新的血管内皮细胞生长抑制剂同种型的制作方法

专利名称：新的血管内皮细胞生长抑制剂同种型的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗其中抑制血管生成较为有利的疾病(例如，治疗实体瘤、糖尿病性视网膜病、卡波西肉瘤、银屑病和类风湿性关节炎)的组合物。具体地，本发明涉及新的血管内皮细胞生长抑制剂(VEEGI)同种型、它们的DNA及相关蛋白序列、其组合物及变体以及它们在治疗血管生成驱动的疾病中的用途。
背景技术：
在正常生理条件下，人类和动物在非常特殊有限的情况下经历血管生成(组织或器官内新血管的生成)。例如，血管生成正常地见于伤口愈合、胚胎发育、以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成中。术语“内皮”是指衬在浆液腔、淋巴管和血管内的薄层扁平上皮细胞。术语“抗血管生成”或“血管生成抑制活性”通常指分子抑制血管生成的能力。
控制性和非控制性血管生成两者被认为是以相似的方式进行的。内皮细胞活跃地参与炎症、细胞粘附、凝结、血栓形成、纤维蛋白溶解和血管生成。内皮细胞及外膜细胞，由基底膜环绕，形成毛细血管。血管生成起始于内皮细胞和白细胞释放的酶对基底膜的侵蚀。沿血管腔排列的内皮细胞随之自基底膜向外突出。血管生成刺激物诱导内皮细胞迁移穿过侵蚀的基底膜。迁移细胞形成脱离亲本血管的“芽突”，内皮细胞在此处经历有丝分裂并增殖。内皮芽突彼此融合形成毛细管环，产生新血管。
持续非调控性血管生成在多种疾病状态、肿瘤转移和内皮细胞异常生长中发生，并助长了这些疾病中观察到的病理损伤。存在非调控性血管生成的各种病理疾病状态被集合起来作为血管生成依赖性或血管生成相关性疾病。
在肿瘤生长期间，内皮细胞增殖、侵入基质、向血管生成刺激物如癌细胞迁移、与血管周围细胞和基质细胞相互作用并最终形成连接肿瘤组织和循环的毛细管(J.Folkman(1995)Nat.Med 127-31)。虽然毋庸置疑，调控血管生成的高度复杂机制尚有待了解，但逐渐变得清晰的是该过程的起始和终止是血管生成的正调节子和负调节子之间平衡的结果。许多血管生成因子(常在肿瘤组织中显著上调)已有描述，包括成纤维细胞生长因子家族的数个成员，例如FGF-I(G.Gimenez-Gallego等(1985)Science 230.1385)、FGF-2(L.Schweigerer等(1987)Nature 325257)以及血管内皮细胞生长因子家族(VEGF)的那些成员(D.W.Leung等(1989)Science 2461306)，还有这些生长因子的受体(L.W.Burrus和B.B.Olwin(1989)J Biol.Chem.26418647；S.Wemistrom等(1991)Growth Factors 4197；B.Tennan等(1992)Biochem.Biophys.Res.Comm.1871579.C.de Vries等，(1992)Science 255989)。最近，发现两种新的蛋白因子，即增殖素和增殖素相关蛋白，参与调控小鼠胎盘新血管形成的起始和停止(Jackson D，等Science 266，1581-4，1994)。特此将本文上文和下文引用的所有文献特别地整体并入作为参考。
已经报道了数种血管生成抑制剂，包括血小板反应蛋白(D.J Good等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.876624)、制管张素(angiostatin)(M.S.O′Reilly等(1994)Cell 79315)、内抑素(endostatin)(M.S.O′Reilly等(1997)Cell 88277)和血小板因子-4(E.Maione等(1997)Science 24777)。显然正常血管生成在需要时迅速激活，并且当不再需要时即刻终止，而病理性血管生成一旦起始，通常拖延并难以停止。这表明在正常血管生成过程中行使功能的负调控机制在病理性血管生成过程中丧失或者抑制。已有提示，由许多前体释放血管生成抑制剂的蛋白水解活性可部分地解释血管生成的下调，正如从凝血酶原蛋白水解激活制管张素以及从胶原蛋白XVIII蛋白水解激活内抑素所表明的那样(M.S.O′Reilly，(1997)Cell 88277)。尽管许多已知的血管生成调节剂是多效性的，可作用于其它细胞类型以及产生该调节剂的细胞类型，但人们可以想到内皮细胞可能产生自分泌因子以抑制血管生成过程或者维持成熟脉管系统的静止。因而本申请的目标在于描述一类特异性地由内皮细胞表达的称之为血管内皮细胞生长抑制剂(VEGI)的新的自分泌血管生成负调节剂。
公开的PCT申请WO 99/23105公开了VEGI蛋白(VEGI-174)和VEGI-251剪接变体以及它们相应的核苷酸序列，特此将其全文公开的内容特别并入本申请作为参考。描述了VEGI-174的N-末端截短形式的抗-血管生成活性。蛋白VEGI-174与人类TNFα、TNFβ以及Fas配体表现出20-30％的序列同源性。利用cDNA克隆作为模板的体外转录和翻译实验产生了分子量为22kD的蛋白，与预测的174个氨基酸的开放读框一致。该蛋白在文中称之为VEGI-174。该蛋白的疏水性分析预测了紧接在N-末端区的14个非疏水氨基酸后面的12个氨基酸的疏水区。这与II型跨膜蛋白的结构相符，类似于TNF(B.B.Aggarwal和K.Natarajan(1996)Eur.CytokineNews.793)。也描述了VEGI同种型。该蛋白在文中称之为VEGI-251，它被预测为膜蛋白。
最近来自多种谱系的22种不同类型的培养细胞的总RNA制备物的RNA分析表明该蛋白的转录仅能在内皮细胞的两种细胞系中检测到HUVE细胞和早期传代的人类静脉内皮细胞。在稍后传代的人类静脉内皮细胞中未检测到mRNA，也未见于人类动脉细胞中。作为强烈对比，TNF家族成员主要地在免疫细胞中表达(B.B.Aggarwal和K.Natarajan(1996)，同前)。例如，TNFα由巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和T细胞产生，而TNFβ主要由有丝分裂原刺激的T淋巴细胞和白细胞产生。同样地，Fas及其它TNF家族成员CD27、CD30、CD40、OX40和4-1 BBr的配体，均在免疫系统的细胞类型中表达。利用多组织RNA印迹，发现EGI转录本在胎盘、肺、肾、骨骼肌、脑、肝、胸腺、睾丸、卵巢和外周血淋巴细胞中表达。
抑制肿瘤血管生成是治疗癌症例如乳腺癌及其它实体瘤的重要方法。首先，肿瘤生长和转移有赖于血管生成。已在模型系统中表明通过特异性诱导的凝结封闭肿瘤新生血管的毛细管，能引起肿瘤脉管系统的根除，并导致肿瘤的消除。另外，已有提示内皮细胞在肿瘤组织中高度增殖，但在正常组织中通常是静止的。这使得肿瘤的新血管形成成为特殊和引人注目的靶。此外，尽管癌细胞的特征在不同的肿瘤中可能极大地不同，多数实体瘤中的内皮细胞群却可能是未转化的，因而保持同质。这对于人类和动物受试者都适用。因而有可能开发出能够普遍地用于治疗许多不同癌症的抗血管生成治疗剂。
除了实体瘤之外，其它重要的血管生成驱动的疾病包括糖尿病性视网膜病、卡波西肉瘤、银屑病、类风湿性关节炎。患有这些疾病的患者可受益于抗-血管生成治疗方法。
