或还原。进行这些过程的方法是本领域熟知的。特别是OXM可作为低级烷化脂，低级的烷化酰胺，低级二烷基酰胺，酸加成盐，羧酸盐或其烷化加减盐。具体说，OXM的氨基或者羧基末端此衍生可以通过例如酯化，酰胺化，酰化，氧化或者还原而成。特别是OXM的羧基末端也可衍生形成一酰胺基团。
OXM可用金属，特别是二价金属处理。锌、钙、镁、铜、锰、钴、钼或铁中的一种或几种金属都可用于处理OXM。
OXM也可与药学上可接受的这载体或稀释剂组合提供。本领域熟知的合适运载体和/或稀释剂包括药物级淀粉，甘露醇，乳糖，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖(或者其他糖类)，碳酸镁，明胶，油，酒精，去污剂，乳化剂或水(无菌的最好)。该组合物可以是一种组合物的混合制剂，或可以是供同时、分开或者相继使用(包括给药)的组合制剂。OXM可采用结晶固体，粉末，水溶液，悬浮液或者油剂提供。
前述所指的与本发明组合物可通过任何方便的方法来给药，例如口服(包括吸入)，非肠道给药，粘膜(例如口腔，舌下，鼻部)给药，直肠给药，皮下或透皮给药，采取相应形式的该组合物。
对于口服给药，该组合物可配制成液体或固体，例如溶液，糖浆，悬浮液或乳液，片剂，胶囊以及药糖块。
液体制剂通常包括、该组合物的悬浮液或溶液或生理学上可接受盐的含适水溶液或非水液体载体，例如水，乙醇，甘油，聚乙二醇或油。这些制剂还可含有悬浮剂，防腐剂，调味剂或者着色剂。
片剂形式的组合物可用药学上常规用于制备固体制剂的适当运载体制备。这样的运载体包括硬脂酸镁，淀粉，乳糖，蔗糖和微晶纤维。
胶囊形式的组合物可用常规的胶囊包封程序来制备。例如，可采用标准运载体来制备含活性成分的粉末，颗粒或者小团，并将其填充入硬明胶胶囊中；或可采用适当的药学运载体，例如水树脂，纤维素，硅酸盐或者油来制备分散液或悬浮液，并将其填充入软明胶胶囊中。
可设计用于口服的合成物在其通过消化道时保护活性分子不受降解，例如有外裹层的片剂或者胶囊。
典型的非肠道吸收组合物包括此组合物或其生理学上可接受的盐的溶液或悬浮液以灭菌的水性碱、非水性运载体或非肠道可吸收的油，例如聚乙二醇，吡咯烷酮乙烯聚合物，卵磷脂，花生油或芝麻油配制。或者该溶液也可以冻干，给药前再用适当的溶剂重建。
鼻腔或口服给药的组合物可以方便地制成气雾剂，滴剂，凝胶和粉末形式。气雾剂通常含有用生理学可接受的水或非水溶剂配制的活性物质的溶液或00悬浮液，一剂或多剂以灭菌形式装于密封容器中，如药筒或可重复使用的喷雾器装置。密封容器也可以是一次性分配装置，如单剂鼻腔吸入器或者装有一次性堆放容器内物质的计量阀的气雾分配器。若该药剂形成含气雾分配器，将加入药学上可接受的推进剂。此气雾剂形式可采取泵喷雾器形式。
适合口浃或舌下给药的组合物包括片剂，药糖块和锭剂，其中活性成分与一种运载体，如糖和阿拉伯树胶，黄芪胶或明胶和甘油一起配制。
用于直肠或阴道给药的组合物可制成使用方便的栓剂形式(含有一中方便的栓剂基质，如可可，黄油)，子宫托，阴道管，泡沫材质或灌肠剂。
适于透皮给药的组合物包括药膏，凝胶，贴片和粉末注射的注射剂。
该组合物以单位计量形式如药片，胶囊或安瓿使用方便。
OXM可用作预防措施，来防止过度的体重增加，或可用于降低体重的治疗方法。
虽然没有证明患体重过重的哺乳动物为临床意义上的肥胖，但是体重过重通常就是肥胖。OXM可以是液体，固体或者半固体形式。
在当今社会，预防或治疗哺乳动物体重过重确实需要。优选的哺乳动物是人，虽然也包括其他哺乳动物如马，犬科动物(特别是家庭饲养的犬科动物)，猫科动物(特别是家庭饲养的猫科动物)以及那些生产肉类的哺乳动物如猪，牛和绵羊科动物。本发明可用于这类动物的体重过重，而使瘦肉的生产最大化。
本文中，术语“预防”指任何程度减轻过重体重的作用。本文中的术语“治疗”指任何程度改善过重体重。
第二方面，本发明提供了一种预防或者治疗哺乳动物体重过重的方法，该方法包括给予哺乳动物含OXM的合成物。哺乳动物很可能需要预防或治疗体重过重。体重减轻有美体作用。含OXM的合成物将以有效浓度给药。
本发明第一方面的所有优选特征也适用于第二方面。
本发明的第三方面提供一种美化性减轻哺乳动物体重的方法，该方法包括给予哺乳动物含OXM的合成物。在这样的情况下，体重减轻纯粹是出于美化外观的目的。
第一、第二方面的所有优选特征也适用于第三方面。
不受理论的束缚，可明白本发明是通过给予OXM作为进食抑制剂来预防或治疗哺乳动物体重过重。通过减少食物摄入结果是防止和治疗哺乳动物体重过重。本文中，术语“食物”包括被摄取并具有发热值的物质。
本发明第四方面提供OXM在制造用于防止或治疗体重过重药物中的用途。
第一和第三方面的优选待征都可应用于第四方面。
本发明的第一、二、四方面内容与药物有关，具体的剂量方案最终由主治医师决定，并且在在使用OXM时考虑到以下因素动物的类型、年龄、体重、症状的严重程度和/或治疗力度，给药方法，副反应和/或相反的迹象。可由标准设计的临床试验和对病人的病情进展和康复的全面监控来确定具体的剂量范围。
这些试验可采用逐步增加剂量的方法，使用动物所能承受的最大剂量的低百分比值作为人使用的起始剂量。
