一种新型g蛋白偶联受体:gave10的制作方法

专利名称：一种新型g蛋白偶联受体:gave10的制作方法
背景技术：
G蛋白偶联受体(GPCRs)是参与细胞信号转导的一个大的整合膜蛋白家族。GPCRs对多种胞外信号包括神经递质、激素、有味物质和光发生反应，并且可转导信号以启动细胞内的第二信使反应。许多治疗药物靶向GPCRs，因为这些受体可介导多种生理反应，包括炎症、血管舒张、心率、支气管扩张、内分泌和蠕动。
GPCRs的特征表现为具有胞外结构域、七个跨膜结构域和胞内结构域。此类受体行使的一些功能如结合配体和与G蛋白相互作用的功能与关键位置处某些氨基酸的存在有关。例如，许多研究表明GPCRs中氨基酸序列的差异导致了与天然配体或小分子激动剂或拮抗剂亲和性的差异。换句话说，序列中小的差异可导致不同的结合亲和性和活性。(参见如Meng等人，生物化学杂志(J Bio Chem)(1996)271(50)32016-20；Burd等人，生物化学杂志(J Bio Chem)(1998)273(51)34488-95；和Hurley等人，神经化学杂志(J Neurochem)(1999)72(1)413-21)。具体地说，研究表明在第三胞内结构域中氨基酸序列的差异可导致不同的活性。Myburgh等人发现促性腺素释放激素受体的第3胞内环中的丙氨酸261对于G蛋白偶联和受体内化是关键的(生物化学杂志(Biochem J)(1998)331(第3部分)893-6)。Wonerow等人研究了促甲状腺素受体并证明第3胞内环中的基因缺失可导致组成型受体活性(生物化学杂志(J Bio Chem)(1998)273(14)7900-5)。
一般而言，内源配体与受体的结合作用导致该受体胞内结构域的构象改变，使得胞内结构域与胞内组分G蛋白之间可偶联。存在几种G蛋白，如Gq、Gs、Gi、Gz和Go(参见如Dessauer等人，临床科学(Clin Sci)(Colch)(1996)91(5)527-37)。受体的第三胞内环(IC-3环)及羧基末端与G蛋白相互作用(Pauwels等人，分子神经生物学(Mol Neurobiol)(1998)17(1-3)109-135和Wonerow等人，见上文)。有些GPCRs相对于G蛋白而言是“泛主结合的”，即一种GPCR可与一种以上的G蛋白相互作用(参见如Kenakin，生命科学(Life Sciences)(1988)431095)。
配体激活的GPCR与G蛋白偶联起始了信号级联过程(称为“信号转导”)。此类信号转导最终导致细胞活化或细胞抑制。
在细胞膜中的GPCRs以两种不同的构象平衡存在“无活性”状态和“活性”状态。处于无活性状态的受体不能与胞内信号转导途径连接来产生生物学反应(存在例外，如在转导细胞中受体过表达时，参见如www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。构象向活性状态的转变使得受体与转导途径(通过G蛋白)相连并产生生物学反应。激动剂结合并更可能使活性构象产生。但有时如果在不存在任何激动剂时已有相当强的反应，则称此类受体具有组成型活性(即已处于活性构象或配体不依赖的或自发的活性状态)。当激动剂加至此类体系中时，通常可观察到增强的反应。但是，当加入经典的拮抗剂时，此类分子的结合不对受体产生作用。另一方面，某些拮抗剂可引起受体组成型活性的抑制，这暗示了后一类药物在技术上不为拮抗剂，而为具有相反内在活性的激动剂。这些药物称为反向激动剂(www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。
对受体的常规研究基于这样的设想首先从内源配体的鉴定开始，然后继续向前推进以确定拮抗剂和其它受体效应分子。即使在首先发现了拮抗剂的情况下，教条式的反应仍是须确定内源配体(WO 00/22131)。但由于活性状态对于测试筛选目的是最有用的，获得此类组成型受体尤其是组成型GPCRs将允许在缺少内源配体信息时易于分离激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂。而且，对于由于受体活性紊乱而导致的疾病，通过使用处于自发活化状态的受体进行测试更易于发现引起组成型活性抑制的药物，或更具体地降低有效活化受体浓度的药物。例如作为可被转染入患者体内用于治疗疾病的受体，此类受体的活性可用通过上述测试发现的反向激动剂精细调节。
通常认为疾病如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和类风湿性关节炎(RA)具有炎性病因，其中涉及到T辅助细胞、单核巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。当前用皮质类固醇进行的抗炎治疗对哮喘是有效的，但伴有代谢和内分泌方面的副作用。可通过肺或鼻粘膜吸收的吸入制剂也可能有同样问题。对RA或COPD目前尚缺乏满意的经口疗法。
嗜酸性粒细胞在过敏及哮喘中介导大部分的呼吸道紊乱。白介素-5(IL-5)是嗜酸性粒细胞生长及活化的细胞因子。研究显示IL-5对组织嗜酸性粒细胞增生及对嗜酸性粒细胞介导的组织损伤而造成呼吸道过分反应是必要的(Chang等人，J Allergy Clin Immunol(1996)98(5 pt 1)922-931及Duez等人，Am J Respir Crit Care Med(2000)161(1)200-206)。在遗传过敏性哮喘中，当暴露于过敏原(例如，屋中尘螨抗原)后，T-辅助细胞-2(Th2)产生产生IL-5。
认为类风湿性关节炎是由激活的巨噬细胞在受侵袭的滑膜中聚集所造成的。γ干扰素(IFNγ)是由T-辅助细胞-1(Th1)所分泌的具有许多促炎特性的细胞因子。它是最有效的巨噬细胞激活细胞因子并且可引起MHCII类基因转录而形成树突细胞样表型。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中引起炎性反应的成分，其中包括肿瘤坏死因子α(TNFα)的释放。静脉注射抗TNFα对治疗类风湿性关节炎的效能已在临床上得到证明。认为肺部巨噬细胞的聚集也是造成慢性阻塞性肺病的原因，巨噬细胞产生嗜中性粒细胞的化学引诱剂(例如IL-8de Boer等人，J Pathol(2000)190(5)619-626)。巨噬细胞及嗜中性粒细胞均释放组织蛋白酶而造成肺泡壁的降解。认为肺上皮细胞是炎性细胞化学引诱剂及其它炎性细胞活化剂的重要来源(参看例如，Thomas等，J Virol(2000)74(18)8425-8433；Lamkhioued等，Am J Respir Crit Care Med(2000)162(2 Pt.1)723-732；及Sekiya等，J Immunol(2000)165(4)2205-2213)。鉴于GPCRs在疾病中起作用并可通过调节GPCRs的活性来治疗疾病，对以前未知的GPCRs的鉴定和描述可为开发新组合物和方法，用于治疗涉及GPCR活性的疾病提供条件。本发明鉴定并描述了一种新的组成型活性GPCRGAVE10的表达，并提供了应用该发现来鉴定和治疗相关疾病的组合物和方法。例如，GAVE10在THP-1细胞(一种单核细胞白血病细胞株)可被脂多糖诱导产生并在类风湿性关节炎患者滑膜中与正常人的滑膜相比有较高水平的表达。在巨噬细胞中，γ-干扰素上调GAVE10的表达。
发明概述本发明涉及一种新鉴定的G蛋白偶联受体，此处称为GAVE10。在一个实施方案中，GAVE10来自一个无内含子的结构基因，该基因编码约330个氨基酸，如SEQ ID NO2中所示。在一个相关方面，给出了如SEQ IDNO1所示的多核苷酸，其对应于包含约1586碱基对(bp)的核酸。
在另一方面，本发明涉及这样的分离核酸，其选自编码具有如SEQID NO2所示氨基酸的脊椎动物蛋白、保留了GAVE10活性的该蛋白的变体、突变体和片段的分离核酸，和包含如SEQ ID NO1所示核苷酸序列、其编码具GAVE10活性的多肽的变体、突变体和片段的分离核酸。进一步，本发明涉及可与SEQ ID NO1结合的核酸杂交探针和互补片段，或可与编码如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的核酸结合的核酸杂交探针和互补片段。进一步，本发明涉及与SEQ ID NO1具有约30％至约99％同一性的核酸，包括与编码如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的分离核酸具有约30％至约99％同一性的核酸。在一个相关方面，寡核苷酸包含至少8个核苷酸，且考虑这样的杂交方法，其包括将互补寡核苷酸和包含如SEQ ID NO1所示核苷酸的核酸或其基本等同物接触的步骤，杂交条件为允许互补序列与该核酸杂交的条件。而且，互补片段可作为反义寡核苷酸用于体内和体外抑制GAVE10表达的方法。此类方法可包括以下步骤提供由SEQ ID NO1所示核苷酸的互补序列组成的寡核苷酸序列、提供包含含有如SEQ IDNO1所示核苷酸序列的mRNA的人类细胞并将该寡核苷酸导入细胞中，其中GAVE10的表达可通过如下的机制抑制，所述机制包括抑制翻译、形成三股螺旋和/或激活核酸酶导致细胞内mRNA的降解。
本发明也涉及这样的分离多肽，其选自具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的纯化多肽、其变体、突变体和片段；以及具有额外氨基酸残基但提供GAVE10功能特性的纯化多肽。
本发明还涉及可操作地连接表达调控元件的核酸，包括含有该分离核酸的载体。本发明还涉及经转染或转化而包含本发明核酸的培养细胞。本发明还涉及用于产生多肽的方法，其包括以下步骤培养包含本发明核酸的转化细胞，允许在表达调控元件下表达，并从细胞或培养细胞的培养基中纯化多肽。
本发明的一个进一步的方面包括可结合本发明多肽的分离抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。而且，在一个相关的方面，公开了产生抗体的方法和使用可与GAVE10结合的抗体治疗GAVE10-相关疾病的方法。抗体也可用于鉴定在不结合配体时可活化GAVE10的分子。
本发明的另一方面包括用于诊断目的，在生物和/或组织样本中确定GAVE10存在与否的方法。在另一实施方案中，可监测或确定暴露于LPS。在本发明的另一方面，公开了用于调节GAVE10信号转导的治疗方法，包括将肽、激动剂、拮抗剂、反向激动剂和/或抗体施与需要其的患者。
在本发明的另一方面，公开了用于鉴定GAVE10调节剂的方法，其包括以下步骤提供化学分子，提供表达GAVE10的细胞，以及确定该化学分子是否能调节GAVE10的信号活性，包括该调节是否是在内源配体存在或缺乏时进行的。在一个相关的方面，化学分子可包括但不限于肽、抗体、激动剂、反向激动剂和拮抗剂。
在另一方面，本发明描述了用于确定侯选化合物是否为反向激动剂的方法，其中将所述侯选物在不存在内源配体、经典激动剂或经典拮抗剂时暴露于组成型受体，且此类组成型活性被所述反向激动剂抑制。
本发明的另一方面包括治疗组合物，其中此类组合物包括核酸、抗体、多肽、激动剂、反向激动剂和拮抗剂。进一步地，本发明的方法也包括通过将此类治疗组合物施与需要其的患者来治疗疾病和调节GAVE10信号活性的方法。
通过参考下列详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将变得更加明显。此外，在下面给出了较详细地描述某些方法或组合物的多篇参考文献。每一参考文献均在此引入作为参考就如同一一指明进行引入一样。
附图简述

图1为hGAVE10的DNA序列(SEQ ID NO1)和hGAVE10的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
发明详述本发明是基于对编码人GAVE10(hGAVE10)的cDNA分子的发现，其中所述GAVE10是G蛋白偶联受体超家族的一员。
此处所用的术语“激动剂”是指当与受体结合时激活胞内反应或加强GTP与膜结合的分子(例如但不限于配体和侯选化合物)。
此处所用的术语“部分激动剂”是指当其与受体结合时，与激动剂相比只在较小程度上激活胞内反应或只在较小程度上加强GTP与膜结合的分子(例如但不限于配体和侯选化合物)。
此处所用的术语“拮抗剂”是指与激动剂在同一位点竞争性结合受体的分子(例如但不限于配体和侯选化合物)。但拮抗剂不激活由受体的活性形式启动的胞内反应，并因此可抑制激动剂或部分激动剂引起的胞内反应。在一个相关的方面，当不存在激动剂或部分激动剂时，拮抗剂不降低基线胞内反应。
此处的术语“侯选化合物”是指易接受筛选技术处理的分子(例如但不限于化学化合物)。在一个实施方案中，该术语不包括公知的选自激动剂、部分激动剂、反向激动剂或拮抗剂的化合物。那些化合物是通过传统的药物开发方法鉴定的，所述方法涉及受体特异的内源配体的鉴定和/或拮抗受体的侯选化合物的筛选，其中此筛选需用竞争试验来评估功效。
此处所用术语“组成型活化受体”或“自发活化受体”可互换，是指在不存在配体时被活化的受体。
在一个相关的方面，此类组成型活化受体可为内源的(如GAVE10)或非内源的；即可通过重组方法修饰GPCRs，以产生野生型GPCRs的突变组成型(参见如EP 1071701；WO 00/22129；WO 00/22131；以及美国专利号6,150,393和6,140,509，此处引用作为参考)。
此处所用术语“组成型受体活化”是指通过非受体与内源配体或其化学等同物结合的方式使受体稳定在活性状态。
此处术语“反向激动剂”是指可结合组成型活化受体并抑制基线胞内反应的分子(例如但不限于配体和侯选化合物)。基线反应由受体的活性形式启动，该反应低于当缺乏激动剂或部分激动剂或减少GTP与膜结合时所观察到的活性的正常基底水平。
此处术语“配体”是指结合另一分子的分子，其中所述结合另一分子的分子为例如但不限于激素或神经递质，且进一步地其中所述分子立体选择性地与受体结合。
编码人GAVE10蛋白质的核苷酸序列如图1所示(SEQ ID NO1)。GAVE10蛋白质的氨基酸序列如图1所示(SEQ ID NO2)。
图1中GAVE10 cDNA(SEQ ID NO1)长约1586个核苷酸，其包括非翻译区，编码长约330个氨基酸的无内含子的蛋白质，分子量约为35kD。
通过Northern印迹检测，约1.8kb的GAVE10 mRNA转录本在某些组织中表达。RT-PCR显示GAVE10在暴露于脂多糖的THP-1中表达。此受体在经转染的HEK293细胞中也显示在不存在激动剂的情况下的有组成型活化。此外，Northern印迹结果显示在脑、骨骼肌或胰脏中未测得GAVE10的表达。相反的，GAVE10有在胎盘、肝脏及肾脏中表达，并在心脏中有微弱的表达。相关的，TaqMan RT-PCR实验被用来进一步评估GAVE10的表达。对组织进行的一组实验结果显示GAVE10在脾脏中表达，也在肾脏、心脏、胸腺及肝脏中表达。GAVE10的表达也在下列细胞中增加例如暴露在IFNγ之下被激活的血管内皮细胞及激活的巨噬细胞，及激活的CD19细胞。GAVE10的表达在以暴露到IL-1或TNF来激活的成纤维样滑膜细胞中增加。GAVE10的表达在患有类风湿性关节炎或骨关节炎患者的滑膜组织中增加。
当谈到本发明的蛋白质和核酸分子时术语“家族”是指两种或多种具有表面上共同的结构域并具有此处所定义的足够的氨基酸或核苷酸序列同一性的蛋白质或核酸分子。此类家族成员可天然存在并可来自相同或不同的物种。例如，一个家族可包含人源的第一种蛋白质和鼠源的该蛋白质的同系物(homolgue)，以及人源的第二种不同的蛋白质和该第二种蛋白质的鼠源同系物。家族成员也可具有共同的功能特征。
在一个实施方案中，GAVE10蛋白质包括与具GAVE10活性的SEQ IDNO2的第三胞内环结构域有至少约65％，优选地至少约75％且更优选地约85％，95％，98％或100％氨基酸序列同一性的第三胞内环结构域。
此处术语“等同的氨基酸残基”是指当两个或多个蛋白质序列进行序列对比分析时，所述氨基酸占据的基本上是蛋白质序列中的同一位置。本发明的优选GAVE10多肽具有与SEQ ID NO2的第三胞内环结构域氨基酸序列有足够的同一性的氨基酸序列。此处所用术语“足够的同一性”是指第一种氨基酸或核苷酸序列与第二种氨基酸或核苷酸序列具有足够的或最小数量的相同或等同(如具有相似侧链)的氨基酸残基或核苷酸。第一种和第二种氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如包含共同结构域的、具GAVE10活性的、有约55％的同一性，优选地65％同一性，更优选地75％，85％，95％或98％同一性的氨基酸或核苷酸序列在此处定义为足够的同一性。
其它目的结构域包括但不限于跨膜(TM)结构域(如SEQ ID NO2所示，TM1从氨基酸残基的第约15位至约39位；TM2从氨基酸残基的第约50位至约71位；TM3从氨基酸残基的第约84位至约107位；TM4从氨基酸残基的第约124位至约144位；TM5从氨基酸残基的第约159位至约192位；TM6从氨基酸残基的第约227位至约250位；以及TM7从氨基酸残基的第约259位至约282位)，胞质(胞内)(IC)结构域(如SEQ ID NO2所示，ICl从氨基酸残基的第约40位至约49位；IC2从氨基酸残基的约108位至约123位；IC3从氨基酸残基的第约193位至约226位；以及IC4从氨基酸残基的第约283位至约330位)和胞外(EC)结构域(如SEQ ID NO2所示，EC1从氨基酸残基的第约1位至约4位；EC2从氨基酸残基的第约72位至约83位；EC3从氨基酸残基的第约145位至约158位；以及EC4从氨基酸残基的第约251位至约258位)。在一个相关的方面，目的结构域也包括但不限于共有的糖基化位点、脂类结合位点和磷酸化位点。天冬酰胺残基位于N-端及EC2及EC3环上。激酶磷酸化位点，例如丝氨酸，位于IC3及C-端上。在TM3下游GAVE10具有ERY基序而不是典型的DRY基序。
此处可互换的“GAVE10活性”、“GAVE10的生物活性”或“GAVE10的功能活性”是指根据标准技术在体内或体外测得的由GAVE10蛋白质、多肽或核酸分子对GAVE10效应细胞产生的活性。GAVE10活性可为直接活性或间接活性，其中所述直接活性如与第二蛋白质的结合活性或对第二蛋白质的酶活性，其中所述间接活性如由GAVE10蛋白质与第二蛋白质相互作用介导的细胞信号活性。在一个优选的实施方案中，GAVE10活性包括至少一种或多种下列活性(i)与GAVE10信号途径中的蛋白质相互作用的能力；(ii)与GAVE10配体相互作用的能力；和(iii)与胞内靶蛋白质相互作用的能力。
因此，本发明的另一实施方案描述了具有GAVE10活性的分离GAVE10蛋白质和多肽。
在下列的子部分中对本发明的各方面进行了进一步的详细描述。
分离的核酸分子本发明的一个方面涉及编码GAVE10蛋白质或其生物活性部分的分离核酸分子。该核酸分子或其部分足以用作杂交探针来鉴定编码GAVE10的核酸(如GAVE10 mRNA)。也可用相关核酸作为PCR引物来扩增或突变GAVE10核酸分子。此处所用的术语“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(如mRNA)和用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可为单链或双链，但优选双链DNA。
“分离的”核酸分子是与存在于该核酸的天然源中的其它核酸分子相分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸没有该核酸所来自的生物体的基因组DNA中编码GAVE10的核酸的天然侧翼序列(即位于该核酸5′和3′端的序列)。例如，由于GAVE10位于人第12条染色体(即143兆碱基)上，在不同的实施方案中，分离的GAVE10核酸分子可包含该核酸所来自的细胞基因组DNA中天然存在于该核酸分子侧翼的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。而且，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有其它细胞材料或培养基，或当通过化学合成产生时，“分离的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有化学前体或其它化学物质。
本发明的核酸分子，如具有SEQ ID NO1核苷酸序列或该核苷酸序列的任一个片段或互补体的核酸分子，可应用标准的分子生物学技术以及此处提供的序列信息进行分离。通过标准的杂交和克隆技术(如Sambrook等人，编辑，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989一书中所描述技术)，用SEQ ID NO1的全部或部分核酸序列作为杂交探针，可将GAVE10核酸分子分离。
用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，并使用合适的寡核苷酸引物，按照标准的PCR扩增技术，可扩增本发明的核酸分子。例如此类引物可包括但不限于5’-ATGACGCCCAACAGCACT-3’(SEQ ID NO3)及5’-TTAGTTCAAGTCCAGGTC-3’(SEQ ID NO4)。可将扩增的核酸克隆入合适的载体并通过DNA序列分析表征。而且，对应于GAVE10核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准的合成技术如通过DNA自动合成仪制备。
在另一优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子包含与SEQ IDNO1中所示的核苷酸序列或其GAVE10-特异性部分互补的核酸分子。与给定的核苷酸序列互补的核酸分子为这样的核酸分子，其与给定的核苷酸序列充分互补以致可以与该给定的核苷酸序列杂交，从而形成可分离的或可检测的双链体。
而且，本发明的核酸分子可仅包含编码GAVE10的核酸序列的一部分，如可用作探针或引物的片段或编码GAVE10生物活性部分的片段。例如，此片段可包括但不限于编码SEQ ID NO2氨基酸残基的第约1位至约14位的区域。从克隆人GAVE10基因而确定的核苷酸序列使得可以产生探针和引物，用于鉴定和/或克隆其它细胞类型(如来自其它组织)中的GAVE10同系物以及来自其它哺乳动物的GAVE10同系物。探针/引物一般包含基本纯化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列区域，该区域在严紧条件下可杂交至SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的天然突变体的有意或反义序列中的至少约12个，优选地约25个，更优选地约50个，75个，100个，125个，150个，175个，200个，250个，300个，350个或400个连续的核苷酸上。基于人GAVE10核苷酸序列的探针可用于检测编码相似或相同蛋白质的转录本或基因组序列。探针可包含与其连接的标记基团，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅因子。此类探针可用作诊断检测试剂盒的部分，用于鉴定没有适当表达GAVE10蛋白质的细胞或组织，例如，这可通过如下方式完成测定来自受试者的细胞样本中编码GAVE10的核酸的水平，如检测GAVE10 mRNA水平或确定基因组GAVE10基因是否已突变或缺失。
