用于测量丙酮的基于酶的系统和传感器的制作方法

专利名称：用于测量丙酮的基于酶的系统和传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙酮检测的领域。可以定性和/或定量测定丙酮的丙酮特异性酶系统和传感器已经得到发展。这些酶系统可以引入相对廉价的、简单的和/或便携式的基于酶的传感器，特别是适用于检测环境或生物样品中的丙酮，例如，哺乳动物呼吸样品。
2.相关技术的描述A.丙酮来源从生物有机体和各种环境中得到或存在于其中的液体或气体中可以检测到丙酮。例如，丙酮可以在这样的环境中检测到如自然环境，包括土壤、沉积物，河流，或者湿地；室内和室外的工作以及家庭环境；以及废物环境，包括废料贮存的池塘和污物堆放场。由于从外部来源将丙酮引入了环境或生物体，因此可以在环境和生物液体和气体中发现丙酮。因此，环境中的丙酮可以因为泄漏、浸提、废物排放或溶液蒸发而产生，或通过燃烧木材或塑料的燃烧气体的散发或操作石油内燃机而产生。同样，在活的有机体中，丙酮因为从外部来源摄取、吸入或吸收而存在。
由于丙酮的内部产生，通过环境检测(通过化学反应或生物产生)或通过有机体检测(例如，微生物、动物等)还可以在这样的环境和生物液体和气体中发现丙酮。因此，公开的文献中报道如下，丙酮作为污水、固体废物和醇类的生物降解产物，腐殖物质的氧化产物而存在。丙酮已经在各种植物和食品中检测到，包括洋葱、葡萄、花菜、番茄、牵牛花、田芥菜、牛奶、大豆、豌豆、干酪和鸡胸。从各种树种的天然散发物中包括丙酮气体。
JD Reisman，用于丙酮的环境健康标准(手稿)，环境健康标准No.207，化学安全国际程序(INCHEM)(1998)(参见1.4部分，“环境等级和人体辐射”http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc207.htm。例如，丙酮可以通过植物萜烯的大气氧化作用在环境中化学合成(Fruekilde等(1998))。
活的有机体可以通过多种酶途径内部产生丙酮。在微生物中，可以合成丙酮，例如通过异丙醇的氧化，如可以通过分枝杆菌spp.进行，包括母牛分枝杆菌；通过2-丙烷磺酸盐的脱磺酸基作用，如可以通过红球菌spp.和丛毛单胞菌spp.进行，包括食酸丛毛单胞菌；和通过乙酰乙酸盐的脱羧作用，如通过梭菌spp.进行，包括丙酮丁酸梭菌，丁酸梭菌，和C.Saccharoperbutylacetonium。
在脊椎动物中，包括人类，丙酮合成的最普通路线是通过酮体形成。酮体是通过肝脏的类脂氧化作用产生的成分，当葡萄糖不可用时作为能源。归类为酮体的主要成分包括乙酰醋酸，β-羟基丁酸和丙酮。酮体通常存在于体内，当快速和持久锻炼过程中，它们的含量会上升。肝脏线粒体中脂肪酸的氧化作用产生乙酰辅酶A，其可以通过柠檬酸循环或者通过一个称为生酮作用的过程得到进一步氧化。生酮作用主要是在葡萄糖不能作为能源时发生，将乙酰辅酶A转化为乙酰醋酸盐，β-羟基丁酸盐。肝脏将乙酰醋酸盐和β-羟基丁酸盐释放到血流中，可以将其运至外周组织作为替换的能源。乙酰醋酸是一种β-酮酸，通过缓慢的自发的非酶的脱羧作用生成丙酮和CO2(图解1)图解I 在四蹄脊椎动物中，包括哺乳动物，可以检测到呼吸作用作为肺中气血交换结果形成的丙酮。
呼吸丙酮的含量和血液丙酮含量相关，因此可以作为血液丙酮含量的准确指标。因此，在其他是健康的患者临床研究中，已经证实升高的呼吸丙酮含量是脂肪代谢和程序性体重丢失的一个可靠指标。存在于人呼吸中丙酮的内源代谢水平约为0.2-0.5ppm(v/v)，而在长期低碳水化合物膳食的健康个体中提高至以及超过5-25ppm。同样地，在高脂肪膳食的个体中，呼吸丙酮的浓度提高。每个这些食谱的情况被称为“良性食谱酮病”。呼吸丙酮含量通过短期禁食提高的，这种情况成为“禁食酮病”，长期运动后的情况成为“过度运动酮病”。在饥饿的情况下(或长期禁食)或食谱中胰岛素水平太低的情况下，呼吸丙酮的浓度可以变得异常高(高达70ppm或更高)，分别地，这样的情况称为“代谢酮酸中毒”或“糖尿病性的酮酸中毒”，糖尿病性的酮酸中毒是潜在的致命情况。在每个这样的情况下，在青少年或成人呼吸中可以检测到升高的丙酮含量。
除了通过良性食谱、禁食、和过度运动酮病，以及通过糖尿病性的和代谢酮酸中毒提高丙酮以外，其他情况和疾病也可以产生升高的血液丙酮，因此提高呼吸丙酮的含量。例如，血液丙酮提高可以在以下情况中观察到，例如1)女性的生殖周期(例如，在怀孕期间或在分娩后恢复排卵之前的间隔期间)；2)新生儿的发育期；3)低血糖(例如，儿童期的低血糖或不当饮食或延长呕吐导致的低血糖)；4)先天代谢疾病(例如，槭糖尿病)；5)肝机能障碍(例如，末期肝疾病或肝缺血)；6)糖皮质激素缺乏；7)生长激素缺乏；8)病毒感染引起的急性胰炎(例如，系统细胞巨化病毒感染)；9)用核苷类似物处理(例如，HIV的抗逆转录治疗)；10)异丙醇摄取或中毒；11)乙醇中毒；以及12)水杨酸盐中毒。在这些情况中，丙酮也可以通过例如儿童或成人的呼吸分析检测得到。
因此，丙酮的检测在许多医药上重要的应用中是有用的。例如，医学报告中已经证实肥胖是糖尿病、高血压、冠心病、高胆固醇血症和中风的主要关键因素。在许多肥胖的情况中，控制体重减少的过程可以逆转这些危急生命的严重疾病。丙酮是一种可以检测到的代谢物，来监控在这样减轻体重过程并与其一致的进展。同样，丙酮的检测可以用于警告糖尿病患者酮酸中毒发作或者用于得到诊断患者其他任何发现丙酮升高的医学情况或疾病所需的预指示。因此，丙酮是可以作为监控所有年龄患者的膳食适应度、体重减轻过程、药物治疗方式适应度、糖尿病、健康状况的手段的关键诊断代谢物。
B.丙酮检测的领域在上述任何一种情况中都可以检测到丙酮，通过使用各种方式。在现有技术中有许多种测量丙酮的方法，包括检测液体溶液中的丙酮(例如，血液和血浆分析，尿检测)和检测那些气体混合物中的丙酮(例如，呼吸样本、室内气体监控)。许多种类的不同方法已经用于丙酮检测、监控和分析。这些方法包括那些依靠，例如颜色指示剂、光学反射、燃烧热、电阻、气态色谱(GC)、液态色谱(LC)、光度测定法、比色法、紫外分光法(UV)、红外光谱学和光谱学(IR)、微波光谱分析和质谱分析(MS)技术。
这些技术和运用它们的方法在专一性方面有不同一些检测各种挥发性有机物(VOCs)；一些单独检测酮(和酮酸)或检测酮(和酮酸)和醛；以及一些特地来测量丙酮。
在第一组丙酮检测的方法中，通过使用任何一种检测各种VOCs的技术来监控丙酮，这样的技术实例包括以下的。检测各种VOCs的周围气体检测仪包括例如，Drager Polytron SE Ex检测仪，其使用催化的、燃烧热“pellistor”型传感器(目录no.6809760；0.6公斤)；以及DragerPolytron IR SE气体检测仪，其使用了红外线传感器(目录no.8312550；1.9公斤)(都可以从Drager SicherheitstechnikGmbH，Lubeck购得，德国)。
基于液固反应的VOCs检测依靠气体或液体吸收到固相上(通常包括化学衍生反应)，接着通过吸收的和/或衍生成分的比色或光度的检测。英国专利No.1082525中描述了这样的液固反应技术，其中披露了含有活性或活化氢原子的有机物成分的检测，其中金属沸石用作固体。在美国专利No.4,882,499中披露了包括液体吸收到固体上和使用光度检测的VOC检测。该专利教导了使用纤维光学的液体检测仪来检测通过毛细管作用吸收的液体样品反射光学系数的变化；为了这一目的，疏水纤维或烧结的基质被用作吸附的固体。
在另一种VOC检测的方法中，在美国专利No.5.382.341中描述了通过电阻/导电性检测来感知吸收到固体上的气体。该专利描述了烟雾检测元件的制造过程，其中铋氧化物膜沉积在基底层上，和，然后电学连接到测量电阻的装置上。在这种情况下，固体可以包括铋氧化物、铋-铁-氧化物、铋-钒-氧化物，或铋-钼-氧化物。同样，德国专利No.028062描述了气体吸收方法，其中固体包括半导体装置的吸收层。
在VOC检测的另一种方法中，依靠气态化学衍生(卤化作用)反应产生可检测的卤化产物。在美国专利No.4,198,208和德国专利No.4007375中教导了这样用于VOC检测的气态衍生方法的实例(描述了用氯反应以及氯化物质的检测)。第一组所有这些技术都可以和教导用于测量丙酮，尽管没有特别VOCs的种类。
用于丙酮检测的第二组方法通常是检测酮/酮酸或同时检测酮/酮酸和醛的。这些方法采用的技术依赖如丙酮的化学衍生作用，产生有颜色的产物。然后有颜色的产物在视觉上可以观察出来，得到定性的结果。类似地，有颜色的产物可以用颜色标准图表进行视觉上的对比得到准定量的数据。另外，通过比色或光度的手段，颜色的程度可以被定量地估计。这些技术中使用的最普遍的衍生反应是基于1)和水杨醛反应；2)和联氨(或苯肼，例如，2，4-二硝基苯肼)反应；以及3)和硝普盐反应。许多其他化学衍生反应用于检测醛和酮/酮酸(包括丙酮)是已知的，但不是常用的，因为这些反应使用高温或腐蚀性的，不耐久的，或昂贵的试剂，使得广泛应用不实际。
在基于水杨醛的试验中，将酮或酮酸引入含有水杨醛的碱性溶液中，因此产生了橙色或红色的衍生物。例如，如在美国专利No.2,283,262中描述的，通过这个途径，尿中的丙酮和乙酰醋酸盐都可以检测到。
在基于联氨和基于苯肼的试验中，醛、酮和酮酸衍生成一种或多种腙或苯腙成分。例如，在美国专利No.4.931,404中描述了通过这条途径，气态丙酮吸收进入液体溶液进行化学衍生作用，其中披露了通过和联氨-或苯肼耦合的阳离子交换基质进行反应的衍生作用，接着通过比色检测如黄色的衍生物；在英国专利No2253910中，披露了通过和联氨溶液反应的衍生作用，接着通过电阻进行衍生物的检测。
在基于硝普盐的试验中，醛、酮以及酮酸和硝普盐反应，即硝普酸的盐(例如，硝普酸钠，即亚硝基铁氰化钠)，形成衍生物，在胺的存在下，形成粉红色或紫色络合物。在一些方法中，硝普盐反应中存在的胺于是用于立即着色的，而在另一些中，是后来加入含有胺的溶液来产生颜色的。在个人健康监控范围中，硝普盐反应是一种最常用于测量丙酮的反应，例如，在糖尿病或体重减轻中。这样的硝普盐方法通常为三种不同形式中的一种气体采样管、液体检测条和液体检测板。
通常使用多种的硝普盐管试验设备。最普遍的一种是德雷格管(即Drger管)，例如，德雷格丙酮检测仪管(目录no.DRAG CH22901从SAFECO，Inc.购得，诺克斯维尔，田纳西)。德雷格丙酮检测仪管可用于呼吸分析，但是主要用于周围气体样品，其中泵将空气样品通过管子引入。相同试验中使用了德雷格芯片测量系统(目录no.540βCMS从SafetyFirst of Middleton购得，威斯康星；0.74公斤)，其中使用了“芯片”，即毛细管大小的德雷格管平面的、平行的基质。该手提式设备将气体样品泵入毛细管，设备中的光学和电学进行比色，将管中衍生物着色的程度转化为定量的数据信号。同样地，通过光度检测有颜色的衍生物来定量监控气体样品中的丙酮(以及其他酮)的方法，在MSA丙酮检测管制造者可得到的信息中有教导(目录no.226620，从Ben Meadows Co.，购得，Lab Safety Supply Inc.的分支，邮箱5277，简斯维尔，威斯康星53547)。同样，美国专利No.5,174,959中披露了包含两个固体基质的硝普盐管试验设备一个硝普盐偶联基质和一个胺偶联基质。该设备可以用于气体样品，其中加入溶剂如甲醇，或用于液体样品如尿。
硝普盐流体检测条和板通常作为尿酮检测条带和板销售。这样的酮检测条的例子是CHEMSTRIP K(Roche Diagnostics公司生产，印第安纳波利斯，印第安纳)和KETOSTIX(Bayer公司生产，塔利顿，纽约)。典型的酮检测条带包括AMES ACETEST试剂板(产品目录号AM-2381，得自Analytical Scientific有限公司，圣安东尼奥，德克萨斯)。
第三组方法是丙酮特异性的。这些丙酮特异检测方法使用了分析设备和技术。例如，丙酮特异性检测方法包括气态色谱分析检测，A Amirav等在“用于医学诊断的人类呼吸分析器”中描述，http://tau.ac.il/chemistry/amirav/breath.shtml(2000年11月)；用微型柱进行液态色谱分析，如美国专利No.6,063,283中描述的；质谱分析检测，如美国专利No.5,999,886中描述的，用于在半导体晶片处理的容器中测量丙酮蒸汽络合物。
在美国专利No.5,355,425(用于液体)和美国专利No.4,587,427(用于气体)中描述了通过IR光谱学进行流体中丙酮特异性检测。RTKrouti1等披露了通过FTIP光谱学进行气体中丙酮特异性检测“通过傅里叶变换红外线干涉图直接分析的丙酮、甲基乙基酮以及六氟化硫的自动化检测，”Applied Spectroscopy 48(6)724-32(1994年6月)。在Medical Technology Co-Operation Offer131.C的摘要中描述了通过微波光谱进行气体中的丙酮特异性检测，题目为“用于呼出气体的微波气体光谱”，从Nizhny Novgorod Region Cooperation of the East-WestAgency (OWA) of the Association for Innovation Research andConsultation mbH of the Innovation Consulting Institute获得(Innovations Beratungs Institut，Dusseldorf，DE)(参见″医学技术″连接网址http://www.owa-ibi.com/owa-deutsch/index.html)。
此外，许多采用连接分析技术的丙酮特异性检测方法也是本领域公知的。例如，这样方法的选择包括，那些依靠GC-HPLC，GC-FID(“火焰离子化鉴定器”)，GC-MS，GC-RGD(“还原气体检测仪”)，以及HPLC-UV技术，在JD Reisman，用于丙酮的环境健康标准(手稿)环境健康标准No.207，化学安全国际程序(INCHEM)(1998)(参见2部分，“同一性、物理和化学特性，以及分析方法”http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc207.htm。
因此，气体吸收(进入液体)通过化学反应，气体吸收(到固体上)通过和不通过化学反应，液体吸收(到固体上)通过和不通过化学反应，气态化学反应、液态化学反应、UV、IR、GC、LC、MS、以及其他技术都已经用于丙酮检测。然而，所有这些技术都存在缺陷。
例如，由于环境、健康以及安全因素，期望选择一种对丙酮特异的丙酮检测方法。这在患者半监控的领域中尤为重要，例如，对于糖尿病和对于节食。因此，广泛的VOC检测技术对于这些目的就不是很理想了。而目前所用特别针对丙酮的丙酮特异性方法，它们需要不能轻易移动的庞大设备，而且其获得和维持也是相对昂贵的，以及通过缺乏医学或科学训练的个体来使用它们也是不切实际的。期望丙酮检测技术能成为重量轻，易移动，低成本，和易操作的。这些特征在患者半监控的领域中同样特别重要。因此，由于这些目的和原因，目前可用的丙酮特异性检测技术是不理想的。
与这些丙酮特异性技术相比，目前可用的检测酮/酮酸或同时检测酮/酮酸和醛的大多数方法，通常相对低廉、重量轻、易移动以及易操作。然而不使用第二个检测系统，如比色或光度，这些测试产物只是定性或半定量的结果可视的颜色数据。其次，这些测试对丙酮不是特异性的乙酰乙酸盐、其它酮，以及醛的存在可能造成错误放大的颜色数据。最后，这些测试会产生假阳性和假阴性结果；假阳性表示存在丙酮增加，假阴性表示不存字丙酮增加。例如，在最常用的试验(硝普盐试验)中假阳性结果通常发生在患者服用了如硫氢药物如卡托普利，或当其他酮或醛存在时；假阴性结果经常发生在当测试高酸性样品时，如服用大剂量维生素C(抗坏血酸)患者的尿样。理想的丙酮检测技术是可靠的、对丙酮是特异性、以及可以产生直接定量结果的。这些特征在患者半监控的领域中同样特别重要。因此，对于这些目的，现有的酮/酮酸和醛检测技术不理想因此，在丙酮检测领域中需要一种丙酮检测技术，其是丙酮特异性的、重量轻、易移动、低成本、易操作，可靠和可以直接产生定量结果。这样的技术可以产生电学效果如，数字结果(或光型计算机或其他设备的情况下，可以产生光结果)，也使十分有用的。如待在家中的患者用来监控生物样品中丙酮含量的可提供的、易处理的、特异性、单独使用的设备还是不容易获得的。
其他如乙醇检测领域，利用基于酶的技术。基于酶的技术可以是分析特异性的，可以得到重量轻、易移动、低成本、易操作和定量的设备形式。例如，在生物样品乙醇检测的领域中，气态乙醇检测已经通过酶联电化学传感器的手段来进行，使用乙醇氧化酶(AOX)或伯醇脱氢酶(ADH)作为酶。在一个典型的乙醇检测系统中，薄膜的、使用固定于羟乙基纤维素中ADH/NAD+的丝网印刷酶电极用于监控乙醇蒸汽。这种乙醇检测酶电极通过将其浸入缓冲液来活化，使用含有乙醇的样品，在650mV(比照Ag/AgCl)电流下监控通过酶促反应产生的NADH。已经描述了用于测量乙醇蒸汽的同样的电极，其中ADH固定于相反胶束介质中。将乙醇转化成液态，其可以在介质中有效地被浓缩，ADH可以作用于它。这些技术容易应用于可以在家中、工作中，以及在其他远离诊所和测试实验室的环境用于监控或自我监控呼吸乙醇的易移动、低成本的检测仪。然而，这些设备没有被设计用于丙酮检测，以及所用酶(例如，伯醇脱氢酶)也不能用于丙酮检测。因此，如果可以发明，基于酶技术可以提供许多在丙酮检测领域所需的益处。
尽管如此，上述所有的丙酮检测方法和设备依靠非酶技术。到目前为止，环境和生物样品中丙酮的酶促测量还没有被描述。因此，似乎除了需要具有上述优点的丙酮检测技术外，丙酮检测领域还缺乏有基于酶的技术的应用及益处。
发明概述本发明涉及丙酮特异性的基于酶的检测系统，包括重量轻、易移动、低成本、易操作、可靠、能直接产生定量结果以及能产生电子结果的丙酮特异性基于酶的检测系统。产生电子结果的能力，例如数据，可以使这样的设备易于计算机化数据收集和通过交流网络如国际互联网传输(通过硬件或软件的方式)，包括通过WO01/63277中描述的方法。这样计算机化数据的收集和传输可以使使用本发明丙酮特异性检测仪的方法对一致性监控、培训和指导尤为有效。
与目前可用的重量轻、易移动、低成本、易操作的丙酮检测技术相比，本发明的丙酮特异性基于酶的检测系统还提高了丙酮检测的灵敏度。上述参考文献中没有一个提示了通过酶促的方法来提高丙酮检测的灵敏度。迄今还没有报道过哺乳动物样品中丙酮的基于酶的测定。然而，如前所述，丙酮的特异性测定在许多医学情况下十分重要，在患者半监控的范围内尤为有用。然而，这样的丙酮特异性检测技术通常在实验室或诊所外就不能进行了，对普通患者的半监控也不实用。由于这些原因，就存在这样的需要提供改进的、比较不笨重的和易操作的专门检测生物样品中丙酮的方法和设备。因此，通过根据本发明的丙酮特异性基于酶的方法的丙酮检测，在许多医学上的重要应用中尤为有用。
已经创造了用于定量测定生物样品中丙酮含量的丙酮特异性酶系统来解决现有技术中的问题。本发明的酶系统和检测仪特异性地作用于底物丙酮。术语“特异性地”用于表征酶、系统或设备，其充分地表现出对丙酮比其他潜在可用底物更高的亲合力或活性，即，相对于通常存在于样品例如人呼吸中的其他化学物质，对丙酮是优先的酶，和/或(在本发明的丙酮检测仪的范围内)不能相当地与丙酮竞争的其他重要底物接触的酶。因此，在本发明的设备和系统中，酶和丙酮或活性丙酮衍生物以外的底物相互作用是可忽略的。
可以将一种或多种酶和设备，如生物传感器，结合以方便样品测定。酶和丙酮的反应可以通过现有技术中公知的各种检测方法来直接或间接地检测。这些酶系统可用于，例如，检测人生物样品如呼吸、唾液或尿中丙酮含量的家用设备中，因此，提供了一种用于监控患者健康和/或用于监控患者对体重减轻膳食的适应性、健康控制过程，以及治疗状况的非入侵方法。
因此，本发明的一个方面是丙酮特异性酶系统，将丙酮的酶介代谢和通过一种或多种在上文所述的信号介质产生的电化学可检信号偶联。特别地，将丙酮特异性酶系统，包括选择丙酮作为目标底物的酶，和检测信号的介质偶联是本发明优选的一方面，尤其是通过使用电化学或光度的方法进行检测。任何可以和电化学可检测协同因子或副产物偶联的丙酮特异性酶都适用于本发明的酶系统。
丙酮特异性酶系统以冻干的形式存在直至接触生物样品。此外，电化学生物传感器，根据发明前面所述的，可以包括通过双糖如海藻糖的存在，稳定地保存丙酮特异性酶系统。生物样品可以是液体或蒸汽的形式，但是优选为蒸汽形式。
样品如人呼吸中丙酮的酶介量化的一个重要特征是使用了对丙酮具有高灵敏度的酶系统(例如，检测下限约为0.2-0.5ppm(v/v))，可以将其并入设备中。此外，酶系统必须是坚固的、稳定的和相对廉价的。通常，设备必须是可以计算机连接的、高选择性，轻便的以及呼吸中存在的其他代谢物如乙醇是低干扰的。由于检测的灵敏度和设备的需要相对简单，酶电极技术(生物传感器)尤其适合于这些需要，其中包括特异性酶促反应。电化学检测依赖于通过电极待测样品反应产生的电流的直接测定。将氧化还原酶(氧化还原作用)酶反应和电极偶联已经成为开发生物传感器的有吸引力的方法。尤其是，对于一定范围的底物，即葡萄糖(即葡萄糖脱氢酶和葡萄糖氧化酶分别反应)，还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)或过氧化氢的电化学检测已经用于电流计生物传感器中。
优选的丙酮特异性酶系统包括选自丙酮单加氧酶、丙酮羧化酶以及仲醇脱氢酶的丙酮特异性酶。尤其是，本发明的丙酮特异性酶系统优选包括选自与NAD(P)H氧化偶联的丙酮羧化酶产物形成，与NAD(P)H氧化偶联的丙酮羧化酶ATP水解，与H2O2生成偶联的丙酮羧化酶ATP水解，仲醇脱氢酶(S-ADH)偶联NAD(P)H氧化，S-ADH催化NAD(P)+生成偶联H2O2生成，以及丙酮单加氧酶偶联NAD(P)H氧化的丙酮特异性酶系统。
在另一个优选实施例中，根据本发明的丙酮特异性酶系统包括信号介质选自有机协同因子、无机协同因子、多电子传递介质及酶反应副产物。优选，通过再循环酶底物放大电化学信号输出，电化学检测信号介质发出的信号是线性或指数放大。