本发明第五方面涉及与运用OXM来鉴定能抑制哺乳动物摄食的制剂。本发明这方面提供了一种鉴定和进一步开发防治体重过重的合适药物的方法。
OXM的应用可包括此肽本身的使用或包括OXM的原理或模型特征的应用。所用的OXM功能或结构特性可以是肽本身的特性，或者可以是一种计算机构建的模型，一种物理的二维或三维模型或者一种电子构建的(例如计算机构建的)一级、二级或三级结构，以及药效基团(三维电子密度图谱)或其X-射线晶体结构。
此结构特性可用于鉴定潜在的能与OXM相互作用从而影响其功能的，可通过计算机建立模型和/或合理的药物设计进行鉴定。
本发明的每一方面的优选特性都对其他各方面作了必要的修正。
现在通过实施例方式说明本发明，并参见以下图表，其中图A是前高血糖素原及其组成成分图；图1是ICV和iPVN两种方法注射高血糖素原衍生的相关产物对禁食老鼠食物摄入的影响的比较。图1A表明在给禁食动物IVC注射GLP-1、OXM、胰高血糖素或肠高血糖素(均3nmol)后8小时的累计摄食量(g)。*，P＜0.05(以生理盐水作为对照)。图1B表明在给禁食动物急剧iPVN注射GLP-1，OXM(均为1nmol)，或激动素(exendin)-4(0.03nmol)后，24小时食物的累计摄入量(g)。*，所有组在1，2，4h时P＜0.01(以生理盐水作为对照)。*，只用激动素-4在8h时P＜0.05(以生理盐水作为对照)。
图2是两张ICV和iPVN给予OXM对禁食老鼠摄食影响的作用效果图。图2A，在给禁食老鼠急剧ICV注射OXM(0.3，1，3，或10nmol)后8小时食物的累计摄入量(g)。图2B给禁食老鼠即刻iPVN注射OXM(0.3，1，3，或10nmol)后8小时食物的累计摄入量(g)。*，P＜0.05(以生理盐水作为对照)。
图3是两张在黑暗初期ICV注射OXM作用效果的柱形图。在黑暗初期饱食老鼠接受OXM、GLP-1(3nmol)或盐水的ICV注射，测定注射后1h的食物摄入量(克；A)和行为(B)。*，P＜0.05(以生理盐水作为对照)。
图4是OXM和GLP-1由激动素-(9-39)所致食物摄入的抑制作用的两张柱形图。图4A，急剧ICV注射GLP-1(3nmol)、GLP-1加激动素-(9-39)(30nmol)、OXM(3nmol)、OXM和激动素-(9-39)(30nmol)，或单用激动素-(9-39)(30nmol)后1h的食物摄入量。图4B，给禁食老鼠急剧iPVN注射GLP-1(1nmol)、GLP-1和激动素-(9-39)(10nmol)、OXM(1nmol)、OXM和激动素-(9-39)(10nmol)，或单用激动素-(9-39)(10nmol)后1h的食物摄入量。**，P＜0.005(以生理盐水作为对照)。
图5是GLP-1和OXM对老鼠下丘脑膜[125I]GLP-1的结合竞争。
图6表明两种作用效果a)在黑暗早期给禁食24h的老鼠IP注射OXM(30，100和300nmol/kg溶于50μl生理盐水中)或生理盐水后的累计食物摄入量(实心方块＝生理盐水，空环＝OXM 30nmol/Kg，空心三角＝OXM 100nmol/Kg，空三角＝OXM 300nmol/Kg)；b)黑暗期开始前给非禁食的老鼠IP注射OXM(30，100和300nmol/kg溶于50μl生理盐水中)或生理盐水后的食物的累计摄入量(实心方块＝生理盐水，空环＝OXM 30nmol/Kg，实心三角＝OXM 100nmol/Kg)。*P＜0.05(以生理盐水作为对照)；图7表明一周内每天两次IP注射OXM(50nmol/Kg)或生理盐水对a)食物累计摄入量(g)；和b)体重增加量(g)的影响。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.005(以生理盐水作为对照)；图8表明IP注射OXM(50nmol/Kg)，生理盐水或阳性对照(1小时＝GLP-1(50nmol/Kg)；2小时＝CCK(15nmol/Kg))，对禁食36小时的老鼠胃排空的影响。胃内容物(干重)以喂食后三十分钟内摄食量的百分比表示。**P＜0.01(以生理盐水作为对照)；图9显示增加注射入禁食24小时的老鼠弓形核内的OXM剂量(0.01-1.0nmol)对注射后1h食物摄入量的影响。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.05(以生理盐水作为对照)；图10表明在IP注射OXM(30nmol/Kg)、GLP-1(30nmol/Kg)或生理盐水之前15分钟iARC注射激动素9-39(5nmole)对注射后1小时食物摄入的影响。(S＝生理盐水，G＝GLP-1(30nmol/Kg)，Ex＝激动素9-39(5nmoles))；图11a表明IP注射A)生理盐水和B)以OXM(50nmol/Kg)於下丘脑弓形核中显示的fos-样免疫反应。***P＜0.005(生理盐水作对照)；
图11b表明IP注射A)生理盐水和B)OXM(50nmol/Kg)或C)IP CCK(15nmol/Kg)于脑干中NTS和AP中显示的fos-状免疫反应。
具体实施例方式