编码“GAVE10的生物活性部分”的核酸片段可通过分离SEQ ID NO1的编码具有GAVE10生物活性的多肽的部分、表达此GAVE10蛋白质的编码部分(如体外重组表达)并评估GAVE10的该编码部分的活性而制备。例如编码GAVE10的生物活性部分的核酸片段包括第三胞内环结构域，如在SEQ ID NO2中氨基酸残基的第约202位至约219位。本发明还包括这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO1核苷酸序列并因此与SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列编码相同的GAVE10蛋白质。
除了在SEQ ID NO1中所示的人GAVE10核苷酸序列外，本领域技术人员能理解在群体(如人群)中存在导致GAVE10氨基酸序列变化的DNA序列多态性。由于天然的等位基因变异，在群体中的个体之间存在GAVE10基因的此类遗传多态性。一个等位基因是在特定基因座处可选择存在的一组基因中的一个。此处所用术语“基因”和“重组基因”是指包含编码GAVE10蛋白质，优选地编码哺乳动物GAVE10蛋白质的开放读码框的核酸分子。此处所用短语“等位基因变体”是指位于GAVE10基因座的核苷酸序列或指由该核苷酸序列编码的多肽。备选的等位基因能通过对一些不同个体进行目的基因测序而鉴定。这可以通过在多个个体中使用杂交探针鉴定相同的基因座容易地实施。GAVE10中的源于天然等位基因变异且不改变GAVE10功能活性的任一及所有此类核苷酸变异和所导致的氨基酸多态性或变异均包括在本发明的范围内。
而且，来自其它物种的编码GAVE10蛋白质(GAVE10同系物)的、具有不同于人GAVE10的核苷酸序列的核酸分子也包括在本发明的范围内。对应于本发明GAVE10 cDNA的天然等位基因变体和同系物的核酸分子可基于与此处公开的人GAVE10核酸的同一性，使用人cDNA或其一部分作为杂交探针，按照标准的杂交技术在严紧的杂交条件下分离。
因此，在另一实施方案中，本发明的分离核酸分子长度为至少300，325，350，375，400，425，450，500，550，600，650，700，800，900，1000或1100个核苷酸，并且可在严紧条件下杂交包含SEQ ID NO1核苷酸序列优选地其编码序列的核酸分子或其互补序列。
此处所用术语“在严紧条件下杂交”是对杂交和洗涤条件的描述，在此条件下，当核苷酸序列相互间具有至少55％，60％，65％，70％和优选地75％或更高互补性时一般仍保持杂交。此类严紧条件为本领域技术人员公知，并可在“分子生物学最新技术”(“Current Protocols in MolecularBiology”)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6一书中找到。严紧杂交条件的一个优选的非限制性实例为在约45℃，于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃，于0.2×SSC，0.1％SDS中洗一次或多次。优选地，在严紧条件下与SEQ ID NO1的序列或其互补序列杂交的本发明分离核酸分子对应于天然存在的核酸分子。此处所用“天然存在的”核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(如编码天然蛋白质)。熟练的技术人员能理解可根据序列特异性变量(如长度、G-C丰度等)修正条件。
本发明考虑包括这样的GAVE10核酸片段，其可用于诊断具有相似特性的GAVE10样分子。诊断片段可来自GAVE10基因的任一部分，包括侧翼序列。此片段可运用公知方法来作为文库探针。此片段可用公知的方法制备。
除了在群体中可能天然存在的GAVE10序列的等位基因变体外，熟练的技术人员还可以理解通过对SEQ ID NO1的核苷酸序列突变可导入变化，由此导致所编码的GAVE10蛋白质的氨基酸序列的改变，同时基本不改变GAVE10蛋白质的生物活性。例如，可通过核苷酸替换在“非必需”氨基酸残基处引起氨基酸替换。“非必需”氨基酸残基为这样的残基，其在野生型GAVE10序列(如SEQ ID NO2的序列)中可被改变，但基本上不改变生物活性。“必需”氨基酸残基是基本生物活性所需要的残基。例如，在不同种属的GAVE10中不保守或仅半保守的氨基酸残基对活性可为非必需的，因此将可能成为改造的靶标。另外，在不同种属的GAVE10蛋白质中保守的氨基酸残基对活性可为必需的，因此将不可能成为改造的靶标。
因此，本发明的另一方面涉及编码在活性非必需的氨基酸残基处含有变化的GAVE10蛋白质的核酸分子。此类GAVE10蛋白质的氨基酸序列不同于SEQ ID NO2，但保留了生物活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包括这样的核苷酸序列，其编码的蛋白质包含与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少约55％相同，65％，75％，85％，95％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
可通过向SEQ ID NO1核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸替换、添加或缺失以使所编码的蛋白质中导入一个或多个氨基酸替换、添加或缺失，由此创建编码具有不同于SEQ ID NO2的序列的GAVE10蛋白质的分离核酸分子。
可通过标准技术如定点诱变和PCR-介导的诱变来导入突变。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基的组别。这些组别包括具碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)，具不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，具无极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)，具分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)以及具芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。这样，GAVE10中预测的非必需氨基酸可优选地用来自同一侧链组别的另一氨基酸残基替换。或者，可在全长或部分的GAVE10编码序列中随机导入突变，如通过饱和诱变导入，并且通过对所得的突变体筛选GAVE10生物活性来鉴定保留活性的突变体。诱变后，可重组表达编码的蛋白质并可确定蛋白质的活性。
在一个优选的实施方案中，可测定突变的GAVE10蛋白质(1)与GAVE10信号途径中的蛋白质作用形成蛋白质蛋白质相互作用体的能力；(2)结合GAVE10配体的能力；或(3)结合胞内靶蛋白的能力。又在另一个优选的实施方案中，可测定突变的GAVE10调节细胞增殖或细胞分化的能力。
本发明包括反义核酸分子，即与编码蛋白质的有意核酸互补的分子，如与双链cDNA分子的编码链或与mRNA序列互补的分子。因此反义核酸可通过氢键结合有意核酸。反义核酸可与全长GAVE10编码链或仅与其一部分互补，如与该蛋白质编码区域(或开放读码框)的全部或部分互补。反义核酸分子可与编码GAVE10的核苷酸序列所在的编码链的非编码区反义。非编码区(“5′和3′非翻译区”)是在编码区侧翼的5′和3′序列，其不被翻译为氨基酸。
已知此处公开的编码GAVE10的编码链序列(例如，SEQ ID NO1)，本发明的反义核酸可根据Watson和Crick碱基配对原则设计。反义核酸分子可与GAVE10 mRNA的全长编码区互补，但更优选地为仅与GAVE10mRNA的编码区或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可与GAVE10 mRNA翻译起始位点附近的区域互补。例如，可使用具有序列5’-CTGTTGGGCGTCATCTTGGTC-3’(SEQ ID NO5)的寡核苷酸。反义寡核苷酸可长例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸。本发明的反义核酸可通过本领域公知的步骤用化学合成和酶连接反应产生。例如可用天然存在的核苷酸或多种经修饰的核苷酸来化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，其中所述经修饰的核苷酸被设计用来增加分子的生物稳定性或增加反义和有意核酸之间形成的双链体的物理稳定性，如可使用硫代磷酸酯衍生物、磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。
可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黄苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，可用表达载体生物学产生反义核酸，在该载体中核酸以反义方向亚克隆(即插入的核酸所转录的RNA与目的靶核酸为反义方向)。
本发明的反义核酸分子一般被施与受试者或原位产生，以便与编码GAVE10蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而通过如抑制转录和/或翻译来抑制该蛋白质的表达。可通过常规的核苷酸互补性来杂交形成稳定的双链体，或例如当用反义核酸分子结合DNA双链体时，通过在双螺旋体大沟中的特异性相互作用来杂交，或杂交至GAVE10的调节区。
本发明反义核酸分子施用方式的例子包括在组织位点处直接注射。另外，可修饰反义核酸分子以靶向所选择的细胞，然后全身施用。例如，对于全身施用来说，可修饰反义分子，以使该分子与所选细胞表面上表达的受体或抗原特异结合，其中所述修饰如将反义核酸分子连接至可结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体上。也可用此处描述的载体将反义核酸分子递送至细胞。为了达到足够的胞内反义分子浓度，可以将反义核酸分子置于强启动子控制下，优选pol II或pol III启动子。
本发明的反义核酸分子可为α-异头核酸(α-anomeric nucleic acid)分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂交体，其中的链走向相互平行(Gaultier等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1987)156625-6641)。反义核酸分子也可包含甲基核糖核苷酸(Inoue等人，核酸研究(1987)156131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等人，FEBS Lett(1987)215327-330)。
本发明也包括核酶。核酶为具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其可切割与该核酶杂交的单链核酸如mRNA。因此，核酶(如锤头状核酶(Haselhoff等人，在自然(Nature)(1988)334585-591)中所描述)可用于催化性切割GAVE10 mRNA转录本，由此抑制GAVE10 mRNA的翻译。可基于此处公开的GAVE10 cDNA的核苷酸序列(如SEQ ID NO1)设计对编码GAVE10的核酸具特异性的核酶。例如可构建四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与编码GAVE10的mRNA中欲切割的核苷酸序列互补，参见如美国专利号4,987,071和5,116,742，或者，可用GAVE10 mRNA从一群RNA分子中选择具有特异核糖核酸酶活性的催化RNA，参见如Bartel等人，科学(Science)(1993)2611411-1418。
本发明还包括可形成三股螺旋结构的核酸分子。例如，GAVE10的基因表达可通过如下方式抑制，即，将核苷酸序列定向互补到GAVE10的调节区域(如GAVE17启动子和/或增强子)上以形成三股螺旋结构来防止GAVE17基因在靶细胞中转录，通常参见Helene，抗癌药物设计(Anticancer Drug Des)(1991)6(6)569；Helene Ann NY Acad Sci(1992)66027；和Maher，生物鉴定(Bioassays)(1992)14(12)807。
在优选的实施方案中，本发明的核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架处进行修饰，以提高如分子的稳定性、可杂交性或溶解性。例如，可修饰核酸的磷酸脱氧核糖骨架以产生肽核酸(参见Hyrup等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1996)45)。此处所用术语“肽核酸”或“PNAs”是指核酸模拟物，如DNA模拟物，其中磷酸脱氧核糖骨架被假肽骨架替换并仅保留了四种天然核苷碱基。已显示中性PNA骨架使得可以在低离子强度条件下与DNA和RNA进行特异性杂交。如Hyrup等人(1996)见上文；Perry-O’Keefe等人，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad SciUSA)(1996)9314670所述，可通过标准的固相肽合成法进行PNA寡聚体的合成。
GAVE10的PNAs可用于治疗和诊断应用。例如，PNA可作为反义或反基因药剂，通过如诱导转录或翻译停滞或抑制复制用于基因表达的序列特异性调控。也可使用GAVE10的PNA。例如，PNA可通过如PNA-指导的PCR钳夹术用于分析基因中的单碱基对突变；当与其它酶如S1核酸酶组合使用时PNA可用作人工限制性酶(Hyrup等人，(1996)见上文)；或PNA可用作DNA序列和杂交的探针或引物(Hyrup等人，(1996)见上文；Perry-O’Keefe等人，(1996)见上文)。
在另一实施方案中，可通过将亲脂基团或其它辅助基团与PNA连接、通过形成PNA-DNA嵌合体或通过使用脂质体或其它本领域公知的药物递送技术来修饰GAVE10的PNA以便如增强稳定性、特异性或细胞摄入。可如Hyrup等人(1996)见上文；Finn等人，核酸研究(1996)24(17)3357-63；Mag等人，核酸研究(1989)175973；和Peterser等人，Bioorganic MedChem Lett(1975)51119所述进行PNA-DNA嵌合体的合成。
分离的GAVE10蛋白质和抗GAVE10抗体本发明的一个方面涉及分离的GAVE10蛋白质和其生物活性部分，以及适用作免疫原产生抗GAVE10抗体的多肽片段。在一个实施方案中，使用标准的蛋白质纯化技术通过合适的纯化策略可自细胞或组织源分离天然的GAVE10蛋白质。在另一实施方案中，GAVE10蛋白质是通过重组DNA技术产生的。除了重组表达外，可用标准的肽合成技术化学合成GAVE10蛋白质或多肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含有GAVE10蛋白质所来自的细胞或组织源中的细胞物质或其它污染蛋白质，或当通过化学合成产生时，基本上不含有化学前体或其它化学物质。短语“基本上不含细胞物质”包括这样的GAVE10蛋白质制品，其中该蛋白质从细胞的细胞组分中被分离出来，所述细胞为用于分离或重组产生该蛋白质的细胞。因此，基本上不含细胞物质的GAVE10蛋白质包括这样的GAVE10蛋白质制品，其具有少于约30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的非GAVE10蛋白质(此处也称为“污染蛋白质”)。当GAVE10蛋白质或其生物活性部分是重组产生的时，还优选其基本上不含培养基，即，培养基在蛋白质制品中所占有的体积少于约20％、10％、5％或更少。当GAVE10蛋白质通过化学合成产生时，优选地基本上不含有化学前体或其它化学物质，即该蛋白质从参与其合成的化学前体或其它化学物质中分离出来。因此，此类GAVE10蛋白质制品具有少于约30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的化学前体或非GAVE10的化学物质。
GAVE10蛋白质的生物活性部分包括这样的肽，其包含的氨基酸序列与GAVE10蛋白质的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列)具有足够的同一性或衍生自后者，并且该肽包含少于全长GAVE10蛋白质的氨基酸并显示GAVE10蛋白质的至少一种活性。一般来说，生物活性部分包含具有GAVE10蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。GAVE10蛋白质的生物活性部分可为如长10个、25个、50个、100个或更多氨基酸的多肽。优选的生物活性多肽包括一个或多个已鉴定的GAVE10结构域，如包含第三胞内环结构域(如SEQ ID NO2)。
而且，可通过重组技术制备其它生物活性部分(其中该蛋白质的其它区域已缺失)并针对其评估天然GAVE10蛋白质的一种或多种功能活性。
优选GAVE10蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。其它有用的GAVE10蛋白质基本上与SEQ ID NO2相同并保留了SEQ ID NO2蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变，其氨基酸序列与SEQ ID NO2存在差异。例如，此类GAVE10蛋白质和多肽具有至少一种此处描述的生物活性。
因此，有用的GAVE10蛋白质为这样的蛋白质，其包括与SEQ IDNO2的氨基酸序列至少约45％，优选地55％，65％，75％，85％，95％，99％或100％相同的氨基酸序列，并保留了SEQ ID NO2的GAVE10蛋白质的功能活性。在其它例子中，GAVE10蛋白质为这样的蛋白质，其具有与GAVE10第三胞内环结构域(SEQ ID NO2)55％，65％，75％，85％，95％，99％或100％相同的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，该GAVE10蛋白质保留了SEQ ID NO2的GAVE10蛋白质的功能活性。
为了确定两条氨基酸序列或两条核酸的百分同一性，对序列进行对比排列以优化比较(如可在第一条氨基酸或核酸序列中导入缺口(gap)，以优化序列对比并使其与第二条氨基酸或核酸序列具最大的序列同一性)。然后在相应氨基酸位置或核苷酸位置比较氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的某个位置与第二条序列中的相应位置被同一氨基酸残基或核苷酸占据，则认为这些分子在那个位置是相同的。两条序列间的百分同一性为两条序列共有相同位置的数目的函数(即百分同一性＝相同位置的数目/位置的总数(如重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两条序列长度相同。
可用数学算法完成对两条序列间百分同一性的确定。用于比较两条序列的数学算法的一个优选非限制性例子是Karlin等人，美国国家科学院院报(1990)872264提供的算法，改进算法见Karlin等人，美国国家科学院院报(1993)905873-5877。此算法被引入Altschul等人，分子生物学杂志(J Mol Bio)(1990)215403的NBLAST和XBLAST程序中。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，设置例如记分＝100，字长＝12，来获得与本发明GAVE10核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，设置记分＝50，字长＝3，来获得与本发明的GAVE10蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得有缺口的对比序列用于比较，可使用Altschul等人，核酸研究(1997)253389中描述的GappedBLAST。或者，可用PSI-Blast进行迭代检索来检测分子间较远的关系。Altschul等人(1997)见上文。应用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数，参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实例为Myers等人，CABIOS(1988)411-17提供的算法。此算法被引入GCG序列比较软件包的ALIGN程序(版本2.0)部分中。应用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。
可用类似于上面所描述的技术在允许或不允许缺口的情况下确定两条序列间的百分同一性。在计算百分同一性时，只计数准确的匹配。
本发明也提供了GAVE10嵌合体或融合蛋白质。如此处所用，GAVE10“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”包括可操作地连接非GAVE10多肽的GAVE10多肽。“GAVE10多肽”是指多肽具有对应于GAVE10的氨基酸序列。“非GAVE10多肽”是指多肽具有的氨基酸序列对应于基本上不同于GAVE10蛋白质的蛋白质，如不同于GAVE10蛋白质且来自相同或不同生物体的蛋白质。在GAVE10融合蛋白质中，GAVE10多肽可对应于GAVE10蛋白质的全部或部分，优选GAVE10蛋白质的至少一个生物活性部分。在融合蛋白质中，术语“可操作地连接”是指GAVE10多肽和非GAVE10多肽相互间融合在读码框内。可将非GAVE10多肽融合在GAVE10多肽的N-端或C-端。一种有用的融合蛋白是GST-GAVE10，其中GAVE10序列融合至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的C-端。此融合蛋白质使得重组GAVE10的纯化易于进行。在一个优选的实施方案中，将本发明的第三胞内环(IC3或IL3)(即SEQ ID NO2的约202至约219位氨基酸)与GST融合，方法为通过PCR扩增IL3并亚克隆该产物入载体如pGEX-2T中。可将所得的构建体导入宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli))并通过合适的小分子(如异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)诱导所述构建体的表达并接下来纯化(参见如Lee等人，生物化学杂志(J Biol Chem)(1996)271(19)11272-11279)。