本发明鉴定并描述了VEGI蛋白家族成员新同种型的序列、功能、组合物和治疗用途。两个新同种型分别被命名为VEGI-192a和VEGI-192b，包括就其表达、分泌和抗-血管生成性质而言充分改变了蛋白性质的新的N-末端序列。
提供了命名为VEGI-192a和VEGI-192b的两个新VEGI同种型，两者均由192个氨基酸残基构成。两个同种型表现出内皮细胞特异性的表达并与早先描述的VEGI-174和VEGI-251共有C-末端的151个残基片断。这些同种型通过可变剪接产生自17kb的人类基因。VEGI251(最丰富的同种型)含有推断的分泌信号。VEGI蛋白在内皮细胞、人类血清和VEGI251转染的哺乳动物细胞的条件培养基中检测到。VEGI251的亚细胞定位模式暗示其为分泌蛋白。VEGI251在内皮细胞中的过表达导致剂量依赖性的细胞死亡。VEGI251转染的癌细胞，与VEGI174转染子肿瘤相比，产生生长速率和微血管密度下降的异种移植肿瘤。本发明提供了内皮细胞分泌的VEGI可行使自分泌血管生成抑制剂和天然存在的血管稳态调节剂的功能的观点。
特此将本文引用的所有出版物全部并入作为参考。
发明概述本发明一般涉及内皮细胞增殖抑制剂，尤其涉及血管生成抑制剂，以及它们的使用方法。VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251的完整核苷酸序列示于表1(SEQ ID NO1)、表2(SEQ ID NO2)和表3(SEQ ID NO3)中，并且推断的氨基酸序列分别示于表4(SEQ ID NO4)、表5(SEQ ID NO5)和表6(SEQ ID NO6)中。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含表1(SEQ ID NO1)中所示的序列或者它们的互补物的分离的多核苷酸。本发明也提供了包括SEQ ID NO1中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个以及至少100个或更多个连续的核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93位之内。本发明也提供了包括SEQ ID NO1中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个以及至少100个或更多个连续的核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的核苷酸包括SEQ IDNO1的核苷酸93和94。
在其它实施方案中，本发明提供了包含表2(SEQ ID NO2)中所示的序列或者它们的互补物的分离的多核苷酸。本发明也提供了包括SEQ IDNO2中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个以及至少100个或更多个连续的核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的核苷酸位于SEQ ID NO2的核苷酸1-386位之内。本发明也提供了包括SEQ ID NO2中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个以及至少100个或更多个连续的核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸386和387。
在有些实施方案中，本发明提供了包括编码SEQ ID NO4多肽的序列的分离的多核苷酸。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO4中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的多核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的氨基酸位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26位之内。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO4中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的多核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的氨基酸包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27。在有些实施方案中，连续的氨基酸大约为表4中所示序列(SEQ ID NO4)的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
在有些实施方案中，本发明提供了包括编码SEQ ID NO5多肽的序列的分离的多核苷酸。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO5中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的多核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的氨基酸位于SEQ ID NO5的氨基酸1-26位之内。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO5中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的多核苷酸的分离的多核苷酸，其中连续的氨基酸包括SEQ ID NO5的氨基酸26和27。在有些实施方案中，连续的氨基酸大约为表5中所示序列(SEQ ID NO5)的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
在有些实施方案中，本发明的多核苷酸提供了编码本文公开的核酸序列的功能性保守变体的序列，其包括核酸替代、添加和/或缺失。变体包括所述多核苷酸序列天然存在的变体(例如简并变体、等位基因变体等)。
在有些实施方案中，本发明提供了与本文描述的本发明的多核苷酸具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分离的多核苷酸。一个实施方案提供了与表1(SEQ ID NO1)中所示核苷酸1-93或者表2(SEQ ID NO2)中所示核苷酸1-386的序列具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分离的多核苷酸。
在有些实施方案中，本发明的多核苷酸进一步包括可检测的标记。在有些实施方案中，本发明的多核苷酸被固定在表面上。在本发明的有些实施方案中，本发明的多核苷酸是单链的。在本发明的有些实施方案中，本发明的多核苷酸选自DNA和RNA。在本发明的有些实施方案中，本发明的多核苷酸部分地通过化学合成制备。
应当理解(除非另有规定或者需求)，本文描述的本发明的多核苷酸的任何实施方案既包括双链形式，也包括已知或者预测构成双链形式的两互补单链形式中的每一个。