A以ICV和iPVN注射OXM后引起禁食老鼠的摄食量显著减少。
肽和化学试剂GLP-1，肠高血糖素，胰高血糖素和SP-1购自半岛实验室(PeninsulaLaboratories，Inc.)(St.Helens，UK)，OXM购自IAF BioChem Pharma(Laval，Canada)。激动素-4和激动素-(9-39)由英国伦敦Hammersmith医院临床科学中心止血单元药物研究委员会(Medical Research Council，Hemostasis Unit，ClinicalSciences Center，Hammersmith Hospital，London，UK)在396 MPS肽合成仪(Advanced ChemTech，Inc.)上用F-moc化学试剂合成并经反相HPLC在C8柱(Phenomex，Macclesfield，UK)上纯化。分子量通过质谱验证正确。所有的化学试剂都购自Merck & Co.，(Lutterworth，Leicester，UK)，另有说明的除外。
动物成年雄性Wistar老鼠(ICSM，Hammersmith Hospital)在控制温度(21-23℃)和光线(光照12小时，黑暗12小时)的条件下单笼培养；随时可获得食物(RM1 diet，Special Diet Services UK Ltd.，Witham，UK)和自来水。日常对待手术后康复的老鼠直至研究完成。所有动物操作程序都得到英国内务部动物处(British Home OfficeAnimals)的批准(Scientific Procedures Act 1986(Project License PIL 90/1077)。试验合成物的ICV和iPVN插管和灌注动物置放永久性不锈钢导管(Plastics One，Roanoke，VA)，主体定位注入ICV或iPVN。所有的研究工作均在禁食24h后的早期光照阶段，在0900-1100之间进行，测定注射后1，2，4，8和24h的食物摄入量。
喂食实验方法高血糖素原衍生物和相关肽对食物摄取的影响的比较在1a实验中，老鼠ICV注入10μl的生理盐水，GLP-1(13nmol)，OXM(3nmol)，胰高血糖素(3nmol)，或肠高血糖素(3nmol；n＝8/每组)。
在所有的实验中，采用具有以下序列的人OXMHis Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp TyrSer Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala GlnAsp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr LysArg Asn Lys Asn Asn Ile Ala采用具有以下序列的人GLP-1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp ValSer Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg在1b实验中，老鼠iPVN注入1μl生理盐水，GLP-1(1.0nmol)，OXM(1.0nmol)，肠高血糖素(1.0nmol)，胰高血糖素(1.0nmol)或SP-1(3.0nmol；n＝12-15/group)。当注射ICV时，激动素-4抑制食物摄入比GLP-1更强。因此，激动素-4注射剂量为0.03nmol的iPVN。
OXM剂量增加对食物摄入量的影响研究在2a实验中，给老鼠ICV注射生理盐水，GLP-1(3nmol)，或OXM(0.3，1，3或10nmol；n＝8/group)。在2b试验中，给老鼠iPVN注射生理盐水GLP-1(1.0nmol)，或OXM(0.1，0.3，或1.0nmol；n＝12-15/group)。为了评估OXM是否通过GLP-1受体起作用，用GLP-1受体的拮抗剂激动素-(9-39)进行研究。
夜间喂食与行为分析实验3OXM可能通过引起非特异性厌食而抑制食物的摄入，这可能不是真正的过饱因素。因此，在黑暗期将GLP-1(3nmol)，OXM(3nmol)或生理盐水(n＝6/group)注射入插入ICV导管的老鼠。注射后1h进行摄食量测定(实验3a)和行为分析(实验3b)。注射后1h采用行为评分表来观察老鼠的行为。
在实验4a中，老鼠分别用ICV注射盐水；GLP-1(3nmol)；GLP-1(3nmol)加激动素-(9-39)(30nmol)，OXM(3nmol)，OXM(3nmol)加激动素-(9-39)(30nomol)，或激动素-(9-39)(30nmol)单独注射。在4b试验中，老鼠分别用iPVN注射盐水，GLP-1(1nmol)，GLP-1(1nmol)加激动素-(9-39)(10nmol)，OXM(1nmol)，OXM(1nmol)加激动素-(9-39)(10nmol)，或激动素-(9-39)(10nmol，n＝10-12/组)单独注射。