在某些宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可提高GAVE10的表达和/或分泌。例如，可使用杆状病毒包膜蛋白的gp6分泌序列作为异源信号序列(分子生物学最新方法，Ausubel等人，编辑，John Wiley & Sons，1992)。其它真核异源信号序列的实例包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。又在另一实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等人，见上文)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。
又在另一实施方案中，融合蛋白质为GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白质，其中全部的GAVE10或其一部分被融合至来自免疫球蛋白家族成员的序列上。可将本发明的GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白质掺入药物组合物并施与受试者以抑制GAVE10配体和细胞表面的GAVE10蛋白质间的相互作用，由此体内抑制GAVE10-介导的信号转导。GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白质可用于影响GAVE10相关配体的生物利用度。GAVE10配体-GAVE10相互作用的抑制在治疗上是有用的，可用于治疗增生和分化紊乱并用于调节(如促进或抑制)细胞存活。而且，本发明的GAVE10-免疫球蛋白融合蛋白质可用作免疫原以在受试者体内产生抗GAVE10抗体、以纯化GAVE10配体和进行筛选测试来确定可抑制GAVE10与GAVE10配体间相互作用的分子。
优选地，本发明的GAVE10嵌合或融合蛋白质通过标准的重组DNA技术产生。例如，将编码不同多肽序列的DNA片段按照常规技术连接在读码框内，如用钝末端或粘末端连接、限制性酶消化以提供合适的末端、根据需要补平粘末端、碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接和酶促连接。在另一实施方案中，可通过常规技术包括DNA自动合成仪合成融合基因。另外，可用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，这样在两个连续的基因片段间产生互补的突出端，接下来可退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见如Ausubel等人，见上文)。而且，许多已编码融合部分(如GST多肽)的表达载体可通过商业途径得到。可将编码GAVE10的核酸克隆入此类表达载体，这样融合部分与GAVE10蛋白质连接在读码框内。
本发明也涉及GAVE10蛋白质变体(即具有不同于GAVE10氨基酸序列的序列的蛋白质)。此类变体可起GAVE10激动剂(模拟物)的作用或起GAVE10拮抗剂的作用。GAVE10蛋白质的变体可通过诱变产生，如GAVE10蛋白质的不连续点突变或截短。GAVE10蛋白质的激动剂可保留与天然存在的GAVE10蛋白质基本上相同的生物学活性或其中一部分的生物活性。GAVE10蛋白质的拮抗剂可通过如竞争性结合包括GAVE10蛋白质的细胞信号级联的下游或上游成员来抑制GAVE10蛋白质天然存在形式的一种或多种活性。因此，用功能局限的变体来处理可产生特定的生物学作用。用如下变体处理受试者较用GAVE10蛋白质的天然存在形式处理可对受试者产生较小的副作用，其中所述变体具有该蛋白质天然存在形式的一部分生物活性。
作为GAVE10激动剂(模拟物)或GAVE10拮抗剂起作用的GAVE10蛋白质变体可通过针对GAVE10激动剂或拮抗剂活性筛选GAVE10蛋白质突变体如截短突变体的组合文库而鉴定。在一个实施方案中，GAVE10变体的多样化文库通过核酸水平的组合诱变产生并由多样化基因文库编码。例如，多样化GAVE10变体文库可通过如下方式制备将合成的寡核苷酸混合物酶促连接入基因序列中，以使一组简并的潜在GAVE10序列可表达为单独的多肽，或备选地，表达为其中含有该组GAVE10序列的一组较大融合蛋白(例如，噬菌体展示)。有许多方法可用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在的GAVE10变体文库。可在DNA自动合成仪上进行简并基因序列的化学合成，然后将合成的基因连接入合适的表达载体。基因简并集合的使用使得可在一个混合物中提供编码所需的潜在GAVE10序列集合的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法为本领域公知(参见如Narang，四面体(Tetrahedron)(1983)393；Itakura等人，生物化学年鉴(Ann RevBiochem)(1984)53323；Itakura等人，科学(Science)(1984)1981056；Ike等人，核酸研究(1983)11477)。
此外，GAVE10蛋白质编码序列的片段文库可用于产生多样化的GAVE10片段群体，用来筛选和接下来选择GAVE10蛋白质变体。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可如下产生用核酸酶处理GAVE10编码序列的双链PCR片段(在所述处理进行的条件下，在每个分子中仅发生大约一次切割)，变性该双链DNA，复性所得DNA以形成可能包含来自不同缺口产物的有意/反义对的双链DNA，重新形成的双链体用S1核酸酶处理去除单链部分并将所得的片段文库连接入表达载体。通过此方法，可获得编码GAVE10蛋白质N-端和不同大小内部片段的表达文库。
用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物和筛选cDNA文库以获得具有所选特性的基因产物的一些技术在本领域是公知的。此类技术适用于快速筛选通过组合诱变GAVE10蛋白质产生的基因文库。适于高通量分析筛选大基因文库的最广泛使用的技术一般包括将基因文库克隆入复制型表达载体，用所得的载体文库转化合适的细胞并在一定的条件下表达组合基因，其中对所需活性的检测有利于分离编码基因的载体，其中所述基因的表达产物已得以检测。递归整体诱变(recursive ensemblemutagenesis；REM)为在文库中增加功能突变体的频率的技术，该技术可用于与筛选测试结合来鉴定GAVE10变体(Arkin等人，美国国家科学院院报(1992)897811-7815；Delgrave等人，蛋白质工程(Protein Engineering)(1993)6(3)327-331)。
分离的GAVE10蛋白质或其部分或其片段可用作免疫原，使用标准的多克隆和单克隆抗体制备技术来产生结合GAVE10的抗体。可使用全长的GAVE10蛋白质，或者，作为备选方案本发明提供了GAVE10的抗原性肽片段用作免疫原。GAVE10的抗原性肽包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列中的至少8个(优选地10个、15个、20个、30个或更多的)氨基酸残基并含有GAVE10表位，这样所产生的针对该肽的抗体可与GAVE10形成特异的免疫复合物。
在一个相关的方面，抗原性肽所包含的表位是位于GAVE10蛋白质表面的区域如亲水性区域。对人GAVE10蛋白质序列的疏水性分析表明位于SEQ ID NO2的约1和约14位氨基酸之间，约72和约83位氨基酸之间，约145和约158位氨基酸之间以及约251和约258位氨基酸之间的这些区域尤其亲水，并因此可能编码可用于产生靶向抗体的表面残基。
GAVE10免疫原一般通过用该免疫原免疫合适的受试对象(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)被用于制备抗体。合适的免疫原性制品可包含如重组表达的GAVE10蛋白质或化学合成的GAVE10多肽。该制品还可包含佐剂，诸如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。用免疫原性GAVE10制品免疫合适的受试对象可诱导多克隆的抗GAVE10抗体反应。
因此，本发明的另一方面涉及抗GAVE10抗体。此处所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原结合位点的分子，其中所述抗原结合位点特异性结合抗原如GAVE10。特异性结合GAVE10的分子是在天然含有GAVE10的样本如生物样本中结合GAVE10而不结合其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括用酶如胃蛋白酶处理抗体可产生的F(ab)和F(ab′)2片段。本发明提供了结合GAVE10的多克隆和单克隆抗体。此处所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一群这样的抗体分子，其只包含一种可与GAVE10特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。这样单克隆抗体组合物一般显示出与特定的GAVE10蛋白质表位的单一结合亲和性。
多克隆抗GAVE10抗体可如上所述通过用GAVE10免疫原免疫合适的受试对象而制备。可用标准技术，如使用固定化GAVE10的酶联免疫吸附测试法(ELISA)，在一段时间内监测接受免疫的受试对象体内的GAVE10抗体效价。如果需要，可从哺乳动物(如从血液)分离直接针对GAVE10的抗体分子，并用公知的技术如蛋白A层析法进一步纯化，以获得IgG级分。免疫后在合适的时间，如当抗GAVE10抗体效价最高时，可从受试对象获得抗体产生细胞并通过标准技术利用此细胞制备单克隆抗体，所述技术有例如Kohler等人，自然(Nature)(1975)256495-497最初描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kohler等人，今日免疫学(ImmunolToday)(1983)472)，EBV杂交瘤技术(Cole等人，单克隆抗体和癌治疗(Monoclonal Antibodies and C ancer Therapy)，(1985)，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)或trioma技术。产生杂交瘤的技术是公知的(一般参见免疫学最新技术(Current Protocols in Immunology)(1994)Coligan等人编辑，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，NY)。简而言之，将永生细胞系(通常为骨髓瘤)与来自如上所述的GAVE10免疫原免疫过的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，并筛选所得杂交瘤细胞的培养上清来鉴定产生结合GAVE10的单克隆抗体的杂交瘤。
可使用任一熟知的用于融合淋巴细胞和永生细胞系的方法产生抗GAVE10单克隆抗体(参见如免疫学最新技术，见上文；Galfre等人，自然(1977)266550-552；Kenneth，单克隆抗体生物学分析中的新方面(Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses)，Plenum Publishing Corp.，纽约，N.Y.(1980)；和Lerner，耶鲁生物医学杂志(Yale J Biol Med)(1981)54387-402)。而且，普通技术人员可以理解也可用此类方法的诸多改变后的方法。一般永生细胞系(如骨髓瘤细胞系)来自与淋巴细胞相同的哺乳动物种类。例如，鼠杂交瘤可通过用本发明免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴细胞与永生小鼠细胞系如骨髓瘤细胞系融合而制备，其中骨髓瘤细胞系对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(“HAT培养基”)敏感。许多骨髓瘤细胞系中的任一种都可按照标准技术用作融合伙伴(partner)，如P3-NS1/l-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可从ATCC获得。一般，用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合。融合所得的杂交瘤细胞然后用HAT培养基选择，其中HAT培养基杀死未融合的和非生产性融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞由于未被转化几天后死去)。本发明的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞可通过筛选骨髓瘤细胞培养物上清液中结合GAVE10的抗体进行检测(例如应用标准的ELISA试验)。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的备选方案，可以应用GAVE10筛选重组组合免疫球蛋白质文库(如抗体噬菌体展示文库)，由此得以分离结合GAVE10的免疫球蛋白文库成员，从而鉴定和分离到抗-GAVE10的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可从供应商处获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及StratageneSurfZAP噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
此外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可在以下文献中查询，例如美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等，Bio/Technology(1991)91370-1372；Hay等，Hum Antibody Hybridomas(1992)381-85；Huse等，科学(Science)(1989)2461275-1281和Griffiths等，EMBO J(1993)25(12)725-734。
此外，重组抗GAVE10抗体，如嵌合的和人源化的单克隆抗体(同时包含人的和非人的部分)可以使用标准重组DNA技术制备。该嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用如下文献中描述的方法产生PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请号125,023；Better等，科学(1988)2401041-1043；Liu等，美国国家科学院院报(1987)843439-3443；Lin等，免疫学杂志(1987)1393521-3526；Sun等，美国国家科学院院报(1987)84214-218；Nishimura等，癌研究(Canc Res)(1987)47999-1005；Wood等，自然(1985)314446-449；Shaw等，国家癌研究所杂志(J Natl Cancer Inst)(1988)801553-1559；Morrison，科学(1985)2291202-1207；Oi等，生物/技术(Bio/Techniques)(1986)4214；美国专利号5,225,539；Jones等，自然(1986)321552-525；Verhoeyan等，科学(1988)2391534；和Beidler等，免疫学杂志(JImmunol)(1988)1414053-4060。
特别需要完全人抗体以用于治疗人类患者。该抗体可应用转基因小鼠制备，所述转基因小鼠不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因，而能够表达人的重链和轻链基因。该转基因小鼠可以用选择的抗原(如GAVE10的全部或一部分)以标准方式进行免疫。直接针对该抗原的单克隆抗体可由常规的杂交瘤技术获得。位于转基因小鼠中的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中进行重排，并随后经历类型转换和体细胞突变。这样，应用该表位可鉴定出抑制GAVE10活性的抗体。克隆非人抗体的重链和轻链并用于构建噬菌体展示的Fab片段。例如，可将重链基因克隆到质粒载体中，以使细菌分泌重链。可将轻链基因克隆到噬菌体外壳蛋白基因中以使其可表达于噬菌体表面。使用与人轻链库(随机收集的)融合的噬菌体感染表达非人重链的细菌。产生的后代噬菌体展示杂合抗体(人轻链/非人重链)。利用选择的抗原淘选能结合所选抗原的噬菌体。为鉴定出该噬菌体可能需要几轮筛选。
从选出的可结合所选抗原的噬菌体中分离人轻链基因。然后利用选出的人轻链基因指导人重链基因的筛选，方法如以下所述。将选出的人轻链基因插入细菌表达载体。表达所选人轻链的细菌用融合了人重链库的噬菌体进行感染。产生的子代噬菌体展示人抗体(人轻链/人重链)。
接着，使用选出的抗原淘选可结合选择抗原的噬菌体。选出的噬菌体展示出完全人抗体，该抗体识别的表位与最初选择的非人单克隆抗体所识别的表位相同。分离编码重链和轻链的基因，并可进一步操作用于制备人抗体。该技术参见Jespers等的描述(生物/技术(Bio/Technology)(1994)12899-903)。
抗-GAVE10抗体(如单克隆抗体)可通过标准技术(如亲和层析或免疫沉淀)用来分离GAVE10。抗-GAVE10抗体可以帮助从细胞中纯化天然的GAVE10和表达于宿主细胞中的重组产生的GAVE10。此外，抗-GAVE10抗体可用于检测GAVE10蛋白质(如在细胞裂解物或细胞上清液中)以评估GAVE10蛋白质的表达丰度和表达方式。抗-GAVE10抗体可用于诊断中作为临床试验方法的一部分来监测组织中的蛋白质水平，以便例如，确定特定治疗方案的疗效。将抗体与可检测的物质偶联可促进检测的进行。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的实例包括散形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例为鲁米诺。生物发光材料的实例包括萤光素酶、虫萤光素和水母发光蛋白。合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
重组表达载体和宿主细胞本发明另一方面涉及含编码GAVE10(或其一部分)的核酸的载体，优选表达载体。如此处所用，术语“载体”指能够运输与其相连的另一核酸的核酸分子。载体的一个类型为“质粒”，是指可连入额外DNA区段的环状双链DNA。载体的另一类型为病毒载体，其中可以将额外的DNA区段连入病毒基因组中。某些载体可在宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他的载体(如非游离型的哺乳动物载体)在导入宿主细胞内时整合到宿主细胞基因组中，并因此随宿主基因组一同复制。此外，某些载体(表达载体)能够指导与其可操作地连接的基因的表达。一般，重组DNA技术中应用的表达载体常为质粒(载体)形式。然而，本发明意在包括其他形式的表达载体，如可执行等同功能的病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，所述核酸以适于在宿主细胞内表达的形式存在。这意味着重组表达载体包括一段或多段基于用于表达的宿主细胞而选出的调控序列，该序列与待进行表达的核酸可操作地连接。在重组表达载体内，“可操作地连接”意指目的核苷酸序列连接到调控序列上，其连接方式允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体导入宿主细胞中后在该宿主细胞中表达)。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(如多聚腺苷酸化信号)。该调控序列在如Goeddel，基因表达技术酶学方法(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)，185卷，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有描述。调控序列包括那些指导核苷酸序列在多种宿主细胞中进行组成型表达的序列(如组织特异的调控序列)。本领域内的技术人员应当理解，表达载体的设计将取决于选择进行转化的宿主细胞、所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞中以产生此处描述的核酸编码的蛋白质或肽(如GAVE10蛋白质、突变体形式的GAVE10和融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达GAVE10，所述细胞有例如，细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞在之前的Goeddel的文献中有讨论。备选地，重组表达载体可应用如噬菌体的调控元件和蛋白质在体外进行转录和翻译，其中所述元件和蛋白质如T7启动子和/或T7聚合酶。
蛋白质在原核细胞内的表达大都在大肠杆菌中使用载体进行，所述载体含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体可在其编码的蛋白质上添加一些氨基酸，这些氨基酸通常添加到重组蛋白的氨基端。此类融合载体一般有三种用途1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解度；和3)在亲和纯化中作为配体协助重组蛋白的纯化。通常，融合表达载体中在融合部分和重组表达蛋白的连接处导入有一个蛋白水解切割位点，从而使得可以在纯化融合蛋白后使重组蛋白得以和融合部分分离。此类酶和关联识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith等，基因(Gene)(1988)6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，三者分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组蛋白上。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等，基因(Gene)(1988)69301-315)和pET 11d(Studier等，基因表达技术酶学方法(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)，AcademicPress，San Diego，California(1990)18560-89)。pTrc载体上靶基因的表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子起始转录。