还应理解，本发明提供了“由”或“基本上由”本文描述的多核苷酸、多肽和/或抗体“组成”的实施方案。
在另一个方面，本发明提供了包含本文描述的任何多核苷酸的载体和表达载体。
又在其它方面，本发明提供了包含本文描述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在有些实施方案中，宿主细胞为原核的，例如大肠杆菌(E.coli)。在有些实施方案中，宿主细胞为真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明也包括含有包括VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸或者VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸之变体的重组多核苷酸的细胞。在一个实施方案中，本发明提供了遗传改造的哺乳动物细胞或者细菌细胞如大肠杆菌，其包括重组修饰的VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸，从而所述多核苷酸过表达。在另一个实施方案中，本发明提供了包含VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸之变体的细胞。在另一个实施方案中，VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸可操作地连接于可诱导的启动子。又在另一个实施方案中，遗传改造的细胞具有变体VEGI-192a或VEGI-192b基因而非天然VEGI-192a或VEGI-192b基因。
本发明也提供了VEGI-192a多肽。因此，本发明提供了包括SEQ ID NO4序列的分离的多肽。本发明也提供了包括由本文描述的本发明的任一多核苷酸编码的多肽的分离的多肽。在其它实施方案中，本发明也提供了包括表4(SEQ ID NO4)所示序列中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的分离的多肽，其中连续的氨基酸位于表4(SEQ ID NO4)所示序列的氨基酸1-26位之内。在其它实施方案中，本发明也提供了包括表4(SEQ ID NO4)所示序列中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的分离的多肽，其中连续的氨基酸包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27。在有些实施方案中，连续的氨基酸大约为SEQ ID NO4的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
本发明也提供了VEGI-192b多肽。因此，本发明提供了包括SEQ ID NO5序列的分离的多肽。本发明也提供了包括由本文描述的本发明的任一多核苷酸编码的多肽的分离的多肽。在其它实施方案中，本发明也提供了包括表5(SEQ ID NO5)所示序列中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的分离的多肽，其中连续的氨基酸位于表5(SEQ ID NO5)所示序列的氨基酸1-26位之内。在其它实施方案中，本发明也提供了包括表5(SEQ ID NO5)所示序列中至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的分离的多肽，其中连续的氨基酸包括SEQ ID NO5的氨基酸26和27。在有些实施方案中，连续的氨基酸大约为SEQ ID NO5的氨基酸5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位。
在其它实施方案中，本发明提供了本文描述的任一多肽，其中多肽包括表位。在其它实施方案中，本发明提供了本文描述的任一多肽，其中多肽固定在固相支持物上。
在其它实施方案中，本发明提供了保留了VEGI-192a和/或VEGI-192b和/或VEGI-251的生物活性的多肽。如实施例中所示，VEGI-192a抑制血管内皮细胞生长；VEGI-251在体外血管生成模型中在表达后抑制血管内皮细胞的生长、毛细管样管的形成，而且也在无胸腺裸鼠中抑制异种移植肿瘤的生长。
本发明也提供了与VEGI-192a和/或VEGI-192b选择性结合的抗体。因此，本发明提供了与本文描述的任一VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽选择性结合的抗体。在一个实施方案中，抗体能够选择性地与VEGI-192a或VEGI-192b结合。在其它实施方案中，抗体能够选择性地与VEGI-192a和VEGI-192b两者都结合，但不结合其它VEGI同种型。在有些实施方案中，抗体与由本文描述的任一多核苷酸编码的多肽结合。在一个实施方案中，本发明提供了能够与本发明的多肽结合的抗体。在另一个实施方案中，抗体能够特异性地与包括(a)表4(SEQ ID NO4)和/或表5(SEQ ID NO5)中所示序列；或(b)SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5中至少10个连续的氨基酸(其中连续氨基酸位于表4(SEQ ID NO4)和/或表5(SEQ ID NO5)中所示的氨基酸1-26位之内)的多肽结合。本发明也提供了能够与表4(SEQ ID NO4)和/或表5(SEQ ID NO5)中所示的多肽区段结合的抗体，其中所述区段为SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5中至少大约5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸，并且所述区段包括SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5的氨基酸26和27。
在有些实施方案中，抗体为多克隆抗体。在其它实施方案中，抗体为单克隆抗体。又在其它实施方案中，抗体被固定在固相支持物上。又在其它实施方案中，抗体还包括可检测的标记。
本发明也提供了组合物(包括药物组合物)，其包含本发明的多核苷酸、多肽、抗体、重组载体和宿主细胞。在有些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含处于药学上可接受的赋形剂中的SEQ ID NO4的多肽或其片断，其中所述片断包括氨基酸26和27。
本发明也提供了血管生成抑制剂，其中抑制剂包括处于药学上可接受的载体中的药学上可接受量的VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或衍生物。
在另一个实施方案中，本发明提供了癌生长阻遏剂或抑制剂组合物，其包含基本上纯的本发明的VEGI同种型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了血管生成促进剂，该促进剂包括当以药学上可接受的量在药学上可接受的载体中供给时可降低或消除VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251功能的抗体、反义寡核苷酸、拮抗剂、核酶、药物或药剂。