在本发明的一个优选实施例中，丙酮特异性酶系统包括从脊椎动物或微生物中获得的丙酮利用酶，更优选为从哺乳动物、真菌、细菌或热古菌(Archaeon)中获得。
在本发明的另一个优选实施例中，丙酮特异性酶系统包括从脊椎动物或从选自需氧的和厌氧的细菌、酵母、真菌和产甲烷的古生菌中获得的仲醇脱氢酶。优选，从热厌氧杆菌属、黄色杆菌属、假单胞菌属、红球菌属(Rhodococcus)，或分枝杆菌属的菌种中分离获得的仲醇脱氢酶；尤其是优选从自养黄色杆菌Py2菌株中分离获得的仲醇脱氢酶。
在本发明的再一优选实施例中，丙酮特异性酶系统包括从需氧或厌氧细菌中分离获得的丙酮羧化酶，优选从黄色杆菌属、红球菌属(Rhodococcus)，或红球菌属(Rhodobacter)的菌种中获得。
在本发明优选的实施例中，用于检测生物样品中丙酮的电化学生物传感器包括至少一种如前面所述的丙酮特异性酶系统，以及用于检测至少一种丙酮特异性酶系统和生物样品中的丙酮之间反应得到的产物的方法。生物传感器的丙酮特异性酶系统优选包括选自丙酮羧化酶、仲醇脱氢酶和丙酮单加氧酶的酶。尤其是，丙酮特异性酶系统可以包括至少一种选自1)仲醇脱氢酶(S-ADH)催化的丙酮还原，伴随NAD(P)H(氧化)；2)丙酮羧化酶偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶反应消耗NAD(P)H；3)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联NAD(P)H消耗；4)S-ADH反应NAD(P)+生成偶联H2O2生成；5)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联H2O2生成；6)丙酮羧化酶偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶NAD(P)+生成偶联H2O2生成；7)丙酮单加氧酶偶联NAD(P)H氧化；8)丙酮单加氧酶偶联H2O2生成；以及9)丙酮单加氧酶催化NAD(P)+生成偶联H2O2生成。
在制造包含一种或多种丙酮特异性酶系统的生物传感器中，各种酶促的副产物和/或因子用于产生检测酶反应的电化学信号。可以使用有机协同因子，如NAD，NADH，NADP，NADPH，FAD，FADH，FMNH，辅酶A，辅酶Q，TTQ(色氨酸色氨酰醌)以及PQQ(吡咯并喹啉醌)。电子传递介质可以用于提高电子传递的动力学，因为有机协同因子有时候易于污浊检测仪。用于协同因子还原形式的对多电子传递有用的介质可以包括入本发明的酶系统。同样地，无机的协同因子或指示剂可以用于产生电化学信号。酶促反应的副产物，如过氧化物或氨基化合物，以及高能粒子也可以用于本发明用来将丙酮代谢和电化学测量信号偶联。可以使用这些协同因子和系统的结合。
在优选实施例中，根据本发明的电化学生物传感器可以进一步包括连接分析设备的装置，如连接互联网的计算机。
在优选实施例中，根据本发明的电化学生物传感器可以以存在两种或多种丙酮特异性酶系统为特征。在这样的生物传感器中，两种或多种丙酮特异性酶系统可以安置在分离的电极上，例如，电极沿着样品检测的路径按顺序集中排列成组，形成电极排列。换句话说，用于和含有单个丙酮样品接触的电极可以集中在常见的样品路径中。具有相同或不同丙酮特异性酶系统的若干组可以沿着路径按顺序排列来提高丙酮检测的灵敏度。
本发明电化学生物传感器的可替换优选实施例中，矩阵中一个或多个这样分开的电极可以是丙酮特异性的，而矩阵中一个或多个其他分开的电极可以检测非丙酮分析物。例如，在乙醇检测仪中，如果存在丙酮，可以通过设计用来检测乙醇的电极第二个检测出来，分离的杂质，丙酮特异性电极可以提供用语纠正这样的丙酮干扰的基础。另一个实施例中，为了测定分析物浓度的有用比率，期望能同时测量丙酮和至少一种其他的分析物，其比例是合乎用于检测的需要的，例如，医学情况或疾病状态，如糖尿病在糖尿病和其他情况中，丙酮与，如β-羟基丁酸盐的比率，对提供患者代谢状态更完整的情况是有用的。设备中的电极矩阵是可以设备和连接的一部分或一个装置，每个电极可以产生单独的电学结果或每个分析物的单独结果。可替换的是，可以产生综合结果的一些类型，如，总合，差别，比例等等。可以和电极连接的设备中电子的，或计算机中电子的或其他电子装置，可以利用丙酮电极的结果，例如计算丙酮和其他测定的分析物(如β-羟基丁酸盐)之间的比例；或计算影响从为非丙酮分析物(如，乙醇)设计的其他矩阵电极得到的丙酮结果的干扰负修正因素，然后计算修正的数据。这样基于矩阵的电子(或电连接的)设备的一个实例是“电子鼻”，其可以用于，例如从呼吸分析得到的医学情况的诊断；从通过受染的流体样品，如细菌感染的尿，的气体或蒸气得到的医学情况的诊断；铁路油槽车以及其他工业容器气体泄漏的诊断；通过检测散发的蒸汽进行发酵和食品加工系统的质量控制监控；封闭气室质量的监控。
本发明的一个优选实施例中，检测生物样品中丙酮的方法包括将含有丙酮的生物样品引入包括至少一种利用丙酮作为底物的丙酮特异性酶系统的生物传感器，然后测量丙酮和丙酮特异性酶系统之间的反应。生物样品优选为蒸汽生物样品。检测可以通过光度的、测热的，或电化学的方式来完成。该方法可以进一步包括通过电化学处理的电极促进至少一种丙酮特异性酶系统和蒸汽样品中丙酮的电化学转换，以及电化学检测至少一种丙酮特异性酶系统和蒸汽样品中丙酮反应得到的产物。
本方法中所用的至少一种酶系统包括选自丙酮单加氧酶，丙酮羧化酶和仲醇脱氢酶。尤其是，酶系统可以包括任何一种或多种1)仲醇脱氢酶(S-ADH)催化的丙酮还原，伴随NAD(P)H的消耗(氧化)；2)丙酮羧化酶偶联(例如β-羟基丁酸盐脱氢酶)反应形成产物伴随NAD(P)H的消耗；3)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联NAD(P)H的消耗；4)S-ADH反应生成NAD(P)+偶联H2O2生成；5)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联H2O2生成；6)丙酮羧化酶偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶反应生成NAD(P)+偶联H2O2生成；7)丙酮单加氧酶偶联NAD(P)H氧化；8)丙酮单加氧酶偶联H2O2生成；以及9)丙酮单加氧酶催化生成NAD(P)+偶联H2O2生成。该方法优选包括蒸汽样品中丙酮含量为0.5ppm至10ppm的电化学检测。
通过使用用于监控丙酮含量的丙酮特异性酶系统，患者护理的若干范围可以扩大。在这方面，可以酶介检测生物样品中丙酮的家用生物传感器使患者、护理人员和支持群体可以严密地控制体重减轻过程。同样，本发明的生物传感器可以使患者在遭受有关丙酮的情况下，如糖尿病，可以监控体重减轻和/或酮酸中毒的发作，以及非入侵的控制他们的饮食和药物，因此控制丙酮的产生。传感器中丙酮特异性酶系统的另一个用途是通过用丙酮或产生丙酮成分标记药方来远程规划药物控制。
在优选实施例中，本发明的电化学生物传感器设备使用了对作为底物的丙酮特异性的酶，其中丙酮酶系统反应结合了电化学检测方法。这样的丙酮特异性监控设备的使用需要生物传感器能够检测低含量的丙酮，尤其是当监控蒸汽样品中的丙酮时。例如，根据本发明的电化学丙酮传感器可以通过测定生物样品中的丙酮含量来帮助糖尿病治疗中的患者。患者在家中就可以很快就得到酮酸中毒的数据和警告，通过将任何为了产生(在丙酮检测中存在的电化学反应)定性或定量结果的方式并入设备，或为了将包括这样产生方式的设备和计算机、仪器，或装置连接的方式。为产生这样定性或定量结果的方式的一个实例就是电子电路。电子电路可以并入根据本发明的丙酮检测生物传感器设备中，或通过将传感器设计成能和计算机或其他含有这样电路的电子仪器连接。这样一方面通过循环酶底物放大电化学信号输出，使用了从所应用的电化学检测信号介质发出的信号。这样的电路是可选择的，例如，能够产生和/或用图象表示/用文字表示/用信号表示来显示定性(例如，“低”、“中等”、“高”、“安全”，或“危险”)或定量结果(例如，“超过指标10％”、“低于平均6％”、“12ppm”或“40mg/dL”)。该设备或装置还可以包括记录一种或多种检测结果的数据贮存方式。如WO01/63277中描述的，为了将通过设备产生的数据传输至如诊所、实验室、医生办公室或支持组，该设备还可以和计算机网络，如互联网连接。进一步，设法监控体重减轻的肥胖患者可以在他们自己家中隐密地使用根据本发明的丙酮特异性传感器，或获得医学专家、护理者或支持组的远程帮助。通过酮症被认为是成功饮食的最佳指标以及丙酮含量与由于脂肪体重减轻磅数的成分相关这一事实来促进本发明的这个方面。
本发明的丙酮特异性酶系统和传感器/电极可以利用监控生酮饮食来用于控制患者疾病的发作，用于检测妊娠期的糖尿病，用于帮助I型糖尿病监控或II型糖尿病控制，用于监控体重减轻和不当饮食咨询以及高性能健康训练的患者进展，以及用于帮助家畜管理。
除了监控体重减轻和控制丙酮有关的疾病，根据本发明的丙酮特异性酶系统的另一个医学应用就是监控给患者使用的药物组分的可用性。用丙酮或产生丙酮标记的释放到患者血流中的治疗组分可以使用包括在此所述的丙酮特异性酶系统的传感器进行追踪。例如，口服活性药物可以配制成包括丙酮，或乙酰乙酸，或，例如，乙酰乙酸盐，酯，或氨基化合物标记的。乙酰醋酸盐自发地脱羧基释放出丙酮。可以通过包括丙酮特异性酶系统的生物传感器来监控“标记的”药物的摄取，从配方到患者血流中丙酮的释放。然后用光度或电化学的方式通过由连接在丙酮特异性酶系统的氧化还原酶反应来检测患者呼吸中的丙酮含量。优选，定量的组分是非肠胃给药，例如，通过注射或定位灌输，但是其他非肠胃的给药途径，如，口服给药，也是合适的。
因此，本发明的另一个优选实施例中，使用丙酮特异性酶系统的方法包括将乙酰乙酸盐或制药学上可接受的盐、酯、氨基化合物，或其他合适的其衍生物与药物化合物结合，然后标记该组分；将标记的组分给施用给患者；然后，使用本发明丙酮特异性酶系统的方法通过患者生物样品中丙酮的检测来监控标记组分至患者血流的释放。尤其是，测量乙酰乙酸盐分解的丙酮结果是跟随着标记组分的释放的，其中通过丙酮和本发明的丙酮特异性酶系统反应来检测生物样品中的丙酮。通过本发明的酶系统，然后放大的数据可以用于监控乙酰乙酸盐释放的比例，以及由此得出给药组分的分解比例，其与药物活性组分释放到生物系统中的比例(即其生物利用率)有关。药物传送以及患者对药物治疗方案适应性可以通过这种方式进行确认。
在另一个优选实施例中，材料生物降解测定的方法包括标记生物相容的植入物或设备，通过将乙酰乙酸盐或药学上可接受的盐、酯或胺以及其衍生物与生物相容组分结合形成生物相容的植入物或设备；将生物相容的植入物或设备放入生物系统中(例如，细胞培养物、生物环境、动物或人患者)；测定通过生物相容植入物或设备腐蚀或分解释放的乙酰乙酸盐的分解产生的丙酮的释放。生物相容植入物或设备可以是为了在生物系统中腐蚀或分解的待检测的单一材料样品，或者可以是手术探查的植入物或设备，例如，包括药物活性成分的植入物或设备，所期望的是其的释放是受控制的。与本发明的丙酮特异性酶反应的乙酰乙酸盐的释放可以通过其分解成丙酮来检测。所测得的丙酮的量可以与植入物释放的乙酰乙酸盐的量相关联，其的转变就是体内生物相容植入物分解的象征。通过本发明酶系统放大的数据然后可以用于监控乙酰乙酸盐释放的比例，因此，以及所组成的植入物或设备的材料腐蚀或分解的比例。
生物相容的材料是那些不损伤正常生物功能的材料。因此，材料是生物相容的而不是如生物化学抑制剂或有毒的、致突变的，或致癌的组分，以及不会导致如免疫反应、致敏反应，或血液凝固活性。生物相容材料的种类包括生物降解和非生物降解材料。生物降解材料和生物有机体接触降解，外部地(如，微生物降解的情况)或内部地(如，在人体内)。典型的生物相容、生物降解的聚合物包括如蛋白质(如，胶原蛋白)、多糖及衍生物(如壳聚糖)、聚乙恶酮、聚羟基链烷酸(PHAs，如PHA聚合物如聚乙醇酸、聚乳酸、聚羟基丁酸、聚羟基戊酸；及PHA共聚物)。其他典型的生物相容聚合物包括聚乙二醇、聚己酸丙酯、纤维素聚合物、聚乙烯醇、聚羟乙基异丁烯酸，以及聚乙烯吡咯烷酮。更多的生物相容材料包括羟磷灰石、陶瓷、玻璃，各种金属，以及合成材料。新的生物相容材料正在持续发展，包括那些在生物环境中短期(如，几周)，长期(如，几个月或几年)，以及非常长期(如，几年或几十年)使用的。新的组分用作生物相容材料必须通过测试来测定它们是否真的是生物相容以及为了分类测定组分的半衰期，如用作短期或长期的生物降解材料，或非生物降解材料。本发明的酶系统可以用于测定这样材料的半衰期。
另外，为了帮助细菌感染的鉴定或测定氧化应力或早期癌症诊断，根据本发明的丙酮特异性酶系统和传感器/电极可以和其他生物组分的检测方法结合起来使用(如，结合检测氧化亚氮、3-羟基丁酮，和/或其他生物组分的方法)。
本发明优选的实施例中，检测样品中丙酮的试剂盒包括丙酮特异性酶系统以及丙酮特异性酶系统的容器，其中容器具有将样品引入丙酮特异性酶系统的入口。丙酮特异性酶系统固定容器内的一次性检测条上，或将丙酮特异性酶系统构造到容器中形成试剂盒的单一的、一次性装置。
本发明还提供了仲醇脱氢酶，其是从自养黄色杆菌Py2(ATAAPTA-4779)获得的蛋白，具有NAD+依赖性仲醇脱氢酶活性，具有将丙酮还原成异丙醇的能力，对酮和仲醇具有特异性活性；对于将异丙醇氧化为丙酮，具有(1)最佳pH约为7.8，以及对于乙醇的氧化，具有(2)当pH为7.8时在相同条件下分别用C3-C5直链仲醇和C2-C5直链伯醇测得对仲醇与对伯醇的平均选择活性比例至少为50∶1；对于丙酮还原成异丙醇，具有(3)最佳pH约为6.2，(4)表观Km约为144±18μM，(5)约43.4±1.2μmol还原丙酮·min-1·mg-1蛋白的表观Vmax，(6)约30.4sec-1的表观kcat，(7)约2.1×105的表观kcat/Km，和(8)约5.1±0.4μM的NADH的Km；以及包括至少一种多肽分子具有(a)通过质谱分析测定的分子量约为37.1kDa，(b)通过变焦电泳测定的pI约为7.4，以及(c)如SEQ ID NO7所示的N-末端氨基酸序列，以及其可以被降解形成具有SEQ ID NO8至SEQ ID NO19所示序列的氨基酸片段。还提供了其多肽。


图1图示了通过P-450单加氧酶催化丙酮依赖性NADH氧化的电化学检测。
图2图示了从自养黄色杆菌Py2菌株纯化得到的S-ADH的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
图3显示了从自养黄色杆菌Py2菌株得到的S-ADH在酮还原中的底物特异性。
图4显示了从自养黄色杆菌Py2菌株得到的S-ADH在乙醇氧化中的底物特异性(NA显示检测没有活性)。
图5图表表示了室温下保存的从自养黄色杆菌Py2菌株得到的冻干S-ADH稳定性，单独以及与各种添加剂(10％重量的海藻糖、柠檬酸盐或蔗糖)。
图6是使用了S-ADH的丙酮电化学传感器的示意图。
图7用图表显示了S-ADH催化反应的电化学响应(□)和UV分光光度响应(●)数据的相关性。
图8图示了通过从自养黄色杆菌Py2得到的S-ADH催化丙酮依赖性NADH氧化的电化学检测。
图9图示了通过从自养黄色杆菌Py2得到的S-ADH催化丙酮依赖性NADH氧化的电化学检测，使用了用Melaola蓝(MB)介质改进的碳电极。
图10图示了NADH浓度试验的电化学结果，使用了用Melaola蓝修饰的玻璃碳电极。
图11图示了通过S-ADH催化的丙酮依赖性NADH消耗的电化学试验结果，使用了Melaola蓝改进的丝网印刷碳电极MB-SPCE。
图12图示了通过S-ADH催化的丙酮依赖性NADH消耗的电化学试验结果，使用了葡萄糖商业检测条和监视器。
图13是与H2O2生成偶联的S-ADH反应的电化学检测图表，尤其显示了S-ADH偶联乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸氧化酶(PO)。
图14图示了使用S-ADH偶联酶系统的丙酮依赖性H2O2生成。
图15是偶联S-ADH反应生成H2O2概括图表的示意图。
图16图示了丙酮依赖性H2O2生成的反射光度测定的试验结果，使用了S-ADH偶联酶系统以及葡萄糖检测条和监视器。
图17图示了丙酮依赖性H2O2生成的电化学试验结果，使用了S-ADH偶联酶系统以及圆盘状铂电极。
图18图示了丙酮依赖性H2O2生成的电化学化学计量的试验结果，使用了S-ADH偶联酶系统。
图19图示了丙酮依赖性H2O2生成的电化学试验结果，使用了S-ADH偶联酶系统以及可置换的镀铂碳电极。
图20图示了丙酮依赖性H2O2生成的电化学试验结果，使用了S-ADH偶联酶系统以及一次性镀铂碳电极。
图21图示了丙酮依赖性H2O2生成的电化学试验结果，使用了S-ADH偶联酶系统以及用嵌入了钴phtalolocyanine的一次性碳电极。
图22图示了用于分析合成呼吸中丙酮的测试气体样品系统。
图23图示了将丙酮从气态转化到湿润泡沫中后的电化学检测，使用了S-AND偶联酶系统。
图24图示了将丙酮从气态转化形成含水薄膜后的电化学检测，使用了S-AND偶联酶系统。
图25图示了丙酮羧化酶活性偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶活性的电化学测定。
图26图示了使用了AC/HBDH偶联酶系统的丙酮依赖性NADH消耗的分光光度测定的结果。
图27图示了丙酮羧化酶(AC)偶联丙酮酸激酶(PK)、肌激酶(MK)，以及乳酸脱氢酶(LDH)活性反应的电化学测定。
图28图示了丙酮羧化酶(AC)偶联丙酮酸激酶(PK)、肌激酶(MK)，以及丙酮酸氧化酶(PO)活性反应的电化学测定。
图29显示了对丙酮响应而产生的H2O2分光光度吸收的测定曲线，通过包括从黄色杆菌Py2得到的丙酮羧化酶、肌激酶、丙酮酸激酶，以及丙酮酸氧化酶的偶联酶系统，在辣根过氧物酶(HRP)和电子受体染料存在下；HRP和染料使H2O2的光度测定能够进行。
图30图示了使用了丙酮羧化酶偶联系统的丙酮依赖性H2O2的生成；使用了丙酮羧化酶(AC)偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶(HBDH)、乳酸脱氢酶(LDH)以及丙酮酸氧化酶(PO)活性反应的丙酮电化学测定的结果。
图31图示了P450单加氧酶偶联半乳糖氧化酶活性的电化学检测。
图32图示了信号放大策略，使用了丙酮羧化酶(AC)偶联酶系统包括乙酰乙酸脱羧酶(ACD)、肌激酶(MK)、丙酮酸激酶(PK)以及丙酮酸氧化酶(PO)图33图示了信号放大策略，使用了丙酮羧化酶(AC)偶联酶系统包括肌激酶(MK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)以及乳酸氧化酶(LO)。
图34图示了线性信号放大策略，使用了仲醇脱氢酶以及吡咯并喹啉醌(PPQ)依赖性乙醇脱氢酶。
图35图示了线性信号放大策略，使用了S-ADH和仲醇氧化酶(SAO)。
图36图示了指数信号放大，使用了S-ADH偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶(HBDH)、乙酰乙酸脱羧酶(ACD)，以及SAO。
图37图示了线性信号放大策略，使用了两种不同的吡啶核苷酸依赖性的仲醇脱氢酶S-ADH-1(NADPH特异性仲醇脱氢酶)，S-ADH-2(NADH特异性仲醇脱氢酶)，以及D(NADH特异性心肌黄酶)和MED(电子介质)。
优选实施例的详细描述定义在此所用的NAD(P)+是指“NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式)和NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，氧化形式)中的一种或两种。”在此所用的NAD(P)H是指“NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原形式)和(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原形式)中的一种或两种。”烟酰胺腺嘌呤二核苷酸也称为3-氨甲酰基-1-β-D-呋喃核糖-吡啶嗡氢氧根5’-酯和腺苷5’-焦磷酸盐，内盐。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐也称为3-氨甲酰基-1-β-D-呋喃核糖-吡啶嗡氢氧根5’，5’-酯和腺苷2’-(磷酸二氢盐)5’-(焦磷酸三氢盐)，内盐。
在此所用的，“ANNN”指“在NNN纳米波长测得的吸收值。”在此所用的，“εNNN”指“在NNN纳米波长测得的消光系数。”在此所用的“酶”是指“催化功能的生物分子；”因此任何可以进行称为催化功能作为其主要催化活性的生物分子被命名为酶，与其他因素如来源、天然或加工后的结构，大小等等无关。
在此所用的“镀铂的碳”，指用铂披覆的碳，例如至少部分铂披覆的碳纳粒子。
在此所用的“光度的”指其中使用了光子的任何检测方式，以及包括，但是不限制于，比色的、光谱测定的、分光光度的、发光为基础的、化学发光为基础的、电解制备的化学发光为基础的、生物发光为基础的，以及荧光为基础的方法。
为了解决一些与患者健康维持相关的问题，基于酶的生物传感器已经得到了发展，其可以将酶介导的丙酮新陈代谢与通过一种或多种信号介质产生的电化学可检测信号偶联起来。任何可以与电化学检测协同因子或副产物偶联的丙酮特异性酶都适用于本发明的酶系统。在优选实施例中，检测生物样品中丙酮的电化学生物传感器包括至少一种丙酮特异性酶系统，以及该至少一种丙酮特异性酶系统和生物样品中丙酮反应产物的检测方法。检测方法可以是电化学的或非电化学的。丙酮特异性酶已经描述了特异性地利用丙酮作为底物的许多主要来源于细菌的酶。这些酶已经从以丙酮作为生长唯一碳源和能源的需氧和/或厌氧细菌中获得。