使大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的一个策略是在蛋白水解切割重组蛋白的能力被削弱的宿主中表达蛋白(Gottesman，基因表达技术酶学方法，Academic Press，San Diego，California(1990)185119-128)。另一策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，以使编码每一氨基酸的各密码子都为优选在大肠杆菌中应用的密码子(Wada等，核酸研究(1992)202111-2118)。对本发明核酸序列进行此类改变可通过标准的DNA合成技术完成。
在另一实施方案中，GAVE10表达载体为酵母表达载体。用于在酵母(如酿酒酵母(S.cerevisiae))中实现表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan等，细胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
备选地，可应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达GAVE10。现有可用于在培养的昆虫细胞(如Sf 9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)(1983)32156-2165)和pVL系列(Lucklow等，病毒学(Virology)(1989)17031-39)。
而在另一实施方案中，本发明的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中进行表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能常由病毒调控元件提供。例如，通常应用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40。对于其他适用于原核和真核细胞的表达系统，见之前Sambrook等的文献的第16和17章。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优选地在特定的细胞类型中表达(例如，应用组织特异的调控元件来表达核酸)。组织特异的调控元件在本领域内是公知的。合适的组织特异性启动子的非限定实例包括白蛋白启动子(肝脏特异；Pinkert等，基因进展(Genes Dev)(1987)1268-277)，淋巴特异的启动子(Calame等，Adv Immunol(1988)43235-275)，特别是T细胞受体(Winoto等，EMBO J(1989)8729-733)和免疫球蛋白(Banerji等，细胞(Cell)(1983)33729-740；Queen等，细胞(Cell)(1983)33741-748)的启动子，神经元特异的启动子(如神经丝启动子；Byrne等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1989)865473-5477)，胰腺特异的启动子(Edlund等，科学(Science)(1985)230912-916)和乳腺特异的启动子(如奶乳清蛋白启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请号264,166)。发育调节的启动子也包括在内，如鼠hox启动子(Kessel等，科学(Science)(1990)249374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes等，基因进展(Genes Dev)(1989)3537-546)。
本发明还提供含本发明的DNA分子的重组表达载体，其中该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是，DNA分子可操作地连接到调控序列上，该连接方式使得可以表达(通过转录该DNA分子)产生与GAVE10mRNA反义的RNA分子。可以对与反义方向克隆的核酸可操作连接的调控序列进行选择以指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达。例如，可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列以指导反义RNA实现组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，其中反义核酸被置于高效调控区域的控制下，其活性由载体所导入的细胞的类型决定。使用反义基因进行基因表达调控的讨论见Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。
本发明的另一方面涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可互换使用。应当理解，该术语不仅指特定的受试细胞，也指该细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响在传代过程中可发生某些改变，这样，后代实际上可能并非与亲代细胞相同，但其仍包括在此处所用术语的范围之内。
宿主细胞可为任意的原核或真核细胞。例如，GAVE10蛋白质可在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、293细胞或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞为本领域内的技术人员公知。载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用，术语“转化”和“转染”意指本领域内公知的各种将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、转导、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质体转染或电穿孔。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据应用的表达载体和转染技术，仅一小部分的细胞可将外源DNA整合到基因组中。为鉴定和筛选整合体，一般将编码选择标记的基因(如抗生素抗性基因)与目的基因一同导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些可赋予药物抗性的基因，所述药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可与编码GAVE10的基因位于同一载体上被导入宿主细胞或可以位于不同的载体上导入。被导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物筛选进行鉴定(例如，掺入了选择标志基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)GAVE10蛋白质。因此，本发明进一步提供了通过应用本发明的宿主细胞产生GAVE10蛋白质的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(编码GAVE10的重组表达载体已经导入了该细胞)，由此使GAVE10蛋白质得以产生。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离GAVE10。
在另一实施方案中，GAVE10被包含在诱导型表达系统中，用于其他亚克隆到修饰表达载体上的蛋白质的重组表达。例如，包含突变G蛋白的宿主细胞(例如，酵母细胞、Y2肾上腺皮质细胞和cyc-S49，见美国专利号6,168,927 B1,5,739,029和5,482,835；Mitchell等，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad USA)(1992)89(19)8933-37和Katada等，生物化学杂志(J BiolChem)(1984)259(6)3586-95)用含有编码GAVE10的核酸序列的第一表达载体进行转导，其中该GAVE10在宿主细胞中进行功能表达。尽管表达的GAVE10具有组成型活性，但突变的存在不允许信号转导发生；即，不能激活G蛋白指导的下游级联放大(例如，不能激活腺苷酰环化酶)。随后，用第二表达载体转导包含GAVE10的宿主细胞。除待通过此诱导型系统进行表达的目的基因外，第二载体还包含与宿主细胞G蛋白突变体互补的结构基因(即，哺乳动物或酵母的功能性Gs、Gi、Go或Gq，例如，见PCT公开号WO 97/48820；美国专利号6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。第二载体的互补结构基因为可诱导的；即，处于外源添加的化合物(如四环素、IPTG、小分子等，见之前的Sambrook等的文献)的控制下，所述化合物可以激活与所述互补结构基因可操作连接的启动子。加入诱导剂后，该互补结构基因编码的蛋白质进行功能性表达，结果具有组成型活性的GAVE10将形成复合体，导致适当的下游通路的激活(例如，形成第二信使)。第二载体包含的目的基因具有可操作连接的启动子，所述启动子可以由合适的第二信使(如CREB和AP1元件)激活。这样，当第二信使积聚时，目的基因上游的启动子被激活以表达所述基因的产物。缺乏诱导剂时，目的基因的表达关闭。
在一个优选的实施方案中，用于此诱导型表达系统的宿主细胞包括但不限于，S49(cyc-)细胞。尽管本发明考虑包含G-蛋白突变的细胞系，但也可以人工制备/构建出合适的突变体(见针对酵母细胞的美国专利号6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。
在相关的方面，细胞用与如下cDNA可操作连接的载体转化，所述cDNA包含编码SEQ ID NO2中所示蛋白质的序列。该系统包含的第一和第二载体可以考虑包括但不限于，pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)、pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan.，细胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
又，宿主细胞可通过适宜的方法转染，其中转染可导致功能性GAVE10蛋白质的表达(例如，Sambrook等，同上和Kriegler，基因转移和表达实验室指南(Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual)，Stockton Press，New York，NY，1990)。该“功能性蛋白质”包括但不限于，一经表达即可与G-蛋白形成复合体的蛋白质，其中该G-蛋白调节第二信使的形成。
在再一相关的方面，可考虑用于目的基因的启动子包括但不限于，那些来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40的启动子。其他的表达构建体组合也适用于此诱导型系统(见，Sambrook等，同上和Kriegler，同上)。
本发明的宿主细胞也可用于制备非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为受精的卵母细胞或胚胎干细胞，所述细胞中已导入编码GAVE10的序列。然后该宿主细胞可以用于产生基因组中导入了外源GAVE10序列的非人转基因动物，或产生其内源GAVE10序列已被改变的同源重组动物。该动物可用以研究GAVE10的功能和/或活性，以及用于鉴定和/或评估GAVE10活性的调节剂。如此处所用，“转基因动物”为非人动物，优选地为哺乳动物，更优选地为啮齿类动物如大鼠或小鼠，其中动物的一个或多个细胞包含转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类、绵羊、狗、牛、山羊、鸡和两栖动物等。
转基因是外源DNA，其被导入细胞且一般导入细胞基因组中，并在细胞发育成转基因动物后保留在成熟动物的基因组内。转基因指导编码的基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。如此处所用，“同源重组动物”为非人动物，优选地为哺乳动物，更优选地为小鼠，其内源GAVE10基因已通过同源重组发生改变。这在动物发育之前，在内源基因以及导入动物细胞(如动物的胚胎细胞)的外源DNA分子间完成。
本发明的转基因动物可以通过将编码GAVE10的核酸导入(如通过显微注射或逆转录病毒感染)受精卵母细胞的雄性原核、并允许卵母细胞在假孕的雌性代孕动物体内发育来产生。GAVE10 cDNA序列(如(SEQ ID NO1)中的序列)可作为转基因导入非人动物的基因组中。备选地，人GAVE10基因的非人同系物(如小鼠GAVE10基因)可基于与人GAVE10cDNA的杂交进行分离，并用作转基因。内含子序列和聚腺苷酸化信号也可包括在转基因内，以提高转基因的表达效率。组织特异的调控序列可以以可操作方式连接GAVE10转基因以指导GAVE10蛋白质在特定细胞内表达。用于通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物(特别是诸如小鼠等动物)的方法是本领域内的常规操作，且可参见如美国专利号4,736,866和4,870,009、美国专利号4,873,191和Hogan，小鼠胚胎的操作(Manipulating the Mouse Embryo)(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。可以使用相似的方法产生在基因组中存在转基因和/或在动物的组织或细胞内表达GAVE10 mRNA的其它转基因动物。起始的转基因动物可用来繁殖其它的携带转基因的动物。此外，携带编码GAVE10的转基因的转基因动物可进一步被培育成携带其他转基因的转基因动物。
为生成同源重组动物，制备出含至少部分GAVE10基因(例如，人或非人GAVE10基因同系物，如鼠GAVE10基因)的载体，所述部分GAVE10基因中已经导入缺失、添加或替代因而可以改变(如功能性破坏)GAVE10基因。在一个优选的实施方案中，设计载体，以致在同源重组后可破坏内源GAVE10基因的功能(即，不再编码功能蛋白质；也称为“敲除”载体)。
备选地，可设计载体，以便在同源重组后内源GAVE10基因发生突变或改变但仍编码功能蛋白质(例如，可改变上游调控区域由此改变内源GAVE10蛋白质的表达)。
在此同源重组载体中，改变的GAVE10基因部分在5′和3′端被GAVE10基因的其它核酸包围，从而允许在载体携带的外源GAVE10基因和存在于胚胎干细胞内的内源GAVE10基因之间发生同源重组。此其它的两翼GAVE10核酸的长度应足以使与内源基因的重组成功进行。一般地，载体内包括几千碱基的侧翼DNA(5′及3′端)(例如参见，Thomas等，细胞(Cell)(1987)51503中对同源重组载体的描述)。
将载体导入(如通过电穿孔)胚胎干细胞系，且筛选出导入的GAVE10基因与内源GAVE10基因发生同源重组的细胞(例如参见，Li等，细胞(Cell)(1992)69915)。然后将筛选出的细胞注射到动物(如小鼠)的胚泡中以形成嵌合集合体(例如参见，Bradley，畸胎癌和胚胎干细胞实用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach)，Robertson编辑，IRL，Oxford，(1987)，113-152页)。然后将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎生长足月。在生殖细胞中带有同源重组DNA的子代可用于繁殖动物，通过转基因的生殖系传送，所繁殖的动物的所有细胞都将含有同源重组的DNA。
用于构建同源重组载体和同源重组动物的方法可以进一步参见Bradley，生物/技术中的最新观点(Current Opinion in Bio/Technology)(1991)2823-829和PCT公开号WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中的描述。
在另一实施方案，产生的转基因非人动物可含有所选系统以允许调控转基因的表达。该系统的一个实例为噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。对cre/loxP重组酶系统的描述参见如Lakso等，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad USA))(1992)896232-6236。重组酶系统的另一实例为酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重组酶系统(O′Gorrnan等，科学(Science)(1991)2511351-1355)。如果cre/loxP重组酶系统被用于调控转基因的表达，则需要同时含有编码cre重组酶和选定蛋白的转基因的动物。该动物可通过构建“双重”转基因动物，例如通过两转基因动物的交配(所述动物中一个含有编码选定蛋白的转基因而另一个含有编码重组酶的转基因)来提供。
此处描述的非人转基因动物的克隆可根据以下文献描述的方法制备，Wilmut等，自然(Nature)(1997)385810-813和PCT公开号WO 97/07668和WO 97/07669。简言之，可以分离转基因动物的细胞如体细胞，诱导其脱离生长周期并进入G0期。然后，通过应用如电脉冲将此静止细胞与去除细胞核的卵母细胞融合，所述去核卵母细胞与分离的静止细胞来自同一动物物种。然后培养重建的卵母细胞以使其发育成桑椹胚或胚细胞，然后将其转移到假孕的雌性代孕动物体内。雌性代孕动物生育的后代即是分离细胞(如体细胞)所来源的动物的克隆。
药物组合物本发明的GAVE10核酸分子、GAVE10蛋白质和抗-GAVE10抗体(此处也称作“活性化合物”)可掺入到适于施用的药物组合物中。该组合物一般包含此核酸分子、蛋白质或抗体，以及可药用载体。如此处所用，术语“可药用载体”意在包括任何及所有适合药物施用的溶剂、分散介质、赋形剂、载体、稀释剂、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。对药物活性物质应用这些介质和药剂是本领域熟知的。除了与活性化合物不相容的外，任何常规介质或药剂均可考虑应用在组合物内。还可以将辅助活性化合物掺入组合物中。
将本发明的药物组合物进行配制以使其适合于预定的施用途径。施用途径的实例包括肠胃外用药，例如静脉内、皮内和皮下、经口(如吸入)、经皮(局部的)、经粘膜和直肠用药。用于肠胃外、皮内和皮下给药的溶液或混悬液可包括以下成分无菌稀释剂(如用于注射的水)、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苄基醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如EDTA；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调整渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。pH的调整可应用酸或碱，如HCl或NaOH进行。肠胃外制剂可封闭在安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶(玻璃或塑料制成)中用以存储。
适于注射用药的药物组合物包括无菌水性溶液(水可混溶的)或分散液，以及用于随时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲溶液(PBS)。在所有的情况中，组合物必须无菌且应是易于注射的流体。组合物在生产和储存条件下必须稳定，且必须避免微生物(如细菌和真菌)的污染。载体可为溶剂或分散介质，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和其适宜的混合物。适当的流动性可通过例如使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散剂的情况下保持所需的粒子大小和应用表面活性剂来维持。多种抗菌剂和抗真菌剂可用来预防微生物的作用，如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠等。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如糖、聚醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延时吸收可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂实现，所述试剂如单硬脂酸铝和明胶。
无菌注射溶液的制备可以按如下进行将活性化合物(如GAVE10蛋白质或抗-GAVE10抗体)以所需数量与以上所列成分中的一种或其组合(按需要)掺入到适当的溶剂中，之后过滤除菌。一般地，分散剂的制备方式是将活性化合物掺入到含碱性分散介质和所需其他成分(来自以上列举的成分)的无菌赋形药中。对于用于配制无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从预先过滤除菌的溶液产生含有活性成分及任何额外所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释液或可食用的载体。组合物可密封于明胶胶囊中或压成片剂。为用于口服治疗性施用目的，可以将活性化合物加入赋形剂中并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。口服组合物也可用流体载体制备以用作漱剂，其中化合物在流体载体中经口应用、漱口然后吐出或咽下。