本发明也提供了包括本文描述的任一多核苷酸、多肽和抗体的阵列和试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供了包含本文描述的任一多核苷酸用于评价样品中多核苷酸的量的试剂盒或阵列。在其它实施方案中，本发明提供了用于评价样品中多肽水平的包含本文描述的任一抗体的试剂盒或阵列。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制血管生成的方法，其包括向个体(例如人类或动物)以足以抑制血管生成的剂量给予组合物，所述组合物包含基本上纯的本发明的VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或者此处公开的这些VEGI同种型的修饰形式。在一个实施方案中，该组合物包含含有表3(SEQ ID NO3)中所示多核苷酸或者编码SEQ IDNO6的多肽的多核苷酸的基因递送载体。在有些实施方案中，多核苷酸可操作地与控制基因表达的调控序列结合。在其它实施方案中，组合物包含基本上纯的表4(SEQ ID NO4)中所示序列的VEGI-192a多肽或其功能性片断，其中所述片断包含SEQ ID NO4的氨基酸26和27，或者包含SEQID NO4氨基酸1-26中的至少一个氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或改善由非控制性血管生成介导的疾病或过程的方法，包括向个体给药剂量足以控制血管生成的组合物的步骤，所述组合物包括VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或者此处描述的这些公开的VEGI同种型的修饰形式。在一个实施方案中，组合物包括含有表3(SEQ ID NO3)中所示多核苷酸或者编码SEQID NO6的多肽的多核苷酸的基因递送载体。在有些实施方案中，多核苷酸可操作地与控制基因表达的调控序列结合。在其它实施方案中，组合物包括基本上纯的具有表4(SEQ ID NO4)中所示序列的VEGI-192a多肽或其功能性片断，其中所述片断包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27，或者包括至少一个来自SEQ ID NO4氨基酸1-26的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法，其包括向个体给药剂量足以抑制肿瘤生长的组合物，所述组合物包括VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸、多肽或者此处描述的这些公开的VEGI同种型的修饰形式。在一个实施方案中，组合物包括含有表3(SEQ ID NO3)中所示多核苷酸或者编码SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸的基因递送载体。在有些实施方案中，多核苷酸可操作地与控制基因表达的调控序列结合。在其它实施方案中，组合物包括基本上纯的具有表4(SEQ ID NO4)中所示序列的VEGI-192a多肽或其功能性片断，其中所述片断包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27，或者包括至少一个来自SEQ IDNO4氨基酸1-26的氨基酸。
在其它实施方案中，本发明提供了加速血管生成的方法，其包括向人类或者动物给药降低或消除VEGI-192a、VEGI-192b和/或VEGI-251活性的抗体、反义寡核苷酸、拮抗剂、核酶、药物或药剂。
又在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或改善由血管生成介导的疾病和过程的治疗方法和组合物，所述疾病和过程包括但不限于，血管瘤、实体瘤、白血病、瘤转移、毛细管扩张症、银屑病性硬皮病、脓性肉芽肿、心肌血管生成、plagie新血管形成、冠脉侧枝(coronary collateral)、缺血性四肢血管生成、角膜病、潮红、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织形成、关节炎、糖尿病性新血管形成、眼色素层炎、早产儿视网膜病变、黄斑变性、角膜移植新血管形成、移植物抗宿主疾病、炎症性肠病、骨髓抑制和再狭窄；其中血管生成是非控制性的或者过度的，因而需要抑制，该方法包括向需要此种治疗的个体提供有效量的本发明的VEGI同种型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或多肽，从而抑制血管生成。
又在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或改善其中期望血管生成的疾病(例如黄斑变性、伤口愈合、消化性溃疡、骨折、瘢痕瘤、血管发生、血细胞生成、排卵、月经和胎盘形成)的治疗方法和组合物，该方法包括向需要此种治疗的个体给药处于药学上可接受的载体中的药学上可接受量的本发明的VEGI同种型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或多肽的拮抗剂、VEGI同种型多核苷酸特异性的反义寡核苷酸或者减少或消除VEGI功能的抗-VEGI抗体、药剂或药物。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测VEGI同种型多肽(VEGI-192a或VEGI-192b)的方法，包括使来自个体的样品与本文描述的选择性结合本发明的VEGI多肽的抗体接触，并检测样品中的多肽和该抗体之间形成的复合物的存在或不存在。这些检测方法也适用于检测本文描述的任一VEGI-192a或VEGI-192b。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测VEGI同种型(VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸的方法，包括使来自个体的样品与选择性结合本发明的VEGI多核苷酸的多核苷酸(例如寡核苷酸)接触，并检测该寡核苷酸与样品中的多核苷酸之间形成的双链体的存在或不存在。这些方法也适用于检测本文描述的任一VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸。
又在另一个实施方案中，本发明提供了诊断涉及病理性血管生成的疾病的方法，其中该方法包括检测样品中存在或不存在衍生自VEGI-192a或VEGI-192b的多肽，该方法包括步骤(i)使来自怀疑具有病理性血管生成的受试者的样品与本发明VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽特异性的抗体接触；和(ii)检测VEGI-192a和/或VEGI-192b与该抗体之间形成的复合物的存在或不存在。