丙酮可以通过仲醇脱氢酶(S-ADH)作用在细菌中形成，仲醇脱氢酶是与两条不同的丙酮代谢途径中的一条有关的酶一种O2依赖性(利用氧气)途径，其中丙酮被氧化产生丙酮醇，一种是CO2依赖性(利用二氧化碳)途径，其中丙酮转化为乙酰乙酸盐。通过S-ADH催化的丙酮生成反应是自由可逆的，并且通常需要辅酶，通常是NAD(H)或NADP(H)。通过氧化NAD(P)H还原丙酮为异丙醇(S-ADH催化的逆反应)的涉及氧化还原化学，通过其可以监控丙酮的浓度(例如，通过NAD(P)H消耗的电化学检测方法)。各种仲醇脱氢酶已经得到纯化和表征。被透彻研究的是从烃氧化(即利用丙烷)细菌获得的那些S-ADH，其采用O2依赖性的丙酮代谢途径。S-ADH酶还从与烃氧化(即丙烷衍生物代谢)不相关的微生物中分离得到或被描述。这些包括甲基细菌和酵母、产甲烷Archaea和发酵Archaea。在这些酶中，得自Thermonoanaerobiumbrockii的S-ADH可以热处理粗制备物或纯化形式购买得的(可从Sigma Chemical Co.购得，圣路易斯，密苏里)。该酶已经被充分表征，是NADPH特异性脱氢酶。
在一些异丙醇氧化细菌中，丙酮作为介质形成，然后在O2依赖性单加氧酶催化反应中经过羟基化形成丙酮醇(羟基丙酮)。然后丙酮醇通过丙酮醇脱氢酶进一步氧化成丙酮醛，或进行碳-碳裂解反应产生C1和C2片段。丙酮单加氧酶，是吡啶核苷酸依赖性酶，为丙酮传感器(如前所述的)中的电化学检测提供了必要条件。以丙酮醇作为介质的丙酮代谢已经在丙酮利用细菌的体外研究中得到了证实。此外，已经确定P450单加氧酶在哺乳动物中采用相同的机理(将丙酮氧化成丙酮醇)。适合用于丙酮特异性酶系统的丙酮单加氧酶是从小鼠(Musmusculus)分离到的细胞色素P450丙酮单加氧酶。丙酮单加氧酶已经被报道为利用丙酮作为底物产生丙酮醇，可从Pan Vera公司(麦迪逊，威斯康星)购得。参见F.Y.Bondoc等，通过细胞色素P450 2E1的丙酮分解代谢CYP2E1-null mice的研究。生化药理学，58461-63(1999)。在细菌中响应此活性的酶还没有完全被表征。此外，通过将半乳糖氧化酶加入酶系统中，丙酮单加氧酶可以偶联H2O2的生成；半乳糖氧化酶将丙酮醇氧化形成H2O2，其可以通过电化学或非电化学检测。
包含丙酮单加氧酶活性的哺乳动物P450细胞色素和P450还原酶可以从肝微粒体中制备得到。P450丙酮单加氧酶催化下列羟基化反应P450单加氧酶通常由两种酶组分组成，包括吡啶核苷酸依赖性还原酶和含有活性位点的氧化酶组分。NAD(P)H提供了必要还原剂用于O2活化以及将一个氧原子并入脂肪族烃底物中。用一些P-450单加氧酶，第三电子传递成分，细胞色素b5，将激活活性。通过丙酮单加氧酶反应的丙酮依赖性NAD(P)H消耗可以进行如下所述的电化学监控，用于仲醇脱氢酶偶联丙酮羧化酶的偶联酶系统，如图1所示。另外，可以通过伴随的O2消耗来进行反应的电化学监控，或通过如下所示的测量吸收值或NAD(P)H消耗的荧光来进行光学监控。
对于其他细菌，包括需氧的和厌氧的，丙酮代谢已经被确定为产生乙酰乙酸盐的CO2依赖性羧化反应的过程。催化该反应的酶丙酮羧化酶，最近已经从两种细菌来源纯化为同系物。尽管丙酮羧化酶不是催化易于电化学检测的反应，但是该酶对丙酮具有高度特异性并且，根据本发明，可以和其他催化氧化还原反应的酶(例如脱氢酶、氧化酶)偶联。使用丙酮羧化酶偶联酶用于电化学检测的可行性在此公开之前没有报道过。
用于丙酮特异性酶系统的合适的丙酮羧化酶包括，但不限制于，从自养黄色杆菌Py2菌株获得的(在此作为X.autotrophicus Py2或X.autotrophicus st.Py2提及)(参见Sluis，M.K.和Ensign，S.A.，从自养黄色杆菌Py2菌株获得的丙酮单加氧酶的纯化和鉴定，PNASUSA，948456-8462(1997))；从荚膜红细菌B10获得的(参见Sluis，M.K.等，从自养黄色杆菌Py2菌株和荚膜红细菌B10菌株获得的丙酮单加氧酶的生物化学、分子，以及遗传分析，细菌学杂志，184(11)2969-77(2002))；以及从胭脂红分枝杆菌B276获得的丙酮单加氧酶(参见Clark，D.D.和Ensign，S.A.，胭脂红分枝杆菌B276中诱发的核苷酸依赖性丙酮单加氧酶的证明，细菌学杂志，181(9)2752-58(1999))。自养黄色杆菌Py2菌株已经于2002年10月29日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，ATCC编号为No.PTA-4799。ATCC位于大学路10801，马纳萨斯，弗吉尼亚20110-2209美国。以及可以通过马纳萨斯，弗吉尼亚20108美国1549邮箱联系。该保藏是根据布达佩斯条约的要求进行的。自养黄色杆菌Py2丙酮单加氧酶亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO1、2和3所示；编码这些亚基的核苷酸序列在基因库中可以得到(参见编号AY055852)。荚膜红细菌B10丙酮单加氧酶基因的氨基酸序列如SEQ IN NO4、5和6所示；编码这些亚基的基因核苷酸序列可以在“荚膜红细菌”测序方案的网站得到(参见http://rhodol.uchicago.edu)。自养黄色杆菌Py2和荚膜红细菌B10的丙酮单加氧酶都是α/β/γ异三聚体，彼此间具有约80％的全序列同源性，以及显示了催化丙酮相同反应的功能同一性。
丙酮特异性酶系统本发明的优选实施例中，提供了包含一种或多种丙酮特异性酶系统的呼吸丙酮诊断设备。这样的设备优选用于监控哺乳动物中的酮生成。为了发展本发明，存在丙酮时，氧化的嘧啶核苷酸作为协同因子或产生了过氧化氢作为副产物，使反应可以电化学检测的情况下，研究了许多氧化还原酶系统。这些氧化还原酶系统包括，例如1)仲醇脱氢酶(S-ADH)催化丙酮还原伴随NADPH消耗；2)仲醇脱氢酶(S-ADH)催化丙酮还原伴随NADH消耗；3)丙酮羧化酶偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶消耗NADPH；4)丙酮羧化酶偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶消耗NADH；5)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联NADPH消耗；6)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联NADH消耗；7)S-ADH反应NADP+生成偶联H2O2生成；8)S-ADH反应NAD+生成偶联H2O2生成；9)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联H2O2生成；10)丙酮羧化酶偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶反应NADP+生成偶联H2O2生成；11)丙酮羧化酶偶联β-羟基丁酸盐脱氢酶反应NAD+生成偶联H2O2生成；12)丙酮单加氧酶偶联NADPH氧化；13)丙酮单加氧酶偶联NADH氧化；14)丙酮单加氧酶偶联H2O2生成；以及15)丙酮单加氧酶催化的NAD(P)+生成偶联H2O2生成。
在所有这些酶系统中，嘧啶核苷酸或过氧化氢是可电化学检测的，然而也可以使用本领域公知的其他检测方法。
酶作为生物活性界面的用途是本领域公知的，而且这样的界面用于检测酶-底物反应电子传递的分析方法中。酶如氧化还原酶的直接电活化可以刺激酶底物的生物电催化的氧化或还原。电极和特定氧化还原酶之间的电子快速传递导致电流产生，对应于底物和生物催化剂之间电子交换的转换率。换句话说，系统的转换电流与酶底物浓度相关联。生物传感器中氧化还原蛋白和其中所含电极支柱的电接触可以通过电极表面的直接电转换来传递。氧化还原酶和电极之间缺乏直接电交流的可以通过活性电荷载体介质的电子传递来实现电接触。电子继电器在电极表面可以被氧化或还原，氧化的或还原的继电器扩散进入酶产生了对于作为电子传递媒介的活性氧化还原中心而言的短电子传递距离，因此，生物催化剂电活化。
检测手段丙酮特异性酶系统，作用于丙酮底物，直接产生了可电化学或非电化学检测的产物或副产物，或酶系统还包括至少一种其他的成分。其他的成分包括利用原始酶催化丙酮反应的产物或副产物形成酶途径的一种或多种其他酶，因此产生光度或电化学可检测的产物或副产物；或至少一种信号介质；或其他酶和信号介质都有。信号介质可以选自，例如，指示剂，如pH变化指示剂；电子转移介质；光度测定介质，以及其他成分。
在本发明的电化学实施例中，在酶促反应的过程中，丙酮特异性氧化还原酶或酶系统选自那些利用了可电化学检测协同因子的，如NADH，或产生了副产物的，如H2O2。这些酶系统可以特异性地检测生物样品中的丙酮，如呼吸或生物流体。然而，丙酮的检测不受限于电化学方法，而且本发明的酶系统可以用于其他类型的设备，例如采用公知的UV、荧光，或测量丙酮特异性酶-底物相互作用的其他合适方法的设备。
非电化学检测手段非电化学检测包括，例如，本领域公知的任何测热的或测定光度的检测方式(例如，任何测热的、光谱测定的、分光光度法的、发光为基础的、化学发光为基础的，或荧光为基础的检测方法。)荧光检测设备具有以下最低要求必须是不透光的以消除环境发出的干扰光，为了防止光褪色其萤石必须保存在暗处(即增加保存寿命)，以及其光学器件必须是90°角放置。二极管发射所期望的激发波长可以起光源的作用，以及PMT可以起检测仪的作用。这些要求不需要阐述，因为萤石的激发和发射的λmax是公知的，而且这些仅仅是对波长的要求。与用于酶电化学设备相同的呼吸收集和丙酮转化仪器可用于荧光设备中。用于黄曲霉毒素的便携式荧光检测仪已经在文献中描述(MACarlson等，用于黄曲霉毒素的自动化手提式生物传感器，Biosens.Bioelectr.14841(2000))，所以存在便携式荧光检测仪的先例。
直接的和间接的荧光对呼吸和体液中的丙酮都能检测。丙酮特异性酶和它们的协同因子可以使用常规的捕集技术将其固定在一次性检测条上。当丙酮通过固定化的介质扩散至酶时，丙酮将发生化学变化。不幸地，丙酮本身不是荧光的，不能在检测设备内部进行衍生。因此需要衍生另一反应物和需要将荧光团或萤石加入系统中来监控检测。对于仲醇脱氢酶系统，可以监控NADH消耗，而丙酮羧化酶系统可以使用ATP-类似物。随着NADH或ATP-类似物被消耗，荧光强度应该减弱。因为丙酮反应是化学计量的，荧光强度与丙酮浓度成比例。H2O2生成系统可以利用H2O2和添加的萤石。在这些系统中，H2O2的产生导致了与丙酮浓度成比例的荧光强度的增强。
我们已经证实用342nm光激发时NADH在pH7.6，100mM磷酸缓冲液中直接发射约为470nm的光；这些数据与文献中报道的相一致(MACarlson等，2000)。此外，NADH直接荧光具有0.1-10μM的线性工作范围，不依赖于pH6-13，每摄氏度强度减弱1.6％，pH低于10时在阳离子和酶存在下，显示稍微改变的荧光强度(参见PW Carr & LD Bowers，分析和临床化学中的固定化酶，在化学分析。关于分析化学及其应用的一系列专题论文(PJ Elving & JD Winefordner，编辑；vol56，p.122(Wiley-Interscience，纽约，1980)，以及其中所包括的参考文献)。利用直接HADH荧光来监控酶活性在若干组中都有描述(AKWillians & JT Hupp，溶胶凝胶包裹乙醇脱氢酶作为多用的、环境稳定的传感器用于乙醇和醛，J.Am.Chem.Soc.1988，1204366；以及VPIordanov等，用于NADH荧光分析的硅薄膜UV滤光器，Sens.Actuat.A，2002，97-98161)。
NADH的间接荧光可以使用染料若丹明123检测。在激发态NADH和若丹明123之间发生了非辐射能量传递(也称为荧光共振能量传递，FRET)。FRET是用于检测两种物质之间接近性的公知技术，即利用FRET作为在体外和体内的“分子衡量标准”。在丙酮特异性酶系统的范围内，供体荧光团，如NADH，将其激发态能量转移至受体荧光团，若丹明123。(RP Haugland，荧光探针和研究产物手册，2002(第9版；MolecularProbes，Inc.；尤金，俄勒冈)；K Van Dyke等编辑。发光生物工艺学。设备和应用，2002(CRC出版社；伯克莱屯，佛罗里达)以及其中所包括的参考文献)。NADH-若丹明123FRET方法已经成功地运用于其他酶试验中(MH Gschwend等，完整的人类肌管中线粒体NADH含量的光学检测，Cell.Mol.Biol.47OL95(2001)；H.Schneckenberger等，在医学诊断和光生物学中的时间闸门显微镜成像和光谱学，Opt.Eng.332600(1994))。生物发光共振能量传递，或BRET，也可以和根据本发明的丙酮特异性酶系统偶联使用。在BRET中，受体荧光团由荧光素酶替代。在底物存在的情况下，荧光素酶的生物发光激发受体荧光团。BRET也已经应用于体外和体内(K Van Dyke等，2002)。
ATP可以用荧光团衍生用于间接荧光。若干可购得的染料包括BODIPY ATP和三硝基苯基ATP(Haugland，2002)。当结合到酶的ATP结合位点时，这些类似物改变其荧光强度或成为荧光团。
H2O2的间接荧光检测已经报道过(Carr & Bowers，1980)。这些方法利用将过氧化物还原成H2O以及自身被氧化的染料。高香草酸(4-羟基-3-苯乙酸)和p-羟基苯乙酸最常用于临床化学(Carr & Bowers，1980)。可购得的试剂盒使用了Amplex红来荧光检测H2O2(Haugland，2002)。
任何荧光染料和荧光可检测的酶底物或协同因子类似物可以用于荧光设备中来检测呼吸或体液中的丙酮。
化学发光(CL)和电解制备的化学发光(ECL)(在此都称作“(E)CL”)广泛地用于医学诊断和分析化学(C Dodeigne等，化学发光作为诊断工具回顾，Talanta 2000，51415；KA Fahnrich等，电解制备的化学发光在化学分析中的最新应用，Talanta 2001，54531)。基于酶的(E)CL系统是灵敏的和特异性的，许多CL系统通过酶循环来检测H2O2(Dodeigne等，2000)。(E)CL可以在很大的线性范围内检测皮摩尔(pM；10-12M)浓度的分析物(Dodeigne等，2000，Fahnrich等，2001)。(E)CL设备可以根据以下的原理来构造。因为反应自身发射光，(E)CL设备不需要光源。光电倍增管(PTM)可以起检测器的作用；(E)CL是暗适应的肉眼可见的。电池可以作为ECL的电源。ECL需要电极和应用电压的来源。如荧光检测设备，(E)CL设备需要是不透光的以及其反应物需要避光保存直至使用。还有如荧光，(E)CL需要衍生的反应物或另外的酶以及测量丙酮的试剂。(E)CL设备可以和一次性检测条一起使用(BD Leca等，丝网印刷电极作为一次性的或可重复利用的光学设备用于氨基苯二酰肼的电致化学发光，Sens.Actuat.B.2001，74190)，以及可以小型化(Y Lv等，使用载体气流的基于微型反应器的化学发光生物传感器芯片用于人尿中尿酸的检测，Analyst 2002，1271176)。
光学电极(或光电极)可以使用根据本发明的丙酮特异性酶系统来制造。例如，可以使用光电极，如使用了ECL的用于葡萄糖的光电极(参见CH Wang等，聚合的氨基苯二酰肼，铁(II)tris(5-氨基邻二氮杂菲)和电极表面的葡萄糖氧化酶的共固定化，以及其作为葡萄糖光电极的应用，Analyst 2002，1271507))。
最常用的CL系统涉及H2O2或其他活性氧物质的检测(Carr & Bowers，1980；Haugland，2002；Dodeigne等，2000；K Van Dyke等，2002，以及其中包括的参考文献)。典型的系统是氨基苯二酰肼-过氧化物酶。在基础溶液中，H2O2氧化氨基苯二酰肼成激发态的氨基邻苯二甲酸盐离子；激发态的氨基邻苯二甲酸盐离子发射425nm光子回到其基态。当用于医学诊断时，该反应用辣根过氧物酶(HRP)催化(Carr & Browers，1980；Dodeigne等，2000)。因此任何产生H2O2或需要可以和另外的试剂反应生成H2O2的协同因子的酶系统可以用于CL设备。在此所描述的H2O2产生系统可以直接使用氨基苯二酰肼-HRP用于丙酮检测。这些酶循环运行，随着时间过去增加了光发射，因为底物是连续循环的(Dodeigne等，2000)。由于氨基苯二酰肼本身是经常用于CL，为了提高灵敏度，其改进的类似物也可用于根据本发明的CL基底的检测仪，替代氨基苯二酰肼。这样的类似物实例是那些在Carr & Browers，1980；Dodeigne等，2000中描述的。
使用CL的NADH检测是常用技术(Dodeigne等，2000)。例如，在1-甲氧基-5-甲硫酸-甲基吩嗪嗡存在下，使用氨基苯二酰肼-过氧化物酶系统，NADH将O2还原成H2O2，其产生了光(Dodeigne等，2000)。对于丙酮监测仪，使用这种系统，周围气体中的O2是足够测量丙酮的。NADH还可以和氧化的亚甲基蓝反应形成和氨基苯二酰肼反应的H2O2(Carr & Browers，1980)。NADH还可以作为CL猝灭剂。在NADH和HRP存在下，底物ALPDO的荧光强度减弱(Van Dyke等，2002)。NADH还可以和Ru(bpy)32+一起用于ECL(ES Jin等，用于NADH的电致化学发光成像纤维电极化学传感器，Electroanal，2001，13(15)1287)。若丹明B异硫氰酸盐也可以用于ECL的H2O2检测(Fahnrich等，2001)。ECL还具有另外一个优势，通过使用合适的抗氧化还原的电极，电活化粒种可以在电极表面再生。再生可以保存反应物以及使传感器经久耐用和/或“无试剂”。所有这些酶系统可以用于和根据本发明的丙酮特异性酶系统连接的(E)CL设备。
CL可以广泛地用于简单而灵敏地量化ATP(Carr & Browers，1980)。荧光素酶催化ATP和荧光素反应产生激发态的氧化荧光素，其通过发射562nm光子恢复到基态(Carr & Browers，1980；Haugland，2002)。该反应的量子产量非常高；可以检测10-14mol的ATP。用于该反应的试剂盒可购得的(Haugland，2002)。因为荧光素酶是引起萤火虫“发光”的酶，因此该反应归为生物发光。天然的和重组的荧光素酶都是可购得的，一些研究小组已经报道使用生物发光ATP试验来量化生物分析物(P Willemsen等，特异的生物发光细胞系用于检测动物肉中产生的甾类激素促效药的用途(蚂蚁)，Anal.Chem.Acta2002，473119；S JDexter等，生物发光ATP试验来定量混合种群中哺乳动物和细菌细胞数量的发展，Biomat.2003，24nb27)。除了氨基苯二酰肼-HRP系统，H2O2还可以使用过氧草酸衍生物来检测(Dodeigne等，2000)。H2O2还可以用铁氰化物作为催化剂的CL非酶促检测(Dodeigne等，2000)。在这些(E)CL系统中，在此所描述的丙酮特异性酶可以产生H2O2或需要可以被利用生成H2O2的协同因子。
光学生物传感器使用光度检测(即，吸收值，荧光)通过并入传感器的酶系统催化反应所消耗的底物或形成的产物。所描述的丙酮特异性酶反应可以通过若干光度方法来监控，即通过测量对于嘧啶核苷酸依赖性酶在340nm的NAD(P)H吸收值或对于H2O2生成酶系统的醌亚胺染料的吸收值。对于后者，通过添加过氧化物酶催化伴随染料化合物氧化的H2O2还原，在特定的波长氧化吸收，可以检测H2O2。过氧化物酶(例如，可购得的辣根过氧化物酶)通常具有宽的底物特异性，因此可以使用多种不同的电子供体化合物。可以通过荧光检测来测定NAD(P)H的消耗(在305nm激发，450nm发射)。
热量测定法可以作为检测手段用于根据本发明的丙酮特异性传感器。化学反应通常是放热或吸热的；即当它们发生时释放或吸收热。热量计通过测量反应介质温度的变化来检测和测量这种热(KRammanathan & B Danielsson，热生物传感器的原理和应用，BiosensBioelectr.16417，(2001)；B Danielsson，酶热敏电阻设备。在生物传感器原理和应用。Vol.15，pp.83-105，LJ Blim & PR Coulet编辑；生物工艺技术系列，15卷；Marcel Dekker，Inc纽约，1991，pp.83-105，以及其中所包括的参考文献)。因此，丙酮特异性酶或酶系统的作用可以用通过热量监测。已经设计了对检测蛋白质构象变化足够灵敏的热量计，以及热量测定法已经用于详细地研究许多酶促反应(M.J.Todd & JGomez，使用热量测定法的酶动力学测定用于酶活性的常规试验？Anal.Biochem.2001，296179(2001))。
热量测定法的主要优势是不需要分析所需要的衍生作用(Danielesson，1991)。因为大多数反应涉及热交换，以及这种热是可检测的，不需要发色团、荧光团、发光团、“介质”，或其他分析物的修饰。试剂和分析物可以“按原样”使用。这就能够分析缺少发色团或荧光团，和/或，衍生或结合电活化粒种困难或不可能的反应。
小型化的或基于芯片的热传感器已经在文献中报道(Ramanathan & Danieleeon，2001；B Xie & B Danielsson，在硅芯片上制造的热微型生物传感器的发展。Sens.Actuat.B 6127(1992)；PBataillard等，集成的硅热电堆作为生物传感器用于葡萄糖、尿素，和青霉素的热监控。Biosen.Bioelect.889(1993))。这些设备的范围从独立式膜上完全排列的热电堆到造在硅/玻璃微通道上的成组热电堆。这些设备已经用于检测特异的，单一的酶促反应(Danielsson，1991；Xie & Danielsson，1992；Bataillard等，1993)。此外，已经报道了用于葡萄糖的两组热传感器(B Xie等，用测热的微型生物传感器进行全血糖的快速检测，Sens.Actuat.B 15-16141(1993)；MJMuehlbauer等，热电酶葡萄糖传感器的模型，Anal.Chem.6177(1989)；BC Towe & EJ Guibeau，医学设备设计，1998，http//lsvl.la.asu.edu/asubiotech/slideshow/slide19.html(2002年1月访问)。使用常规热量计的初步实验表明了仲醇脱氢酶丙酮反应是放热的(数据未显示)。