实验5 受体结合试验受体结合试验在终体积0.5ml的溶液进行。溶液含老鼠丘脑下部的细胞膜(含200μg蛋白质)；500Bq的[125I]GLP-1(100pM)和未标记竞争肽(GLP-1和OXM)。含膜溶液室温孵育90分钟。结合的和游离的放射性标记物通过离心分离(2分钟、4℃)。沉淀的膜用试验缓冲液(0.5ml、冰浴的)洗涤，洗涤后按上述方法离心。除去上清液，沉淀的放射活性用γ计数仪测量。特异性结合值(饱和)计算为在缺乏(总结合)和存在1μm GLP-1或OXM(非饱和结合)时[125I]GLP-1结合量之间的差异。所有曲线是用一式三份测量值点构成。IC50值用Prism 3程序(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)计算得到。
统计关于食物摄取分析，数据以平均值±标准误差(SEM)形式表示。实验各组间的统计学差异先进行方差分析(ANOVA)，继而以多重方差(post-hoc)最小显著性差异检验(Systat8.0，Evanton，IL)确定。关于行为分析，数据显示为每种行为发生数的中值和范围。使用Mann-Whitney U检验(Systat 8.0)比较各组间的差异。所有检验中，P＜0.05认为具有统计学意义。
结果高血糖素原衍生物和相关多肽对食物摄取的影响的比较。
ICV给药在实验1a中，OXM和GLP-1显著减少了再进食。这种对食物摄取的抑制持续到注射后4个小时(图1A)。胰高血糖素和肠高血糖素(3noml)在任何时间点对食物摄取都没有影响(图1A)。
iPVN给药在实验1b中，当iPVN注射后，OXM，GLP-1(3nmol)和激动素-4(0.03nmol)也抑制了再进食。这种抑制持续到注射后8小时，比ICV注射更久(图1B)。肠高血糖素，胰高血糖素(1nmol)和SP-1(3nmol)在iPVN注射后任何时间点对进食都没有影响。
增加OXM剂量对食物摄取的影响ICV给药在实验2a中，当ICV注射后，OXM以剂量依赖方式减少了再进食，剂量3nmol时，注射后1、2、和4小时达到最大抑制作用。
IPVN给药在实验2b中，当iPVN注射后，GLP-1(1nmol)和OXM(1nmol)显著减少食物摄取量，持续到注射后8小时(图2B)。
OXM对在黑暗期开始时ICV插管饱食老鼠的影响黑暗期是老鼠自然进食时间。因此，评估此时假定的致饱因素对非禁食动物的影响更具有生理学意义。
OXM对食物摄取的影响在实验3a中，在黑暗早期注射时，注射一小时后，与注射盐水的相比，GLP-1和OXM都显著降低了进食(图3A)。
观察ICV注射OXM后对行为的影响。
在黑暗早期，ICV给予OXM(3nmol)导致显著降低进食行为的发生(在实验3a中已经提到过)，并增加了饲养行为(在实验3b中)(图3B)。梳理毛发、静止、低头、挖洞或移动行为无变化。
为了评估OXM是否通过GLP-1受体发挥作用，用GLP-1受体拮抗剂——激动素-(9-39)作试验。
ICV给药 实验4GLP-1受体拮抗剂—激动素-(9-39)和GLP-1以10∶1比率(拮抗剂/激动剂)的ICV给药，阻断了GLP-1的厌食作用(图4A)。此外，激动素-(9-39)和OXM的共同给药导致OXM的厌食作用减弱(图4A)。
iPVN给药与上述相似，当iPVN注射后，GLP-1和OXM的厌食作用都被同时注射的激动素-(9-39)所阻断(图4B)。
受体结合实验5GLP-1对老鼠下丘脑膜制备物中，GLP受体的亲和力(IC50)是0.16nM(图5)。OXM对同一制备物中，GLP-1受体的亲和力是8.2nM(图5)，大约比GLP-1弱两个数量级。
讨论当注射ICV和iPVN，OXM对禁食所致的再进食有强抑制作用。此种作用对于iPVN可持续8小时，对于ICV持续4小时。在ICV和iPVN的摩尔给药量相同时，OXM的作用的量级和时间过程与GLP-1大致相同。此外，OXM能抑制黑暗期开始时非禁食老鼠摄取食物，此时老鼠没有厌食行为症状。
研究提示胃粘膜上有OXM特异性结合位点。然而，在CNS没有鉴定到这类结合位点。因此，推测OXM是通过下丘脑的GLP-1受体发挥作用，如同OXM和GLP-1在进食研究中有相类似作用。已显示OXM对GLP-1受体具有纳摩尔亲和力(IC50＝8.2nm)，大约比GLP-1的(IC50＝0.16nM)弱两个数量级。尽管对GLP-1的亲和力弱，但OXM降低食物摄取与GLP-1是同一个数量级。一种解释是OXM可能通过下丘脑的GLP-1受体和自己的受体起作用。因此尽管其对GLP-1受体亲和力低，OXM诱导的反应比得上GLP-1的作用。
激动素-(9-39)是GLP-1受体拮抗剂激动素-4的一层段，是GLP-1受体的选择性强拮抗剂。当GLP-1和激动素-(9-39)共同注射时，GLP-1的厌食作用被阻断。当OXM和激动素-(9-39)共同注射时，OXM的厌食作用也完全被阻断。这增强了OXM是通过GLP-1受体发挥作用的论点。
我们研究了在即刻ICV注射后，肠高血糖素和胰高血糖素对禁食老鼠的作用。给与这些多肽药物后，没发现对禁食所致食物摄取有影响。此外，当iPVN给药时，这些多肽也没有作用。当iPVN注射时，没有观察到SP-1，假定的OXM的最小活性结构，对食物摄取有抑制作用。因此，观察到的OXM作用是特异性的。