又在另一个实施方案中，本发明提供了诊断病理性血管生成的方法，包括检测样品中存在或不存在VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸(优选RNA)，该方法包括步骤(i)使来自怀疑具有病理性血管生成的受试者的样品与特异性结合本发明VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸(例如RNA)的多核苷酸(例如寡核苷酸)接触；和(ii)检测多核苷酸与衍生自VEGI-192a或VEGI-192b的寡核苷酸之间形成的双链体的存在或不存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了利用聚合酶链式反应(PCR)诊断病理性血管生成的方法，该方法包括利用如SEQ ID NO1及SEQ IDNO2中所示的VEGI同种型(即VEGI-192a、VEGI-192b)的核苷酸序列设计引物，其中所述聚合酶链式反应特异性地扩增VEGI的区段用作为检测的基础。该引物可用于扩增VEGI DNA或VEGI RNA，后一种扩增发生在通过RNA反转录将RNA转化为互补DNA(cDNA)之后。通过将扩增产物与标准(其可利用本领域公知的方法产生)进行比较，可使得所述PCR试验成为定量的。
又在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中VEGI同种型(即VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸的方法，该方法包括通过杂交测定法测定样品中存在或不存在VEGI-192a或VEGI-192b同种型RNA或DNA。
在另一实施方案中，本发明提供了诊断或预后试剂盒，包含与本发明的VEGI同种型(即VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸或多肽结合的抗体；与VEGI DNA或RNA杂交的寡核苷酸；和/或用于扩增VEGI DNA或RNA的PCR引物，以及适用于检测样品中VEGI同种型的存在的辅助试剂。由于VEGI可作为膜蛋白行使功能，膜结合VEGI的天然存在的可溶形式可作为其拮抗剂起作用，而且检测该可溶形式的方法包括在本发明的另一个实施方案中。
又在另一个实施方案中，本发明提供了诊断测定法，包括检测VEGI同种型(即VEGI-192a或VEGI-192b)多核苷酸中存在或不存在突变，所述突变导致VEGI同种型表达或功能的下降或提高。此种测定法将包括杂交测定、限制性图谱多态分析以及基因测序等等。
又在另一个实施方案中，本发明提供了测试可能的药剂或药物的血管生成抑制活性的方法，该方法通过测试药物或药剂是否能够上调VEGI同种型(即VEGI-192a或VEGI-192b)的表达和/或活性而实施。由于VEGI同种型，象其它血管生成抑制剂一样，被从细胞膜中释放该蛋白的蛋白酶激活，(因此)蛋白酶还有促进此激活的其它试剂如金属离子将可用作为提高VEGI同种型表达的药剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了测试可能的抗肿瘤药剂或药物的方法，该方法通过测试所述药物或药剂是否能够通过上调VEGI同种型的表达和/或活性而抑制血管生成来实施。
又在另一个实施方案中，本发明提供了测试可能的促进血管生成的药物或药剂的方法，该方法通过测试所述药剂或药物是否能够阻断和/或抑制VEGI功能(例如抑制血管生成)来实施。在这种情况下，通过抑制如上文所讨论的激活VEGI同种型的蛋白酶或抑制此激活所需的试剂或者抑制能促进此激活的试剂如金属离子，可下调VEGI，由此加强血管生成。
附图的简短说明

图1.正常成人的血清VEGI水平。利用抗-VEGI抗体通过ELISA对来自40个正常志愿者(男性20名、女性20名)的血清进行测量。每点代表单个数值。利用纯化的重组VEGI产生标准曲线。这些点中的水平条指示每个性别组的中值。
图2.VEGI以多种转录本形式在人类组织中表达。利用32P-标记的全长VEGI-174cDNA作为探针通过多组织RNA印迹分析测定VEGI在成人组织中的表达。检测到了所示大小的3个不同的VEGI-相关信息。
图3.新VEGI cDNA的分离。A.表示合成5′RACE产物接着筛选cDNA文库以从各种人类组织中分离全长VEGI cDNA的方案。阴影框代表存在于RACE板中的连接的5′衔接物。PCR引物由具有空心箭头的箭头记号指示。不同大小的PCR产物通过溴化乙锭染色观看。分离PCR产物并进行测序。L＝肺；U＝子宫；B＝脑。在L和U泳道之间显示了1Kb DNA分子量标梯。B.3个VEGI同种型的氨基酸序列的比对(alignment)。推断的VEGI-251和VEGI-174疏水区以下划线标出。星号表示同源序列的起点。
图4.VEGI-174和VEGI-251在人类组织中的差异表达。利用VEGI-251和VEGI-174特异性的cDNA片断对成人组织进行VEGI表达的RNA印迹分析。用VEGI-174探针检测到2kb的转录本，而用VEGI-251探针检测到7.5kb的信息。所检测的人类组织如下1.外周血白细胞，2.肺，3.胎盘，4.小肠，5.肝，6.肾，7.脾，8.胸腺，9.结肠，10.骨骼肌，11.心脏，12.脑。
图5.各种培养细胞中VEGI同种型的核糖核酸酶保护分析。来自所示各培养物的总RNA与同种型特异性VEGI探针杂交，而β-肌动蛋白作为上样对照。全长未消化探针示于探针泳道(P)，由实心箭头指示，而RNase保护产物由空心箭头指示。Y＝酵母RNA，Hc＝人类冠状动脉内皮细胞，Hm＝人类皮肤微血管内皮细胞，Hu＝人类脐静脉内皮细胞，Sm＝人类冠状动脉平滑肌细胞，3T＝NIH3T3胚胎小鼠细胞系，Ba＝成年牛大动脉内皮细胞，Bh＝胎牛心脏内皮细胞，Hy＝EA.Hy926人类杂交瘤细胞，bE＝bEND.3小鼠脑内皮瘤细胞。
图6.人类VEGI基因结构以及推断的同种型的产生。编号1到9的片断代表基因作图期间产生的PCR片断，特异性引物对列于材料和方法中。上方带罗马数字的框代表外显子，而水平线代表内含子序列。推断的转录起始位点由双箭头指示。R表示每个转录本各自特有的5′非翻译序列，而带点框代表共同的3′非翻译区。显示了内含子近似的大小。VEGI-251、VEGI-192a或VEGI-174特异性序列标记为′251′、′192′或′174′。外显子IIIb编码VEGI-251和VEGI-192a共有的残基。外显子III和IV 5′的内含子以虚线表示，因为VEGI-192a和VEGI-174转录本的该5′端或者起始位点尚未确定。′COM′表示所有三个同种型共有的最后一个外显子的编码区。
图7.TNFα诱导VEGI同种型在微血管和大血管内皮细胞中表达。核糖核酸酶保护试验证明了并行诱导的VEGI表达。箭头指示保护的RNA。A.用15、50和90ng/ml TNFα处理达24小时的HMVE细胞。B.HUVE细胞中TNFα对VEGI基因表达的诱导。HUVE细胞由20ng/ml TNFα处理4、8和24小时(+)。对照(-)接受相应的载体处理。
图8.重组VEGI-174和VEGI-251在转染的内皮细胞中的胞内定位。A.VEGI-174-myc和VEGI-251-myc(B)通过结合的myc标签的德克萨斯红染色在转染的ABAE细胞中检测到。C.在转染的HUVE细胞中的VEGI-251-myc(红)和冯·威利布兰德因子(绿)双重染色。D图描绘了具有C-末端myc标签的VEGI表达构建物。E-J.N-末端标记GFP的VEGI构建物在ABAE细胞中表现出不同的分布。由载体质粒(E)转染的细胞在整个细胞中到处显示出GFP，而3个VEGI构建物(F，H-J)产生局部的GFP分布。在I和J中，VEGI-2511-99指导GFP分布在质膜中。K.在F到J所用的表达构建物中GFP标签定位在VEGI片断的氨基末端。