对于在此描述的丙酮监测仪，丙酮特异性酶及其协同因子可以通过常规捕集方法将其固定在热电堆上。对于热量测定法，和酶以及反应物结合的电化学检测、电化学介质，以及“光学的”介质(发光团)是不需要的。反应包括不需要修饰或衍生可以直接监测丙酮。当呼吸或流体样品中丙酮通过固定化介质散发和酶接触时，丙酮将发生化学变化。该反应将产生或吸收热，导致温度变化。该温度和参照热电堆的温度相比可以量化该热量；测量是有差别的。释放或吸收的热量与分析物的浓度成比例。
对于呼吸收集，将丙酮从气态转化为液态，即，凝聚，是放热的。参照或双热电堆可以补偿这个热量。因此酶测热丙酮监测仪可以使用如酶电化学丙酮监测仪的相同呼吸收集装置除了额外的双热电堆。
完整的酶测热设备需要足够的绝缘以防止和周围的环境热交换。除了电化学检测，该设备的其他方面，如酶稳定性、特异性、设备轻便性等等，与此文件中所描述的酶电化学设备是相同的。
因此，根据本发明的用于生物传感器中得到信号转导的有用方法不仅包括电化学(测量电流的或测定电势的)，而且包括光学的或光度的(包括热量测定法、荧光为基础的技术，或化学发光为基础的技术)，以及测热的方法，所有这些可应用于丙酮传感器信号转导。
因此，尽管已经在此详细地描述和举例说明了电化学检测方式，本发明的酶系统不受限于用于使用了电化学检测策略的生物传感器中。其他检测策略可以合适地并入对于生物样品中的丙酮是特异性的生物传感器中。光度试验，如可以使用反应溶液中吸收光数量随着时间改变的试验。同样，荧光改变或样品浊度改变的试验也可用于测量丙酮特异性酶-底物反应。如下文所描述的光度试验。Bergmeyer已经描述了H2O2的氧化还原电位和辅酶测热的/测光度的检测。John在“光度试验”中已经对用于酶活性的光度试验进行了概述。Hart等1999年在电分析上公开的文献中披露了NADH消耗测量电极。Vanysek概述了氧化还原电势，以及Voet & Voet披露了适合用于生化应用的各种化合物的氧化还原电势。
使用S-ADH偶联丙氨酸脱氢酶的酶系统成功地用分光光度监测NADH生成。此外，因为反应还产生了铵离子，用于NH4+的光学传感器可以作为检测手段用于这样的酶系统。TD Rhines和MA Arnold描述了这样的一种光学手段，基于检测氨气的用于尿素的纤维-光学生物传感器，Anal Chem.Acta，1989，227387；若干基于酶的测量电流的NH4+传感器是可购得的。对于丙酮检测，氨的产生可以与如上的仲醇脱氢酶系统偶联；然后氨浓度与丙酮浓度成比例。另外一种偶联丙酮与氨产生的酶反应式如下
第二个反应式可以用于光学地或电流地测量丙酮。此外，NADH是再循环的。同样，丙酮羧化酶偶联谷氨酸脱氢酶的酶系统产生NH4+，因此可以光学地或电流地检测，以及与丙酮浓度相关联。
电化学检测手段电流生物传感器通过酶促产生或消耗氧化还原活性化合物在两个电极之间产生电流来工作。已经描述了电流丙酮生物传感器反应式的若干实例，其中对丙酮存在的酶催化消耗或产生NAD(P)H或H2O2。在转换器是H2O2的实例中，一种通过电流监控反应的可替代手段需要使用Clark型氧电极并检测O2浓度下降。例如，在仲醇脱氢酶(S-ADH)偶联H2O2生成的情况下，酶系统催化下列反应
然后在阴极氧被还原/消耗，产生电极和主体溶液(bulk solution)之间浓度梯度。电化学反应的速度依赖于溶液中氧的浓度。
电势生物传感器使用了离子特异性电极，其中所测的酶反应过程中释放或消耗离子(例如，H+、CN-、NH4+)(1、2、3)。例如，可以使用用于测量丙酮浓度的电势传感器，其中NH4+生成与由S-ADH和丙氨酸脱氢酶催化的反应偶联，如下所示
(已经得到该系统的光度数据来证实其用于丙酮特异性信号转导的实用性参见以下“结果”部分的讨论)。
一个可以利用丙酮羧化酶的非常相似的系统(“β-OH-butyratedehydr.”即“β-羟基丁酸盐脱氢酶”)
可以使用的电化学生物传感器的另一类型是光可寻址的电势传感器。在这样设备的一个实例中，丙酮特异性酶系统可以用于(如，将其固定在表面)所述的电势传感方式，用于感知葡萄糖，在A Seki等，用于尿素、青霉素和葡萄糖的基于光可寻址的电势传感器的生物传感器，Anal.Chem.Acta373(1)9-13(1998年11月2日)。
在设计根据本发明的丙酮特异性生物传感器中，可以使用各种酶促副产物和/或因子用于产生电化学信号。一组包括有机协同因子，如NAD、NADH、NADP、NADPH、FAD、FADH、FMN、FMNH、辅酶A、辅酶Q、TTQ(色氨酸色氨酰醌)以及PQQ(吡咯并喹啉醌)。例如，PQQ依赖性脱氢酶可以氧化异丙醇。该反应的电子可以通过PQQ传递，其被还原，在电极被氧化或通过中介的酶。也可以使用其他维生素。
本发明中有用的酶促反应副产物包括过氧化氢和铵。
高能分子也可以用于本发明，偶联丙酮代谢产生电化学测量信号，包括ATP、ADP、AMP、GTP、GDP以及GMP。这些分子或磷酸盐都不能直接检测，但是可以通过偶联酶系统产生的氧化还原副产物来检测。
这些副产物、协同因子以及高能分子还可以通过上述的非电化学手段来检测。
信号介质电子传递介质是氧化还原可逆的物质，可以用于酶催化反应中的(即从或到)电极电势表面和有机物质(如协同因子)之间的电子传递。电子传递介质的实例包括二茂铁及衍生物、铁氰化物、对苯二酚、苯醌以衍生物、2，6-二氯靛酚、亚甲基蓝、苯二胺及衍生物、吩恶嗪及衍生物(例如，Meldola蓝，即8-二甲氨基-2，3-苯并吩恶嗪)，以及吩嗪烷基硫酸盐(例如，吩嗪甲基硫酸盐、吩嗪乙基硫酸盐)。在所给的实施例中，可以使用电子传递介质中的一种或一种以上物质。
电子传递介质可以用于提高所给酶偶联电极系统中电子传递的动力学，因为有机协同因子可以轻易地削弱检测仪的功能。这种削弱是由于在有机物质和电极电势表面之间单独地传递多电子产生自由基而导致的。这些自由基然后在电势表面呈现二聚体和/或多聚体形式，污浊了电极的表面，因此抑制了有效的电子传递。可以使用电子传递介质来避免这种电极的污浊。电子传递介质可以用于期望电极电压变换的情况中，例如，用于没有这种介质的反应系统的优选电压恰好在该电势下产生了太多电子干扰“噪声”。可以加入电子传递介质为了使所使用的电压移位至不同的电压范围，在其发生较少的噪声。可用于固定化酶，如葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶等等，的扩散电子传递介质实例在Willner和Katz的表5中列出。
多电子传递中用于其还原形式，例如，NADH、NADPH、FADH、FMNH、辅酶Q、PQQ，的优选介质包括，例如二茂铁及衍生物铁氰化物、对苯二酚、苯醌以衍生物、2，6-二氯靛酚、亚甲基蓝、苯二胺及衍生物、吩恶嗪及衍生物(例如，Meldola蓝，即8-二甲氨基-2，3-苯并吩恶嗪)，以及吩嗪烷基硫酸盐(例如，吩嗪甲基硫酸盐、吩嗪乙基硫酸盐)。
可以用于产生电化学信号的第二组介质因子包括有机协同因子，例如Pt、Os、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Mo，以及W(参见Holm等，生物学中金属位点的特征，Chem.Rev.1996.96，p.2239-2314)。一些有用的酶含有血红素中心，因此含有铁(例如，细胞色素P450单加氧酶)。其他有用的是胺氧化酶，其中含有Cu。
在可替换的实施例中，为了和酶促反应产生的产物或副产物发生反应，可以将“光度介质”加入酶系统，然后产生可以，例如，光度、比色、荧光，或(UV或IR)光谱检测的衍生物。因此，添加这样的“光度介质”可以使酶反应结果的转换可以表征，即产物或副产物至光度信号。例如，在酶促催化的氧化还原反应中，显色的氧化还原指示剂如，例如，四唑盐，可以用作光度指示剂。许多这样显色的氧化还原指示剂是本领域公知的。四唑盐的实例包括，但不限制于，3-(4，5-二甲噻唑-2-某基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT溴化物)；3-(4，5-二甲噻唑-2-某基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐(MTS；可从Promega Corp.，购得，麦迪逊，威斯康星)；以及 (5-氰基-2，3-二甲苯基四唑氯化物)(CTC)。这样的光度介质可用于，例如，将电子传递介质的氧化还原“信号”转移至光度检测信号。
酶系统的酶和其他成分可以固定于安置于电极上的凝胶层中。任何各种本领域公知的凝胶可用于电极上生物制剂的固定化。例如，如PCT/US02/16140中所述的方法(2002年5月21日申请)可以用于将丙酮特异性酶系统中的生物制剂固定于电极上的聚氨酯水凝胶中。
酶检测和多酶系统除了监控样品中的丙酮本身，具有用于检测特定生物样品中多底物的多于一种酶系统的丙酮特异性酶系统可以用于生物传感器。例如，连接丙酮特异性酶系统的电极可以使乙醇检测仪中出来的丙酮信号减少。这样的设置可以安置在矩阵中，其中至少两种不同检测方式或至少两种不同检测仪可以用于检测乙醇和丙酮。这样的阵列对于校正乙醇呼气测醉器分析中的丙酮干扰是有用的。
荧光检测同样可以使用阵列来完成。荧光传感器阵列已经在文献中描述。它们已经可以用于复杂样品如葡萄酒香味、香料，以及基因。荧光传感器排列使用共价连接至光学纤维远极面上孔中聚苯乙烯小珠的荧光或发色染料或底物(D.R.Walt，成像光学传感器排列。Curr.Opin.Chem.Biol.6689(2002))。高密度光学排列可以包括若干类型的用于不同分析物的染料或底物。排列分别地暴露于每个可能的成分，然后至样品。使用模式识别来推断样品的组成。在呼吸或体液组分中，可以将丙酮特异性酶，协同因子，以及显色或荧光染料共价连接至小珠一个部分，而对其他分析物具有特异性的酶，如乙醇，可以连接至其他小珠。每个小珠将“点燃”暴露于其目标分析物。
基于酶的荧光或显色排列从未应用于丙酮的检测。
丙酮特异性酶传感器的用途对于监控的有效性和患者对体重减轻膳食的适应性，呼吸丙酮监控是一种有用的工具。酮病可以通过锻炼和膳食选择来控制，甚至在两种相等能量平衡的膳食中。在呼吸中丙酮水平中反馈膳食和锻炼选择的反应时间在2-3小时，是比尿酮分析更好的脂肪减少指标。
家用丙酮诊断生物传感器对于帮助患者控制1型和2型糖尿病是有效的。尤其是1型糖尿病中，这样的生物传感器能使患者监控体重减轻，检测酮酸中毒发作的信号，以及控制相对于胰岛素利用的糖摄入。如果患者每日可以通过国际互联网与健康护理专家及同年龄人共享丙酮测定值和周支持小组会议，指标显示可以提高体重减轻的成功率。使用本发明的丙酮特异性检测系统不受限于控制肥胖和糖尿病。可以预期的是在此所描述的丙酮特异性生物传感器对于控制任何病理学指标是丙酮产量的疾病都是有效的。
此外，丙酮特异性酶系统被证实是监控患者对指定治疗方案的适应性的高效手段，用乙酰乙酸盐或其衍生物标记的药物。乙酰乙酸盐降解为丙酮可以通过包括本发明的丙酮特异性酶系统的生物传感器来测定，因此提高了健康护理专家对于追踪相应标记药物的剂量和生物利用率的能力。
实施例利用这些系统的丙酮特异性酶系统和丙酮传感器已经得到发展。在下文优选实施例中描述了酶鉴定和/或纯化、酶表征和选择，酶-加-协同因子系统、多酶-加-协同因子系统、提供了线性(按化学计量)丙酮检测的偶联酶系统，提供了放大(例如，指数)丙酮检测的偶联酶系统、酶和酶系统稳定性测试、丙酮蒸汽到液体转化的研究，以及利用这样系统传感器的酶介质丙酮传感器设备(电化学和非电化学设备)。这些实施例提供了例证但不是限制本发明。以下描述了在基于酶的电化学和非电化学传感器中使用了丙酮特异性酶系统的优选实施例。
材料和方法材料。从自养黄色杆菌Py2菌株获得的丙酮羧化酶和在异丙醇中生长的自养黄色杆菌Py2菌株细胞团从Scott A.Ensign教授处获得，犹他州大学，洛根，犹他州。从荚膜红细菌B10(ATCC33303)获得的丙酮羧化酶、在丙酮中生长的荚膜红细菌B10细胞团、在丙醇中生长的母牛分枝杆菌JOB5(ATCC29678)无细胞提取物，以及在丙醇中生长的胭脂红分枝杆菌B276(ATCC31338)细胞团也从Ensign教授处获得，所有这些细菌菌株是公众可得的。从自养黄色杆菌Py2菌株和在异丙醇中生长的自养黄色杆菌Py2菌株获得的仲醇脱氢酶从细胞团中分离；典型的、公众可得的仲醇脱氢酶如表1所示。丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)、肌激酶(EC 2.7.4.3)、丙酮酸氧化酶(EC 1.2.3.3)、辣根过氧化物酶(EC 1.11.1.7)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.28)、苹果酸酶(EC 1.1.1.40)、乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.2)、丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.1)、乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)、乙醇氧化酶(EC 1.1.3.13)，以及β-羟基丁酸盐脱氢酶(EC 1.1.1.30)从Sigma购得(圣路易，密苏里)。所有其他所用的化学制品和试剂是分析纯的。所有溶液在18MΩ水中制备(Millipore)。
表1公众可得的一些S-ADH酶的信息


利用丙酮、异丙醇以及丙醇微生物的富集和分离。
富集培养物在用丁基橡胶塞子卷曲密封的160Ml血清瓶中进行。瓶中含有10mL矿物盐培养基包括(g/L)NaNH4HPO4(1.74)；NaH2PO4×H2O(0.54)；KCl(0.04)；MgSO4×7H2O(0.2)以及1ml/L微量元素母液(母液g/LFeCl2×4H2O(5.4)；MnCl2×4H2O(1.0)；ZnSO4×7H2O(1.45)；CuSO4×5H2O(0.25)；浓HCl(13ML/L)；(NH4)6Mo7O24×4H2O(0.1)；H3BO3(0.1)；CoCl2×6H2O(0.19))。将培养液的pH调至7.2。利用丙醇微生物的富集用从当地表土供应商购买的约0.5克土培植，或用约0.5克从当地超级市场购买的无菌制陶土或有机堆肥。
20％(v/v)浓度的气态丙醇用注射器加入血清瓶的预留空间。利用丙酮和异丙醇的微生物的富集用同样的方法进行，除了将底物加入1M母液变为终浓度为25mM丙酮，或10mM异丙醇。富集培养物在振荡器上28℃培养。为了分离单个菌落，富集培养物在含有1.5％w/v琼脂的矿物盐培养基(如上所述)中培养(以下称为“矿物盐琼脂”)在不同的装置中，可以在CO2捕集器存在下生长的丙酮利用微生物开始富集培养物。将20mL矿物盐培养基和微量元素(参见上面)装入250mL带障板的锥形烧瓶中。锥形烧瓶用已经修改成能抓住玻璃瓶的橡胶塞塞住。玻璃瓶中含有约0.5mL50％(w/v)KOH。KOH从锥形烧瓶预留空间捕获CO2。这些装置设计用来富集丙酮利用和涉及丙酮羧化酶依赖性途径的微生物。富集培养物在振荡器上28℃培养。
浊度显示细菌生长两到三倍后将富集培养物转移(通常3至5天后)。为了分离单个菌落，将富集培养物涂布在矿物盐琼脂平板上。为了分离利用丙醇的细菌，将琼脂平板放入3.5L的厌氧瓶中。将丙醇加入瓶中直至瓶内的正压达到0.3-0.5巴。然后将瓶放入振荡器28℃培养。为了丙酮利用微生物的分离，将琼脂平板放入1.4L的干燥器中。该干燥器包括两个开口的细颈瓶，每个含有3-4mL纯丙酮。在将其放入28℃培养箱之前，干燥器用若干层PARAFILM(蜡基的密封薄膜，从American National Can获得，芝加哥伊利诺斯)密封。为了可以在CO2捕集器存在下生长的丙酮利用微生物的分离，将琼脂平板放入如上所述的干燥器中。细颈瓶中除了丙酮，将还含有50％KOH(约4Ml)的细颈瓶放入干燥器。另外，为了分离利用丙酮和异丙醇的细菌，将富集培养物转移至含有加了丙酮或异丙醇的矿物盐培养基的琼脂平板。将添加的丙酮或异丙醇加在放入培养皿的小泡沫塞上。培养皿用若干层parafilm密封来减少培养过程中底物的蒸发。
5至10天后琼脂平板上可观察到菌落。将分离物转移至新鲜的琼脂平板以及如上所述的培养。分离的菌株也可以在营养琼脂上划线培养来检查纯度。在琼脂平板上若干次转移之后，分离到31个菌株以及通过菌落形态学鉴定是不同的。从丙醇富集物中分离到8个菌株(在此命名为TDCC Prop 1-8)，从异丙醇富集物中分离到8个菌株(在此命名为TDCC IP 1-8)，以及从丙酮富集物中分离到15个菌株(在此命名为TDCC Ac 1-8)。这些没有一个是从丙酮加KOH捕获富集物得到的。筛选分离物以及培养依赖丙酮、丙醇，或异丙醇生长的收集菌株。
依赖丙酮、丙醇，或异丙醇生长的分离物和收集菌株的筛选在含有5mL添加了0.005％(w/v)酵母提取物的上述培养基的60mL血清细颈瓶中进行。培养基从单个菌落培养。将异丙醇加入形成终浓度为8mM的母液。有底物的培养物与没有底物(培养基空白实验)的培养物相比显示了更高的浊度认为是采样。然后筛选采样得到如上所述的在CO2捕集器存在下依赖丙酮生长的。
分离物/菌株的培养、收集，以及无细胞提取物的制备。
为了仲醇脱氢酶的初始纯化以及无细胞提取物的实验，培养较大批量的若干异丙醇利用菌株。胭脂红分枝杆菌B276菌株(ATCC31338)(之前为珊瑚诺卡氏菌B276)以及TDCC IP-1菌株(以及两个其他的菌株数据未显示)，在2500mL批量的添加了0.005％酵母提取物的天然盐培养基中培养。初始加入异丙醇(8Mm)作为碳源和能源。培养物在振荡器(200rpm)上30℃培养。然后通过600nm下的光密度来监控随后的生长。在由于缺乏底物生长速率降低时的若干时间点，将更多的异丙醇加入。总共加入培养物的异丙醇约为96mM。在对数生长期结束时，通过在4℃离心将细胞沉淀(GSA rotor，8,500rpm，20min.)。细胞用50mM Tris-HCl缓冲液洗涤一次，pH7.5。将细胞球称重，用少量的TRIS(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)缓冲液重悬(约2mL每克细胞(湿重))。细胞在-20℃下冰冻直至进一步使用。为了无细胞提取物的制备，将细胞解冻，通过超声波破碎(4×20s，脉冲，50％强度)。细胞碎片和没破碎的细胞通过离心沉淀，5分钟，14,000rpm(在Eppendorf benchtop centrifuge中进行，Model5417C，Brinkmann，Instruments，Inc.，Westbury，NY)。可替换的是，为了更大量的准备，将细胞悬浮液三次通过小型-Frech压力池，20,000psi(137，895.2kPa)，溶解产物通过在4℃以6,000×g离心40min来净化。
蛋白质纯化从自养黄色杆菌Py2菌株中获得的丙酮羧化酶和从荚膜红细菌获得的丙酮羧化酶如之前所述进行纯化。从自养黄色杆菌Py2菌株中获得的仲醇脱氢酶(S-ADH)通过下列的程序纯化。如上所述的制备依赖异丙醇生长的自养黄色杆菌Py2(150克)的无细胞提取物(380mL)，应用5×15cm DEAE-琼脂糖凝胶柱(二乙氨基乙基交叉链接琼脂糖球材料；目录编号17-0709-10，Amersham Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韦，新泽西)在A缓冲液(25mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)，pH7.6，5％丙三醇，1mM二硫苏糖醇)中高速流动平衡，流速为10mL/min。填料以后，用1000mL缓冲液A洗涤柱子，在2400mL缓冲液A中形成90-290mM KCl线性梯度。收集含有S-ADH活性的馏分，用2L含有5％丙三醇的25mM磷酸钾(pH6.2)(缓冲液B)在4℃下透析16小时。然后将蛋白质用RED SEPHAROSE CL-6B(Procion Red HE-3B染料连接的，交叉链接琼脂糖球材料，用于亲和色谱仪的亲和基质；产品目录号17-0528-01，Amersham Pharmacia Biotech)柱(1.5×10cm)，在B缓冲液中平衡，流速为2mL/min。用30mL缓冲液B洗涤柱子后，用20mL含有10mM NAD+的缓冲液A洗脱S-ADH。然后将含有S-ADH的馏分用2L缓冲液A在4℃下透析16小时，通过超滤浓缩(使用YM30超滤膜；产品目录号13722，从Millipore购得，贝德福德，马萨诸塞)，用液氮冷冻。从细菌筛选培养物中部分纯化的S-ADH如下制备如上所述制备1至5克细胞团的无细胞提取物，然后用5mL HI TRAP Q柱(四，四乙铵，使用阴离子交换基质的交叉链接琼脂糖球材料；产品目录号17-1 153-01，Amersham Pharmacia Biotech)，在100mM MOPS中平衡，pH7.6，含有5％(v/v)丙三醇(缓冲液C)。用10mL缓冲液C洗涤柱子，在100mL缓冲液C中形成0-100mM NaCl线性梯度。收集含有S-ADH活性的馏分，使用30kDa MWCO(“分子量截留”)离心膜(目录编号UFV4BTK25，Millipore)浓缩至0.5Ml，-80℃保存。
实施例1与NADH氧化偶联的丙酮羧化酶的分光光度检测在2mL(1cm路径长度)玻璃管中进行检测，该管已经被融化改造成血清瓶式玻璃上部(开口处为7×13mm)，使该管可以用红色的血清瓶的橡胶塞子密封。在pH7.6总体积1mL的反应混合物中含有ATP(10mM)、氯化镁(11mM)、醋酸钾(80mM)、MOPS(100mM)、CO2(将50mM(1mol CO2(g)加入到4mol的碳酸氢钾来维持pH)和20-40μg纯化的丙酮羧化酶。加入β-羟基丁酸脱氢酶(3U)和NADH(0.2mM)使乙酰乙酸形成与NADH氧化偶联。检测时，在30℃下预培养除了丙酮之外的所有检测成分的试样2min。加入丙酮(2mM)来起始检测。30℃下在具有自动控温的细胞固定器的Agilent Technologies(Palo Alto，CA)的型号8453UV可视分光系统中通过测定340nm下吸收值的逐步下降来监控反应(NADH的ε340为6.22mM-1.cm-1)。