B外周OXM给药也能导致食物摄取减少和体重减轻。
多肽和化学药品
OXM购自IAF BioChem Pharma(Laval，Canada)。GLP-1购自半岛实验室(PeninsulaLaboratories Inc，St.Helens，UK)。激动素-(9-39)是在伦敦Hammersmith医院止血单元药物研究委员会(Medical Research Council Hemostasis Unit Clinical SciencesCentre Hammersimth Hospital London UK)中采用F-moc化学试剂在396 MPS多肽合成仪上合成，用反相HPLC C8柱(Phenomex Macclesfied，UK)纯化，以0.1％三氟乙酸配的乙晴梯度为洗脱。正确的分子量通过质谱证实。除非另有说明，所有化学试剂都是从Merck Eurolab Ltd(Lutterworth Leicestershire，UK)购买。
动物成年雄性Wistar老鼠(180-200g)在控制温度(21-23℃)和光照(12小时光照，12小时黑暗)条件下，单笼饲养。它们能够得到足量标准鼠食(RM1 diet，Special DietServices UK Ltd，Witham Essex，UK)和水。所有操作过程的进行都得到英国内务部动物处(British Home Office Animals)的批准(科学操作)Act 1986(项目证号PPL90/1077，70/5281和70/5516)。
弓形核内套管插入术立体定位给动物植入永久性留置的单侧不锈钢导入套管(Plastics One，Ronoke.VA)，植入到下丘脑的弓形核中。套管植入位置是前囱后3.3mm，和外侧0.3mm及头骨外表面向下9.0mm。
腹膜内注射所有的腹膜内注射用1ml注射器和25号针头。注射体积根据各动物体重调整，最大注射量500μl。所有肽溶于生理盐水中。
在这些研究中，所用的人OXM和人GLP-1的序列在上述第9页提供。
体内方案1.研究外周给药OXM对禁食动物的食物摄取的剂量反应影响在研究前，动物被禁食24小时。在光照初期(09.00-10.00时)，老鼠分别腹膜内注射体积500μl的盐水；GLP-1(30nmol/kg体重，作为阳性对照组)和OXM(10-300nmol kg体重)(n＝12/组)。注射后，动物返回自己的笼子，并提供已称重的鼠食。测定注射后1，2，4，8，和24小时的摄食量。
2.研究外周给药OXM对非禁食动物在黑暗期摄取食物的影响黑暗期是老鼠“正常”的摄取食物时间。因此，此时任何食物摄取的抑制可认为比禁食后再摄食的变化更符合生理情况。熄灯前(18.00-19.00时)动物腹膜内注射盐水或OXM(3-100nmol/kg体重)(n＝12/组)。测定关灯后1，2，4，8和12小时的摄食量。
3.反复腹膜内注射OXM的影响45只动物按体重随机分成3组(每组15只)1)盐水处理组，并随时获得充足食物，2)OXM(每次注射50nmol/kg体重，根据前面的剂量反应试验得出的剂量)处理组，并随时获得充足食物，3)盐水处理，但白天食物受限制和OXM处理，夜晚摄取食物。动物每天注射两次(07.00点和18.00时)持续7天。每天测量食物摄取量(g)，体重(g)和水摄取量(ml)。第八天，动物被断头处死。取出并称重附睾白色脂肪组织(WAT)和肩胛间棕色脂肪组织(BAT)作身体肥胖评估。
4.研究外周给药OXM对胃排空的影响动物禁食36小时，以确保胃是空的。光照早期段(09.00-10.00时)，动物被允许接触足量的已称重的标准鼠食30分钟。此后，取出食物并再称重。动物分别腹膜内注射盐水，OXM(50nmol/kg体重)和CCk-8(15nmol/kg体重)。与前述食物摄取实验同样时间，在取食1，2，4或8小时后，每时间段每组杀死12只老鼠。CCk-8组在这次实验中仅作为2小时点的阳性对照。动物用二氧化碳窒息处死。快速进行腹腔手术，暴露胃。结扎幽门连接处(2.0Mersilk Johnson & Johnson，Belgium)，然后结扎胃和食管连接处，取出胃。然后取出胃内容物，置于已称重的容器中，空气干燥48个小时。一旦干燥，称重内容物，在半个小时再进食期间每只老鼠留存在胃内的鼠食百分率用下面的公式计算％胃内残余食物＝(胃内容物干重)/(摄取食物总重)×1005.研究增加OXM弓形核内用药剂量的影响按体重将弓形核内(Intra-ARC(iARC))植入套管的老鼠随机分成6组，每组12-15只。在光照初期(09.00-10.00点)，禁食24小时的老鼠分别接受盐水OXM(剂量为0.01，0.03，0.1，0.3和1.0nmol)iARC注射。测定注射后1，2，4，8和24小时的摄食量。
6.研究OXM的外周给药是否直接通过弓形核的GLP-1受体发挥作用将弓形核内(Intra-ARC(iARC))植入套管的老鼠随机分成6组(n＝10-12/组)。在光照初期(09.00-10.00时)，禁食24小时的老鼠接受盐水或激动素-(9-39)(5nmol)弓形核内套管注射，15分钟后，腹膜内分别注射盐水，OXM(剂量为30nmol/kg体重)，或GLP-1(剂量为30nmol/kg体重)。注射的细节在下表1中描述。