可包括药学相容的粘合剂和/或辅药作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下任一种成分或具有类似性质的化合物粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲基酯或橙味调味品。用于吸入施用时，化合物以气溶胶喷雾形式递送，气溶胶可由含合适抛射剂(例如，气体如二氧化碳)的加压容器或给药器(dispenser)或喷雾器产生。
全身施用也可通过经皮或经粘膜途径进行。对于经皮或经粘膜施用，可将对待渗透的屏障而言适宜的渗透剂用于制剂中。该渗透剂一般在本领域内公知，且包括如用于经粘膜施用的去污剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过应用鼻喷雾或栓剂完成。对于经皮施用，活性化合物的剂型可以为本领域内公知的软膏、油膏、凝胶或霜剂。
化合物也可以制备成栓剂(例如，应用常规栓剂基质，熔融温度为哺乳动物体温的润滑材料，如可可油或其他甘油酯)或灌肠滞留剂形式直肠递送。
在一个实施方案中，活性化合物应用可以保护化合物避免其从体内被快速清除的载体进行配制，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以应用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。
用于制备这些制剂的方法对本领域内的技术人员而言是显而易见的。材料也可从供应商处获得，如Alza公司和Nova Pharmaceuticals，Inc.。也可用脂质体悬液(包括带有单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)作为可药用载体。这些可根据本领域内技术人员公知的方法制备，如参见美国专利号4,522,811中的描述。
配制单位剂量形式的口服或肠道外用药组合物是特别有利的，这可以利于施用及剂量的一致性。此处应用的单位剂量形式指在物理上不连续的适用于作为整体给予待治疗患者的单位；每一单位含预定量的活性化合物，该数量的活性化合物经计算与所需的药物载体联合可产生所需的治疗效应。根据疾病的类型及严重程度，施用给患者的起始候选剂量为约1μg/kg到15mg/kg(如0.1-20mg/kg)的抗体，无论是通过例如一次或多次单独施用或是通过连续输注。根据以上提及的因素，典型的每日剂量可为约1μg/kg到100mg/kg或更大。对于超过几天或更长时间的重复施用，根据疾病，治疗可持续进行直到获得了所需的对疾病症状的抑制。但是，也可以使用其他给药方案。治疗的进程由常规的技术和试验可以容易地进行监测。一示例性剂给药方案在WO 94/04188中公开。用于本发明单位剂量形式的规格决定于且直接取决于活性化合物的独特特性、待获得的具体治疗效果以及复合该活性化合物用于个体治疗时本领域所固有的限制。
可将本发明的核酸分子插入载体并用作基因治疗载体。将基因治疗载体递送给患者可通过如静脉注射、局部施用(美国专利号5,328,470)或通过立体定位注射(例如参见，Chen等，美国国家科学院院刊(Proc Natl AcadUSA)(1994)913054-3057)进行。基因治疗载体的药物制剂可以在可接受稀释剂中包括基因治疗载体；或可以包含其中埋植有基因递送工具的缓释基质。备选地，当整个基因递送载体可以从重组细胞中完整产生时，例如反转录病毒载体，药物制剂可包括一个或多个产生此基因递送系统的细胞。
药物组合物可与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器内。
本发明的应用和方法此处描述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同系物和抗体可用于一种或多种以下的方法中a)筛选试验；b)检测试验(例如，染色体作图、组织分型、法医生物学)；c)预测医学(例如，诊断试验、预后试验、临床监测试验和药物基因组学)；和d)治疗方法(如治疗性和预防性的)。GAVE10蛋白质与其他细胞蛋白质相互作用，因此可用于(i)调节细胞增殖；(ii)调节细胞分化；和(iii)调节细胞存活。本发明的分离的核酸分子可用于表达GAVE10蛋白质(例如，在基因治疗应用中在宿主细胞中通过重组表达载体表达)，用于检测GAVE10 mRNA(如在生物样本中)或用于检测 GAVE10基因中的遗传损伤以及用于调节GAVE10活性。此外，GAVE10蛋白质可用于筛选能调节GAVE10活性或表达的药物或化合物；以及用于治疗紊乱，所述紊乱的特征为GAVE10蛋白质产生不足或过量，或产生的GAVE10蛋白质形式与GAVE10野生型蛋白质相比活性降低或异常。此外，本发明抗-GAVE10抗体可用于检测和分离GAVE10蛋白质，以及用于调节GAVE10活性。本发明进一步涉及通过以上描述的筛选试验鉴定到的新型药剂，及其在此处描述的治疗中的用途。
A.筛选试验存在内源配体时激活G蛋白受体将允许G蛋白受体复合体形成，由此导致GTP结合G蛋白。G蛋白的GTPase结构域可以将GTP缓慢水解为GDP，在正常情况下导致受体失活。但组成型激活的受体会持续将GDP转变成GTP。
G蛋白的不可水解底物[35S]GTPγS可用于监测G蛋白与如下胞膜增强的结合作用，其中所述胞膜表达组成型激活的受体。Traynor和Nahorski报道，[35S]GTPγS可用于监测在存在和缺乏配体时与膜偶联的G蛋白(MolPharmacol(1995)47(4)848-54)。该试验系统优选用于候选化合物的起始筛选，因为该系统可通用于所有G蛋白偶联受体，而不必考虑与受体结合的具体G蛋白的种类。
Gs20刺激腺苷酰环化酶，而Gi和Go抑制该酶。如在本领域内所公知的，腺苷酰环化酶催化ATP向cAMP转化；因而，偶联Gs蛋白的组成型活化GPCR将与提高的cAMP细胞水平相关联。备选地，偶联Gi(或Go)蛋白的组成型活化GCPRs将与降低的cAMP细胞水平相关联，参见“突触传导的间接机制(Indirect Mechanism of Synaptic Transmission)”，第8章，从神经元到脑(第三版)，Nichols等编，Sinauer Associates，Inc.，1992。因此，检测cAMP的试验可用于判定候选化合物是否为受体的反向激动剂。本领域内已知的多种测定cAMP的方法均可以使用。在一个实施方案中，抗-cAMP抗体用于基于ELISA的试验中。在另一实施方案中，则考虑全细胞第二信使报告系统(见PCT公开号WO 00/22131)。
在一个相关的方面，环AMP通过促进cAMP效应DNA结合蛋白或转录因子(CREB)的结合而驱使基因表达，其中cAMP效应DNA结合蛋白或转录因子(CREB)然后在称为cAMP效应元件的特异性位点结合启动子并驱动基因表达。因此可构建这样的报告体系，其在报告基因如β-半乳糖苷酶或萤光素酶之前具有包含多个cAMP效应元件的启动子。进一步地，当组成型活化的Gs-连接受体引起cAMP的累积时，则可激活基因并表达报告蛋白。然后可用标准的生物化学试验检测报告蛋白如β-半乳糖苷酶或萤光素酶(PCT公开号WO 00/22131)。
其它G蛋白，如Go和Gq，与磷脂酶C的激活相关，所述磷脂酶又可水解磷脂PIP2释放出两个胞内信使甘油二酯(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3积聚的增加与Gq-相关受体和Go-相关受体的激活相关联(PCT公开号WO 00/22131)。检测IP3积聚的试验可用于判定候选化合物是否为Gq-相关受体或Go-相关受体的反向激动剂。Gq-相关受体还可用AP1报告试验检测，该试验在于检测Gq-依赖的磷脂酶C是否引起了含AP1元件的基因的激活。这样，激活的Gq-相关受体将显示为该基因表达的增强，而反向激动剂将显示为该表达的减弱。
本发明提供了用于鉴定调节剂的方法(此处也称作“筛选试验”)，所述调节剂即能结合GAVE10蛋白质或对例如GAVE10表达或GAVE10活性具有刺激或抑制效应的候选或测试化合物或试剂(例如，肽、肽模拟物(peptidomimetics)、小分子或其他药物)。
在一个实施方案中，本发明提供用于筛选如下候选或测试化合物的试验，所述化合物能结合膜结合形式的GAVE10蛋白质、多肽或其生物活性部分或调节其活性。本发明的测试化合物可应用众多手段之任一种在本领域内公知的组合文库方法中获得，包括生物文库；可空间寻址的平行固相或液相文库；需要去回旋(deconvolution)的合成文库方法；“单珠单化合物”文库方法；和应用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(Lam，抗癌药物研究(Anticancer Drug Des)(1997)12145)。
用于合成分子文库的方法的实例可在本领域内找到，例如DeWitt等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1993)906909；Erb等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1994)9111422；Zuckermann等，医学化学杂志(J Med Chem)(1994)372678；Cho等，科学(Science)(1993)2611303；Carrell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332059；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332061和Gallop等，医学化学杂志(JMed Chem)(1994)371233。
化合物文库可呈现在溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13412-421)或珠子上(Lam，自然(Nature)(1991)35482-84)、芯片上(Fodor，自然(Nature)(1993)364555-556)、或细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号5,571,698；5,403,484和5,223,409)、质粒(Cull等，美国国家科学院院刊(Proe Natl Acad USA)(1992)891865-1869)或噬菌体上(Scott等，科学(Science)(1990)249386-390；Devlin，科学(Science)(1990)249404-406；Cwirla等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)876378-6382；和Felici，分子生物学杂志(J Mol Biol)(1991)222301-310)。
在一个实施方案中，试验为基于细胞的试验，其中使细胞表面表达膜结合形式的GAVE10蛋白质(或其生物活性部分)的细胞与受试化合物接触，并测定受试化合物结合GAVE10蛋白质的能力。例如，细胞可为酵母细胞或哺乳动物来源的细胞。测试化合物与GAVE10蛋白质的结合能力的测定可以通过例如以下方式进行将测试化合物与放射性同位素或酶标记偶联，这样测试化合物与GAVE10蛋白质或其生物活性部分的结合可通过检测复合物中的标记化合物进行确定。例如，测试化合物可直接或间接标记125I、35S、14C或3H，放射性同位素的检测可通过直接计数放射量或通过闪烁计数进行。备选地，测试化合物可应用如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶进行酶标记，且酶标记的检测可通过测定适宜的底物向产物的转化来实现。在一个优选的实施方案中，试验包括将在细胞表面表达膜结合形式的GAVE10蛋白质或其生物活性部分的细胞与可以结合GAVE10的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与GAVE10蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与GAVE10蛋白质相互作用的能力的测定包括测定测试化合物与已知化合物相比优先与GAVE10或其生物活性部分结合的能力。
在另一实施方案中，试验为基于细胞的试验，包括使细胞表面表达膜结合形式的GAVE10蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)GAVE10蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。测试化合物调节GAVE10或其生物活性部分的活性的能力可通过，例如，测定GAVE10蛋白质结合GAVE10靶分子或与其相互作用的能力来确定。如此处所用，“靶分子”是指天然与GAVE10蛋白质结合或作用的分子，如表达GAVE10蛋白质的细胞的表面分子、在第二细胞的表面上的分子、在细胞外周围区域中的分子、与胞膜内表面关联的分子或细胞质分子。GAVE10靶分子可不为本发明的GAVE10分子或GAVE10蛋白质或多肽。在一个实施方案中，GAVE10靶分子为信号转导途径的成分，所述途径促进胞外信号(例如由化合物结合膜结合形式的GAVE10分子所产生的信号)通过胞膜向细胞内转导。例如，靶分子可为具有催化活性的第二胞内蛋白质或促进下游信号分子与GAVE10关联的蛋白质。
GAVE10蛋白质与GAVE10靶分子结合或作用的能力可通过以上描述的用于测定直接结合的其中一种方法来测定。在优选的实施方案中，GAVE10蛋白质与GAVE10靶分子结合或作用的能力可通过测定靶分子的活性来确定。靶分子活性的测定方法有例如检测靶分子对胞内第二信使(如胞内Ca2+、甘油二酯、IP3等)的诱导、检测靶分子对合适底物的催化/酶促活性、检测报告基因(例如可操作地连接编码可检测标记(如萤光素酶)的核酸的GAVE10效应调控元件)的诱导或检测细胞反应，例如细胞分化或细胞增殖。
而在另一实施方案中，本发明的试验为无细胞试验，包括将GAVE10蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触，并测定测试化合物结合GAVE10蛋白质或其生物活性部分的能力。测试化合物与GAVE10蛋白质的结合可以如以上所描述的方式直接或间接进行检测。在优选的实施方案中，试验包括将GAVE10蛋白质或其生物活性部分与能结合GAVE10的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与GAVE10蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与GAVE10蛋白质相互作用的能力的测定包括测定测试化合物与已知化合物相比优先结合GAVE10或其生物活性部分的能力。
在另一实施方案中，试验为无细胞试验，包括将GAVE10蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)GAVE10蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。对测试化合物调节GAVE10的活性的能力的测定可通过，例如利用以上描述的用于测定直接结合的其中一种方法测定GAVE10蛋白质结合GAVE10靶分子的能力来实现。在备选的实施方案中，对测试化合物调节GAVE10活性的能力的测定可通过测定GAVE10蛋白质进一步调节GAVE10靶分子的能力来实现。例如，可以按前述测定靶分子对适当底物的催化/酶促活性。
而在另一实施方案中，无细胞试验包括将GAVE10蛋白质或其生物活性部分与能结合GAVE10的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与GAVE10蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与GAVE10蛋白质相互作用的能力的测定包括测定GAVE10蛋白质优先结合GAVE10靶分子或调节GAVE10靶分子的活性的能力。
受体可由非配体分子激活，所述非配体分子并不一定抑制配体结合但可引起受体结构改变以致造成G蛋白结合或，可能的受体聚集、二聚化或簇集，从而引起激活作用。
因此，可以由暴露于细胞表面的GAVE10的多个部位产生抗体。然后，可筛选出经标准试验(如监测cAMP水平或胞内Ca2+水平)测定能通过G蛋白级联激活细胞的抗体。
抗体可用公知的技术制备。由于涉及分子作图，特别是表位作图，单克隆抗体可能是优选的。单克隆抗体可由表达于细胞表面的完整受体以及已知形成在细胞表面的肽引起。可应用Geysen等，美国专利号5,998,577的方法以获得大量的相关肽。
所发现的可激活GAVE10的抗体可经过修饰以最小化与激活GAVE10无关的活性，如补体结合。这样，可对抗体分子实行截短或突变以使激活GAVE10以外的活性最小或丧失。例如，对某些抗体，仅需要抗原结合部分。这样，可去除抗体的Fc部分。
将表达GAVE10的细胞暴露于抗体以激活GAVE10。然后使激活的细胞暴露于多种分子以期鉴定出那些改变受体活性(无论是提高激活水平还是降低激活水平)的分子。然后可对达此目的的分子在无抗体的情况下在表达GAVE10的细胞上进行试验，以观察对非激活细胞的效应。然后可以用公知的技术检测靶分子并将其修饰为候选药物，用于治疗与GAVE10代谢改变相关的紊乱。
本发明的无细胞试验适于应用可溶形式和膜结合形式的GAVE10。对于包括膜结合形式的GAVE10的无细胞试验，可能需要利用增溶剂以使膜结合形式的GAVE10维持在溶液中。该增溶剂的实例包括非离子去污剂，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、异三癸基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-氯氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-氯氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸。
在本发明以上试验方法的不止一个实施方案中，可能需要固定GAVE10或其靶分子以易于从非复合形式的一种或全部两种所述蛋白质中分离出复合形式，以及适于试验的自动化。在存在或缺乏候选化合物时测试化合物与GAVE10的结合或GAVE10与靶分子的相互作用可在任何适用于容纳反应物的容器内完成。该容器的实例包括微滴板、试管和微离心管。在一个实施方案中，可提供融合蛋白，该融合蛋白质添加有允许其中一种或全部两种上述蛋白质结合到基质上的结构域。例如可将谷胱甘肽-S-转移酶/GAVE10融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sephares珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上。备选地，可应用谷胱甘肽衍生的微滴板，然后使微滴板接触测试化合物，或测试化合物和非吸附靶蛋白或GAVE10蛋白质，且在利于形成复合物的条件下孵育混合物(例如在生理性盐和pH条件下)。孵育后，洗涤珠子或微滴板孔以移去任何未结合成分，且直接或间接地测定复合体的形成，参见以上描述。备选地，可以使复合物与基质解离，且用标准技术测定GAVE10的结合或活性水平。
其他用于固定蛋白质于基质上的技术也可用于本发明的筛选试验。例如，可利用生物素或链霉亲和素固定GAVE10或其靶分子。生物素化的GAVE10或靶分子可应用本领域内公知的技术(如生物素化试剂盒，PierceChemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-丁二酰亚胺)制备产生，并固定在链霉亲和素包被的96孔板(Pierce Chemicals)的孔内。备选地，可使用与GAVE10或靶分子反应但不阻碍GAVE10蛋白质结合靶分子的抗体对平板的孔进行衍生，通过抗体结合，将未结合的靶标或GAVE10捕获在孔内。除了以上描述的用于检测GST-固定的复合物的方法外，用于检测复合物的方法还包括应用与GAVE10或靶分子反应的抗体对复合物进行的免疫检测以及依赖于检测与GAVE10或靶分子连结的酶促活性的酶联试验。
在另一实施方案中，GAVE10表达的调节剂可通过如下方法鉴定，其中，使细胞与候选化合物接触并测定胞内GAVE10 mRNA或蛋白质的表达。将存在候选化合物时GAVE10 mRNA或蛋白质的表达水平与缺乏候选化合物时GAVE10 mRNA或蛋白质的表达水平进行比较。然后，基于该比较，可以鉴定候选化合物是否为GAVE10表达的调节剂。例如，当GAVE10 mRNA或蛋白质在存在候选化合物时的表达大于(统计学显著大于)缺乏该化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为GAVE10 mRNA或蛋白质表达的刺激剂或激动剂。备选地，当GAVE10 mRNA或蛋白质在存在候选化合物时的表达低于(统计学显著低于)缺乏该化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为GAVE10 mRNA或蛋白质表达的抑制剂或拮抗剂。如果GAVE10活性在存在配体或激动剂时减少，或在组成型GAVE10的情况下低于基线，则候选化合物被鉴定为反向激动剂。胞内GAVE10 mRNA或蛋白质的表达水平可由此处描述的用于检测GAVE10 mRNA或蛋白质的方法进行测定。
而在本发明另一方面，GAVE10蛋白质可在双杂交或三杂交试验中用作“诱饵蛋白”(例如参见美国专利号5,283,317；Zervos等，细胞(Cell)(1993)72223-232；Madura等，生物化学杂志(J Biol Chem)(1993)26812046-12054；Bartel等，Bio/Techniques(1993)14920-924；Iwabuchi等，癌基因(Oncogene)(1993)81693-1696；和PCT公开号WO 94/10300)，以鉴定其他与GAVE10结合或作用(“GAVE10结合蛋白”或“GAVE10-bp”)并调节GAVE10活性的蛋白质。该GAVE10-结合蛋白也可能通过GAVE10蛋白质作为如GAVE10途径的上游或下游元件参予信号传播。
由于可制备出大量的纯GAVE10，故可以确定出可能功能区域的构象的物理特征，用于合理的药物设计。例如，该分子的IC3区域和EC结构域为特别有意义的区域。一旦确定了区域的形状和离子构型，可与这些区域作用的候选药物即可成型，然后可以在完整细胞、动物和患者中进行试验。能够获得此3-D结构信息的方法包括X射线晶体学、NMR光谱学、分子模建等。3-D结构也可导致鉴定出其他已知蛋白中的类似构象位点，而对于所述蛋白已存在作用于此位点的已知药物。这些药物或其衍生物可能能用于GAVE10。
本发明还涉及由以上筛选试验鉴定到的新药剂，以及其在此处描述的治疗中的应用。