图9.通过Western分析检测转染的MB231细胞和未转染的HUVE细胞的条件培养基中的VEGI-251。A.来自稳定转染子MDA-MB231的条件培养基。泳道1＝仅pcDNA3载体，泳道2和3＝表达VEGI-251的两个独立的克隆。B.泳道1＝HUVE细胞-条件培养基，泳道2＝HUVE细胞裂解物。在两个实验中，条件培养基用Centricon柱(分子量截留10,000)浓缩，用多克隆抗体免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE并利用针对VEGI共有C-末端区(残基29-174)的单克隆抗体1-8F进行Western检测。两组都显示了大约25kD的VEGI肽。
图10.VEGI-251过表达导致内皮细胞死亡并干扰肿瘤新血管形成。A.分泌VEGI的慢病毒递送对于HUVE细胞是致死的。表达VEGI-251和sVEGI的慢病毒原液与表达VEGI-174的慢病毒原液相比的剂量依赖性细胞毒性。病毒感染后24小时，通过Coulter计数对保留在培养物中的贴壁细胞计数。估计病毒p24水平，且病毒剂量表示为感染复数(MOI)。所示数值为3个独立实验的平均数±SEM。B.VEGI-251和sVEGI对异种移植MDA-MB231乳腺肿瘤生长的阻滞。将表达所示构建物的稳定转染的MDA-MB231细胞库皮下注射到雌性无胸腺小鼠的乳房脂垫中，并以不知情的方式监测肿瘤大小。对照小鼠接受转染空pcDNA3载体的MDA-MB231细胞。对于VEGI-251和sVEGI都观察到肿瘤生长的减弱，但对于全长VEGI-174则没有。C.VEGI-251和sVEGI转染导致MB231异种移植肿瘤中降低的微血管密度。肿瘤石蜡切片(5μm)取自图10A中所述小鼠。血管如材料和方法中所述通过CD31免疫染色鉴定。利用了单向方差分析。aP＜0.0005；bP＜0.05，与具有载体pcDNA3的对照异种移植物相比而言。
图11.利用P-32-标记的VEGI-174cDNA作为探针，对各种人类器官中VEGI表达的多组织RNA印迹分析结果的照片。可见不同大小的VEGImRNA信号。
图12.举例说明用于寻找可能的VEGI同种型的RACE-PCR操作方案。ADP1和ADP2表示衔接物特异性引物。GSP1和GSP2表示基因特异性引物。
图13.RACE-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果的照片。利用溴化乙锭染色观察到来自不同人类组织的不同大小的4个PCR产物。分离PCR产物并进行测序。
图14.转染了空载体(泳道1)或VEGI-251cDNA(泳道2)的MDA-MB-231细胞的条件培养基的蛋白质印迹分析照片。对条件培养基进行凝胶过滤层析，并收集分子量为10-50kD范围内的级分，并进行SDS-PAGE。图A凝胶考马斯亮蓝染色。图B利用VEGI的单克隆抗体(13-2D)的蛋白质印迹。
图15.显示由转染了VEGI-174、VEGI-251、IL6/VEGI或者空pCDNA-3载体的MDA-MB-231细胞形成的异种移植肿瘤的生长抑制。将1百万稳定转染的细胞注射到雌性无胸腺裸鼠的乳房脂垫中。每只动物有2个注射部位，且每组有5只动物。对各组编号，并以不知情方式监测异种移植肿瘤的大小。对于VEGI-251或IL6-VEGI过表达细胞观察到统计学意义的肿瘤生长抑制。VEGI-174过表达对肿瘤生长没有影响。
图16.利用针对人类VEGI的mAb 13-2D对获自图7所述实验中的肿瘤样品进行的免疫组织化学分析。VEGI过表达细胞被染成棕色。左侧图是由VEGI-251转染的细胞形成的肿瘤的切片照片。VEGI-251的产生水平显然高度可变，正如有些肿瘤切片(G9-1R)的强烈染色(表明高水平的VEGI产生)而同组中有些肿瘤显著低的染色(G9-2R)所证明的那样。右侧图是由载体-对照细胞形成的肿瘤的切片照片。对照肿瘤切片中的棕色染色可能是抗体与位于小鼠内皮上的内在VEGI分子交叉反应的结果。
图17.显示由VEGI-251转染的MDA-MB-231癌细胞形成的肿瘤的生长速率根据癌细胞产生的VEGI的量变化。VEGI水平较高的肿瘤(G9-1R)生长得比具有低VEGI水平的肿瘤(G9-2R)慢得多。
图18.VEGI转录本的蛋白质印迹分析。图A，VEGI在人类细胞中的表达Jurkat，人类T细胞白血病细胞；L923，人类胎肾细胞；HL60，人类早幼粒细胞白血病；V.E，人类静脉内皮细胞(第10代)；A431，人类表皮样癌；V.E.-2，人类静脉内皮细胞(第20代)；Raji，人类伯基特氏淋巴瘤；A.E，人类动脉内皮细胞；THP-1，人类单核细胞白血病；CCD-29Lu，人类肺气肿；CAMA1，乳腺癌；AN3CA，子宫癌；SK.UT.1，子宫癌；MG63，成骨细胞瘤；HOS，成骨细胞瘤；MCF7，乳腺癌；OVCAR-3，卵巢癌；CAOV-3，卵巢癌；HUVE，人类脐静脉内皮细胞；AOSMIC，平滑肌。估计的信使RNA大小为6.5kb。图B，运用多组织RNA印迹(Clonetech)检测的VEGI在成人组织中的表达进行三个独立的印迹。显示了来自三个实验中任一的阳性结果。
图19.显示VEGI对内皮细胞和乳腺癌细胞增殖的影响。细胞数目针对所示的VEGI浓度绘图。显示了对ABAE细胞(实心圆)而非MDA-MB-231(空心圆)或MDA-MB-435(三角形)细胞生长的抑制。癌细胞和ABAE细胞分别以2000和8000细胞/孔一式三份种植于24孔板中。培养基含IMEM(Gibco)和10％ FCS。对于ABAE细胞向培养基中添加FGF-2(1ng/ml)。培养于37℃、5％ CO2中维持6天。然后用胰蛋白酶作用细胞，并利用Coulter计数器测定细胞数目。显示了回收的ABAE细胞总数目的五分之一，以使和癌细胞的比较标准化。
图20.VEGI在增殖或静止内皮细胞中的表达。通过RNA印迹分析测定培养的HUVE细胞中的VEGI mRNA水平。于每一泳道上样等量的总RNA(15μg)，如β-肌动蛋白强度所指示的那样。总RNA在指定的时间点制备(种植后天数)。同时测定每个培养瓶中的细胞数目。实验进行双份。细胞以125,000细胞每瓶(T-25)种植于IMEM、10％ FCS、6ng/ml FGF-2中，并培养于37℃、5％ CO2中。
图21.显示VEGI对ABAE细胞在胶原凝胶上形成毛细管样管能力的影响的曲线图。显示了重组VEGI抑制ABAE细胞形成毛细管样管的能力。柱上方给出的p-值(t-检验)通过将ABAE细胞在存在所示的各种浓度的VEGI时形成毛细管样管的程度与培养基中不存在VEGI时相比较获得。
图22.显示了VEGI对置于鸡胚尿囊绒膜(CAM)上的胶原凝胶中血管生成的抑制。新毛细血管由包埋在凝胶中的FGF-2(100ng)或者VEGF(250ng)诱导生长进入置于CAM上的胶原凝胶球(0.05ml)中。凝胶中血管生成的程度通过评价注射入CAM循环并且滞留在凝胶中的FTIC-葡聚糖的荧光强度确定。显示了由低于100的数值所指示的VEGI对毛细血管生长的抑制。抑制剂也包埋在凝胶中。误差棒代表一式三份实验数值的标准差。