表1分组 ARC内注射 腹腔内膜给药1盐水盐水2盐水OXM(30nmol/kg)3盐水GLP-1(30nmol/kg)4激动素-(9-39)(5nmol)盐水5激动素-(9-39)(5nmol)OXM(30nmol/kg)6激动素-(9-39)(5nmol)GLP-1(30nmol/kg)免疫组织化学腹膜内分别注射OXM(50nmol/kg)，CCK(剂量为每公斤体重15nmol/kg)，或盐水90分钟后，最终被麻醉的老鼠先通过贲门灌注0.1M的磷酸缓冲盐水(PBS)，然后灌注4％的甲醛磷酸缓冲液(PBF)。取出脑子放在甲醛磷酸缓冲液固定过夜，然后转移到蔗糖磷酸缓冲液(20％w/v)过夜。在冷冻超薄切片机中，将脑和脑干切成40μm的冠状切片；切片通过亲和素—生物素—过氧化物酶方法染色观察fos-样免疫反应(FLI)。然后，将切片固定在聚-L-赖氨酸覆盖的载玻片上，以递增浓度(50-100％)的乙醇脱水，在二甲苯中脱脂，用DPX仪盖上盖玻片。玻璃片用光学显微镜(Nikon Eclipse E-800)观察FLI-阳性核，用显徽摄像仪(Xillix Micro Imager)捕获影像。下丘脑和脑干的FLI-阳性核的数目由不知道本实验的研究小组的独立成员计算。计算每张切片的FLI-阳性核平均数目，并以整数值表示各动物的荧光阳性核数目。
下丘脑外植体静态培养一种静态培养系统。雄性Wistar老鼠脱颈椎处死并立刻取出整个脑子。固定此脑子作成标本，腹侧面朝上，放置在振荡的显微镜切片机(Microfild Scientific Ltd.，Dartmouth，UK)上。从下丘脑基部切取1.7mm的切片，侧面封闭于在Willis环(Circle of Willis)并在含有经95％O2和5％CO2平衡的1ml人造脑脊液的小室(chambers)中培养。该下丘脑切片含有中间前视觉区，PVN(下丘脑室旁核)，背内侧核(dorsomedial nucleus)，腹内侧核(ventromedial nucleus)，下丘脑外侧核(lateral hypothalamic)和ARC。将这些试管放在平台上，37℃恒温水浴中。经过最初2个小时平衡后，每个外植体用于测试期之前在600μl aCSF(人造脑脊液)中培养45分钟(基础期)。所用的100nM OXM，是其GLP-1受体IC50的十倍剂量。最后接触含有56mMKCl的aCSF45分钟证实了该组织的活力。在每次实验期末取出aCSF并保存在-20℃直到用放射免疫试验测定αMSH-免疫反应的。
放射免疫试验测定αMSH-IRαMSH用一种室内放射性免疫试验(in-house radioimmunoassay)来测定，采用Chemicon International Inc.的抗体。
统计学分析IP和iARC摄食实验的数据用ANOVA和随后进行的LSD(最小显著差异)检验作了分析。不同处理组的脂肪垫重量用非配对t检验分析。比较了下丘脑外植体培养实验各外植体与其自身基础期的数据，用配对t检验分析。在所有情况下，P＜0.05被认为有统计学显著性。
结果1.禁食动物OXM外周给药的影响与盐水对照组相比，OXM经腹膜内给药(100和300nmol/kg)，导致禁食24小时动物注射后1小时再进食的明显抑制(1小时OXM为100nmol/kg，5.4±0.2g(P＜0.05)，300nmol/kg，4.5±0.2g(P＜0.05)；而盐水为6.3±0.2g)。100nmol/kg OXM所引起的摄食量减少持续到注射后8小时。然而，最高剂量OXM(300nmol/kg)对进食的明显抑制作用持续到注射后24小时(24小时OXM 300nmol/kg，9.5±0.6g；而盐水17.5±0.7g，P＜0.05)(图6a)。在测定的任何时间点30nmol/kg和10nmol/kg的OXM不能改变摄食量。
2.外周给药OXM对非禁食动物黑暗期摄食量的影响在黑暗期前，立刻注射对通夜进食的老鼠，在实验的任何时间点，3和10nmol/kg的OXM对其摄食量均无影响。但是，30nmol/kg的OXM对摄食量有明显抑制作用持续至注射后2小时。(2小时OXM，30nmol/kg，为4.5±0.4g而盐水5.8±0.4g，P＜0.05)。注射后4小时摄食量减少，但不明显。在整个黑暗期，100nmol/kg的OXM对摄食量有明显抑制(8小时OXM为100nmol/kg，14.1±0.8g；而盐水为16.9±0.5g，P＜0.05)(图6b)。
3.OXM反复腹腔注射(IP)给药的作用每天两次Ip注射OXM(50nmol/kg)共七天与注射盐水的对照动物相比，引起了积累性的日进食量明显减少(第7天累积摄食OXM为50nmol/kg，168±4.6g；而盐水为180±4.3g，P＜0.05)(图7a)。此外，注射OXM的动物比盐水相比，体重增加明显减慢(第7天累计增重OXM为50nmol/kg，21.0±1.5g；而盐水为37.6±1.9g，P＜0.005)。另外，限制食物的“配对喂养”动物增重不如注射OXM动物那样慢，尽管得到了同样的进食量。(第7天配对喂养为33.5±2.0g，P＝NS；而盐水(随意喂食)为P＜0.05；相比于OXM)(图7b)。此外，持续的OXM引起了肥胖症的减少，这在注射盐水的配对动物中没有观察到(表2)。OXM处理动物在实验第一和第二天饮水明显减少(第一天OXM，为24.1±1.28ml；而盐水对照为28.1±1.33ml，P＜0.05)。在随后的几天中，与注射盐水动物相比，日饮水量增加(第3-6天)。然而，第七天，盐水和OXM处理组之间饮水量没有区别(未显示)。