B.检测试验此处鉴定的cDNA序列的部分或片段(以及相应的完整基因序列)可在多个方面用作多核苷酸试剂。例如，序列可用于(i)在染色体上对相应的基因绘图并，由此定位与遗传疾病相关的基因区域；(ii)从微小量生物样本中对个体实施鉴定(组织分型)；和(iii)为生物样本的法医鉴定提供帮助。这些应用在以下的分段中描述。
1.染色体作图一旦分离出基因的序列(或序列的一部分)，则该序列可用于在染色体(如2号染色体)上定位GAVE10基因。因此，此处描述的GAVE10核酸分子或其片段可用于在2号染色体上作图定位GAVE10。2号染色体上GAVE10序列的作图定位是确定该序列与疾病相关基因(例如HLA复合体)之间的关系的重要第一步。
简言之，通过从GAVE10序列中制备PCR引物(优选的长度为15-25bp)，可以对GAVE10基因在2号染色体上作图。该引物可用于对包含单个人染色体的体细胞杂合体进行PCR筛选。仅有包含与GAVE10序列对应的人类基因的那些杂合体能产生扩增片段。
通过融合不同哺乳动物来源的体细胞(例如，人和小鼠的细胞)制备体细胞杂合体。人和小鼠细胞的杂合体在生长和分裂时，一般人的染色体会出现随机丢失，而小鼠染色体保留。通过应用小鼠细胞(由于缺乏特定的酶)不能但人细胞可以在其中生长的培养基，含编码所需酶的基因的一条人染色体将得以保留。通过应用多种培养基，可以建立一组杂合细胞系。组内每一细胞系含单一的人染色体或小数目的人染色体及一整套鼠染色体，从而使得可以容易地将单独的基因作图定位于特定的人染色体上(D′Eustachio等，科学(Science)(1983)220919-924)。还可通过应用带有易位和缺失的人染色体制备仅含人染色体片段的体细胞杂合体。
体细胞杂合体的PCR作图是一种将特定序列定位于特定染色体上的快速方法。每台热循环仪每天可定位三段或更多的序列。用GAVE10序列设计寡核苷酸引物，用一组2号染色体的片段或涉及其的易位体可进行亚定位。其他作图策略可同样用于在2号染色体上对GAVE10序列进行作图定位，包括原位杂交(描述于Fan等，美国国家科学院院刊(Proc Natl AcadUSA)(1990)876223-27)、用标记的流式分拣染色体预筛选和通过与染色体特异的cDNA文库杂交进行预选择。
可使用DNA序列与中期染色体铺展物的荧光原位杂交(FISH)一步提供精确的染色体定位。染色体铺展物的制备可应用被化学物阻滞在分裂中期的细胞进行，所述化学物如可破坏有丝分裂纺锤体的秋水仙碱。染色体可以用胰蛋白酶短暂处理然后进行Giemsa染色。每条染色体上会出现亮带和暗带图案，由此可鉴定出各染色体。FISH技术可应用500或600个碱基的DNA序列进行。但是，大于1,000个碱基的克隆更有可能结合独特的染色体位置并产生足够的信号强度以便简单检测。优选地1,000个碱基且更优选地2,000个碱基将足以在合理的时间内产生好的结果。参见Verma等的有关该技术的综述(人类染色体基础操作手册(Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques)(Pergamon Press，New York，1988))。染色体作图可以在硅片上(in silico)考虑统计学因素，如优势对数得分或单纯接近度(mere proximity)进行推断。例如，通过硅片上作图GAVE10被暂时绘制在12q24.23。
用于染色体作图的试剂可单个应用以标记2号染色体或染色体上的单一位点，或可应用一组试剂标记多个位点和/或多条染色体。对作图目的，实际上优选对应于GAVE10基因两翼区域的试剂。编码序列在基因家族内更可能保守，因此增加了染色体作图中交叉杂交的机会。
一旦将序列绘制在精确的染色体位置，则可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据联系起来(该数据存放在例如McKusick，人类的孟德尔遗传(Mendelian Inheritance in Man)中，可在线从Johns Hopkins大学的Welch医学图书馆获得)。然后，基因和绘图定位于同一染色体区域的疾病之间的关系，可通过连锁分析进行确定(物理上邻近的基因的共遗传)，如参见Egeland等，自然(Nature)(1987)325783-787中的描述。
此外，可测定受到或未受到GAVE10相关疾病影响的个体之间DNA序列的差异。如果在一些或全部的受影响个体中观察到突变而未在任何未受影响的个体中观察到此突变，则该突变可能为特定疾病的致病因子。对受到影响和未受到影响的个体的比较一般包括首先在染色体中寻找结构的改变，如缺失或易位，所述改变可在染色体铺展物中观察到或可应用基于该DNA序列的PCR检测到。最终，可对来自几个个体的基因进行完整测序，以证实突变的存在并将突变与多态性区分开来。
2.组织分型本发明的GAVE10序列也可用于从少量生物样本出发对个体进行鉴定。例如，美国部队正考虑将限制性片段长度多态性(RFLP)用于人员的鉴定。该技术中，用一种或多种限制性酶消化个体的基因组DNA，在Southern印迹中用探针探测以产生独特的条带用于鉴定。该方法避免了目前身份识别标识(Dog Tags)方法的局限性，所述局限性为可丢失、转换或被窃，这使得阳性鉴定变得困难。本发明的序列可用作RFLP的额外DNA标记(在美国专利号5,272,057中描述)。
此外，本发明的序列可用于提供备选的技术以逐个碱基确定个体基因组中选定部位的实际DNA序列。这样，此处描述的GAVE10序列可用于制备针对序列的5’和3′末端的两段PCR引物。然后可以使用所述引物扩增个体的DNA并随后提供其序列。
由此方式从个体得到的相应DNA序列组将提供独特的个体身份辨识方法，这是因为由于等位基因的差异使得每一个体将具有独特的一套该DNA序列。可应用本发明的序列从个体和组织获得此身份辨识序列。本发明的GAVE10序列是人类基因组中的一个独特部分。在该序列的编码区有一定程度的等位基因变异，且在非编码区有程度更高的变异。据估计人类个体间等位基因变异的频率为每500个碱基约发生一次。此处描述的每个序列均可在某种程度上作为标准，与来自个体的DNA比较用于鉴定的目的。由于非编码区有更多数目的多态性，故区分个体只需要较少的序列。应用一组约10到1,000个引物(每条引物产生100个碱基的非编码扩增序列)，SEQ ID NO1的非编码序列可提供阳性的个体鉴定。如果应用预测的编码序列如SEQ ID NO1中的那些，对于阳性个体鉴定，更为合适的引物数目将为500-2,000。
如果使用来自GAVE10序列的一组试剂(如此处所描述)来产生个体的独特身份辨识数据库，则同样的试剂可随后用于鉴定来自该个体的组织。应用此独特身份辨识数据库，可从极其少量的组织样本出发实现个体(存活的或死亡的)的阳性鉴定。
3.GAVE10部分序列在法医生物学中的应用基于DNA的鉴定技术也可用于法医生物学中。法医生物学为应用对犯罪现场发现的生物证据进行遗传分型来作为阳性鉴定(如犯罪者)手段的一个科学领域。为进行鉴定，可应用PCR技术扩增取自很少量生物样本的DNA序列，所述生物样本如发现于犯罪现场的组织(如头发或皮肤)或体液(如血液、唾液或精液)。然后可与标准品比较扩增序列，由此允许鉴定出生物样本的来源。
本发明的序列可用于提供靶向人类基因组特定位点的多核苷酸试剂如PCR引物，可增加基于DNA的法医鉴定的可靠性。例如，目的核酸可提供另一“鉴定标记”(即，特定个体所特有的另一DNA序列)。如以上提到的，实际的碱基序列信息可作为由限制性酶产生的片段图形的一个精确备选方案用于鉴定目的。靶向SEQ ID NO1非编码区的序列特别适用于此用途，因为该非编码区存在大量数目的多态性，从而提高了应用该技术区分个体的辨别力。多核苷酸试剂的实例包括GAVE10序列或其部分，例如来自SEQ ID NO1非编码区且长度为至少20到30个碱基的片段。
此处描述的GAVE10序列还可用于提供如下多核苷酸试剂，如被标记的探针或标记探针，所述试剂可用于如原位杂交技术中以鉴定特定的组织(如脑组织)。当提供给法医病理学家的是未知来源的细胞或降解组织时，这会十分有用。该GAVE10探针组可用于鉴定组织的物种和/或器官类型。
以类似的方式，诸如GAVE10引物或探针等试剂可用于筛选受污染的组织培养物(即在培养物中甄别不同类型细胞混合物的存在)。
C.预测医学本发明也涉及预测医学领域，其中诊断试验、预后试验、药物基因组学和临床监测试验被用于预后(预测性)目的以预防性治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及诊断试验，该试验用于在生物样本(如血、尿、粪、痰、血清、细胞和组织)环境中测定GAVE10蛋白质和/或核酸的表达以及GAVE10的活性。可应用此试验确定个体是否患有与异常GAVE10表达或活性相关的疾病或紊乱或存在疾病发生危险性。
本发明也提供预后(或预测性)试验，以确定个体是否存在罹患与GAVE10蛋白质、核酸表达或活性有关的紊乱的危险。例如，可以在生物样本中测试GAVE10基因中的突变。该试验可用于预后或预测性的目的，由此可以在以GAVE10蛋白质、核酸的表达或活性为特征或与其相关的紊乱发作之前预防性治疗个体。
本发明另一方面提供了用于测定个体的GAVE10蛋白质、核酸的表达或GAVE10的活性以便由此选择合适的治疗性或预防性药剂用于该个体的方法(此处称为“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型(如检查个体基因型以判定个体对特定药剂的反应能力)选择药剂(如药物)用于治疗性或预防性治疗个体。
而在本发明另外的方面，涉及到在临床试验中监测药剂(如药物或其他化合物)对GAVE10表达或活性的影响。
这些以及其他的药剂在以下的部分中作进一步详细描述。
1.诊断试验用于检测生物样本中GAVE10存在与否的示例性方法包括从受试对象中获得生物样本，并将生物样本与可检测GAVE10蛋白质或编码GAVE10蛋白质的核酸(如mRNA或基因组DNA)的化合物或试剂接触，以检测生物样本中GAVE10的存在。用于检测GAVE10 mRNA或基因组DNA的优选试剂为能够与GAVE10 mRNA或基因组DNA杂交的标记核酸探针。核酸探针可为，例如全长GAVE10核酸，如SEQ ID NO1的核酸或其部分，如长度为至少15、30、50、100、250、500或更多个核苷酸并且足于在严紧的条件下足以特异杂交到GAVE10 mRNA或基因组DNA上的寡核苷酸。可用于本发明诊断试验的其它合适探针在本文中有描述。
用于检测GAVE10蛋白质的优选试剂为能够结合GAVE10蛋白质的抗体，优选地为带有可检测标记的抗体。抗体可为多克隆的或更优选地为单克隆的。可应用完整的抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。对探针或抗体而言，术语“标记”意在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体上直接标记探针或抗体，以及通过与直接被标记的另一试剂反应间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括用荧光标记的二级抗体检测一级抗体和用生物素末端标记DNA探针以便可以使用荧光标记的链霉亲合素进行检测。术语“生物样本”意在包括从受试对象分离的组织、细胞和生物体液，以及存在于受试对象体内的组织、细胞和体液。即，本发明的检测方法可用于在体外及体内检测生物样本中的GAVE10 mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于体外检测GAVE10 mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。用于在体外检测GAVE10蛋白质的技术包括ELISA、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于体外检测GAVE10基因组DNA的技术包括Southern杂交。此外，用于体内检测GAVE10蛋白质的技术包括向受试者体内导入标记的抗-GAVE10抗体。例如，可给抗体标记上放射活性标志，其在受试者体内的存在和部位可通过标准成象技术检测。
在一个实施方案中，生物样本含有来自受试对象的蛋白质分子。或者，生物样本可以含有来自受试对象的mRNA分子或来自受试对象的基因组DNA分子。优选的生物样本是利用常规手段从受试对象分离到的外周血白细胞样本。
因此，在开发预后或诊断实验时，将鉴定核酸或蛋白质的多态性与疾病联系起来用于诊断携带者或患者可能是有益的。例如，对于类风湿性关节炎、哮喘、节段性回肠炎等，进行预后或诊断试验将是有益的。GAVE10表达水平在激活或炎性状态的细胞中上升。与炎性有关的紊乱包括过敏性疾病、结肠炎、节段性回肠炎、水肿、接触性过敏、过敏反应、其他形式的关节炎、脑膜炎及其中免疫系统对损害产生反应的其它疾病，所述反应为通过血管扩张、发热、细胞聚集、体液等而在某位点造成肿胀等。因此，GAVE10代谢的紊乱可用于类风湿性关节炎的诊断。而且，类风湿性关节炎的分子机制可能是可检测的，例如，可能存在可以在组织样本(如血液样本)中进行检测的诊断性SNP、RFLP、表达水平的变化性、功能的变化性等等。
在另一实施方案中，这些方法还包括从对照受试者获得生物样本；使对照样本与能够检测GAVE10蛋白质、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，以便检测生物样本中GAVE蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和数量；和将对照样本中GAVE10蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和数量与测试样本中GAVE10蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和数量进行比较。
本发明还包括检测生物样本(测试样本)中GAVE10存在的试剂盒。该试剂盒可以用于确定受试者是否患有或有增加的危险性患有与GAVE10异常表达有关的疾病(例如恶性肿瘤)。例如，该试剂盒可以包含能够检测生物样本中的GAVE10蛋白质或mRNA的标记化合物或试剂以及用于检测样本中GAVE10数量的手段(例如，抗GAVE10抗体或能与GAVE10的编码DNA(例如SEQ ID NO1)结合的寡核苷酸探针)。当GAVE10蛋白质或mRNA的数量高于或低于正常水平时，试剂盒还可以用于得出受试对象是否患有或有危险患有与GAVE10异常表达相关的疾病的结果。
对于基于抗体的试剂盒，其可以包含例如(1)可与GAVE10蛋白质结合的第一抗体(例如附着在固相支持物上)；和，任选地，(2)可与GAVE10蛋白质或与第一抗体结合并缀合有可检测试剂的不同第二抗体。如果不存在第二抗体，则可以使用能与第一抗体结合并可以被标记的另一分子，或标记该第一抗体。正如本领域已知的，无论如何都应包括已标记的结合部分以充当可检测报道分子。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，其可以包含，例如(1)可与GAVE10核酸序列杂交的寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸或(2)可用于扩增GAVE10核酸分子的引物对。
试剂盒还可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包含在探测可检测试剂(例如酶或底物)时所必需的成分。试剂盒还可以含有可以进行分析和与测试样本进行比较的对照样本或一系列对照样本。试剂盒的每一个成分通常装在不同的容器中，并且所有这些不同容器与用于观察受试对象是否患有或有危险患有GAVE10表达异常相关疾病的说明书一起被放在一个包装中。
2.预后实验本文中所描述的方法可进一步用作诊断或者预后试验以鉴定受试者是否患有或有危险患有与异常GAVE10表达或活性有关的疾病或病症。例如，本文中所描述的试验，例如前瞻性诊断试验或后随试验，可用于鉴定患有或者有危险患有与GAVE10蛋白、核酸的表达或活性有关的病症的受试者。例如，近来与细菌的接触或患有与哮喘、慢性阻塞性肺病和类风湿性关节炎有关的炎症易于用这个试验来检验。作为一种备选方案，可以使用预后试验鉴定患有或有危险患有此疾病或病症的受试者。
因此，本发明提供了一个方法，其中从受试者获得测试样本，并检测GAVE10蛋白或核酸(例如mRNA或基因组DNA)。GAVE10蛋白或核酸的存在可以用于诊断患有或有危险患有与异常GAVE10表达或活性有关的疾病或病症的受试者。本文中所用的“测试样本”指来自目的受试者的生物样本。例如，测试样本可以是生物液体(例如血清)、细胞样本或组织。
此外，此处所描述的预后试验可用于判定能否给受试者施用药剂(例如，激动剂，拮抗剂，肽模拟物，蛋白质，肽，核酸，小分子或其他候选药物)以治疗与异常GAVE10表达或活性有关的疾病或病症。例如，这些方法可用于判定特定药剂或药剂类(例如降低GAVE10活性的药剂类)能否有效地治疗受试者。因此，本发明提供了一种方法，由此可以判定药剂是否能有效地治疗患者的与异常GAVE10表达或活性相关的病症，其中获取测试样本，并检测GAVE10蛋白或核酸(例如，其中，GAVE10蛋白或核酸的存在可以用于诊断受试者是否可以通过给予药剂治疗与异常GAVE10表达或活性有关的病症)。
本发明的方法还可用于检测GAVE10基因的遗传损伤或者突变，由此确定带有损伤基因的受试者是否有出现如下病症的危险性，所述病症的特征在于异常细胞增殖和/或分化。在优选实施方案中，此方法包括在来自受试者的细胞样本中检测如下遗传损伤或突变存在与否，所述损伤或突变的特征在于存在至少一个影响编码GAVE10蛋白的基因的完整性的改变或者造成GAVE10基因错误表达的改变。例如，这些遗传损伤或突变可以通过确定至少一种如下情况的存在来检测1)GAVE10基因中一个或多个核苷酸的缺失；2)GAVE10基因中一个或多个核苷酸的增加；3)GAVE10基因中一个或多个核苷酸的替换；4)涉及GAVE10基因的染色体重排；5)GAVE10基因的信使RNA转录本水平的改变；6)GAVE10基因的异常修饰，例如基因组DNA的甲基化模式的异常改变；
7)GAVE10蛋白的非野生型水平；8)GAVE10基因的等位基因丢失；9)GAVE10蛋白的不恰当的翻译后修饰。
如本文所述，在本领域中有大量已知的实验技术可用于检测GAVE10基因中的损伤。优选的生物样本是用常规方法从受试者分离得到的外周血白细胞样本。
在某些实施方案中，损伤的检测涉及在聚合酶链式反应(PCR)(见，例如美国专利号4,683,195和4,683,202)，例如锚定PCR或RACE PCR中，或者，作为一种选择，在连接链式反应(LCR)(见，例如Landegran等，科学(Science)(1988)2411077-1080；和Nakazawa等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1994)91360-364)中使用探针/引物，其中后者在检测GAVE10基因中的点突变时尤其有用(见，例如Abravaya等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1995)23675-682)。该方法可以包括如下步骤从患者收集细胞样本，分离样本细胞的核酸(例如，基因组，mRNA或者两者)，在一定条件下使核酸样本与一个或多个可与GAVE10基因特异杂交的引物接触以实现GAVE10基因(如果存在的话)的杂交和扩增，然后检测扩增产物的存在与否或者检测扩增产物的大小并将此长度与对照样本比较。预期可能有利的是将PCR和/或LCR用作初始扩增步骤与本文中描述的用于检测突变的任何技术相结合。
可选择的扩增方法包括自动维持的序列扩增(Guatelli等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1990)871874-1878)，转录扩增系统(Kwoh等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)861173-1177)，Q-β复制酶(Lizardi等，Bio/Technology(1988)61197)或任何其他核酸扩增方法，之后可以用本领域技术人员已知的技术检测扩增的分子。这些检测方案对检测以非常低数量存在的核酸分子尤其有用。
在一个备选实施方案中，样本细胞中GAVE10基因的突变可以通过限制性酶切割式样的改变而得以鉴定。例如，可以分离样本和对照DNA，进行扩增(任选地)，用一个或多个限制性内切酶消化，通过凝胶电泳来测定片段的长度尺寸并进行对比。在样本与对照DNA之间片段长度的差异指示出样本DNA中有突变。另外，序列特异的核酶(见，例如美国专利号5,498,531)也可以用于通过核酶酶切位点的产生或丢失评判特异突变的存在。
在其他实施方案中，可通过样本和对照核酸(例如DNA或RNA)与含有成百或上千的寡核苷酸探针的高密度阵列(Cronin等，HumanMutation(1996)7244-255；Kozal等，自然医药(Nature Medicine)(1996)2753-759)杂交的方法来鉴定GAVE10的遗传突变。例如，GAVE10的遗传突变可以用含有发光DNA探针的二维阵列来鉴定，参见如Cronin等，同上。简言之，第一杂交探针阵列可用于对样本和对照中的长链DNA进行扫描，通过产生顺序重叠探针线形阵列来鉴定两序列间的碱基改变。该步骤允许鉴定点突变。这个步骤之后为第二杂交阵列，它通过使用能与所有检测的变体或突变体互补的较小特异化探针的阵列，可以对具体突变进行表征。每个突变阵列都由平行探针组构成，一个与野生型基因互补而另一个与突变基因互补。
又在另一个实施方案中，本领域已知的任何一种测序反应都可用于直接地对GAVE10基因测序，以及通过样本GAVE10序列与相应野生型(对照)序列的比较来检测突变。测序反应的实例包括以Maxam和Gilbert(美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)74560)或者Sanger(美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)745463)开发的技术为基础的那些反应。也可以考虑利用任何一种自动测序方法实施诊断试验(Bio/Techniques(1995)19448)，包括用质谱进行测序(见，例如，PCT公开号WO 94/16101；Cohen等，Adv Chromatogr(1996)36127-162；和Griffin等，应用生物化学与生物技术(Appl BiochemBiotechnol)(1993)38147-159)。