图23.显示了VEGI对无胸腺裸鼠中人类乳腺癌异种移植肿瘤生长的抑制。将过表达VEGI或者载体转染的CHO细胞(5×106细胞/次注射)与人类乳腺癌细胞(1×106细胞/次注射)的混合物注射到雌性裸鼠的乳房脂垫中。注射后监测肿瘤大小。图A将MDA-MB-231异种移植肿瘤的大小(mm2)作为接种后时间(天数)的函数绘图。图B将MDA-MB-435异种移植肿瘤的大小(mm2)作为接种后时间(天数)的函数绘图。空心圆，与载体转染的CHO细胞共接种。实心圆，与分泌型VEGI转染的CHO细胞共接种。
图24.显示VEGI-192a对内皮细胞增殖的影响。显示了正确折叠的VEGI-192a而不是不正确折叠的VEGI-192a或缓冲液对ABAE细胞生长产生抑制。ABAE细胞分别以8000细胞/孔一式三份种植于24孔板中。培养基含IMEM(Gibco)和10％ FCS。对于ABAE细胞向培养基中添加FGF-2(1ng/ml)。培养物于37℃、5％ CO2中维持6天。然后用胰蛋白酶作用细胞，并利用Coulter计数器测定细胞数目。显示了回收的ABAE细胞总数目的五分之一，以使和癌细胞的比较标准化。
发明的详细说明本发明提供了抑制血管内皮细胞生长的新的VEGI同种型多核苷酸和多肽，以及通过给药这些多核苷酸、多肽及其它药剂治疗由血管生成介导的或者与之相关的疾病和过程的方法。本发明的VEGI多核苷酸或多肽可以从包括但不限于血清、尿液和腹水的体液中分离，或者通过化学或生物学方法(例如，细胞培养、重组基因表达)合成。
重组技术包括利用聚合酶链式反应(PCR)自DNA原料的基因扩增，以及利用反转录酶/PCR自RNA原料的基因扩增。这些方法是本领域公知的。VEGI抑制血管生长进组织如未血管化或血管化的肿瘤中。本发明包括分子量大约为22kD的蛋白，以及该蛋白的任何修饰形式，包括但不限于，截短物或翻译后修饰，例如能够克服内源生长因子的血管生成活性的该蛋白的糖基化形式。
定义如本文所述，“突变体”或“变体”VEGI多核苷酸或多肽是在核酸或氨基酸序列中包括一个或多个缺失、添加、颠换或改变的多核苷酸或多肽序列。如本文进一步描述的，突变体VEGI序列可造成截短或者改变的VEGI多核苷酸或多肽，VEGI多核苷酸或多肽增加或减小的表达，或者它们的任何组合。突变可以位于编码、非编码、5′或3′侧翼、基因组或编码核苷酸中。
“保持功能的”VEGI同种型(即VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251)多核苷酸或者VEGI同种型多肽变体是保留了至少一个方面的VEGI同种型功能的VEGI序列。保持功能的变体可以由于线性序列的差异而致，例如起因于单碱基突变、添加、缺失和/或碱基修饰。差异也可以起因于碱基之间的糖和/或链键的改变。关于多肽，保持功能的变体可以因例如保守和/或非保守氨基酸替代、氨基酸类似物以及缺失引起。所保持的功能取决于所考虑的相关功能。例如，如果VEGI同种型多核苷酸被考虑用作为探针，则变体多核苷酸序列与靶杂交的能力就是相关功能。如果考虑多核苷酸编码VEGI同种型多肽(或其片断)的能力，则变体序列编码相同多肽的能力就是相关功能。如果考虑VEGI同种型多肽结合特定实体(例如抗体或另一种蛋白)的能力，则变体序列编码具有等同结合特征的多肽的能力是相关的。可以，就编码的基因产物的生物活性(例如作为将基因产物分配到蛋白家族的结果和/或鉴定存在于基因产物中的功能域的结果而归属于与VEGI同种型多核苷酸相应的基因产物的生物活性)考虑VEGI同种型多肽。表现出“功能活性”的多肽是指能够显示出与完整或成熟VEGI同种型多肽相关的一种或多种已知的功能活性的多肽。此类功能活性包括，但不限于生物活性(例如，抑制血管生成、抑制血管内皮细胞增殖、诱导细胞粘附)、抗原性(结合或者与一种或多种VEGI同种型多肽竞争结合抗-VEGI同种型抗体的能力)、免疫原性(产生与一种或多种VEGI同种型多肽结合的抗体的能力)、与其它VEGI多肽形成聚合物的能力以及与VEGI多肽受体或配体(例如DR3)结合的能力。
如本文所用的，“表达”包括转录和/或翻译。
“异源”是指来源于(即获自)如下实体，该实体和与之进行比较的其余实体在基因型上不同。例如，可以通过基因工程技术将多核苷酸置于来自不同来源的质粒或载体中，从而成为异源多核苷酸。连接于其天然并不连接的编码序列的启动子是异源启动子。
“试剂”多核苷酸、多肽或抗体是为反应提供准备的物质，该物质具有某些已知和期望的反应参数。反应混合物也可以包含“靶”，例如所述试剂能够与之反应的多核苷酸、抗体、多肽或多肽集合。例如，在某些类型的诊断测试中，样品中靶的存在和/或量可以通过添加试剂、允许试剂与靶反应、并测量反应产物的量(如果有的话)来确定。在临床处理环境中，“靶”也可以是所给药物质(例如药物化合物)的对象，即，细胞、细胞集合、组织或器官。
多核苷酸的“稳定双链体”或者在生物化学反应中任意两个或多个组分之间形成的“稳定复合物”，是指在所述双链体或复合物的形成与随后的检测之间(包括任何任选的洗涤步骤或中间可能发生的其它操作)足够长久持续存在的双链体或复合物。
基因或多核苷酸在测试样品中“差异性表达”，指与相同类型的对照样品相比，该多核苷酸以较高或较低的水平被检测到。典型地，差异性表达的多核苷酸包括多核苷酸被如此表达以至于，例如，发现mRNA处于高于(如过表达)或者低于(如次表达)至少约25％、至少约50％到75％、至少约90％、至少约2倍、至少约4倍、至少约5倍以及至少约10倍或更多倍的水平上。比较可以在两个组织间进行，例如，如果利用原位杂交或允许在某种程度上区别组织中不同细胞类型的另一种测定法的话。比较也可以在自组织来源中取出的细胞之间进行。
药物、化合物或药物组合物的“有效量”是足以直接或间接地实现有益或期望结果的量，包括临床结果例如抑制血管内皮细胞生长、抑制血管生成、促进血管生成、缩小肿瘤大小、阻滞癌细胞生长、减轻因疾病引起的一种或多种症状、提高患有此病的患者的生活质量、减小治疗该病所需的其它药物的剂量、增强另一种药物的效果、延缓疾病的进程和/或延长患者的存活。有效量可以在一次或多次给药中给予。应当理解，在血管生成相关病的临床情况下，药物、化合物或药物组合物的有效量可以或可以不联合另一种药物、化合物或药物组合物而实现。因而，“有效量”可以在给药一种或多种治疗剂的情况下考虑，而且如果单个治疗剂联合一种或多种其它治疗剂实现或可以实现期望的结果的话，则此单个治疗剂可以认为是以有效量给药的。
如本文所用的，“治疗”或“处理”是获得有益或期望结果(包括并且优选临床结果)的方法。对于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于，一种或多种如下的结果降低血管内皮细胞增生、抑制血管生成、促进血管生成、减小肿瘤大小、减轻因疾病引起的症状、提高患有此病的患者的生活质量、减小治疗该病所需的其它药物的剂量、延缓疾病的进程和/或延长患者的存活。
本文中血管生成相关疾病的“发展”或“进展”是指所述紊乱的最初显现和/或继发的进展。血管生成相关疾病的发展可能可以利用标准临床技术检测和评价。不过，发展也指可能不可检测的疾病进展。对于本发明的目的，发展或进展是指疾病状态的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，血管生成相关疾病的“发作”或“发生”包括最初发作和/或复发。