表2组织/激素 盐水 OXM配对喂养WAT 0.69±0.02 0.51±0.01a0.61±0.02bBAT 0.16±0.01 0.12±0.01a0.15±0.01b每天两次腹腔注射(IP)盐水或OXM(50nmol/kg)七天，对限制食物和随意摄食老鼠附睾白色脂肪组织(epididymal WAT)和肩胛间棕色脂肪组织(interscapular BAT)增量的作用。
4.延迟胃排空对OXM厌食作用的影响给禁食36小时老鼠食物一小时后，GLP-1处理动物的胃内容物干重(作为30分钟喂食期食物消耗的百分比)明显高于盐水处理动物(1小时GLP-1为50nmol/kg，76.9±2.7g；而盐水对照组为65.8±1.6g，P＜0.01)，提示GPL-1引起了明显胃排空减少。OXM处理动物胃内容物比盐水处理对照动物多，尽管没有统计学显著性(1小时OXM，50nmol/kg为72.0；而盐水对照组为65.8±1.6g，P＜0.07)。喂食后两小时，与盐水处理动物相比OXM对胃内容物没有影响。但是，在此刻，注射阳性对照物CCK(15nmol/kg)的动物胃内容物明显高(2个小时CCK，15nmol/kg为64.7±6.4g而盐水对照组为38.5g；P＜0.01)，提示CCK引起了胃排空速率明显下降。与盐水对照动物相比，喂食后4或8个小时，OXM对胃内容物没有影响(图8)。
5.弓状核内注射剂量增加的OXM作用的研究24小时禁食后再进食的第一个小时里，iARC给药OXM的所有剂量(除了0.01nmoles外)都明显抑制了进食(1小时OXM 0.03nmoles，6.1±0.5g(P＜0.05)；0.1nmoles，5.6±0.4g(P＜0.05)；0.3nmoles，5.1±0.6g(P＜0.01)；1.0nmole，3.6±0.5g(P＜0.005)；而盐水对照为7.7±0.2g)(图9)。OXM 0.3和1.0nmoles对进食的显著抑制作用持续到注射后8小时。注射后二十四小时，OXM 1.0nmoles对进食有抑制，尽管不明显(24小时OXM 1.0nmole为37.8±3.0g；而盐水对照对40.8±1.6g，P＝NS)。
6.对外周给药OXM是否通过弓状核GLP-1受体起作用的研究腹腔内给药GLP-1(30nmol/kg)或OXM(30nmole/kg)都能在进入黑暗期一小时后明显抑制进食(1小时GLP-1为5.0±0.6g；OXM为5.1±0.4g；而盐水对照为9.2±0.3g)。然而，预先给药GLP-1受体拮抗剂-激动素9-39(300nmol/kg)，直接将其注射入ARC，阻断了OXM腹腔给药所致的厌食作用(表3和图10)。腹腔内注射GLP-1抑制进食不受在先的激动素9-39的iARC给药的影响。
表3肽 进食S.E.M.
盐水/盐水9.2 0.3盐水/GLP-1 5.0 0.6激动素9-39/*GLP-1 5.0 0.3盐水/OXM 5.1 0.4激动素9-39/OXM 9.4 0.4激动素9-39/盐水 9.0 0.3在OXM(30nmol/kg)，GLP-1(30nmol/kg)或盐水的IP给药前，激动素9-39(5nmole)iARC给药或盐水注射15分钟对一小时摄食量(g)的影响。(S＝盐水，G＝GLP-1(30nmol/kg)，Ox＝OXM(30nmol/kg)，Ex＝激动素9-39(5nmoles))。
7.绘制对IP OXM反应中下丘脑的FLI表达图在IP OXM(50nmol/kg)给药后，几乎只在下丘脑弓状核中发现致密的FLI着色(图11a)。其他下丘脑核(PVN(下丘脑室旁核)，DMH(下丘脑背内侧核)VMH(下丘脑腹内侧核))中均未显示特异性的c状沟(c-fos)着色。
在脑干中，IP CCK(15nmlo/kg)引起致密的FLI着色，大部分见于NTS(背侧孤束核nucleus tractus solita)和后区(the area postrema)中(图6b)。但是，在同一脑干核研究中，不论IP盐水或IP OXM(50nmol/kg)均未引起特异性c-fos表达增加(图11b)。
8.用OXM培育时下丘脑外植体释放α-MSH的变化与基本释放(basal release)相比，下丘脑外植体与OXM培育引起了α-MSH释放的明显增加(α-MSHOXM，100nM为4.1±0.6fmol/每个外植体；而基础释放为2.6±0.5fmol/每个外植体，P＜0.005)。外植体存活力通过在56mM KCl中培育评估，证实＞80％的外植体存活。将那些非存活(not viable)的外植体排除于此分析中。