其他可用于检测GAVE10基因中的突变的方法包括如下方法，在该方法中通过保护作用防止切割剂的切割，得以检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中的碱基错配(Myers等，科学(Science)(1985)2301242)。一般，“错配切割”技术中必须提供由含有野生型GAVE10序列的(标记的)RNA或DNA与获自组织样本的潜在突变RNA或DNA杂交形成的异源双链体。用切割双链体中的单链区域的试剂处理此双链体，所述双链体中的单链区域可以因为例如对照与样本链之间的碱基对错配而存在。RNA/DNA双链体可以用RNAase来处理以消化错配区域，DNA/DNA杂合体可以用S1核酸酶来处理以消化错配区域。在其他实施方案中，DNA/DNA或者RNA/DNA双链体可以用羟胺或锇酸及哌啶来处理以消化错配区域。消化错配区域之后，所得物质在变性聚丙烯酰胺凝胶上根据大小分离，从而确定出突变的位点，参见例如Cotton等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1988)854397；Saleeba等，酶学方法(Methods Enzymol)(1992)217286-295。在优选实施方案中，可以标记对照DNA或RNA以利于检测。
在另一个实施方案中，错配切割反应使用一个或多个能识别双链DNA中错配碱基对的蛋白(所谓的“DNA错配修复酶”)在规定系统中检测从样本细胞获得的GAVE10 cDNA中的点突变并对其作图。例如，大肠杆菌的mutY酶切割G/A错配处的A，来自Hela细胞的胸苷DNA糖基化酶切割G/T错配处的T(Hsu等，Carcinogenesis(1994)151657-1662)。根据一个示范实施方案，基于GAVE10序列(例如野生型GAVE10序列)的探针与来自测试细胞的cDNA或其他DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理双链，切割产物(如果有的话)可以在电泳方案或类似的方案中检测到，参见，例如美国专利号5,459,039。
在其他实施方案中，可以使用电泳迁移率的改变鉴定GAVE10基因中的突变。例如，单链构象多态性(SSCP)可用于检测突变与野生型核酸之间电泳迁移率的差异(Orita等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad SciUSA)(1989)862766；也见Cotton，突变研究(Mutat Res)(1993)285125-144；Hayashi，Genet Anal Tech Appl(1992)973-79)。使样本和对照GAVE10核酸的单链DNA片段变性然后使之复性。单链核酸的二级结构会因序列不同而不同，由此导致的电泳迁移率的改变使得即使单个碱基变化也可得以检测。可以标记DNA片段或者用标记的探针对其进行检测。使用RNA(比DNA)可以增强试验的灵敏度，因为RNA二级结构对序列的改变更为敏感。在一个优选实施方案中，此主题方法利用异源双链分析基于电泳迁移率的改变来分离异源双链分子。(Keen等，Trends Genet(1991)75)在另一个实施方案中，用变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Myers等，自然(Nature)(1985)313495)来分析突变型或野生型片段在含有梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中的运动。当DGGE用作分析方法时，DNA将被修饰以保证它不会完全变性，例如，用PCR添加约40bp的高熔点富含GC的DNA，即GC夹。在另一个实施方案中，用温度梯度代替变性梯度来鉴定对照与样本DNA的迁移率差异(Rosenbaum等，Biophys Chem(1987)26512753)。
其他可用于检测点突变的技术的实例包括但不限于，选择性寡核苷酸杂交，选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸引物，其中将已知的突变置于中央，然后在只有完全匹配才可发生杂交的条件下，使引物与靶DNA杂交(Saiki等，自然(Nature)(1986)324163；Saiki等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)866230)。在使这些等位特异性寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或者许多不同的突变体杂交时，可以将寡核苷酸结合在杂交膜上然后与标记的靶DNA杂交。
或者，可以在本发明中使用依赖于选择性PCR扩增的等位特异性扩增技术。在特异扩增中用作引物的寡核苷酸可以在分子中央(以致扩增依赖于差异杂交)(Gibbs等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1989)172437-2448)或在一个引物的3’最末端(此时，在适合的条件下，错配能阻止或延缓聚合酶的延伸)(Prossner，Tibtech(1993)11238)携带令人感兴趣的突变。另外，也可能期望向突变区域中引入新的限制性位点以创造基于切割的检测(Gasparini等，Mol Cell Probes(1992)61)。预期，在某些实施方案中扩增也可以使用Taq连接酶进行(Barany，美国国家科学院院报(Proc NatlAcad Sci USA)(1991)88189)。在这种情况下，只有在5’序列的3’末端有完全的匹配时，连接反应才可以发生，这就使得可以通过寻找扩增物的有无来检测特异位点处已知突变的存在。
此处所描述的方法可以，例如，使用含有此处所描述的至少一个探针核酸或抗体试剂的预先包装诊断试剂盒来执行。此方法和试剂盒可以方便的应用于，例如，临床条件下，对显示出GAVE10基因有关疾病或病症的征兆的患者或具有该疾病家族史的患者进行诊断。
另外，表达GAVE10的任何细胞类型和组织都可以在此处所描述的预后试验中使用。
3.药物基因组学通过本文描述的筛选试验鉴定的对GAVE10活性(例如GAVE10基因表达)具有刺激或抑制影响的试剂或调节剂，可以施用给个体以治疗(预防性或治疗性)与GAVE10活性有关的疾病(例如，与哮喘、慢性阻塞性肺病和类风湿性关节炎有关的炎症)。可以考虑将此治疗与个体的药物基因组学结合起来，所述药物基因组学研究的是个体基因型与个体对外来化合物或药物的反应性之间的关系。对治疗物代谢的差异可以通过改变药理学活性药物的血液浓度和剂量之间关系，导致严重毒性或治疗失败。因此，个体的药物基因组学使得可以基于对个体基因型的考虑来选择有效的预防或治疗剂(例如药物)。此药物基因组学还可以用于确定适当的剂量和治疗方案。因此，可以通过确定个体的GAVE10蛋白质的活性、GAVE10核酸的表达或GAVE10基因的突变内容，选择对个体适宜的治疗或预防药剂。
药物基因组学所处理的问题是患者在药物应答方面存在的临床显著遗传差异，这种差异是由患者体内药物处置的不同和异常作用导致的。见，例如，Linder，临床化学(Clin Chem)(1997)43(2)254-266。一般，可以区分两类药理学遗传情况(pharmacogenetic conditions)。作为能改变药物作用于身体的途径的单因素而传递的遗传情况，称作“改变的药物作用”。作为能改变身体对药物的作用途径的单因素而传递的遗传情况，称作“改变的药物代谢”。这些药理学遗传情况可以以罕见缺陷或多态性的形式存在。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷是常见的遗传酶病，其中主要的临床并发症是吞食氧化剂药物(抗疟疾药物、磺酰胺、止痛剂或硝基呋喃)和食用蚕豆后出现的溶血。
作为举例说明性实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的一个主要决定因素。对药物代谢酶(例如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶，CYP2D6和CYP2Cl 9)遗传多态性的发现解释了，为什么服用标准和安全药物剂量后，一些患者不能获得预期的药物效果或表现出过度的药物反应和严重毒性。在群体中这些多态性表现为两种表型，强代谢者(extensive metabolizer，EM)和弱代谢者(PM)。PM的普遍性在不同群体之间是不同的。例如，编码CYP2D6的基因具有高度多态性，在PM中已鉴定到几种突变，所有均导致CYP2D6功能的缺乏。CYP2D6和CYP2Cl 9的弱代谢者在接受标准剂量后十分频繁地出现过度药物反应和副反应。正如通过可待因的止痛作用(由CYP2D6形成的代谢物吗啡介导的)所证实的，如果代谢物是活性治疗部分，则PM将不会表现出治疗反应。另一极端是对标准剂量不起反应的所谓超快代谢者。近来，超快代谢的分子基础已得以鉴定，其是由CYP2D6基因扩增导致的。
因此，通过确定个体中GAVE10蛋白质的活性、GAVE10核酸的表达或GAVE10基因的突变内容，可以选择出对于预防或治疗个体适宜的药剂。此外，可以使用药物基因组学研究，通过对编码药物代谢酶的多态性等位基因进行基因分型鉴定个体的药物应答表型。当使用GAVE10调节剂(如，通过本文所述其中一种示例性筛选试验鉴定的调节剂)治疗对象时，在给药或选择药物方面，此信息可以避免不良反应或治疗失败，由此增强治疗或预防的功效。
4.在临床试验过程中监测疗效监测药剂(例如，药物或化合物)对GAVE10表达或活性的影响(例如，调节异常细胞增殖和/或分化的能力)既可以应用于基础药物筛选中也可以应用于临床试验中。例如，可以在表现出降低的GAVE10基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性的对象的临床试验中，监测药剂(通过本文描述的筛选试验确定的)在增加GAVE10基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性方面的有效性。或者，可以在表现出增加的GAVE10基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性的对象的临床试验中，监测药剂(通过本文描述的筛选试验确定的)在降低GAVE10基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性方面的有效性。在这些临床试验中，GAVE10的表达或活性以及，优选地，其它基因的表达或活性(例如，细胞增殖疾病所涉及的基因)可以用作特定细胞的免疫应答性的标志。
例如，但不限于，可以鉴定当用调节GAVE10活性的药剂(例如，化合物、药物或小分子)(例如，本文所述筛选试验鉴定的药剂)处理时细胞中可以被调节的基因(包括GAVE10)。因此，例如，在临床试验中，为了研究药剂对细胞增殖疾病的作用，可以分离细胞，制备RNA并分析GAVE10及参与该疾病的其它基因的表达水平。基因表达水平(即，基因表达式样)可以通过如下方式定量按本文所述进行Northern印迹分析或RT-PCR，或者，作为备选方案，利用本文所述方法之一测量产生的蛋白质的量或测量GAVE10或其它基因的活性水平。以此方式，基因表达式样可以作为标志指示细胞对药剂的生理反应。由此，可以在使用药剂治疗个体之前以及治疗过程中的不同点上，确定反应状态。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，由此可以监测使用药剂(例如，通过本文所述筛选试验鉴定的激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其它候选药物)治疗受试者的疗效，该方法包括步骤(i)在施用药剂前从受试者获得用药前样本；(ii)检测用药前样本中GAVE10蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从受试者获得一个或多个用药后样本；(iv)检测用药后样本中GAVE10蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；(v)对用药前样本中GAVE10蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平与一个或多个用药后样本中GAVE10蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平进行比较；和(vi)据此改变患者的药剂施用方案。例如，可能期望增加药剂施用以增加GAVE10的表达或活性水平，使之超过所检测到的水平，即，增加药剂的效力。或者，可能期望降低药剂施用以降低GAVE10的表达或活性水平，使之低于所检测到的水平，即，降低药剂的效力。
D.治疗方法本发明为有危险患有(或易感)或已患有与异常GAVE10表达或活性相关的疾病的患者提供了预防和治疗方法。所述疾病包括但不限于如炎性疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病和类风湿性关节炎。
1.预防方法一方面，本发明提供预防方法，该方法通过给受试者施用调节GAVE10表达或至少一种GAVE10活性的药剂，预防受试者患上与异常GAVE10表达或活性有关的疾病或病症。可以通过，例如，本文所述任一种诊断或预后试验或其组合，鉴定个体是否有危险罹患可由异常GAVE10表达或活性引起的或促成的疾病。可以在以GAVE10异常为特征的症状显现之前施用预防剂，以便预防疾病或病症，或作为备选方案阻滞疾病或病症的进程。例如，根据GAVE10异常的类型，可以使用GAVE10激动剂或GAVE10拮抗剂治疗个体。适宜的药剂可以根据本文所述筛选试验确定。
2.治疗方法本发明另一方面涉及调节GAVE10表达或活性用于治疗目的的方法。本发明的调节方法涉及使细胞与能调节和细胞有关的一种或多种GAVE10蛋白质活性的药剂接触。能够调节GAVE10蛋白质活性的药剂可以是本文所述的药剂，例如核酸或蛋白质、GAVE10蛋白质的天然关联配体、肽、GAVE10肽模拟物或其它小分子。在一个实施方案中，该药剂刺激GAVE10蛋白质的一种或多种生物学活性。此刺激剂的实例包括活性GAVE10蛋白质和已导入细胞中的编码GAVE10的核酸分子。在另一实施方案中，该药剂抑制GAVE10蛋白质的一种或多种生物学活性。此抑制剂的实例包括反义GAVE10核酸分子和抗GAVE10抗体。可以体外(例如，通过使用药剂培养细胞)或，作为备选方案，体内(例如，通过向患者施用药剂)执行此调节方法。由此，本发明提供治疗罹患疾病或病症(其特征在于GAVE10蛋白质或核酸分子的异常表达或活性)的个体的方法。在一个实施方案中，本方法涉及施用可调节(例如，上调或下调)GAVE10表达或活性的药剂(例如，通过本文所述筛选试验鉴定的药剂)或药剂组合。在另一实施方案中，本方法涉及施用GAVE10蛋白质或核酸分子作为治疗物以弥补降低的或异常的GAVE10表达或活性。
当GAVE10被异常下调和/或当增加的GAVE10活性可能具有有益作用时，刺激GAVE10活性是有利的。相反，当GAVE10被异常上调和/或当降低的GAVE10活性可能具有有益作用时，抑制GAVE10活性是有利的。
本发明进一步通过如下实施例进行举例说明，这些实施例不应理解为是限制性的。在整个申请中引用的所有文献、专利和出版的专利申请的内容特此并入作为参考。
实施例1 克隆hGAVE10 cDNA在人类基因组库中寻找GPCR基序。选择了人类基因组DNA，AC021016.3，gi7630969。这个基因组DNA及其片段在Northern印迹中用作探针。
对人肾、胸腺和胎盘cDNA文库汇合物进行PCR筛查。用以下序列设计PCR引物正向引物5’-CAGGACCAAGATGACGCCCA-3’(SEQ ID NO6)巢式正向引物5’-CGAAGCTTCAGGACCAAGATGAGC-3’(SEQ ID NO7)上述巢式正向引物包含一HindIII限制性酶位点，之后有一Kozak序列。巢式反向引物包含一XhoI限制性酶位点。PCR在BiometraTrio-Thermoblock热循环仪中进行，使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，在加入模板cDNA、引物、Pfu缓冲溶液及dNTP后将此聚合酶加入PCR反应中。50μl反应中包含5μl 10×Pfu DNA缓冲液，2μl(2500单位/ml)Pfu DNA聚合酶，1.0μl NTP混合液(每种核苷酸含10mM)；2.0μl正向引物(10mM)；2.0μl反向引物(10mM)；5μl cDNA模板及33μl无菌水。在热循环仪中使用下列循环94℃反应2分钟，随后进行30个循环的94℃反应45秒，58℃反应45秒，72℃反应3分钟，72℃反应10分钟；然后在4℃冷却。
PCR之后，把3μl dNTP(每种核苷酸各10mM)(Clontech目录号.7404-i)和1μl(5单位)Taq DNA聚合酶(Qiagen，目录号201223)加入到PCR产物中，混合物在72℃温育10分钟。然后PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。从凝胶上切下含有所要片段的大约1Kb长度的条带，使用Qiaquick凝胶抽提试剂盒及制造商提供的方案(Qiagen，目录号28704)纯化。然后将纯化的PCR产物亚克隆入pCR2.1载体(Invitrogen，目录号K2000-01/40/J10及K2030-01/40/J10)。为了把PCR产物亚克隆入载体，使用Invitrogen TA克隆载体试剂盒准备连接反应。连接反应包括5μl无菌水；1μl Invitrogen 2X连接缓冲液；2μl pCR2.1载体(25ng/μl)；4μlPCR产物DNA(10ng)；4μl(5X)稀释缓冲液；和1μl T4 DNA连接酶(5单位)。在14℃温育此反应18小时。使2μl连接反应混合物与200μl INVαF′感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen目录号C658-00)混合，在冰上温育30分钟，在37℃热休克45秒，再在冰上温育2分钟，之后加入800μl LB，由此用连结反应物转化大肠杆菌。然后细胞在细菌摇床/培养箱中振动下37℃过夜温育(空气为再循环的)。过夜温育后，将200μl转化反应混合物铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上并37℃温育过夜。
温育之后，挑取菌落并且每个单菌落分别在含有500μl LB(含有100μg/ml氨苄青霉素)的不同试管中在摇床/培养箱中过夜生长。为了用PCR筛选菌落，使用如下反应41.5μl含有一个菌落的LB；5μl Taq缓冲液(10X)；1.0μl dNTP(每种核苷酸各10mM)；1.0μl正向引物(10mM)；1.0μl反向引物(10mM)；及0.5μl Taq DNA聚合酶(5单位/μl)。使用如下的循环在热循环仪中温育反应94℃2分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，及72℃10分钟，之后冷却到4℃。
为了检查PCR反应的结果，在1％TAB琼脂糖凝胶上用5μl PCR反应液电泳。阳性克隆显示约1kb的插入片段。在细菌摇床/培养箱中，使阳性克隆在5ml LB+100μg/ml氨苄青霉素中37℃过夜生长。用Qiagen DNA纯化柱(Qiagen目录号12143)根据制造商推荐的方案纯化质粒。用T7正向引物(5′-GGCTCCCAACTTCTCTTC-3′)(SEQ ID NO8)和M13反向引物(5′-GGGCAGTGGCCAGCACGC-3′)(SEQ ID NO9)对阳性克隆测序。DNA测序鉴定分离出含有如图1所示的DNA序列(SEQ ID NO1)和如图2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的cDNA。
实施例2 制备过量表达hGAVE10的哺乳动物细胞为了制备大量的hGAVE10用于进一步试验，将编码bGAVE10的cDNA克隆入表达载体并转染哺乳动物细胞，例如293细胞。
为了产生过量表达hGAVE10的哺乳动物细胞，于6孔35mm组织培养板中，在含有10％胎牛血清(Gibco/BRL目录号1600-044)的2mlDMEM培养基(Gibco/BRL，目录号11765-054)中接种细胞(每孔3×105个细胞(ATCC目录号CRL-1573))。
然后，在CO2培养箱中37℃温育细胞直到细胞达到50-80％的汇合。hGAVE10的克隆cDNA核酸序列用上述的方法插入到pcDNA3.1克隆载体(Invitrogen，目录号V790-20)中。将2μg DNA稀释在100μl无血清的F12 HAM培养基中。独立地，将25μl Lipofectamine试剂(LifeTechnologies，目录号18324-020)稀释在100μl无血清F12 HAM培养基中。然后把DNA溶液与Lipofectamine溶液轻轻地混合，并在室温下温育45分钟以产生DNA-脂复合体。
用2ml无血清F12 HAM培养基洗细胞一次，对于每个转染(6-孔板中6个转染)，将0.8ml无血清F12 HAM培养基加入含有DNA-脂复合体的溶液(总体积0.2ml)中，并轻轻混合。然后将得到的混合物(此后称“转染混合物”)铺在(0.8ml+0.2ml)洗过的细胞上。不加入抗细菌试剂。然后在CO2培养箱中将细胞与脂-DNA复合体在37℃一起温育16小时，以进行转染。
在温育期完成后，在没有首先去除转染混合物的情况下，将1ml含有10％胎牛血清的F12 HAM培养基铺在细胞上。转染后18小时，吸出铺在细胞上的培养基。然后用PBS(pH2-4)(Gibco/BRL目录号10010-023)洗细胞，然后将PBS换成含有5％血清的F12 HAM培养基(“选择培养基”)。转染后72小时，在含有400μg/ml抗细菌剂遗传霉素(LifeTechnologies，目录号11811)的选择培养基中10倍稀释细胞。
实施例3 激动剂试验为了筛选人GAVE10的激动剂，人为地使hGAVE10与Gq机制偶联，Gq机制的激活刺激胞内肌质网小泡释放Ca2+。Ca2+释放入胞质，在这里它可以用Ca2+螯合剂染料来检测。可以使用荧光成像平板阅读器或者FLIPR仪器(Molecular Devices)监测导致的任何荧光改变。可以通过荧光的增强反映激动剂的活性。
预改造表达hGAVE10的CHO-K1细胞，以表达Gq蛋白的不加区别形式(Gα16)。为了制备这样的细胞，从商业途径获得偶联Gα16的CHO细胞(Molecular Devices LIVEWARETM细胞，目录号RD-HGA16)，之后使用实施例2的方案以便在这些细胞中表达hGAVE10。
37℃及5％CO2下F12 Ham培养基中使细胞保持在生长对数期，所述F12 HAM培养基(Gibco/BRL，目录号11765-054)中含有10％胎牛血清、100IU/ml青霉素(Gibco/BRL，目录号15140-148)、100μg/ml链霉素(目录号15140-148，Gibco/BRL)、400μg/ml遗传霉素(G418)(Gibco/BRL，目录号10131-035)和200μg/ml Zeocin(Invitrogen，目录号R250-05)。试验前一天，用96/384 Multidrop装置(Labsystems，Type 832)以12,500细胞/孔把CHO-K1细胞铺在384-孔底部透明的试验板(Greiner/Marsh，目录号N58102)上，板孔体积为50μl。在潮湿的5％CO2培养箱(FormaScientific CO2水夹套型培养箱3110型)中37℃温育细胞。