与过氧化氢生成偶联的丙酮羧化酶的分光光度检测在2mL(1cm路径长度)玻璃管中进行检测，pH7.5的1mL总体积中含有ATP(0.1mM)、硫酸镁(10mM)、醋酸钾(80mM)、磷酸钾(50mM)、CO2(将50mM(1mol CO2(g)加入到4mol的碳酸氢钾来维持pH)、40μg纯化的丙酮羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸盐(2mM)、丙酮酸激酶(20U)、肌激酶(15U)、丙酮酸氧化酶(2U)、过氧化物酶(15U)、黄素腺嘌呤二核苷酸(0.01mM)、脱羧辅酶(0.2mM)、4-氨基安替比林(0.5mM)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(0.02％w/v)。偶联的酶或试剂(即磷酸烯醇丙酮酸盐、丙酮酸激酶、肌激酶、丙酮酸氧化酶、黄素腺嘌呤二核苷酸和脱羧辅酶)使ATP水解与H2O2形成(丙酮酸氧化)偶联。加入过氧化物酶、4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺，30℃下、以550nm(醌亚胺染色产物的ε550为36.88mM-1·cm-1)持续地分光光度监控自动控温的细胞固定器中H2O2的形成。分析时，在30℃下预培养除了丙酮之外的所有检测成分的试样2min。加入丙酮(5mM)来起始检测。
实施例2仲醇脱氢酶NADH氧化的分光光度检测30℃下、在2mL(1cm路径长度)玻璃管中进行检测，在pH6.2(酮还原检测)或pH7.8(醇氧化检测)的1mL反应体积中含有NAD(H)(0.2mM)、磷酸钾缓冲液(25mM)和酶源(无细胞提取物、柱馏分、或纯化的酶)。在30℃下预培养除了底物之外的所有检测成分的试样1.5min。通过加入底物(2.5mM)来起始检测并通过测定340nm(NADH的ε340为6.22mM-1.cm-1)的吸收值的变化来持续监控。
与H2O2生成偶联的仲醇脱氢酶的分光光度检测在2mL(1cm路径长度)玻璃管中进行检测，在pH6.2的1mL总体积中含有磷酸钾(50mM)、1.5μg纯化S-ADH、NADH(50μM)、乳酸盐(10mM)、乳酸脱氢酶(20U)、丙酮酸氧化酶(2U)、黄素腺嘌呤二核苷酸(0.01mM)、脱羧辅酶(0.2mM)、4-氨基安替比林(0.5mM)、和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(0.02％w/v)。偶联的酶或试剂(即乳酸盐、乳酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、黄素腺嘌呤二核苷酸、脱羧辅酶)使NADH氧化与H2O2形成(丙酮酸氧化)偶联。在一些检测中(其中特异地)，用丙氨酸(10mM)和丙氨酸脱氢酶(2U)替代乳酸盐和乳酸脱氢酶。如上所述，在30℃、550nm下(醌亚胺染色产物的ε550为36.88mM-1.cm-1)持续地分光光度监控自动控温的细胞固定器中的反应。检测时，在30℃下预培养除了丙酮之外的所有检测成分的试样2min。加入丙酮(2.5mM)来起始检测。
伯醇脱氢酶与伯醇氧化酶偶联的底物再循环检测在2mL(1cm路径长度)玻璃管中进行检测，在pH6.2的1mL总体积中含有磷酸钾(25mM)、乙醇脱氢酶(1U)、NADH(100μM)、乙醇氧化酶(2U)、过氧化物酶(15U)、4-氨基安替比林(0.5mM)、和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺(0.02％w/v)。如上所述，30℃时、在550nm下(醌亚胺染色产物的ε550为36.88mM-1.cm-1)或者在340nm下(NADH的ε340为6.22mM-1.cm-1)持续地分光光度监控自动控温的细胞固定器中的反应。在30℃下预培养除了乙醇之外的所有检测成分的试样2min。加入乙醇(50μM或5μM)来起始检测。
稳定性分析将足量的用于各个活性检测的酶(如，1.5μg S-ADH)等分到具有特定浓度添加剂(如缓冲液(25mM MOPS，pH7.6)中的海藻糖(10％w/v))的1.5mL微型离心机的离心管中，并在-80℃下冻存1h。然后将样本放入柜式冷冻干燥机(Virtis model Advantage ES)中，在-50℃下(柜内温度)放置16h，然后升高到20℃4h。取出冷冻干燥的样本，使其在室温下(17-24℃)放置一段时间。在特定时间点，重新用水溶解样本并如上所述进行检测。
蛋白质表征在用12％T、2.7％C的凝胶Laemmli处理(Laemmli，U.K.自然，227680-685(1970))之后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。“T％”表示所有单体重量百分比，是对所有单体浓度的测定，用％T＝100×((丙烯酰胺克数)+(交联剂克数))/凝胶总体积(mL)计算得到；“％C”表示交联剂的重量百分比，用％C＝100×(交联剂克数)/((丙烯酰胺克数)+(交联剂克数))计算得到；所用交联剂是N，N’-亚甲基双丙烯酰胺。通过库马西兰(PhastGel Blue R，产品目录号17-0518-01，Amersham Pharmmacia Biotech)染色来显示电泳得到的蛋白。通过与标准蛋白的Rf值比较来确定基于SDS-PAGE迁移的多肽表观分子量。由Commonwealth Biotechnologies有限公司(Richmond，VA)进行N末端测序。通过改进的双缩脲检测(V.J.Chromy等，临床化学，201362-63(1974))，以δ-球蛋白作为标准来确定蛋白质浓度。
如下进行富集S-ADH的质谱分析和生成肽氨基酸序列。通过高溶解性的双向凝胶电泳表征S-ADH的可溶性蛋白质。蛋白质(30μg)溶解在再水合样本缓冲液中进行等电聚焦(IEF)分析，该缓冲液中由5M尿素、2M硫脲、2％(w/v)CHAPS(3-[(3-胆碱胺基丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐)，2％(w/v)SB3-10(2-癸基二甲氨基)丙磺酸盐)、40mM TRIS、2mM三丁基磷(使用前加入再水合溶液中)和0.2％Bio-Lyte3/10(Bio-Rad，Hercules，CA，产品目录号163-2104)组成。蛋白质/再水合溶液再用水溶解到11cm IPG ReadyStrippH3-10(Bio-Rad，产品目录号163-2014)，在惰性条件下0伏、20℃、16h。
在Protean IEF池中(Bio-Rad，型号526BR02142)用IPGReadyStrip(Bio-Rad)以35,000volt-hours进行一向等电聚焦。在第一向电泳之后，凝胶在含有20％甘油、0.375M Tris、6M尿素、2％SDS和5M三丁基磷的缓冲液中平衡20min。将IPG ReadyStrip放置在预浇制了1mm的4-20％梯度Tris-HCl-SDS凝胶(Bio-Rad，产品目录号345-0036)的CriterionTM上，将含有溴酚蓝(Bio-Rad，产品目录号161-0404)的热的0.5％琼脂糖加到剩余孔中。室温下在Criterion小型电泳池中(Bio-Rad，产品目录号165-6001)进行电泳。用10×Tris-糖胶-SDS溶液(Bio-Rad，产品目录161-0732)制备电泳缓冲液。在装配凝胶系统和加入电泳缓冲液后，以2mA、3500v、45w的起始电流进行电泳1.5h。电流上升到5mA 30min，接着升到10mA 2-3h。一般电泳时间在4-5h之间。电泳之后，凝胶在由17％硫酸铵、30％甲醇、3％磷酸和0.1％库马西亮蓝G250(Bio-Rad，产品目录号161-0436)的缓冲液中染色至少12h。凝胶用水洗涤并在2％乙酸中存放直到进一步处理。
用Bio-Rads荧光-S-多重图象仪(Bio-Rad，产品目录号170-7700)捕获胶状库马西染色凝胶的图像。采用数字滤波算法来排除不一致的背景而不会去除重要的图像数据。最初采用内标(分子量标记)来确定被标记目标蛋白的分子量。通过比较在双向凝胶上相对于蛋白标准的位置来确定S-ADH蛋白的分子量和PI。
从2-D凝胶上手工切下对应于S-ADH的蛋白质斑点。凝胶块在1.5mL微型离心管中通过猛烈摇晃30min，用25mM碳酸氢铵/50％乙腈来软化并脱色。用极细的移液枪去除和弃去蓝色的脱色溶液。重复脱色步骤直到从凝胶块上去除染料。凝胶块在真空中干燥10-15min。蛋白质在37℃下、25μL总体中消化过夜，其中改进的测序级(sequence grade)胰岛素(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)以25ng/μL的最终蛋白溶解在25mM碳酸氢铵中。肽用50％乙腈和0.5％三氟醋酸洗脱。所有肽样本被浓缩、脱盐，并如生产商描述方法用C18反相ZipTipTM移液器枪头(Millipore，Bedford，MA，产品目录号ZTC18S096)去除去垢剂。
生成的胰蛋白酶肽直接通过质谱分析。质谱分析试验在装有N2激光(337nm，3-nsec脉冲宽度、20-Hz重复率)的PerSeptiveBiosystems(Framingham，MA)Voyager DE-STR上进行。在反射模式中用衰变抽提获得质谱光谱。用低分子量肽标准进行内部质量校准，质量测定的精确度一般为±0.1Da。所有肽样本稀释在α-氰基-4-羟基苯乙烯酸中，该溶液通过将10mg α-氰基-4-羟基苯乙烯酸溶解在含有0.1％三氟乙酸的1mL水溶性50％乙腈中。一些得自S-ADH的胰蛋白酶肽的分子量下述方法之一进一步通过质谱分析测定(sequence)。
方法1蛋白质的胰蛋白酶消化用Keough T.，Lacey M.P.，YoungquistR.S.美国国家科学院汇编1996；967131描述的氯磺化乙酰氯试剂实现。磺化样本用三氟乙酸酸化，直接用C18小型柱(ZipTipTM，Millipore)完全清除。将衍生的肽洗脱到α-氰基-4-羟基苯乙烯酸中(Fluka，产品目录号28480)并直接加到MALDI板上。在装有N2激光的AppliedBiosystems Voyager DE-STR时间飞行质谱仪上分析衍生的肽。在反射模式中用衰变抽提获得质谱光谱。用低分子量肽标准进行内部质量校准，质量测定的精确度一般为±0.2Da。在用限时离子选择分离适当的衍生前体离子后，获得PSD片段离子光谱。以如下比率1.0000(前体离子区段)、0.9000、0.7500、0.5625、0.4218、0.3164和0.2373(片段离子区段)逐步降低施加于反射器的电压来将片段离子重新聚焦到最终检波器上。用Applied Biosystems开发的软件将各个片段接合在一起。所有前体离子区段在100个激光脉冲的低激光强度(可变阻尼＝1980)下获得，以避免检测器饱和。增加激光强度(可变阻尼＝2365)来保留PSD识别的区段。在20MHz数字化比率下获得PSD数据；因此，所有片段离子用化学平均而不以单一同位素质量进行测定。
方法2从S-ADH胰蛋白酶肽获得序列标记。通过限时离子选择分离适当前体离子后得到四条肽的源后衰变(PSD)片段离子质谱。通过以如下比率1.0000(前体离子区段)、0.9000、0.7500、0.5625、0.4218、0.3164和0.2373(片段离子区段)逐步降低施加于反射器的电压来将片段离子重新聚焦到最终检波器上。用Applied Biosystems开发的软件将各个片段接合在一起。所有前体离子区段在＜256个激光脉冲的低激光强度(可变阻尼＝1450)获得，以避免检测器饱和。对于所有剩余PSD识别区段，增加激光强度。一般地，对于各个片段离子区段，为200激光脉冲。在20MHz数字化比率下得到PSD数据。用肽标准进行质谱校准。在所有PSD质谱试验中测定亚稳态分解。
方法3通过ESI MS/MS从S-ADH胰蛋白酶肽得到序列标记，在Micromass Q-TOF2四极/时间飞行MS系统中得到质谱分析。
实施例3NADH的起始电化学测定及与分光光度数据的关系购买10微米圆盘形碳纤维微电极(得自BioanalyticalSystems(“BAS”)，West Lafayette，Indiana(零件号码MF-2007))并用Kuhr等方法(63)预处理。电极表面用1μm金刚石研膏(Bioanalytical Systems)磨光10min，并用热甲苯超声波处理2min。微电极在甲醇和水中各漂洗一次，然后在水中超声波处理1min两次来去除残余的磨光材料。接着通过在1M HCl中以100V/s从-200mV升到+1800mV进行10个循环两次来电化学预处理被磨光的微电极。然在100mM磷酸钾缓冲液中以100V/s从0mV升到+1800mV进行10个循环两次来处理微电极。然后从单独的磷酸缓冲液中得到背景扫描。所有电压与Ag/AgCl参比电极(Bioanalytical Systems)比对。在得到酶(1U/mL)和NAD(P)H(2mM)的基线快速扫描循环伏特克数(CVs)后，加入所需体积水溶性丙酮(20mM终浓度)。快速混合溶液，在25min中每隔1min测定快速扫描CVs。采用BAS 100W的电化学软件版本2.3(得自Bioanalytical Systems，West Lafayette，Indiana，下文称为“BAS”)从每个CV中扣除缓冲液的背景。
除非另外指出，所有电化学检测采用偶联到BAS PA-1前置放大器和法拉第笼的Bioanalytical Systems(BAS)型100A或B电化学分析仪进行，其中通过BAS 100W电化学软件版本2.3得到所有波形和电流。数据用Microsoft Excel 97 SR-2和BOMEM GRAMS/32版本4.04，II级(Galactic Industries Corporation)处理。电泳池是定制的0.20mL的池，由Plexiglas构建(丙烯聚合薄片得自Atofina Corp.，巴黎，法国)，含有一个Ag/AgCl参比电极、预处理碳纤维微电极和一个铂线辅助电极。
为了建立两种酶的分光光度数据和电化学数据间的关系，对两种分析采用相同的反应条件。对于得自布氏热厌氧菌的S-ADH，1mL反应体积中含有2mM NADPH、20mM丙酮和1U S-ADH的最终浓度。对于得自自养黄色杆菌Py2菌株的S-ADH，1mL反应体积中含有2mM NADH、20mM丙酮和1U S-ADH的最终浓度。对于这两个反应，得到该酶和NAD(P)H相对于磷酸缓冲液空白的基线A340。然后从分光光度计中取出含有反应溶液的试管，从试管中取出0.4mL溶液并剩下0.6mL。所需体积的水溶性丙酮加到1.0mL反应中。混合溶液，往试管中加入0.4mL，将试管再放回分光光度计中。然后用Shimadzu UV-VIS-NIR扫描分光光度计(型号UV-3101PC，哥伦比亚，马里兰)监控在A340的下降30min。用UVPC专用光谱软件版本3.9(Shimadzu，哥伦比亚，马里兰)提取数据并用Microsoft Excel 97 SR-2处理。购买具有1mm路径长度和0.4mL体积的玻璃管(得自Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚，零件号码14-385-906A)。
用Meldola蓝改进的碳电极电化学测定丙酮依赖的NADH消耗如下制备用电催化的Meldola蓝改进的玻璃态碳圆盘电极。首先用1μm金刚石悬液湿润磨光直径3-mm的玻璃态碳电极(BAS的零件号码MF-2012)，在取离子水中超声波处理1min，然后进一步用0.05μm氧化铝磨光悬液磨光。刚刚磨光的电极通过在去离子水中超声波处理彻底洗涤，然后通过在5mL脱氧100mM磷酸缓冲液(pH7.2)中以5V/s从-500mV升到+300mV进行20个循环4次来电化学预处理。循环之后，施加-0.5V的恒定极化电压60s。然后室温下在0.5％Meldola蓝中(Aldrich，密尔沃基，威斯康星，产品目录号32，432-9)浸泡电化学预处理的电极30min。使用前用去离子水洗涤。
用Meldola蓝介质制备的丝网印刷碳电极购自Gwent电子材料有限公司(Pontypool，英国)。一次性检测条按照Hart等描述的几何方法构建，由两个沉积在聚乙烯基底上的丝网印刷电极构成。工作电极是含有电催化的Meldola蓝的石墨电极(得自Gwent的零件号码C70902D2)，而参比/计算电极是Ag/AgCl印刷油墨(得自Gwent的零件号码C61003D7)。工作电极区由喷涂其他绝缘包被(得自Gwent的零件号码D2000222D2)确定。电极几何区域为3×3mm，或9mm2。使用前电极在磷酸缓冲液中预浸泡10min来去除松散结合的Meldola蓝。
采用分光光度法，用如上制备Meldola蓝-碳电极在含有100mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)、NADH(500μM)、S-ADH(1U)和各种浓度丙酮的1mL反应体积中测定由S-ADH催化的NADH的丙酮依赖性消耗。在两分钟温育期后，电压从断路步进到68mV(比照Ag/AgCl)并在120s后记录电流。
用商品一次性血糖测试条测定NADH的丙酮依赖性消耗一次性葡萄糖生物传感器检测条和读出器(精确的超级糖尿病控制系统(Precision Xtra Advanced Diabetes Management System))可得自MediSense(Abbott实验室营业部，贝德福德，摩洛哥)。含有25mM磷酸钾缓冲液(pH6.2)、NADH(2mM)、S-ADH(20U)和丙酮(分别为0.5、1.0、1.5、2.0mM)的1mL反应体积在室温下温育。5min后，从各个反应混合物中取出20μL等分试样，并在加入到葡萄糖仪前应用于一次性检测条。记录仪表读出值(mg/dL葡萄糖当量)并绘制对应于丙酮加入量的关系图。
与H2O2形成偶联的二级醇脱氢酶的电化学检测圆盘铂电极(BAS零件号码MF-2013)用于监控由S-ADH偶联的酶反应产生的对应于丙酮浓度的H2O2。测定前，用氧化铝研膏磨光电极表面1min，然后用去离子水超声波处理1min洗涤，再用水洗涤。然后被磨光的Pt电极通过应用以100mV/s从+200mV升到+900mV 10个循环电化学预处理。所有电压参比于Ag/AgCl电极(BAS零件号码MF-2078)。在0.5mL总体积的试样中含有磷酸钾(100mM，pH7.2)、纯化的S-ADH(1U/mL)、NADH(20μm)、乳酸(100mM)、乳酸脱氢酶(5U/mL)、丙酮酸氧化酶(4U/ml)、黄素腺嘌呤二核苷酸(0.01mM)、辅羧酶(0.2mM)。加入丙酮来起始检测。在2min温育期后，电压从起始电流逐步升高到350mV。在120s后记录氧化电流并绘制与丙酮浓度的关系图。
采用与上述用于圆盘铂电极相同酶试剂系统和相似电化学技术评价一次性电极材料来监控由偶联酶反应生成的丙酮依赖的H2O2。购买丝网印刷披铂碳/石墨电极和酞菁钴碳电极(零件号码分别为C2000511D1和C40511D8，Gwent电子材料有限公司)，具有与较早描述的Meldola蓝丝网印刷碳电极相同的电极结构(electrode geometry)。使用前丝网印刷披铂碳电极在磷酸缓冲液中预浸泡5min。加入丙酮起始检测并温育2min，其间电压从断路(open circuit)步进到350mV。120s后记录氧化电流。使用前，酞菁钴改进的丝网印刷碳电极在磷酸缓冲液中预浸泡5min。在每次加入丙酮后温育反应物3.5min。进行分光光度测定，在150mV下具有5s的起始无噪时间(quite time)，然后电压步进到650mV 30s，记录电流。每个试验使用一个酞菁钴改进的丝网印刷电极，然后弃去。
剪切直径1/8英寸(3.06mm)的Toray碳纸(多孔碳纸)或布的圆片(用手工打孔器)，加载20％(w/w)铂毫微颗粒(这些铂颗粒是沉积在碳上的毫微颗粒；加载毫微颗粒的纸或布购自ETEK Division of DeNora North America，萨默塞特，新泽西，零件号码SLS-SPEC)来制备一次性披铂碳电极模板，并用双面碳带(也是直径1/8英寸(3.06mm)圆片)与丝网印刷碳工作电极(得自Gwent电子材料有限公司的零件号码为C10903D4)相连。在一些实施例中，将20μm非离子去垢剂TRITON X-100(t-辛基苯氧基聚乙氧乙醇(t-octylphenoxypolyethoxyethanol)；产品目录号T-8787，得自Sigma化学公司)或BRIJ(四乙烯基甘油单十二烷基酯(tetraethyleneglycol monododecyl ether)；产品目录号P-1254，Sigma)应用于ETEK材料圆片，并且在使用前干燥。测量前通过以100mV/s从+200mV升到+900mV进行10个循环两次来电化学预处理电极。加入丙酮起始检测并温育2min。进行分光光度检测，215mV时的无噪时间为2s，然后将电压从相对于Ag/AgCl的215mV步进到350mV。30s后记录氧化电压。
用葡萄糖一次性检测条反射光度测定丙酮依赖的H2O2形成并与电化学数据关联购买一次性葡萄糖生物传感器检测条和读出器(得自Lifescan有限公司，milpitas，加利福尼亚的一次接触基础读出器和检测条)。往含有S-ADH偶联酶系统(如上述的)的1mL反应体积中连续加入100μM丙酮并在室温下温育。每次加入丙酮反应4min，然后从反应混合物中取出20μL等分试样，在将其加入葡萄糖仪之前先应用于一次性检测条。记录仪器读出值(mg/dL葡萄糖当量)并绘制对应于丙酮总浓度的关系图。还用上述圆盘铂电极电化学监控H2O2浓度。绘制电化学检测与比色读数之间的关系。
基于酶的电化学检测气态丙酮通过将标准浓度的丙酮注入充灌了7L水饱和空气的校准安全气袋(10L袋，校准工具有限公司(Calibrated Instrument，Inc)，Ardsley，新泽西)中，并在37℃下蒸发(约30min)来制备丙酮的气态样本(0-10ppmv/v)。通过该方法制备的气体样本在温度和湿度含量方面与人类呼吸极其相近。采用气态色谱法用装有火焰电离检测仪和上柱注射器的Hewlett Parkard5890气态色谱仪来校准气体取样系统(即丙酮的气态和液相样本浓度)。将1μL水溶液样本加到15m长、卷曲的毛细管柱中(Nukol，直径0.53mm，具有0.5-μm液相层，产品目录号25326，可得自Supelco有限公司，Bellafonte，宾西法尼亚)。烘干箱温度在40℃下保持4min，然后以25℃/min升高到200℃。氦的运载气流速度为5mL/min。