讨论OXM的外周给药引起老鼠进食减少。这可见于光照期禁食后和通过喂食期。厌食作用强并持续24小时。每天两次腹腔注射OXM七天，与盐水处理动物相比，日进食减少，无快速减敏现象。OXM处理动物体重增加明显少于配对喂养的动物，尽管两组动物接收了相同的日摄取热量。腹膜内给药OXM确实可以短暂减少水的摄取，尽管这个现象没有持续；提示体重增加速率的降低并非由于脱水而致。
在总结长期研究时，取出附睾白色脂肪组织(epididymal WAT)和肩胛间棕色脂肪组织(interscapular BAT)并称重。发现，与配对应喂食的动物相比，尽管进食量相同，OXM处理动物所有脂肪垫重量都有减少。因此看来外周OXM给药也影响了其他新陈代谢参数。
过饱的一个主要作用是通过迷走神经介导(vagally mediated)的可导致脑干活动的机制，过缓胃排空。GLP-1和OXM都是啮齿动物和人胃排空的强抑制物，并且对GLP-1来说，认为是其促使过饱的主要机制。我们推侧OXM以同样的方式起作用，并且它对胃排空的作用是引起持续厌食的原因。但是，尽管OXM外周给药导致再给食后最初一个小时中胃排空轻微延迟，但这不明显，而且作用是短暂的。这提示OXM确实能减缓胃排空，但它很可能不是造成强的持续进食抑制的原因。
这里我们报告了OXM外周给药几乎只增加了ARC中的FLI。此外，我们发现用OXM培育下丘脑外植体引起了下丘脑外植体释放POMC(阿片黑素皮素原pro-opiomelanocortin)-衍生产物——α-MSH增加。腹腔注射OXM不影响NTS和AP中的FLI表达——这些区域被认为在整合迷走神经介导的信号(vagally mediated information)中起重要作用，进一步加强了关于OXM不是通过这些通路起作用的观点。
据认为脑干中的核是GLP-1作用的主要部位，随后信号被传递到下丘脑PVN，在PVN介导了其厌食作用。OXM直接注射入ARC中，即使是很低的剂量都能引起强烈持久的进食抑制作用，进一步支持了ARC是OXM作用部位的推测。在ARC中预先给予激动素9-39阻断了OXM外周给药所引起的厌食作用。然而令人感兴趣的是，GLP-1外周给药无厌食作用。这些发现强有力表明OXM通过ARC中的GLP-1受体起作用。此外，还鉴定到介导GLP-1和OXM作用的不同通路。
综上所述，这些数据显示OXM在长期和短期调节进食和体重维持中有潜在的重要性。胜于“传统”的通过饱食通路来减少食欲，包括减缓胃排空和激活脑干核，循环性OXM通过直接与ARC相互作用——可能是激活此核中的POMC阿片里季皮质原神经元——而介导其厌食作用。因此，OXM可用于治疗或预防哺乳动物肥胖等体重过重，并且为开发治疗哺乳动物肥胖等体重过重治疗药物提供了一个新的目标。
权利要求
1.一种用于预防和治疗哺乳动物体重过重的含有胃肠激素的合成物。
2.如权利要求1所述的含有胃肠激素的合成物，其特征在于，所述体重过重指肥胖症。
3.如权利要求1或2所述的含有胃肠激素的合成物，其特征在于，所述合成物与药药学上可接受的赋形剂结合使用。
4.如权利要求1-3中任何一项所述的含有胃肠激素的合成物，其特征在于，该合成物为液体，固体或半固体形式。
5.如权利要求1-4中任何一项所述的含有胃肠激素的合成物，其特征在于，所述哺乳动物是人。
6.一种预防和治疗哺乳动物体重过重的方法，该方法包括给予哺乳动物含胃肠激素的合成物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述体重过重指肥胖症。
8.一种美体性哺乳动物减重方法，所述方法包括给予哺乳动物含胃肠激素的所述合成物。
9.如权利要求6-8中任何一项所述的方法，其特征在于，所述合成物包含胃肠激素和药学上可接受的赋形剂或载体。
10.如权利要求6-9中任何一项所述的方法，其特征在于，所述减重是减少食物摄入量的结果。
11.胃肠激素在制造用于预防和治疗体重过重的药物中的用途。
12.胃肠激素在鉴定抑制哺乳动物进食的药物中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述用途利用了胃肠激素的功能和/或结构特征。
14.如权利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述用途利用了胃肠激素的电子构建模型。
15.如权利要求12-14中任何一项所述的用途，其特征在于，所述胃肠激素的特征是其一级、二级、三级结构药效基团和/或X-射线晶体结构。
16.一种如此前描述的实施例中的用于预防和治疗哺乳动物体重过重的含有胃肠激素的合成物。
17.一种预防和治疗哺乳动物体重过重的方法，该方法的描述参见实施例。
全文摘要
本发明涉及防止和治疗哺乳动物体重过重的合成物和使用方法。该合成物含有显示出减少食物摄取的胃肠激素。
文档编号A61P3/04GK1551780SQ02817279
公开日2004年12月1日 申请日期2002年9月9日 优先权日2001年9月7日
发明者斯蒂芬·罗伯特·布鲁, 穆罕默德·阿里·加特, 卡罗琳·简·斯墨尔, 凯瑟琳·路易丝·达金, 简 斯墨尔, 路易丝 达金, 德 阿里 加特, 斯蒂芬 罗伯特 布鲁 申请人:皇家学院创新有限公司