制备如下的母液HEPES(pH7.5)(Gibco/BRL，目录号15630-080)的1M母液；1N NaOH中丙磺舒(probenicid)(Sigma，目录号P8761)的250mM母液；DMSO(Sigma D2650)中Fluo 4-AM染料(Molecular Probes，目录号F1 4202)的1mM母液。用1000ml Hank平衡盐溶液(Fisher/Mediatech，目录号MT21023)、20ml 1M HEPES母液和10ml250mM丙磺舒母液制备反应缓冲液。为了制备上样缓冲液，把1.6ml的1mM Fluo 4-AM染料母液与0.32ml pluronic acid(Molecular Probes，目录号P6866)混合，然后与400ml上述反应缓冲液及4ml胎牛血清混合。
试验前1小时，用96/384 Multidrop装置把50μl新制备的上样缓冲液加到384-孔板的各个孔中。在潮湿培养箱中37℃温育细胞以使染料吸收最大化。在试验即将开始之前，用384 EMBLA细胞洗涤仪(Skatron；型号为12386)用90μl反应缓冲液洗涤细胞2次，吸头设置在平板底部上方至少10mm的位置，在每个孔中留45μl缓冲液。
FLIPRII(Molecular Devices)仪器的CCD相机(PrincetonInstruments)设定为2.0的f-stop，0.4秒的曝光。相机用于监测细胞平板，以得到染料荷载的精确量。
于生理盐缓冲液中测试10μM浓度的含有可能激动剂的化合物文库。加入化合物之前，测量荧光变化10秒。加入化合物后，第一分钟内每秒测一次荧光，之后在3分钟的全部试验分析时间中每6秒曝光一次。在第10次扫描后加入100μM化合物原液的5μl等分试样，使细胞上的最终化合物浓度为10μM。记录前80次扫描的最大荧光变化作为激活剂活性的测量值，并与10μM ATP(Sigma A9062)所诱导的最大荧光变化比较。
实施例4 拮抗剂试验为了筛选人GAVE10的拮抗剂，人为地使hGAVE10与Gq机制相偶联。如实施例3中，利用FLIPR仪器探测导致的任何荧光改变。荧光的减弱反映拮抗剂的活性。
如实施例3中所述，预改造表达hGAVE10的CHO-K1细胞，以表达Gq蛋白的不加区别形式(Gα16)。37℃及5％CO2下F12HAM培养中使细胞维持在生长对数期。所述F12 HAM培养基(Gibco/BRL，目录号11765-054)中含有10％胎牛血清、100IU/ml青霉素(Gibco/BRL，目录号15140-148)、100μg/ml链霉素(目录号.15140-148，Gibco/BRL)、400μg/ml遗传霉素(G418)(Gibco/BRL，目录号10131-035)和200μg/ml Zeocin(Invitrogen，目录号R250-05)。试验前一天，用96/384 Multidrop装置以12,500个细胞/孔将CHO-K1细胞铺在384-孔底部黑色/透明的试验板(Greiner/Marsh，目录号N58102)上，板孔体积为50μl。细胞在潮湿5％CO2中37℃温育。
制备如下的母液HEPES(pH7.5)(Gibco/BRL，目录号15630-080)的1M母液；1N NaOH中丙磺舒(Sigma，目录号P8761)的250mM母液；DMSO(Sigma D2650)中Fluo 4-AM染料(Molecular Probes，目录号F14202)的1mM母液；和配体或拮抗剂的母液。用1000ml Hank平衡盐溶液(Fisher/Mediatech，目录号MT21023)、20ml 1M HEPES母液、10ml的250mM丙磺舒母液和1mM CaCl2制备反应缓冲液。为了制备上样缓冲液，把80μl的1mM Fluo 4-AM染料母液与16μl pluronic acid(MolecularProbes，目录号P6866)混合，然后与20ml上述反应缓冲液及0.2ml胎牛血清混合。
试验前30分钟，用96/384 Multidrop装置把30μl新制备的上样缓冲液加到384-孔板的每个孔中。在潮湿CO2培养箱中37℃温育细胞以使染料吸收最大化。在试验即将开始之前，用384 EMBLA细胞洗涤仪及100μl反应缓冲液洗涤细胞3次，吸头设置在平板底部上方至少40mm处，在每个孔中留45μl缓冲液。
用Platemate-384移液器(Matrix)将5μl 100μM拮抗剂化合物母液加入到细胞中。在温育步骤中，化合物的浓度约为10μM。将细胞铺在FLIPRII上，在第一分钟内每秒测一次板荧光，之后在3分钟的全部试验分析时间内每6秒曝光一次。在第10次扫描后加入拮抗剂或配体(10μM)。每次加入之后，384个吸头用20μl的0.01％DMSO水溶液洗涤10次。
实施例5 受体结合试验为了制备含有hGAVE10受体的膜组分，在含有1mM EDTA的磷酸缓冲盐溶液(10ml)中孵育以收获表达或者过量表达hGAVE10的CHO细胞系。在用5ml缓冲液A(50mM Tris-HCl(pH7.8)(Sigma T6791)，5mMMgCl2(Sigma M8266)和1mM EGTA(Sigma 0396))重悬细胞之前，细胞在含有1mM EDTA的磷酸缓冲盐溶液(10ml)中再洗3次。
然后，在组织匀浆器(Polytron，Kinemetica，Model PT 10/35)中破碎细胞1分钟。得到的匀浆物在Sorvall仪器RC3B冷冻离心机中49,000xg，4℃离心20分钟。得到的沉淀在25ml的缓冲液A中重悬，离心步骤重复3次。最后一次离心之后，沉淀再一次在5ml缓冲液A中重悬，等分试样，并在-70℃保存。
使用膜组分和放射性标记的配体或激动剂作为示踪者，进行受体结合试验。在96-孔板(Beckman仪器)中进行试验。结合反应物由含有放射性配体或激动剂(0.01nM-25nM)、18μg CHO细胞制品，及0.1％牛血清白蛋白(Sigma，目录号34287)的终体积为0.2ml的缓冲液A组成(见Im等，生物化学杂志(J Biol Chem)(2000)275(19)14281-14286)。在室温下温育此反应物1小时。通过多通道收获器(Brandell)上的Whatman GF/C滤纸过滤终止反应，所述滤纸之前用0.3％聚乙烯亚胺(Sigma，目录号P3143)和0.1％牛血清清蛋白(BSA)处理1小时。将混合物加于滤纸上并温育1小时。用1ml冰冷的50mM Tris-HCl，(pH7.6)洗涤滤纸6次。通过测量放射性，对于每个示踪者浓度基于总结合与非特异结合(背景)的差别，计算特异结合。获取8-16个浓度数据点以便确定在配体和受体之间达平衡状态时配体与受体的结合(平衡结合参数)和与放射性配体或激动剂竞争结合受体所需的非放射性配体或激动剂的量(竞争结合值)。制作抑制曲线以确定抑制50％的结合所需的浓度(IC50)。
实施例6 Northern印迹试验在来自几个人组织样本的总RNA或poly A+RNA上进行Northern印迹分析，以测定这些组织是否表达hGAVE10。所用的探针是标有P32的随机引发的hGAVE10 cDNA或其部分。
制备探针标有P32的hGAVE10 cDNA按如下方法制备25ng如上所述制备的hGAVE10 cDNA在微量离心管中于45μl 10mM Tris-HCl，pH7.5；1mMEDTA中重悬，在95℃加热5分钟。然后使管子在冰上骤冷5分钟。冷却之后，管中的混合物用45μl GAVE10 cDNA和上面描述的缓冲液重悬，并与RTS Rad Prime Mix(提供有RTS Rad Prime DNA标记系统)(LifeTechnologies，目录号10387-017)混合。边轻轻地彻底混合，边加入5μl标有P32的α-dCTP(比活性3000 Ci/mM)(Amersham，AA0005)。得到的混合物在37℃温育10分钟。通过加入5μl的0.2M EDTA(pH8.0)来终止温育。取混合物的5μl等分试样并通过计数放射性来估计掺入hGAVE10cDNA的放射性α-dCTP。
RNA抽提在培养皿中加入1ml Trizol试剂(Life Technologies，目录号15596)直接裂解感兴趣的细胞。用吸管吹吸细胞裂解液几次以匀浆化裂解液(之后，把细胞裂解液转入试管中)。匀浆之后，30℃温育裂解液5分钟以允许核蛋白复合体完全解离。温育之后，以每1ml Trizol试剂0.2ml氯仿(Sigma，目录号C53 12)的量将氯仿加入裂解液中，剧烈震荡试管15秒。然后裂解液在30℃温育3分钟。温育之后，在4℃以12,000xg离心裂解液15分钟。得到的水相转移到新管中并按每1ml Trizol试剂0.5ml异丙醇的量加入异丙醇。然后水相样本在30℃温育10分钟，并在4℃，12,000xg离心10分钟，离心之后，弃去上清。用70％乙醇洗涤剩下的RNA沉淀。洗涤过的样本在4℃，7500xg离心10分钟，弃去产生的上清。然后干燥剩下的RNA沉淀，并在无Rnase的水(Life Technologies，目录号10977-015)中重悬。将总RNA(例如来自外周组织的样本)或poly A+RNA(例如不同脑区的样本)用于Northern或者Taqman(下面有描述)试验。可以购买已知的标准品，例如Perkin-Elmer的人脑肌动蛋白。
凝胶电泳在水、5X甲醛凝胶电泳缓冲液(描述如下)和2.2M甲醛(Sigma，目录号P82031)中融化2g琼脂糖(Sigma，目录号A0169)，制备琼脂糖凝胶。
凝胶电泳的样本制备如下RNA4.5μl(共5μg)5X甲醛凝胶电泳缓冲液 2.0μl甲醛 3.5μl甲酰胺(Sigma，目录号F9037) 10.0μl甲醛凝胶电泳缓冲液(5X)是0.1M的3-(N-码啉代)丙磺酸(MOPS)(pH7.0)(Sigma，目录号M5162)；40mM乙酸钠(Sigma，目录号S7670)；和5mM EDTA(pH8.0)(Sigma，目录号E7889)。
样本在65℃温育15分钟，之后在冰上骤冷却。冷却之后，样本离心5秒。然后向样本中加入2μl甲醛凝胶上样缓冲液；50％甘油(Sigma，目录号G5516)；1mM EDTA(pH8.0)；0.25％溴酚蓝(Sigma，目录号18046)；0.25％二甲苯青FF(Sigma，目录号335940)。
表1列出在一些实验中使用的一些RNA的来源。
表1
在5V/cm下预电泳凝胶5分钟。预电泳之后，将样本加载到凝胶上。在4V/cm电泳1X甲醛凝胶电泳缓冲液淹没的凝胶。2小时时更换缓冲液进行电泳。
将RNA从凝胶向硝化纤维素转移用溴化乙锭(Sigma，目录号El 385)(在0.1M乙酸铵(Sigma，目录号09689)中，0.5μg/ml)对凝胶染色30分钟，以保证RNA不被降解。然后用Sambrook等所描述的方案(Sambrook等编辑，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第1卷，7.46-7.51页，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))把RNA从琼脂糖凝胶转移到硝化纤维素滤膜上(Schleicher & Schuell Inc.，目录号74330-026)。
标有P32的cDNA的杂交在68℃温育Clontech ExpressHyb杂交液(Clontech，目录号8015-1)2小时。温育之后，将15ml温的杂交液倒在多组织样本Northern(MTN)膜上。摇动下，使MTN膜在68℃浸在杂交液中。1小时过去后，加入之前95℃煮沸变性5分钟的hGAVE10 cDNA探针，浓度为106计数/ml。然后，使杂交液覆盖凝胶在68℃继续温育2小时至过夜，其间不停地摇动。
从Clontech ExpressHyb杂交液中取出MTN膜，并使用Clontech洗液1(2×SSC；0.05％SDS)，将膜于室温浸入15ml溶液并摇动40分钟，每40分钟更换溶液，连续清洗三次。将Clontech洗液2(0.1×SSC；0.1％SDS)在55℃加热保温1小时。然后使用Clontech洗液2(0.1×SSC；0.1％SDS)，将膜于浸入15ml溶液并在55℃摇动60分钟。每15分钟更换洗液。
显像膜在-70℃过夜曝光Kodak X-OMAT AR(Kodak，目录号165 1579)胶片，然后用标准方法显像。筛选许多不同组织，在所选组织(例如脾和肺)中发现一个独特的大约2.3kb的mRNA。
实施例7 PCR试验TaqMan或实时RT-PCR可检测样本中的信使RNA。在PCR过程中，试验利用AmpliTaq GoldDNA聚合酶的5′核酸酶活性切割TaqMan探针。TaqMan探针在探针5′端包括报告染料，例如6-FAM(6-羧基荧光素)，并在探针3′端包括淬灭染料(例如，TAMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基罗丹明))。设计TaqMan探针使其特异地与正向引物和反向引物位点之间的目的靶cDNA杂交。当探针是完整时，3′端淬灭染料使5′端报告染料的荧光熄灭。PCR过程中，AmpliTaq GoldDNA聚合酶的5′→3′活性导致了5′端报告染料和3′端淬灭染料之间的探针被切割，从而报告染料被置换出来。一旦被置换出来后，报告染料的荧光就不再被淬灭染料熄灭。因此，可以通过监测报告染料的荧光增强来检测从靶cDNA模板产生的PCR产物的积累。
来自Perkin Elmer Applied Biosystems的ABI Prism序列检测仪系统(型号为ABI7700)可用于监测PCR过程中报告荧光的增强。相对无源参照物的释放标化报告信号。
cDNA模板的制备可以商业上获得几种组织的总RNA和poly A+RNA，例如从Clontech获得(见上表1和下表2)。
表2
5μg的总RNA与2μl(50ng/μl)的随机6聚体引物(Life Technologies，目录号18090)混合，使总反应体积为7μl。得到的混合物在70℃加热10分钟，并在冰上快速冷却。把以下试剂加入混合物中4μl的5X第一链缓冲液，2μl 0.1mM DTT，1μl 10mM dNTP和1μl水。混合物轻轻混合并在37℃温育2分钟，温育之后，加入5μl的Superscript RT-PCR反转录酶(Life Technologies，目录号18090)。然后混合物在37℃温育60分钟。通过加入1μl的2.5mM EDTA终止反应。然后混合物在65℃温育10分钟。
PCR和TaqMan试验在96孔板MicroAmp光学试管(Perkin Elmer，目录号N801-0933)中，进行PCR和TaqMan试验。反应混合物包括25μl的TaqManPCR混合物(Perkin Elmer，目录号N808-0230)，1μl正向引物(5′-TGCTCTTTGCCAGTCTGCC-3′)(SEQ ID NO10)，1μl反向引物(5’-AAGATAGCCTGGGAGCTGCA-3’)(SEQ ID NO11)，1μl的TaqMan探针(5′-TGGAACCACTGGACCCCTGGTGC-3’)(SEQ ID NO12)，1μl cDNA和21μl水，将其加入各孔中。在不同cDNA模板浓度(例如，5，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625ng/μl(模板cDNA浓度为终浓度))下，对每个组织样本重复配制两份TaqMan样本。然后用MicroAmp光学8-条带盘盖(PerkinElmer，目录号N801-0935)密封平板。
用人β肌动蛋白(Perkin Elmer，目录号401846)重复两次绘制标准曲线。对标准曲线的每个cDNA模板浓度，均获得了大量的扩增分子。一旦获得已知基因的标准曲线扩增即允许对每个未知靶基因扩增产生的cDNA分子的数量进行确定以及用内对照进行标准化。
来自上述TaqMan反应的结果可以表示为相对于任选组织的调控倍数(例如，用GAVE10在脾中的表达值除以GAVE10在脑中的表达值)。作为备选方案，不同组织的已知反应性，例如β肌动蛋白可用作参考框架。观察到高水平的GAVE10 mRNA。
实施例7 用[35S]GTPγS鉴定反向激动剂与激动剂制备含有组成型活性受体的膜，方式是首先吸出铺满的单层真核细胞(表达GAVE10)中的培养基(细胞可以在瓶中或多孔板中)，之后用10ml冷PBS冲洗，再吸出。加入含有20mM HEPES和10mM EDTA(pH7.4)的5ml缓冲液，从基底上刮下细胞。将细胞物质转移到50ml离心管中(4℃，20000转/分钟离心17分钟)。之后吸出上清液，得到的沉淀在含有20mM HEPES和0.1mM EDTA(pH7.4)的30ml缓冲液中重悬。之后进行如上的离心。吸出上清液，得到的沉淀在含有20mM HEPES、100mM NaCl和10mM MgCl2的缓冲液(结合缓冲液)中重悬。然后，悬液用Brinkman polytron匀浆器匀浆(15～20秒的多次冲击直到所有物质成为均一悬液)以产生膜蛋白制品。用Bradford方法(见PCT公开号WO 00/22131)测定蛋白浓度。
候选化合物优选使用96孔板形式筛选。在结合缓冲液中将膜蛋白制品稀释到0.25mg/ml以在50μl体积中提供终浓度12.5μg/孔。将100μl GDP缓冲液(37.5ml结合缓冲液和2mg GDP，Sigma目录号G-7127)加入到每个孔中，之后加入Wallac ScintistripTM(Wallac)。将5μl候选化合物转移到每个孔中(即，在总试样体积200μl中的5μl，导致1∶40的比率，从而候选物的终浓度为10μM)。将50μl膜蛋白加入每孔中(包括不含受体的膜对照)并在室温下预温5-10分钟。之后，每孔中加入50μl含有[35S]GTPγS(0.6nM)的结合缓冲液，之后室温下在摇床上温育60分钟。22℃下4,000转/分钟离心平板15分钟终止试验。然后板用8道多孔管吸出上清，用板盖将板封住并在Wallac 1450TM上读数(参见制造商的说明书)。由与带子结合的物质的量的变化可以测定出候选者是反向激动剂(与基线相比降低)还是激动剂(与基线相比升高)。
尽管参照以上的实施例已经详尽地描述了本发明，但应理解能进行多种改变而不背离本发明精神。因此，本发明只被下述权利要求所限制。本申请中提及的所有引用专利和出版物完整地并入此处作为参考。
权利要求
1.分离的核酸，其包含GAVE10(SEQ ID NO1)或GAVE10变体的核苷酸序列。
2.分离的核酸，其包含的序列编码具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的GAVE10多肽。
3.根据权利要求1的核酸，其中所述核酸选自RNA、基因组DNA、合成DNA和cDNA。
4.分离的核酸，其包含GAVE10(SEQ ID NO1)的核苷酸序列的等位基因变体。
5.根据权利要求1的分离的核酸，其中所述变体编码添加、缺失或替代突变。
6.根据权利要求5的核酸，其编码替代突变，其中所述突变在所述序列中提供至少一个功能等同的氨基酸残基。
7.分离的核酸，其包含在严紧条件下可与杂交探针杂交并且与SEQID NO1互补或与编码SEQ ID NO2的核酸互补的序列，其中所述探针包含SEQ ID NO1或编码SEQ ID NO2的核酸的片段。
8.分离的核酸，其包含的序列编码多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO1至少30％一致。
9.纯化的多肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO2。
10.纯化的多肽，其包含如SEQ ID NO2中所示的第三胞内环。
11.表达载体，其包含与表达控制元件可操作地连接的权利要求1的核酸。
12.权利要求11的表达载体，其中所述表达控制元件选自组成型、细胞特异性和诱导型调控序列。
13.包含权利要求11的载体的培养细胞。
14.培养细胞，其包含与表达控制元件可操作地连接的权利要求1的核酸。
15.用权利要求11的载体转染或转化的培养细胞或所述细胞的后代，其中所述细胞表达所述载体包含的核酸所编码的多肽。
16.权利要求13的培养细胞，其中所述细胞选自真核细胞和原核细胞。
17.产生蛋白质的方法，其包括在允许所述载体包含的核酸所编码的多肽实现表达的条件下，培养权利要求13的细胞。
18.特异性结合GAVE10的抗体。
19.权利要求18的抗体，其是单克隆抗体或多克隆抗体。
20.治疗方法，其用于对需要治疗的患者调节GAVE10的信号活性或信号转导，所述治疗方法包括给所述患者施用GAVE10的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。
21.用于鉴定GAVE10的激动剂的方法，其包括使潜在的激动剂与表达GAVE10的细胞接触，并确定在所述潜在激动剂存在时GAVE10的信号活性是否相对于无所述潜在激动剂时GAVE10的活性增加。
22.用于鉴定GAVE10的反向激动剂的方法，其包括使潜在的反向激动剂与表达GAVE10的细胞接触，并确定在所述潜在反向激动剂存在时，GAVE10的活性是否相对于无所述潜在反向激动剂时GAVE10的活性降低，并且在存在内源性配体或激动剂时也降低。
23.用于鉴定GAVE10的拮抗剂的方法，其包括使潜在的拮抗剂与表达GAVE10的细胞接触，并确定在所述潜在拮抗剂存在时GAVE10的信号活性是否相对于存在内源性配体或激动剂时GAVE10的活性降低。
24.治疗组合物，其包含能够调节GAVE10的信号活性或转导的GAVE10的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。
25.治疗疾病的方法，其包括对需要治疗的患者施用治疗组合物，其中所述治疗组合物包含能够调节GAVE10的信号活性或转导的GAVE10的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。
全文摘要
本发明提供了新型GAVE10多肽、蛋白质和核酸分子。除了分离的全长GAVE10蛋白质外，本发明还教导了分离的GAVE10融合蛋白、抗原性肽和抗GAVE10抗体。本发明教导GAVE10的重组表达载体、其中导入了此表达载体的宿主细胞以及其中引入了GAVE10基因或GAVE10基因被破坏的非人转基因动物。本发明还提供利用本发明组合物进行的诊断、筛选和治疗方法。
文档编号A61K48/00GK1596269SQ02823899
公开日2005年3月16日 申请日期2002年9月30日 优先权日2001年10月1日
发明者H·艾施因德雷罗, A·阿尔达提, 蔡济东 申请人:安万特药物公司