两种取样技术用于将丙酮从气态转变为液相；泡沫系统和薄液层系统。至于泡沫系统，将一片聚氨酯泡沫剪切成圆柱状(19mm长和10mm直径)使之体积约1mL。泡沫在水中沸煮20min，然后塞进3cc的一次性塑料注射器中。插上注射器活塞并推紧以排出过量水分，然后去除活塞。在导入气态丙酮样本之前，将50μL水或磷酸缓冲液加入泡沫中。一旦水接触泡沫时，表面张力将水吸入泡沫空隙中，水均匀地分布在泡沫的表面。然后将含有湿润泡沫的注射器通过管道连接到气体取样系统，通过启动隔膜泵或人工挤压气袋使气体样本以5L/min的流速通过泡沫12sec。这使气体样本总体积等于1L。取样后，迅速断开装有泡沫的注射器，重新插入活塞。然后将液体挤到电泳池中用于电化学分析，或者挤压到小瓶衬垫(vial insert)中用于气态色谱分析。对于电化学测定，丙酮转化的水溶液样本与浓缩酶溶液(上述的S-ADH和偶联酶)混合制备期望的最终酶溶液，并温育2min。如上述用计时安培分析法测定由酶反应生成的丙酮依赖H2O2。
对于薄液层取样方法，该气体以500mL/min流速的极细气流从气袋中释放2min，使气体总体积等于1.0L。在本试验中，反转工作电极(电极表面超上)，使少量酶溶液(50μL)形成相对薄的液层来覆盖电极表面。气体垂直地吹向液体表面。气流搅动液体来提高从气态变为液相的丙酮质量。在气体样本流尽后，使酶溶液反应1min。如上述电化学测定从酶反应中生成的丙酮依赖H2O2。绘制对应于气袋中气态丙酮浓度的电流反应关系图。
数据分析将起始速率数据代入Michaelis-Menten方程并使用软件KaleidaGraph第四版(Synergy Software，Reading，PA)计算动力学常数(Km和Vmax)。
结果纯化得自自养黄色杆菌Py2菌株的S-ADHS-ADH被认为参与包含脂肪族烃分解代谢的细菌路径的初始(生长在异丙醇中)或中间步骤(生长在丙烷中)。这些酶反应是自由可逆的，其中反应方向依赖于化学平衡。该逆反应，即还原丙酮为异丙醇伴随着NADH或NADPH氧化(大部分脱氢酶具有优选于其他酶的一种辅酶)，给基于酶的电化学传感器提供底物特异性和氧化还原化学必然性。由于这些原因，通过检测异丙醇、丙烷和丙酮中生长的细菌培养物的细胞提取物中的S-ADH活性(数据未显示；生长筛选和分离按试验方法中的描述进行)来更加详细地研究这类酶。在其中，异丙醇生长的自养黄色杆菌Py2菌株的细胞提取物具有最高S-ADH特异性活性(1.2μmol还原丙酮·min-1·mg-1蛋白)，并且还初步观察到具有高于一级醇的二级醇特异性。为了进一步研究这种酶的特性，根据其在存在NADH时还原丙酮和在存在NAD+时氧化异丙醇的能力来纯化S-ADH。用DEAE-琼脂糖和RED琼脂糖色谱约40倍纯化该酶，具有30-40％的估计回收率。如附图2所示，这种两步纯化方法在SDS-PAGE上富集具有42kDa的表观分子量的单一多肽。在异丙醇中生长的黄色杆菌属的细胞提取物中模糊地观察到以相同表观分子量移动的多肽条带，在生长在葡萄糖黄色杆菌属的细胞提取物的相同位置上也不是清晰可见的(附图2)。与SDS-PAGE分析一致，葡萄糖生长的细胞提取物中的S-ADH活性仅为在异丙醇生长的细胞提取物的活性的3％，这表明S-ADH由异丙醇存在诱导。质谱分析提供更加精确的分子量估计，纯化S-ADH为37.1kDa，这与由SDS-PAGE确定的表观分子量一致。变焦电泳确定S-ADH的pI为7.4。由Edman降解的S-ADH多肽的N-末端序列确定为MKGLVYRGPGKKALE(SEQ ID NO7)。用胰蛋白酶消化多肽生成“胰蛋白酶片段”并应用源后延迟测序(PSD-MALDI)基质辅助激光吸附离子化质谱分析来确定其他氨基酸序列。
通过衍生片段接着PSD-MALDI序列分析得到六个肽的氨基酸序列(表2)。
表2.黄色杆菌属Py2 S-ADH的衍生胰蛋白酶片段的序列


具有所观察的946.27质量电荷比的肽序列与由Edman降解产生的N-末端测序中存在的九聚物一致。采用PSD MALDI分析，检测到其他四氨基酸序列(表3)。
表3.PSD MALDI检测的黄色杆菌属Py2 S-ADH片段的序列

还可以通过ESI MS/MS(电喷离子化串联质谱分析/质谱分析)获得S-ADH胰蛋白酶肽片段的氨基酸序列。得到的MS/MS分析在下列氨基酸序列是一致的(表4)。
表4.由MS/MS检测的黄色杆菌属Py2 S-ADH片段的序列

因此，X.anthobacter Py2 S-ADH被表征为具有NAD+依赖的二级醇脱氢酶活性、能够将丙酮还原为异丙醇、具有酮和二级醇的特异活性的蛋白质；对于将异丙醇氧化为丙酮，具有(1)pH最佳值为7.8，和(2)当pH7.8时在相同条件下分别用C3-C5直链二级醇和用C2-C5直链一级醇测定时，至少50∶1的二级对一级醇的平均比活性；对于将丙酮还原为异丙醇，具有(3)pH最佳值为6.2，(4)约144±18μM的表观Km，(5)约43.4±1.2μmol还原丙酮·min-1·mg-1蛋白的表观Vmax，(6)约30.4sec-1的表观kcat，(7)约2.1×105的表观kcat/Km，和(8)约5.1±0.4μM的NADH的Km；和具有至少一个分子量为(a)由质谱分析确定的约37.1kDa的分子量，(b)由变焦电泳确定的约7.4的pI，和(c)SEQ ID NO7的十四个N末端氨基酸序列，并且其能够被降解形成具有SEQ ID NO8到SEQ ID NO19的氨基酸序列的片段。
此外，同时还共纯化了该蛋白质的末端截去类似物。这种末端截去类似物缺少末端十肽，但是与完整蛋白一样起作用(数据未显示)。在此使用的术语“酶”是指“催化功能生物分子”，包括完整天然(或天然大小)分子和保留功能的末端截去类似物，即有约10个氨基酸从至少一端被删除。特别对应于黄色杆菌属Py2 S-ADH，上述术语“酶”包括完整天然分子和末端截去类似物。
得自X.anthobacter Py2 S-ADH的底物特异性和抑制在丙酮还原检测中，NADH而非NADPH可以作为电子供体(数据未显示)。用于还原丙酮为异丙醇的pH最佳值是6.2，而逆反应的最佳值为7.8(数据未显示)。从检测中收集的数据中计算出动力学常数，在检测中，NADH或丙酮的浓度保持在固定的饱和浓度，而在各个检测中丙酮或NADH的浓度是变化的。计算得到表观Km、Vmax、kcat和kCAT/Km分别为144±18μM、43.4±1.2μmol还原丙酮·min-1·mg-1蛋白、30.4sec-1和2.1×105。NADH的Km计算为5.1±0.4μM。在一些作为可选择的底物被评价的化合物中，S-ADH具有酮和二级醇的特异性(附图3和4)。在附图4中，“NA”表示“没有活性”，即对被测底物“没有活性”。如所示，在比较中，一级醇表现为无活性或极低的活性。在酮和二级醇中，2-戊酮和2-戊醇分别具有还原和氧化反应的最高特异性活性。
作为结果，该酶产生活性的唯一被检测一级醇是1-丁醇，并且测定的特异活性(在pH7.8下)仅为1.7±0.2μmol氧化丁醇·min-1·mg-1蛋白。没有检测到对于乙醇、1-丙醇或1-戊醇的活性。因此对于C2-C5直链一级醇的平均特异活性至多约0.475氧化醇·min-1·mg-1蛋白。检测对于C3-C5直链二级醇的活性。该酶对这三种醇都具有活性，并且测定的特异性活性值(在pH7.8下)为24±1.8μmol氧化2-丙醇·min-1·mg-1蛋白、21±3.6μmol氧化2-丁醇·min-1·mg-1蛋白和37±1.1μmol氧化2-戊醇·min-1·mg-1蛋白。因此，对于C3-C5直链二级醇的平均特异性活性为至少25氧化醇·min-1·mg-1蛋白。因此，对于该S-ADH而言，当pH7.8时在相同条件下分别用C3-C5直链二级醇和C2-C5直链一级醇进行检测时，最小平均二级醇对一级醇的特异性活性比可能为25/0.475＝52.6；在这些条件下进行检测，具有至少约50∶1的二级醇对一级醇的平均比活性。
采用饱和浓度的丙酮，存在浓度为丙酮Km值13倍的甲醇、乙醇、和1-丙醇时，S-ADH活性并不被抑制(数据未显示)。由于乙醇是诊断气酮检测中极可能的抑制剂，在存在高浓度乙醇情况下检测S-ADH活性。存在41mM乙醇时，其相当于人类呼吸中发现的乙醇的最高浓度500ppm(v/v)气态乙醇，S-ADH为82-85％活性。
用分光光度计研究S-ADH的丙酮检测极限，来评价该酶检测人类呼吸中存在的最低水平丙酮的活性。加入大量酶(4U)时，NADH消耗反应时间少于20s，并且丙酮浓度线性(相关系数＝0.99997)范围在0.058-5.8ppm(w/v)之间。丙酮检测范围的较低端(0.058-0.29ppm(w/v))处在诊断性的呼吸丙酮分析所需的检测参数内(空腹个体的较低的呼吸丙酮水平为0.3-0.8ppm(w/v))。而且，这种检测方法的灵敏度受限，因此其他检测方法(如电气化学方法)利用S-ADH反应来检测低浓度丙酮，可能提高灵敏度。
自养黄色杆菌Py2菌株的S-ADH的稳定性并入生物传感器的酶的活性是确定其商业可用性的主要参数之一。保持酶的活性会影响存储费用、操作和加工过程。因而有必要寻找适合在室温下长期稳定S-ADH活性的条件，优选以干燥形式。在冻干和存储过程中，加入维持酶周围的离子和亲水环境的相容性溶液可以提高酶的稳定性。从附图5中可以看出，纯化的S-ADH被冻干，并在冻干后1天内重悬和分析，相对于非冻干的对照，其保留约60-70％活性。二糖海藻糖的存在对于保持酶活性十分有益，样本在室温下放置65天和213天后，仍分别保留约100％和70％的活性，而不含添加剂的S-ADH样本在室温下放置65天后完全失活。在个别试验中，S-ADH被加入到各种组分的混合物中，这种混合物与最近描述用于制备薄膜、丝网印刷酶电极的配方极其相似。该配方包括添加剂羟乙基纤维素(2％w/v)、DEAE-右旋糖苷(10mg/mL)和乳糖醇(10mg/mL)，该混合物可以风干而不必冻干。采用该混合物，S-ADH在室温下存放23天后仍100％保留其活性(数据未显示)。
生化比较自自养黄色杆菌Py2菌株菌株Py2的S-ADH与其他S-ADH酶X.autotrophicus菌株Py2的S-ADH是第一种从CO2依赖性的利用丙酮的生物体中纯化的S-ADH酶。这种酶与先前描述的仲醇脱氢酶具有相似分子量和底物特异性。来自假单胞菌属sp.6307(ATCC 21439)、母牛分枝杆菌JOB-5(ATCC 29678)、产朊假丝酵母(ATCC 32195)、红球菌rhodochrous PNKb1(Ashraf & Murrell(1990))的NAD依赖性仲醇脱氢酶和来自布氏热厌氧菌的NADP依赖性的S-ADH都具有37-48kDa的亚单位分子量。从M.vaccae菌株JOB-5纯化的S-ADH为37kDa分子量(亚基)，受丙烷增加诱导。不同于黄色杆菌属S-ADH，M.vaccae酶表现具有除了仲醇特异性之外的部分伯醇特异性，虽然伯醇具有相当高的Km值(如2-丙醇和1-丙醇分别为Km＝0.05mM和Km＝8.1mM)。相应地，丙酮还原的Km计算为0.3mM。另一个不同点在于还原和氧化反应的最佳pH。M.vaccae JOB-5具有氧化2-丙醇的最佳pH10-10.5和还原丙酮的最佳pH7.5-8.5。另一个仲醇脱氢酶分离自利用丙烷的细菌R.rhodochrousPNKb1(Mr＝42kDa)，虽然这种酶具有几乎相同的仲醇和伯醇特异性(如1-丙醇和2-丙醇分别为Km＝18mM和Km＝12mM)。与利用丙烷的生物中的S-ADH酶不同，来自甲基营养菌假单胞菌属6307(ATCC21439)(Mr＝48kDa)的S-ADH被证实具有高仲醇特异性，而对伯醇无活性。还表明存在高浓度乙醇时该酶大部分未被抑制(存在10mM和100mM乙醇时分别为0％和30％抑制)。得自布氏热厌氧菌(Mr＝40kDa)的S-ADH具有与得自黄色杆菌属的S-ADH极其相似的底物特异性，除了其更多利用NADPH而不是NADH。众所周知，得自布氏热厌氧菌的S-ADH是少数已经被克隆和测序的S-ADH酶之一(Genebank登录号A32973)。其他可获得的S-ADH酶(S-ADHs)包括在US5,763,236中描述的得自Candida parapsilos的S-ADH；其序列可以在Genebank登录号AB010636中得到；得自产乙醇热厌氧菌39E(ATCC 33223)的S-ADH(Genebank登录号U49975)；和得自Clostridum beijerinckii的S-ADH(Genebank登录号M84723)。相应地，得自布氏热厌氧菌和产乙醇热厌氧菌的S-ADHs(这两种酶具有相同的N末端序列)的N末端氨基酸序列中前15个氨基酸残基中(MKGFAMLSIGKVGWI)的5个与得自自自养黄色杆菌Py2菌株的S-ADH的N末端序列(MKGLVYRGPGKKALE)相匹配。
从文献可以看出，有许多对丙酮特异的S-ADH酶。这种S-ADH酶可以被加入到生物传感器中。除此之外，发现通过以丙酮、异丙醇或乙烷作为生长物质富集从土壤中分离得到的培养物收集菌株和一些新菌株具有S-ADH活性(数据未显示)。为了比较和评价这些S-ADH活性的相对特异性，用各种酮或醇底物分析从黄色杆菌属中纯化的S-ADH和从异丙醇中生长的细菌菌株(TDCCIP-1(和两种其他菌株数据未显示))、丙烷中生长的M.vaccae JOB-5和布氏热厌氧菌S-ADH的部分纯化制备物或含有S-ADH的细胞提取物。如表5所示，得自自自养黄色杆菌Py2菌株、菌株IP-1、M.vaccae JOB-5和布氏热厌氧菌的S-ADH酶都具有可忽略和实质上相对较低的伯醇底物活性。虽然用于丙酮监控的S-ADH反应平衡会由于丙酮还原(即NAD(P)H过量)而发生变化，伯醇主要是乙醇的低特异性优选用于降低可能的抑制作用。长链酮(即2-丁酮、2-戊酮和3-戊酮)会激活所有酶，但是这意义不大，因为这些化合物一般不存在于人类呼吸中。有趣的是，得自布氏热厌氧菌的S-ADH对短链酮较有活性，这与对长链酮较有活性的得自黄色杆菌属的S-ADH的活性相反。应当指出，布氏热厌氧菌的S-ADH是一种商业上可得的S-ADH(Sigma)。这种酶在本发明的生物传感器中的应用将会在下文进行更加详细的描述。因此，如上描述分离的自养黄色杆菌的S-ADH酶代表一种能够通过本发明的偶联酶系统相对地选择检测哺乳动物样本中的长链酮的特定酶。
表5.细菌仲醇脱氢酶的底物特异性。

a在pH6.2时，以2.5mM底物和0.2mM NADH(NADPH用于布氏热厌氧菌检测)双重计算酮还原率。
b在pH6.2存在等量乙醇(2.5mM)时，双重计算酮还原率。
c在pH6.2时，以2.5mM底物和0.2mM NAD+(NADP+用于布氏热厌氧菌检测)双重计算乙醇氧化率。
dNA，未检测到活性e在pH6.2时，以5mM底物和0.2mM NADH或NAD+计算的酮还原率和乙醇氧化率。
电化学监控S-ADH反应酶-底物相互作用的电化学传导提供了一种常规分析方法来检测各种底物。如前所述，基于脱氢酶的酶反应一般需要用于酶促反应的化学计算量的吡啶核苷酸协同因子NADH或NADPH。在本领域中已经描述了许多生物传感器，它们基于这些辅酶的电化学检测。如附图6所示，以与其他生物传感器相似的方式工作，NAD(P)H消耗的电化学检测可以偶联电极与S-ADH酶促反应，产生一种以底物特异性方式量化丙酮的方法。为了评价附图6中所示的方案，用碳微电极实施快速扫描环流伏安法(扫描速度＞100V/s)来测定由布氏热厌氧菌的S-ADH催化的NADPH的丙酮依赖性消耗。通过持续进行伏安法扫描酶反应混合物来测定由布氏热厌氧菌的S-ADH催化的NADPH的丙酮依赖性氧化的电化学检测。这些扫描说明阳极峰区的持续变化，这些变化取决于丙酮的加入。阳极电流随时间过去而降低，表明当S-ADH催化丙酮还原为异丙醇时，NADPH被消耗(氧化)。从约1200mV到0mV进行扫描，并测定阳极电流；在一分钟内获得19个扫描数据。每次扫描的起始电流(约1200mV)有规律地变化，在1分钟时检测为约-6.5nA和在19分钟时检测为-0.2nA。对于每次扫描，显著的截止(ceased)电流约600mV(此后检测为约0nA)。为了进一步确定NADPH消耗被精确测定，在相同反应条件下用电化学和分光光度监控反应。如图7所示，用两种检测方法获得的反应数据之间十分吻合，说明丙酮特异的、NADPH依赖性的S-ADH反应可以被精确地电化学监控。用于测试布氏热厌氧菌的S-ADH的伏安法扫描方法用得自自养黄色杆菌Py2的S-ADH重复，以确定NADH依赖性S-Adh反应可以通过电化学监控。至于NADPH依赖性的酶，持续扫描含有得自自养黄色杆菌Py2的S-ADH的反应混合物，结果如本文的附图8所示，对应于NADH的酶催化氧化，阳性电流持续地丙酮依赖性降低。
如上所述NAD(P)H依赖性S-ADH反应的电化学检测提供必要的基本分析方法，来实现一些酶电极结构的设计标准。总之，本领域所描述的基于脱氢酶的生物传感器含有覆盖了催化性酶和介质化合物的混合物或层的导电电极。当包被的电极与含有底物的样本接触时，该酶对底物起催化作用，介质化合物将电荷转移到该电极，产生相对于参比电极的读出信号。这种活性电极优选由具有导电性的碳组成，它可以被配制成丝网印刷油墨或者其他可采用低成本生产方法和最终可任意使用的配方/组合物。现有技术描述的特别适用于NAD(P)H的介质化合物包括viologen衍生物、醌衍生物、吩嗪、osmium phendione、硫堇、茜素绿和Meldola蓝(Katakis & Dominguez，Mikrochim.Acta12611-32(1997))。如前提及的介质通过在还原电位中提高NAD(P)H电氧化动力速率，提高电极的整体灵敏度。研究使用介质Meldola蓝(MB)电化学地检测S-ADH反应的可行性(如图9所示)。
用具有吸收了Meldola蓝的玻璃态碳电极测定NADH浓度来实施计时安培分析法。如附图10所示，用改进的电极测定的电流反应与存在的NADH浓度线性相关。还检测和确定1mM NADH的线性关系(数据未显示)。由于NADH的消耗与丙酮浓度成比例(即由S-ADH催化的反应)，这些结果说明Meldola蓝改进的碳电极提供一种丙酮量化的介导电极系统。作为进一步研究此并构建实用的、一次性的丙酮传感器的方法，计时安培分析试验采用填充了介质Meldola蓝的丝网印刷碳电极(下文称为“MB-SPCE”)来实施。在附图11中所示的是丙酮依赖的S-ADH反应数据，是采用MB-SPCE一次性电极检测条获得的。丙酮反应的相关系数(R2)为0.965，电极间的可重复性近6％。这些数据表明丙酮特异酶系统可以用实用的电极系统通过电化学监控。
设计用于丙酮测定的实用装置，在其中监控丙酮依赖的NADH消耗。该装置采用商业上可得的、一次性葡萄糖传感器系统(一种已知能指示NADH浓度的血糖监控仪，和用于其中而制备的血糖测试条，它们都由摩洛哥，贝德福德的Abbott实验室的MediSense有限公司生产)来测定由S-ADH催化的对丙酮响应NADH消耗。结果示于附图12中，表示由便携式监控仪和一次性测试条测定的丙酮依赖的NADH消耗。这说明使用批量生产的电极和监控仪构建测量丙酮的实用装置的可行性，用以指示和/或记录丙酮特异性酶系统的电流。
与根据NAD(P)H的消耗来电化学监控S-ADH反应不同，还可能通过电化学测定在一定电压下阴极电流密度的升高来监控NAD(P)+形成，该电流密度直接与NAD(P)+浓度成比例。该检测方案的缺点在于氧气常常在NAD(P)+电化学还原所需的负电压电位产生强烈干扰反应。此外，电还原NAD(P)+形式二聚体的自由基，导致酶电极积垢。由于这些原因，包括NAD(P)+电化学再生的电化学试验常常采用电子转移介质在阳极进行，使电压远离干扰峰。但是，由于人的呼吸中总存在氧气，丙酮生物传感器的这些选择不进一步改进不具有实用性。
另一种监控NAD(P)+形成的方法是间接将其他酶的活性与S-ADH酶反应偶联。如附图13所示，NAD(P)+形成可以与乳酸脱氢酶催化偶联来生成丙酮酸盐。然后丙酮酸盐被丙酮酸氧化酶氧化生成乙酰磷酸盐和CO2，伴随着H2O2形成。然后H2O2被电化学氧化并通过任何本领域熟知方法在电极处被检测。在该方法中，NAD(P)+的丙酮依赖形成(由S-ADH催化)间接地与H2O2生成偶联。为了研究这些酶反应之间的偶联，该反应混合物(含有偶联酶和试剂)在存在辣根过氧化酶(HRP)的情况下用NADH依赖的得自自养黄色杆菌Py2的S-ADH制备。HRP催化H2O2还原和电子供体(显色染剂)的氧化，因此可以通过分光光度监控该反应。附图14说明偶联反应的结果，其中加入丙酮时观察到吸收值增大，这对应H2O2形成。通过进一步优化反应条件，将偶联反应达到稳定状态所需的滞后时间缩短到少于20s(数据未显示)。用苹果酸酶替代乳酸脱氢酶，改进NADPH依赖的得自布氏热厌氧菌的S-ADH的偶联反应。苹果酸酶是NADP+依赖的，催化苹果酸盐氧化和脱羧形成丙酮酸盐。如上所述，丙酮酸盐被丙酮酸氧化酶进一步氧化形成H2O2。此时，NADP+形成间接与H2O2生成偶联。采用该偶联酶系统，观察到不依赖于丙酮的背景吸收值的增强(数据未显示)。然而，在加入丙酮后，观察到H2O2形成比率增加约为背景比率的5倍。(小的H2O2形成背景比率(丙酮依赖的)可能由于苹果酸酶催化的NADPH氧化酶(心肌黄酶)活性)。采用位点指导的突变改变偶联酶对NADH和NADPH的特异性(Holmberg等，蛋白质工程，12(10)851-6(1999))，乳酸脱氢酶和苹果酸酶的吡啶核苷酸在各个偶联的S-ADH反应中的依赖性(即得自自养黄色杆菌的S-ADH是NADH依赖的，并与NADH依赖的乳酸盐脱氢酶偶联；而得自布氏热厌氧菌的S-ADH是NADPH依赖的，并与NADPH依赖苹果酸酶偶联)可以相互变换。另外，可以使用天然存在的乳酸脱氢酶或苹果酸酶的同系物，它们对NADH和NADPH不具有严谨的特异性(B.I.Lee等，分子生物学杂志，307(5)1351-62(2001))。
除了上述两种偶联的S-ADH酶系统外，其他偶联的酶系统也可以被用于本发明的丙酮特异性酶系统。在附图15中所示的方案中，S-ADH催化丙酮还原，生成NAD(P)+，然后NAD(P)+通过适当的吡啶核苷酸依赖性脱氢酶(NADH或NADPH特异性，取决于S-ADH所需的协同因子)还原成NAD(P)H。然后脱氢酶反应的氧化产物作为氧化酶的底物，通过进一步氧化该分子生成H2O2。在该偶联方案中使用的其他酶包括但不限于丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1)，其催化丙酮酸盐的NAD+依赖形成，然后丙酮酸盐被丙酮酸氧化酶氧化；酵母氨酸脱氢酶(EC 1.5.1.7)，其催化赖氨酸的NAD+依赖形成，然后赖氨酸进一步被赖氨酸氧化酶(EC1.4.3.14)氧化形成H2O2；苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)，其催化草酰乙酸盐的NAD+依赖形成，然后草酰乙酸盐被草酰乙酸盐脱羧酶(EC4.1.1.3)脱羧成丙酮酸盐，丙酮酸盐进一步被丙酮酸氧化酶氧化形成H2O2；和丙三醇脱氢酶(EC 1.1.1.6)，其催化二羟丙酮的NAD+依赖形成，然后二羟丙酮被半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.9)氧化成甲基乙二醛。在这些酶中，在一个酶偶联方案中检测丙氨酸脱氢酶，用丙氨酸脱氢酶替代乳酸脱氢酶，来证实这种改变的偶联方案在与S-ADH合作中能起作用。采用这种变化的酶系统，在加入丙酮时观察到吸收值上升，其对应于H2O2形成(数据未显示)。
与H2O2形成偶联的S-ADH反应的非电化学监控还可以构建用于非电化学测定丙酮的实用装置。研究是否可以通过丙酮特异的偶联的酶系统制备用于测定丙酮的实用的非电化学装置，构建一个装置来测定丙酮依赖性的H2O2形成。该装置组合了血糖监控仪和所生产的用于该控制仪的测试条(都由加利福尼亚的Milpitas的Lifescan有限公司制造)与H2O2生成系统，其中S-ADH催化丙酮与乳酸脱氢酶和丙酮酸氧化酶偶联。在该装置中，酶催化H2O2形成与过氧化物酶和染料偶联，当与H2O2接触时反应产生有色的反应产物。然后该装置通过反射光度读取器量化有色产物。附图16显示该结果，表示由便携式监控仪和一次性测试条测定的丙酮依赖的H2O2形成。无论加入丙酮(◆)(数据的线性回归得到y＝0.0457x+1.9048)或者等量H2O2(■)(数据的线性回归得到y＝0.044x+1.3333)，该监控仪读数是相同的，表明酶系统没有对装置读数产生干扰并且该酶系统能够精确地催化丙酮转化为H2O2。这说明构建用于丙酮测定的实用非电化学装置是可行的，该装置采用批量生产的电极和监控仪来定量指示和/或记录丙酮特异性酶系统的反应产物浓度。
与H2O2形成偶联的S-ADH反应的电化学监控电化学检测H2O2被充分研究了多年，并且已经被用于一些商业应用。因此上述酶系统(即与H2O2形成偶联的S-ADH反应)代表一种采用已经建立的电化学方法学酶学监控丙酮的新手段。最后，通过计时安培分析电化学法，用圆盘形铂电极监控丙酮依赖的H2O2形成，其由与乳酸脱氢酶和丙酮酸氧化酶偶联的S-ADH催化，在此称之为“3-酶系统”。附图17表示由3-酶系统催化的丙酮依赖的电流反应。电流与丙酮浓度线性相关，当丙酮浓度在0-200μM时具有相关系数0.997。进行8组独立的测定，当丙酮浓度范围在10-200μM时，计算得到的相对标准方差(％CV，方差系数)小于4％。定义99％置信限度时，检测方法的极限(MDL)是3.3μM，这对于检测人类呼吸中等量的气态丙酮具有足够灵敏度。用较高丙酮浓度(达到500μM)重复实验时，保持线性关系(相关系数R2＝0.922)和可重复性(所有浓度范围的CV＝5％，各个浓度测定8次)(数据未显示)。
3酶系统的电化学分析结果直接与标准浓度H2O2的电流反应比较，以确定是否3酶系统能够精确地将丙酮转化为H2O2。如附图18所示，由于加入丙酮(◆)或H2O2(■)的电流反应几乎是相同的，丙酮和H2O2数据的线性回归得到几乎相同的方程，分别为y＝1.1213x+9.8416和y＝1.1161x+13.442。这表明该反应已经完成，丙酮通过3-酶系统按化学计量转化成H2O2。
如上所述进行分析，但是存在可能的干扰化合物。仅仅测量丙酮、以及丙酮加10mM乙醇、丙酮加50μM异丙醇、丙酮加50μM异丁醇、丙酮加50μM丁酮、丙酮加50μM戊酮时的电流反应(数据未显示)。该结果说明乙醇、异丙醇、异丁醇并不干扰丙酮的测定。显著地，乙醇以超过丙酮1000倍(10mM)存在时，不起抑制作用。乙醇是存在于人类呼吸中的主要挥发性代谢产物。当存在其他酮时，由于在电化学检测中S-ADH并不区分这些酮底物(例如，50μM丁酮的电流反应等价于50μM丙酮)，丙酮的电流反应随着其他酮的浓度增加而加强。但是，在人类呼吸中没有发现显著性水平的其他酮，因此并不妨碍呼吸生物传感器的应用。
如先前提及的电化学测量丙酮依赖性NADH消耗，上述的3-酶系统提供实现特定商业设计标准所必需的基本分析方法。活性电极优选由导电性碳构成，其可以配制成丝网印刷油墨(即制成条状电极)或者其他能够通过低成本加工方法生产和最终随意使用的配方或组合物。为了实现这些最终目的，一些低成本电极材料用3-酶系统评价，以证明该酶系统用于测量丙酮的商业可用性。
附图19表示用丝网印刷镀铂碳电极通过3酶系统测定的对应于丙酮浓度的电流反应。电流反应与存在的丙酮的浓度线性相关。误差杆根据由8根电极(单独使用)测定的8个测量结果计算得到。可重复性由电极与电极的差异决定，主要在于电极表面的湿润度。已经发现预湿润电极5min可以显著地提高了可重复性。其他与丝网印刷镀铂碳电极非常相似的被评价材料是导电性碳布或纸，其上结合了高导电性的加载铂的毫微颗粒的石墨颗粒(加载10-20％(w/w))。这些布或纸被穿孔并粘贴到丝网印刷碳电极上，与3-酶系统合并使用来测量丙酮。附图20表示通过3酶系统转化丙酮产生的H2O2的电极电流反应(数据回归得到y＝6.1601x+18.889)。为了有助于湿润电极的表面，一些电极在使用前表面活性剂预处理以降低石墨-铂表面的疏水性。已经证实这种处理有助于湿润电极的表面而不会降低电极的灵敏度(数据未显示)。用3酶系统评价的第三种电极是含有介质钴酞菁的丝网印刷碳电极。附图21表示使用该电极的丙酮浓度的电流反应曲线。显示由于3酶系统中存在的NADH的电化学反应的偏移。当存在不同的固定浓度的NADH时，在应用相同电压下记录电流反应来进一步研究该效果(数据未显示)。在此已证明钴酞菁改进的丝网印刷碳电极对NADH有电活化作用(在H2O2测定的电压下)，因此存在高浓度NADH会干扰丙酮测定。但是，在3酶系统的试剂条件下，存在的低浓度NADH电流反应以确定方式(持续地)偏离，其中这可以从电流反应中被减去而不需要调整标准精确度。本试验结果说明铂电极或铂化碳电极不是唯一的在检测由3酶系统催化的丙酮依赖的H2O2形成中起作用的电极材料。其他用于检测H2O2的介质改进丝网印刷碳电极包括二茂络铁及其衍生物、醌及其衍生物、与多聚(乙烯基吡啶)偶联的二嘧啶锇、potassiumhexacyanoferrate、二茂镍、亚甲蓝、亚甲绿和吩嗪硫酸甲酯。
气态丙酮的基于酶的电化学检测如先前提及的，基于酶的电化学传感器的重要特征在于其能够量化气态丙酮的浓度。由于酶电极仅在液态下响应，两个能将丙酮气体转化成液态的取样系统被研究，从而使样本被直接或间接导入酶电极系统，其中产生与其对应的电流(与存在的丙酮的浓度成比例)。这两种取样系统的原理(在下文更加详细描述)遵循用于气液转化的Henry定律常数kh=ca·pg-1]]>其中kh是丙酮的Henry定律常数(24M·atm-1，由NIST(国家技术和标准协会)报道)，ca是液态(M)丙酮的浓度，而pg是气态丙酮的局部压强(atm)。作为结果，当气态丙酮样本与液态接触时，气液丙酮浓度达到Henry定律所表述的平衡。人类呼吸中的气态丙酮的浓度范围是0.5-10ppm(v/v)，需要通过生物传感器量化。因此，在平衡条件下，0.5-10ppm(v/v)的气态丙酮等于约10-200μM的液态丙酮。这种关系的依据用气态色谱证实，将标准浓度气态丙酮通过一块预先用确定体积的液体缓冲液湿润的聚氨酯泡沫。附图22是用于生成气态丙酮标准的仪器的图示。将已知量的丙酮注射到含有湿润空气的校准安全气袋中，并蒸发。蒸汽以固定速率释放并通过湿润的泡沫。然后测定液体中的丙酮浓度，并确定其与起始丙酮气态浓度的关系。采用这种转化策略(即湿润泡沫)，证明了在气流速度范围(0.5-5.0L/min)和气体体积(≥0.5L)时，气态丙酮转化为液态达到理论平衡浓度值。不用泡沫而用薄的液膜(50μL)来重复该试验，其中丙酮气态样本以极细的气流喷到液体上。采用这种转化策略，气态丙酮转化成薄液膜，获得接近平衡的浓度值。然后这些数据用于设计转化和通过3酶系电化学量化气态丙酮的恰当的液体体积和条件(模拟人类呼吸)。
附图23表示对丙酮气体的计时安培分析响应，用聚氨酯泡沫提取气体样本的手段。使用3酶系统作为基本变换器将被转化的丙酮转换为H2O2，然后在350mV(比照Ag/AgCl)下，用圆盘形铂电极电化学分析H2O2。在整个试验范围内，对气态丙酮浓度的电流反应具有优良的灵敏度和线性特征。数据线性回归得到方程y＝19.181x+18.787，R2值为0.993。通过将气态丙酮转化为含有3酶系统的液膜来重复本试验。结果显示在附图24中，其中计时安培分析电流反应与气态丙酮浓度线性相关。数据线性回归得到方程y＝26.931x+28.789，R2值为0.9966。这些结果说明任何一种气态取样策略(也就是，湿润泡沫或液膜)都很好地作为精确地将丙酮气体导入酶电极的系统，其中丙酮可以被电化学量化。
丙酮羧化酶的生物化学特性除了S-ADH之外，另一种适合在生物传感器中使用的丙酮特异性酶为丙酮羧化酶。如上提及的，丙酮羧化酶是唯一能在各种需氧和厌氧细菌中催化丙酮羧化成β-酮酸乙酰乙酸的酶，这些细菌能够以丙酮作为碳和能量来源生长。许多这种生物体还能够在异丙醇中生长，如先前所述，仲醇脱氢酶催化异丙醇起始氧化为丙酮，然后丙酮接着羧化为乙酰乙酸。丙酮羧化酶可以通过公开的方法从自养黄色杆菌中纯化。丙酮羧化酶是一种以α2β2γ2四级结构排列的包含三种多肽(19.6kDa、78.3kDa和85.3kDa)的复聚体酶，其羧化活性需要MgATP。该酶具有每毫克蛋白每分钟消耗0.206μmol丙酮的Vmax值以及7.8μM(丙酮)、122μM(ATP)和4.17mM(CO2加重碳酸盐)的表观Km值。丁酮也是一种底物，其羧化率为丙酮羧化率的40％。也已经从厌氧、光异养rhodobacter capsulatus菌株B10纯化得到丙酮羧化酶，其在四级结构(由19.5kDa、78.6kDa和85.2kDa的多肽组成的α2β2γ2复聚体)、动力学参数(每毫克蛋白每分钟消耗0.291μmol丙酮的Vmax值以及丙酮的Km为8.2μM)以及氨基酸序列(83％同一性)上与黄色杆菌属酶几乎相同。
用于电化学测量丙酮羧化酶反应的方案丙酮的ATP依赖的羧化来形成乙酰乙酸，该反应由丙酮羧化酶催化，不包括用于电化学检测的完全氧化还原化学。为了可用于生物传感器，需要开发具有底物氧化或还原的偶联酶反应。如附图25所示，丙酮羧化酶可被偶联到β-羟基丁酸盐脱氢酶，其中通过羧化反应形成的乙酰乙酸随后被该酶还原，伴随NADH氧化。然后可以用上述用于S-ADH的方法电化学监控NADH的丙酮依赖消耗。附图26表示用该酶系统分光光度绘制NADH氧化与时间的比率。仅在加入丙酮后观察到NADH的氧化，而加入乙醇(10mM)后没有出现比率下降，表明乙醇不抑制该反应。该酶系统对丙酮具有高度特异性，但是其他化合物(如1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇和2-丁醇)不具有活性，也不抑制丙酮羧化活性。丁酮一般作为以丙酮羧化率的40％被羧化的底物，采用偶联酶系统时具有约丙酮的3-4％的比率。这可能是由于β-羟基丁酸盐脱氢酶的底物特异性。
用得自自养黄色杆菌Py2菌株的S-ADH采用与上述方式相似的分光光度法研究与β-羟基丁酸盐脱氢酶偶联的丙酮羧化酶反应的丙酮检测极限。采用丙酮羧化酶和β-羟基丁酸盐脱氢酶偶联酶系统，NADH消耗反应与范围在0.058-208ppm(w/v)的丙酮浓度线性相关(相关系数＝0.99954)。丙酮检测范围的较低端(0.058-0.29ppm(w/v)在诊断呼吸丙酮分析所需的检测参数内。
在附图27中所示是一种可替代的酶系统，其偶联丙酮羧化酶ATP-水解与NADH氧化。该4组分酶系统已经被描述用于分光光度测量丙酮羧化酶活性，可以很容易改变用于电化学检测(附图27)。采用这种偶联分析，当丙酮被羧化时丙酮羧化酶生成AMP，然后形成的AMP在肌激酶催化的反应中转化为两分子ADP。由该反应形成的ADP被丙酮酸激酶磷酸化为ATP，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸盐转化为丙酮酸。然后形成的丙酮酸被该过程中消耗NADH的乳酸脱氢酶还原。虽然该酶系统更加复杂，其采用与上述相同的电化学检测方法。
第三种电化学监控丙酮羧化酶活性的方法包括改进在附图27中给出的策略，使ATP水解与H2O2反应偶联。如附图28中所示，在该策略中用丙酮氧化酶替代乳酸脱氢酶；当生成丙酮时，其被氧化，从而形成H2O2。为了研究该酶系统，在存在辣根过氧化物酶(HRP)和电子受体染料时，用得自黄色杆菌属Py2的丙酮羧化酶，以及肌激酶、丙酮酸激酶和丙酮酸氧化酶制备酶反应混合物(含有偶联的酶或试剂)，可以分光光度地监控反应系统终产物(H2O2)。附图29说明偶联反应的结果，其中加入丙酮时观察到吸收值增加，对应于H2O2形成。对于S-ADH-H2O2生成系统，在加入丙酮后出现滞后，这种滞后可以通过进一步优化反应条件来缩短。在附图30中所示的是第四种电化学监控丙酮羧化酶活性的方法，包括结合在附图27和28中图示的策略的某些方面。采用这种策略，从丙酮羧化酶β-羟基丁酸盐脱氢酶偶联反应中产生的NAD+被乳酸脱氢酶利用来氧化乳酸为丙酮酸。从而生成的丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化以产生H2O2，然后检测H2O2；电化学检测生成的H2O2(数据未显示)。
此外，作为另一种监控NAD(P)H的丙酮依赖性消耗的策略，如附图31所示丙酮单加氧酶与半乳糖氧化酶偶联来生成H2O2。另外，利用乳酸脱氢酶和丙酮酸氧化酶可以将丙酮单加氧酶NAD(P)+与H2O2形成偶联。
丙酮羧化酶的稳定性如上对S-ADH酶的描述，重要的是设计一种用于在室温下长期以干燥方式稳定丙酮羧化酶活性的配方。纯化的丙酮羧化酶被冷冻干燥，并在冷冻干燥一天内再用水溶解并分析时，保留相对于非冷冻干燥的对照的约90％的活性(数据未显示)。但是存放在室温和4℃下时，数天中其活性下降。S-ADH的情况为，海藻糖的存在能保持在室温下放置的样本的活性(＞90％)至少111天。在个别试验中，整个偶联分析反应混合物(即得自自自养黄色杆菌Py2菌株的丙酮羧化酶、β-羟基丁酸盐脱氢酶、NADH、ATP、缓冲液、醋酸钾和氯化镁)被冷冻干燥来确定检测成分对该处理是否稳定。当检测混合物在一天之内再用水溶解并分析，保留了其活性的84％。当被冷冻干燥的反应混合物中包括了海藻糖，其活性的95％被保存。进行第三个稳定性试验，在存在海藻糖(20％w/v)时不同于冷冻干燥，可以风干丙酮羧化酶。在这种情况下，丙酮羧化酶在24h后保留100％活性(数据未显示)。一种酶可以风干(替代冷冻干燥)并保持其活性是丝网印刷技术特别需要的。
将丙酮特异性酶并入用于呼吸丙酮的基于酶的电化学传感器的其他前景在一些丙醇氧化细菌中，丙酮作为中间产物形成，一般认为丙酮在O2依赖的单加氧酶催化的反应中进行羟基化以形成丙酮醇(羟丙酮)。虽然这种细菌酶尚未被完全表征，但是它以与迄今所述的其他单加氧酶和系统相似的方式起作用。已知的单加氧酶一般由多个酶成分(2-4个酶成分)组成，包括吡啶核苷酸依赖的还原酶、电子转移蛋白(如铁氧化还原蛋白)和含有活性位点的加氧酶成分。NAD(P)H提供O2活化所需还原剂，并将氧原子结合到脂肪族烃底物上。可以用上述用于仲醇脱氢酶和丙酮羧化酶相偶联的酶系统的方法(附图1)电化学监控丙酮单加氧酶反应的NAD(P)H的丙酮依赖消耗。此外，丙酮P450单加氧酶已经在哺乳动物系统中被描述。虽然这种酶可能具有不同于细菌来源的丙酮单加氧酶的生物物理特性(也就是不同大小亚基分子量、氨基酸序列等)，其催化的反应适合于监控基于酶的生物传感器中的丙酮，采用与所述用于细菌丙酮单加氧酶相似的策略。丙酮单加氧酶反应的产物丙酮醇已经被报道是半乳糖氧化酶的底物(J.Tkac等，酶和微生物技术(2001)28383-88；M.M.Whittaker和J.W.Whittaker，生物化学(2001)407140-48)。因此，作为监控丙酮依赖的NAD(P)H消耗的另一种策略，如附图31所述丙酮单加氧酶反应可以被偶联到半乳糖氧化酶来形成H2O2。
丙酮信号放大策略当被测样本中的丙酮浓度很低时，放大酶电极信号很重要。例如，呼吸中丙酮的基础水平(未禁食个体)相对较低(0.2-0.5ppmv/v)。通过酶再生底物(无效循环)实现放大，从而放大输出信号。因此，不完全饱和的低水平丙酮可以获得连续反应比率，将持续稳定增大信号强度。只要该浓度对于所用酶系统来说是不完全饱和的，增大比率将依赖于所测量丙酮的起始含量。因此，生物传感器可以通过测定反应比率来校准，并将它们与起始丙酮浓度相关联。
在第一个实施例中，如附图32所示，一个放大方案采用乙酰乙酸脱羧酶。乙酰乙酸脱羧酶存在于发酵微生物中，催化丙酮羧化的逆反应。采用这种方案，乙酰乙酸脱羧酶ATP水解活性与附图28中所示H2O2形成偶联，然而加入乙酰乙酸脱羧酶再生乙酰乙酸为丙酮，从而建立一种不会耗尽(deplete)丙酮浓度的系统。这种放大系统的另一种变化形式示于附图33，其中乳糖氧化酶被加入到先前在附图27中给出的偶联酶系统。当丙酮酸被还原成乳酸时，乳酸氧化酶催化乳酸再生为丙酮酸，在该过程中生成H2O2，然后用电化学检测。
许多不同的丙酮信号放大策略可以与S-ADH酶一起应用。在第一个实施例中，在附图34中说明，S-ADH酶被偶联到吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖的乙醇脱氢酶；这种酶之一分离自假单胞菌属sp.菌株VM15C(Shimao，1986)。该特定PQQ-脱氢酶已经被报道对低分子量仲醇而不对伯醇具有特异性。在这种放大策略中，S-ADH酶将丙酮还原成异丙醇，然后形成的异丙醇由PQQ依赖的乙醇脱氢酶再氧化为丙酮。从该氧化产生的电子通过PPQ酶辅基直接传递给电极。涉及指导电子转移的整合的酶电极已经被报道用于这类酶。一个相似的例子示于附图35，其中S-ADH偶联到仲醇氧化酶(SAO；EC 1.1.3.18)。SAOs已经分离自许多不同生物体中，如假单胞菌属sp.参见如M.Morita等，假单胞菌的仲醇氧化酶的分离和特性，农业生物化学431225-35(1979)。采用这种策略，丙酮被再循环，其中丙酮最初被S-ADH还原并接着被SAO再氧化，在底物循环的每次周转中同时生成H2O2。这种线性放大方案简单(仅需要两种酶)并且具有相对容易地监控H2O2的优点，是有利的。
这种用于信号放大的系统结合乙醇脱氢酶和乙醇氧化酶活性，通过将伯醇氧化酶(AO)偶联到伯醇脱氢酶来研究。用乙醇作为底物并在同一反应时间测定H2O2形成的增加，用双酶系统观察到比仅用AO时增加7-10倍(数据未显示)。当使反应时间延伸到更长时期时，对于双酶系统，该信号可以进一步增强。这说明用于放大对丙酮的响应的实用方法是将S-ADH偶联到SAO。
附图36阐述放大策略的第三个例子，其通过利用从由S-ADH催化的反应中制备NAD+来增强S-ADH/SAO偶联系统。在这种情况下，从将丙酮还原为异丙醇中生成的NAD+被偶联到羟基丁酸脱氢酶(HBDH)，其中羟基丁酸盐(过量加入)被氧化为乙酰乙酸。然后乙酰乙酸被乙酰乙酸脱羧酶(ACD)脱羧为丙酮，从而增加丙酮的含量(以一分子)，丙酮进行后续的再循环。与附图35所述提供丙酮反应的线性放大(即对于各种底物循环来说，生成的H2O2量加倍)酶系统不同，这种类型的放大系统将指数性增加H2O2产出量，可以检测生物样本中极其低水平的丙酮。
第四个例子示于附图37，其中放大策略对于NADH或NADPH协同因子优先使用S-ADH酶。在这种情况下，第一个S-ADH催化丙酮还原为异丙醇，并氧化NADPH。第二个S-ADH再将异丙醇氧化为丙酮，生成NADH，然后NADH被NADH依赖的心肌黄酶(D)用于还原电子介质，然后如通过在电极处被氧化而被检测。虽然这种系统能够产生放大，其一种商业应用优选采用具有真正完全辅酶特异性的的S-ADH酶，以及一种调控和如实监控辅酶浓度和化学平衡的底物/产物比的方法。
如本文所述，在一个优选实施例中提供一种方法用于将丙酮特异性酶结合到电化学或非电化学的生物传感器中，从而使这些活性能用于诊断监控人类呼吸中的丙酮。如本文所讨论，电化学测量丙酮的优选策略采用结合形成连锁酶系统的酶，包括1)仲醇脱氢酶(S-ADH)催化丙酮还原，伴随着NADPH消耗，和2)S-ADH催化丙酮还原，伴随着NADH消耗(大体上是S-ADH催化丙酮还原，伴随着NAD(P)H消耗，电化学检测NAD(P)H)；3)与NADPH消耗偶联的丙酮酸羧化酶反应(如，β-羟基丁酸脱氢酶)，和4)与NADPH消耗(大体上是与NAD(P)H消耗偶联丙酮酸羧化酶反应，电化学检测NAD(P)H)偶联的丙酮酸羧化酶反应(如，β-羟基丁酸脱氢酶)；5)与NADPH消耗偶联的丙酮羧化酶反应ATP水解，和6)与NADPH消耗(大体上是与NAD(P)H消耗偶联丙酮酸羧化酶反应，电化学检测NAD(P)H)偶联的丙酮羧化酶反应ATP水解；7)S-ADH反应NADP+形成偶联H2O2形成，和8)S-ADH反应NAD+形成偶联H2O2形成(大体上是S-ADH反应NAD+形成偶联H2O2形成，电化学检测H2O2)；9)丙酮羧化酶反应ATP水解偶联H2O2形成，电化学检测H2O2；10)丙酮羧化酶反应偶联(如β-羟基丁酸脱氢酶)NADP+形成偶联H2O2形成，和11)丙酮羧化酶反应偶联(如β-羟基丁酸脱氢酶)NAD+形成偶联H2O2形成(大体上是，丙酮羧化酶反应偶联，如β-羟基丁酸脱氢酶，NAD(P)+形成偶联H2O2形成，电化学检测H2O2)；12)丙酮单加氧酶偶联NADH氧化(大体上是，丙酮单加氧酶偶联NAD(P)H氧化。本发明不限于这些酶系统，任何丙酮特异性酶可以被用于本发明的酶系统。而且，可以使用任何电化学可检测的适合与丙酮特异性酶偶联的协同因子和中间产物。
实施例5按照本发明的丙酮生物传感器可以被用于追踪由“标记”化合物代谢形成的丙酮的释放，该化合物作为药物配方或者其他被施用或被植入的组合物的一部分被施用。在一个优选实施例中，乙酰乙酸和/或任何其药学上可接受的盐和药学上可接受的酯或氨基化合物可以用作一个标记来追踪组合物的释放，该组合物被施用或植入一个或一组活的生物体中，如环境样本或细胞培养物或菌落。乙酰乙酸的药学上可接受的碱性加成盐包括碱金属如钠、钾和锂盐；碱土金属，如钙和镁；过渡金属，如锌、铁和铜；碳酸盐、碳酸氢盐、铵、烷基铵、烷基胺、链烷醇胺和羟基链烷胺盐。另外适合的有醇酯。优选地使用乙酰乙酸的钠盐或钾盐。优选的酯为乙基酯。乙酰乙酸及其钠盐或钾盐在室温下为固体，而乙酸乙酯在室温下为液体。乙酰乙酸盐用作标记目的被施用，以约10mg-约200mg的剂量，优选在约10mg-约170mg的范围。
在脂肪酸β氧化过程中，在各个氧化循环中从脂肪酸链上水解两分子乙酰辅酶A，在这过程中生成能量所需的ATP。如此生成的乙酰辅酶A被代谢为二氧化碳，或者其可以在哺乳动物肝中通过转化为乙酸乙酯形成酮体过程中被利用。以这种方式制备的乙酰乙酸可以作为替代葡萄糖的另一种能量来源，特别在饥饿时。通过肝脏生成的乙酰乙酸释放到血液中作为能量/燃料，特别被大脑和心肌利用。流入动物血流中的自由乙酰乙酸已经被证明会引起丙氨酸和谷氨酸水平升高，可能是由于肌肉刺激产出这些氨基酸，而且已知降低血糖水平。总之，通过代谢和呼吸和从尿液中排出，丙酮被从哺乳动物系统中迅速清除。乙酰乙酸自发脱羧生成丙酮和二氧化碳，在高血液水平乙酰乙酸的个体的呼吸中，丙酮的气味极显著。以CO2和未改变的丙酮呼出是丙酮从体内除去的基本路径。呼出的未改变的丙酮量与体内丙酮浓度相关。用丙酮特异性生物传感器可以检测尿中和呼出的丙酮。
因此，丙酮特异性生物传感器可以被用于检测乙酰乙酸标记的丙酮释放，从而追踪施用的治疗性化合物或植入的组合物，或者植入的组合物的生物降解和/或生物侵蚀。
在优选实施例中，施用的配方在具有期望生物释放的主要物质的混合物含有乙酰乙酸、盐、酯、或氨基化合物。这种主要物质例子包括但不限于药学上可接受的活性成分、生物药物(biopharmaceutical)(例如，蛋白质如抗体、激素、酶、血清和疫苗；基因治疗)和其他生物活性物质如食物添加物(例如，维生素、矿物质、草药添加物和nutraceuticals)。
药学活性成分包括但不限于止痛剂、麻醉剂、抗酸剂、驱虫剂、抗生素、抗凝血剂、抗痉挛药物、抗抑郁剂、抗呕吐药、抗真菌药、抗高血压药、抗感染药、抗炎症药、抗狂躁剂、抗菌剂、抗肿瘤剂、抗寄生虫药、抗原生动物药物、安定药、退热剂、防腐剂、抗病毒剂、自主药剂(如抗胆碱药、类交感作用药、抗交感神经药、拟副交感神经功能药物、副交感神经阻断药)、气管扩张剂、心脏血管药、泻药、化疗剂、凝血剂、避孕药、镇静剂、利尿剂、除痰剂、生血药、催眠药、免疫调节剂、精神病药物、镇静剂、刺激物、镇定剂、血管收缩药和血管扩张药。
在优选实施例中，植入的组合物为固体物质，往其中加入或嵌入乙酰乙酸、盐、氨基化合物或酯，或者其配方，例如，以粉末的、粒状的颗粒或液体或溶液液滴、分散在成批的固体物质和/或其间隙中。颗粒或液滴可以仅由乙酰乙酸、盐、氨基化合物或酯，或者其溶液组成，或者它们结合了其他物质，包括但不限于上述主要物质和药学上可接受的赋形剂、佐剂、稀释剂和/或载体。这些固体材料可以是坚硬的、或者是可塑的、橡胶样、凝胶状和/或泡沫状材料，并且它可以为任何形状，例如团状、块状、条状、球形、片状、薄膜、膜、纤维、织物、网筛或基质形式。
用乙酰乙酸或其衍生物来标记药物，可以通过用按照本发明的丙酮特异性酶系统检测呼吸丙酮容易地检测适合于前述治疗体系的物质。因此，由于年龄或疾病精神受损患者、精神病患者或者任何其他适应力极差的患者可以以非侵入方式监控药物剂量。通过结合丙酮特异性生物传感器与相连的分析装置，例如，互联网，可以获得在家监控患者的即时结果。通过这种方式，丙酮特异性生物传感器可被用于确保对特定患者进行健康护理服务，用于在临床检验场所检测药物配方的生物释放，和用于持续检测药物配方的延迟释放或控制释放。
丙酮特异性生物传感器还可以用在生物环境中，例如医药装置、植入物等。这些装置和植入物包括药物传送植入物、美容植入物、假体植入物和生物植入物。
如上指出，乙酰乙酸在室温下为固体。因此，在室温下为固体的乙酰乙酸及其药学上可接受的盐和药学上可接受的酯和氨基化合物适合用于，例如，粉末、颗粒、药丸、片剂、胶囊、植入物和溶液配方。在室温下为液体的乙酰乙酸的药学上可接受的盐和药学上可接受的酯和氨基化合物适合用于，例如液体配方(如炼金药、糖浆、滴剂和液体胶囊)和半液体配方(例如软膏、面霜和药膏)。优选固体配方包括药丸、片剂和胶囊配方，更优选为非咀嚼药丸、片剂和胶囊，还包括埋植的配方。优选溶液、流体和半流体配方包括可注射和难溶的配方，更优选肠胃外可注射和难溶的配方，还包括埋植的配方。
用于涉及药学上可接受盐、酯和氨基化合物的术语“烷基的”在此定义为“脂肪族的”。优选的“烷基的”基团包括C1-C10脂肪族基团，更优选不饱和C1-C10脂肪族基团，还更加优选C1-C6脂肪族基团。甚至更优选使用直链烷基基团，优选不饱和C1-C4脂肪族基团。
通过使用丙酮特异性生物传感器的例子将是监控诊断为两极症的患者的碳酸锂摄入。需要及其严格地滴定锂来获得合理的产生效力的例子水平，而不导致过量。过量锂会致命。因此，300mg碳酸锂的胶囊可以再配制成含有200mg乙酰乙酸钠，以标准的方式施用于患者(例如，每天四次)。然后用丙酮特异性生物传感器检测从乙酰乙酸盐标记释放的丙酮来监控患者的顺应性。通过用互联网与生物传感器连接，患者的医师可以每天记录在一段时间内所测定的丙酮水平。可以同时测定血液锂水平来确定丙酮测定值与锂的生物利用度的关系。因此，本发明的生物传感器可被用于减少或消除侵入(如血液)检测锂水平的需要。
另外，丙酮标记可与安慰剂形式的药学活性化合物共同施用，而不与该化合物配制在一起。将乙酰乙酸盐灌注人类患者的方法是本领域已知的。患者可在数小时期间如3小时，以约20μmol/kg/min灌注乙酰乙酸钠或自由/游离乙酰乙酸。已经证明以1.36mmol/min速率持续灌注乙酰乙酸钠3小时会导致灌注结束时血液酮体浓度增加到3μmol/ml。持续灌注3-14C标记的乙酰乙酸、钠盐(例如，以0.68-0.88毫微居里每公斤每分钟(mμCi/kg/min)的速率灌注)，可以追踪呼吸排出物的14CO2。因此，将标记的乙酰乙酸与目标药物一起灌注，能够提供一种将丙酮生成与目标药物的血液生物利用度相关联的方法。
还期望一种检测样本中丙酮的试剂盒，包括与生物传感器分离或包含在其中的丙酮特异性酶系统，以及使用说明书。例如，丙酮特异性酶系统可被粘贴或安置在一次性检测条上，该检测条可被插入容器中，该容器具有导入生物样本的入口。另外，生物传感器容器和丙酮特异性酶系统可被做成单一的一次性设备。
考虑到检测生物样本中丙酮的已有方法的局限性，发明丙酮特异性酶系统和含有这些酶系统的生物传感器产生对低浓度丙酮更灵敏、对丙酮更特异和更不可能得出由于杂质干扰的错误读数的优点。因此，发明丙酮特异性生物传感器适于在实验室外使用，并且可以是便携式的。便携式丙酮特异性生物传感器具有丙酮高灵敏度，方便在各种场所监控丙酮水平，而且可期望具有体液丙酮的传统硝普盐检测的最低水平的精确度。
通过用能够产生与丙酮特异性酶相同的协同因子(如，NAD(P)H或NAD(P)+)或反应副产物的不同酶替代丙酮特异性酶，本文公开的各种信号扩大方案还可以用在检测除了丙酮之外化合物的系统。
本文给出的概念和数据提供了开发特异于丙酮检测的基于酶的生物传感器的途径。虽然本发明已经用在此描述的优选实施例阐明，本领域技术人员知晓各种其他修改是显然的，并且容易由这些技术人员实施，而不背离本发明精神和保护范围。因此，目的不在于将附加的权利要求的保护范围限定在本文描述的优选实施例中，而是从总体上宽泛地解释由这些公开所支持的完全宽度。引用的所有参考文献的公开在此合并作为参考。
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<220>
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<221>结构域<222>1..9<223>仲醇脱氢酶，胰蛋白酶片段<400>12Gly Leu Val Tyr Arg Gly Pro Gly Lys1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>自养黄色杆菌Py2<220>
<221>结构域<222>1..7<223>仲醇脱氢酶，胰蛋白酶片段<220>
<221>不确定的<222>3..3<223>Ile3可能是Leu3<400>13His Gln Ile Ala Ser Ser Arg1 5<210>14
<211>6<212>PRT<213>自养黄色杆菌Py2<220>
<221>结构域<222>1..6<223>仲醇脱氢酶，片段<400>14Leu Asp Asn Val Pro Glu1 5<210>15<211>6<212>PRT<213>自养黄色杆菌Py2<220>
<221>结构域<222>1..6<223>仲醇脱氢酶，片段<400>15Phe Asp Gln Arg Gln Pro1 5<210>16<211>8<212>PRT<213>自养黄色杆菌Py2<220>
<221>结构域<222>1..8<223>仲醇脱氢酶，片段<400>16Gly Ala Gly Arg Ile Ile Ala Val1 5<210>17<211>7<212>PRT
<213>自养黄色杆菌Py2<220>
<221>结构域<222>1..7<223>仲醇脱氢酶，片段<400>17Gln Val Glu Pro Leu Met Ser5<210>18<211>9<212>PRT<213>自养黄色杆菌Py2<220>
<221>结构域<222>1..6<223>仲醇脱氢酶，片段<400>18Phe Phe Ala Asp Ile Ile Glu Ala Ala1 5<210>19<211>6<212>PRT<213>自养黄色杆菌Py2<220>
<221>结构域<222>1..6<223>仲醇脱氢酶，片段<400>19Asp Thr Val Thr Thr His1 权利要求
1.一种丙酮特异性酶系统，包括选择性地以丙酮作为底物，并与可检测的信号介质偶联的酶。
2.按照权利要求1的丙酮特异性酶系统，其中丙酮特异性酶是丙酮单加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脱氢酶中的任何一种。
3.按照权利要求1的丙酮特异性酶系统，其中丙酮特异性酶被偶联到可通过电化学或光度方法检测的信号介质。
4.按照权利要求3的丙酮特异性酶系统，其中丙酮特异性酶系统是与NAD(P)H氧化偶联的丙酮羧化酶产物形成、与NAD(P)H氧化偶联的丙酮羧化酶ATP-水解、与H2O2形成偶联的丙酮羧化酶ATP-水解、仲醇脱氢酶(S-ADH)伴随NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶偶联到β-羟基丁酸盐脱氢酶催化的NAD(P)+形成偶联到H2O2产生、S-ADH催化NAD(P)+形成偶联到H2O2产生、丙酮单加氧酶偶联到NAD(P)H氧化、或者丙酮单加氧酶偶联到H2O2产生、或者丙酮单加氧酶催化NAD(P)+形成偶联到H2O2形成的任何一种。
5.按照权利要求4的丙酮特异性酶系统，其中仲醇脱氢酶得自哺乳动物或微生物，微生物是需氧菌、厌氧菌、酵母、真菌或产甲烷菌的任何一种。
6.按照权利要求5的丙酮特异性酶系统，其中仲醇脱氢酶分离自热厌氧杆菌属Thermoanaerobium、黄色杆菌属(Xanthobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)或分枝杆菌属(MycobacteriumO中任何一种物种。
7.按照权利要求5的丙酮特异性酶系统，其中仲醇脱氢酶分离自自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)Py2菌株。
8.按照权利要求4的丙酮特异性酶系统，其中丙酮羧化酶分离自黄色杆菌属、红色杆菌属或红球菌属中任何一种物种。
9.按照权利要求4的丙酮特异性酶系统，其中信号介质是有机协同因子、无机协同因子、指示剂、电子转移介质、光度介质、酶反应副产物或它们的结合中的任何一种的成员。
10.按照权利要求9的丙酮特异性酶系统，其中得自电化学可检测信号介质的信号通过再循环酶底物来放大电化学信号输出值被线性或指数地放大。
11.一种应用按照权利要求1的丙酮特异性酶系统的方法，其中所述方法包括a)结合i)至少一种药物化合物，与ii)至少一种选自乙酰乙酸和药学上可接受的乙酰乙酸盐、酯和酰胺的标记来形成被标记的药物化合物；b)将该被标记的化合物施用给患者；和c)此后，通过用丙酮特异性酶系统检测来自该患者的生物学样本中的丙酮浓度来检测进入患者血流的标记释放，其中由于标记降解形成丙酮，丙酮存在于患者的生物样本中；d)使从生物样本中测定的丙酮浓度与来自被施用的标记化合物药物化合物的释放相联系；和e)可选择地，重复步骤c)和d)来确定药物化合物从被施用标记化合物释放比例。
12.一种应用按照权利要求1的丙酮特异性酶系统的方法，其中所述方法包括a)结合i)至少一种选自乙酰乙酸和药学上可接受的乙酰乙酸盐、酯和酰胺的标记，与ii)一种生物相容组合物来形成一种生物相容的植入物或装置；b)将该生物相容的植入物或装置放入患者中；c)此后，通过用丙酮特异性酶系统检测来自该患者的生物学样本中的丙酮浓度来检测进入患者血流的标记释放，其中由于标记降解形成丙酮，丙酮存在于患者的生物样本中；d)使从生物样本中测定的丙酮浓度与来自生物相容植入物或装置的生物相容组合物的降解或释放相联系；和e)可选择地，重复步骤c)和d)来确定生物相容植入物或装置的降解或释放比例。
13.一种应用按照权利要求1的丙酮特异性酶系统的方法，其中所述方法包括通过结合至少一种选自乙酰乙酸、乙酰乙酸盐、酯和氨基化合物的成员与生物相容组合物来形成生物相容植入物或装置来标记生物相容性植入物或装置；将该生物相容植入物或装置放入患者中；和测定来自生物相容植入物或装置的乙酰乙酸的释放。
14.一种检测生物样本中的丙酮的方法，所述方法包括将生物含有的丙酮导入包括至少一种利用丙酮作为底物的丙酮特异性酶系统的生物传感器；和检测由丙酮与丙酮特异性酶系统相互作用生成的产物。
15.按照权利要求14的方法，其中检测是通过电化学的、光度的或量热的装置实现的。
16.按照权利要求14的方法，其中所述方法还包括通过电化学处理电极便于至少一种丙酮特异性酶系统与生物样本中的丙酮间的电化学传导；和电化学检测一种产生自至少一种丙酮特异性酶系统与生物样本中丙酮间反应的产物。
17.按照权利要求14的方法，其中该至少一种丙酮特异性酶系统包括为丙酮单加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脱氢酶中任意一种的酶。
18.按照权利要求17的方法，其中该至少一种丙酮特异性酶系统包括为丙酮羧化酶产物形成偶联NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶联NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶联H2O2形成、仲醇脱氢酶(S-ADH)结合NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶偶联到β-羟基丁酸盐脱氢酶催化NAD(P)+形成偶联到H2O2产生、S-ADH催化NAD(P)+形成偶联到H2O2产生或丙酮单加氧酶偶联到NAD(P)H氧化的任何一种的成员。
19.按照权利要求17的方法，其中生物样本为蒸汽形式。
20.按照权利要求19的方法，其中该方法包括电化学检测0.2ppm到10ppm水平的丙酮蒸汽样本。
21.一种用于检测生物样本中丙酮的生物传感器，包含至少一种含有选择性以丙酮作为底物，偶联到可检测的信号介质的丙酮特异性酶系统；和一个用于检测从至少一种丙酮特异性酶系统与生物样本中丙酮间反应产生的产物的装置。
22.按照权利要求21的生物传感器，还包括一个具有用于将生物样本导入丙酮特异性酶系统的入口的容器。
23.按照权利要求21的生物传感器，其中该丙酮特异性酶系统以干燥或冻干形式存在直到与生物样本接触。
24.按照权利要求21的生物传感器，其中检测是通过电化学的、光谱的或量热装置实现的。
25.一种按照权利要求24的电化学生物传感器，其中该至少一种丙酮特异性酶系统包括丙酮单加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脱氢酶中任意一种酶。
26.按照权利要求25的电化学生物传感器，其中该至少一种丙酮特异性酶系统为丙酮羧化酶产物形成偶联NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶联NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶ATP-水解偶联H2O2形成、仲醇脱氢酶(S-ADH)结合NAD(P)H氧化、丙酮羧化酶偶联到β-羟基丁酸盐脱氢酶催化NAD(P)+形成偶联到H2O2产生、S-ADH催化NAD(P)+形成偶联到H2O2产生或丙酮单加氧酶偶联到NAD(P)H氧化、丙酮单加氧酶偶联到H2O2产生、或者丙酮单加氧酶催化NAD(P)+形成偶联到H2O2形成的任何一种的成员。
27.一种按照权利要求25的电化学生物传感器，其中丙酮特异性酶系统通过存在海藻糖而稳定的保藏。
28.一种按照权利要求25的电化学生物传感器，其中生物样本是液体形式或蒸汽形式。
29.一种按照权利要求25的电化学生物传感器，进一步包括用于从在丙酮检测中发生的电化学反应中产生的定性或定量结果的装置或用于连接(interface)所述生物传感器与所述装置来产生定性或定量结果的装置。
30.一种按照权利要求25的电化学生物传感器，其中具有至少两个分析物检测电极，被沿着样本检测路径以顺序排列簇被聚集，其中至少所述分析物检测电极之一为可操作地含有丙酮特异性酶系统的丙酮特异性酶电极。
31.一种用按照权利要求20的生物传感器来监控患者医学状况的方法，其中该方法包括a)得到至少一种来自患者的生物样本和将生物样本导入该生物传感器中；b)通过检测与生物传感器的丙酮特异性酶系统相互作用的丙酮测定生物样本中的丙酮浓度；c)可选择地，将生物传感器与计算机网络连接来传送测定值；和d)将丙酮浓度测定值与患者医学状况相联系。
32.按照权利要求31的方法，其中被监控的医学状况是糖尿病或体重下降。
33.一种用于检测样本中丙酮的试剂盒，该试剂盒含有与可检测的信号介质偶联的至少一种包括选择性以丙酮作为底物的酶的丙酮特异性酶系统；和用于至少一种丙酮特异性酶系统的容器。
34.按照权利要求33的试剂盒，进一步含有其上放置了丙酮特异性酶系统的一次性检测条。
35.按照权利要求34的试剂盒，其中该检测条与该容器相分离使得该检测条可被插入到该容器中，该容器具有一个可导入样本的孔。
36.按照权利要求34的试剂盒，其中该检测条和该检测条的容器构造成单一的一次性装置，该容器具有一个可导入样本的孔。
37.一次性检测条，其上放置了丙酮特异性酶或丙酮特异性酶系统。
38.按照权利要求37的检测条，其中丙酮特异性酶是丙酮单加氧酶、丙酮羧化酶或仲醇脱氢酶中的任意一种。
39.一种得自自养黄色杆菌Py2菌株(ATCCPTA-4779)的蛋白质，具有NAD+依赖的仲醇脱氢酶活性、能够将丙酮还原为异丙醇和具有酮和仲醇的特异活性；(A)所述蛋白质(1)具有，对于将异丙醇氧化为丙酮的pH最佳值为7.8，和(2)对于氧化醇类，具有pH7.8时在相当条件下分别用C3-C5直链仲醇和用C2-C5直链伯醇测定时，至少50∶1的仲醇对伯醇的平均比活性；(B)对于将丙酮还原为异丙醇，所述蛋白质具有(1)pH最佳值为6.2，(2)约144±18μM的表观Km，(3)约43.4±1.2μmol还原丙酮·min-1·mg-1蛋白的表观Vmax，(4)约30.4sec-1的表观kcat，(5)约2.1×105的表观kcat/Km，和(6)约5.1±0.4μM的NADH的Km；和(C)所述蛋白质包括至少一个多肽分子量，(1)所述多肽分子具有(a)质谱分析确定的约37.1kDa的分子，(b)由变焦电泳确定的约7.4的pI，和(c)SEQ ID NO7的十四个N末端氨基酸序列，和(2)所述多肽分子量能够被降解形成具有SEQ ID NO8到SEQ ID NO19的氨基酸序列的片段。
40.一种得自按照权利要求37的蛋白质的多肽分子，(1)所述多肽分子具有(a)质谱分析确定的约37.1kDa的分子量，(b)由变焦电泳确定的约7.4的pI，和(c)SEQ ID NO7的十四个N末端氨基酸序列，和(2)所述多肽分子量能够被降解形成具有SEQ ID NO8到SEQ IDNO19的氨基酸序列的片段。
全文摘要
本发明描述了特异于丙酮的酶系统和采用这些系统检测生物的或环境的样本中的丙酮的方法。本发明公开了含有这些酶系统的生物传感器，其中丙酮的检测通过连接电化学的、光度测定的或者其他检测方法与一个或多个丙酮特异性酶反应或路径。本发明还涉及应用这种丙酮特异性传感器监控包括患者控制体重、疾病检测和治疗剂的生物利用度的方法。
文档编号A61B5/08GK1620502SQ02826929
公开日2005年5月25日 申请日期2002年11月8日 优先权日2001年11月9日
发明者P·E·克兰利, J·R·艾伦, K·L·达诺夫斯基, J·A·麦金太尔, T·E·小米勒, B·M·罗斯纳, A·D·斯特里克兰, V·苏布拉马尼亚恩, L·孙 申请人:陶氏环球技术公司