如本文所用，血管生成相关疾病的“延迟发展”是指推迟、阻止、减缓、阻滞、稳定和/或延期该病的发展。这种延迟可以是变化不等的时间长度，取决于病史和/或治疗个体的医学状况。对本领域技术人员显而易见的是，充分或有意义的延迟实际上可以包括就个体不患可检测的疾病意义而言的预防。“延迟”疾病发展的方法是在给定的时间框架下，与不利用此法相比，降低疾病程度的方法。此类比较典型地是基于临床研究，利用统计学意义数目的受试者进行，尽管该知识可建立在未公开证据的基础上。“延迟发展”可指与不给药所述治疗剂相比，程度和/或不期望的临床表现被减弱，和/或进展的时间进程被减缓或延长。因而该术语也包括，但不限于症状的缓和、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的延迟或减缓以及可检测或不可检测的好转(部分或完全的)。
如本文及所附权利要求书中所用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文中另行明确规定。因而，例如，提及“一种多核苷酸”包括多数此类多核苷酸，而提及“该药剂”包括提及一种或多种药剂及本领域技术人员公知的其等同物等。
一般技术本发明的实施将使用，除非另行指出，本领域技术范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有充分的说明，例如《分子克隆实验室指南》(“Molecular CloningA Laboratory Manual”)第2版(Sambrook等，1989)；《寡核苷酸合成》(“Oligonucleotide Synthesis”)(M.J.Gait编辑，1984)；《动物细胞培养》(“Animal Cell Culture”)(R.I.Freshney编辑，1987)；《酶学方法》(“Methods in Enzymology”)(学院出版社有限公司)；《实验免疫学手册》(“Handbook of ExperimentalImmunology”)(D.M.Wei和C.C.Blackwell编辑)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”)(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；《当代分子生物学方案》(“Current Protocols in Molecular Biology”)(F.M.Ausubel等编辑，1987)；《PCR聚合酶链式反应》(“PCRThe Polymerase ChainReaction”)(Mullis等编辑，1994)；《当代免疫学方案》(“Current Protocolsin Immunology”)(J.E.Coligan等编辑，1991)。
本发明的多核苷酸本发明提供了VEGI同种型的多核苷酸，包括编码VEGI-192a、VEGI-192b和VEGL-251的多核苷酸。与新同种型对应的核苷酸序列在表1、2和3(SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)中给出，并且它们相应的多肽序列在表4、5和6(SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ IDNO6)中给出。
表1.编码VEGI-192a的多核苷酸序列(SEQ ID NO1)CTCCTATCAT AGGCGCCATG CAACTCACAA AGGGCCGTCT TCATTTCAGT CACCCTTTGTCTCATACAAA GCACATTTCT CCTTTTGTTA CAGATGCACC TCTTAGAGCA GACGGAGATAAGCCAAGGGC ACACCTGACA GTTGTGAGAC AAACTCCCAC ACAGCACTTT AAAAATCAGTTCCCAGCTCT GCACTGGGAA CATGAACTAG GCCTGGCCTT CACCAAGAAC CGAATGAACTATACCAACAA ATTCCTGCTG ATCCCAGAGT CGGGAGACTA CTTCATTTAC TCCCAGGTCACATTCCGTGG GATGACCTCT GAGTGCAGTG AAATCAGACA AGCAGGCCGA CCAAACAAGCCAGACTCCAT CACTGTGGTC ATCACCAAGG TAACAGACAG CTACCCTGAG CCAACCCAGCTCCTCATGGG GACCAAGTCT GTATGCGAAG TAGGTAGCAA CTGGTTCCAG CCCATCTACCTCGGAGCCAT GTTCTCCTTG CAAGAAGGGG ACAAGCTAAT GGTGAACGTC AGTGACATCTCTTTGGTGGA TTACACAAAA GAAGATAAAA CCTTCTTTGG AGCCTTCTTA CTATAG
表2.编码VEGI-192b的多核苷酸序列(SEQ ID NO2)TTAAACGGGC CCTCTAGACT CGAGCGGCCG CCACTGTGCT GGATATCTGC AGAATTCGGCTTAGCGCGTG AATCAGATCG GGGGGGGGGG TTAAGCAAAG CCATAAAACT GTCAGTTTAATATACCATCA TTTCACTAAC ATGAAGTGTG CCGGCTCTGT CCCCCCCTTT CTTTTCCTCCTTCCAACTCT TTTAAAAAAG AACAGCTCTA CTTACGCCAA GGTGGAATTT TGGCTCTACTAGCCACTATT CTGCGACAGA GTGGCTTTGT TGACGTGAGA AAGGCTCTCT TTGCTTTGCCAGAATTAGTC ATGGAAACTT CACAGGAACA CCAGGGCCCC TCAGATATAC ACAGAATACCATGGAGCTGG GGACAAAGGA ATTCACATGC ACCTCTTAGA GCAGACGGAG ATAAGCCAAGGGCACACCTG ACAGTTGTGA GACAAACTCC CACACAGCAC TTTAAAAATC AGTTCCCAGCTCTGCACTGG GAACATGAAC TAGGCCTGGC CTTCACCAAG AACCGAATGA ACTATACCAACAAATTCCTG CTGATCCCAG AGTCGGGAGA CTACTTCATT TACTCCCAGG TCACATTCCGTGGGATGACC TCTGAGTGCA GTGAAATCAG ACAAGCAGGC CGACCAAACA AGCCAGACTCCATCACTGTG GTCATCACCA AGGTAACAGA CAGCTACCCT GAGCCAACCC AGCTCCTCATGGGGACCAAG TCTGTATGCG AAGTAGGTAG CAACTGGTTC CAGCCCATCT ACCTCGGAGCCATGTTCTCC TTGCAAGAAG GGGACAAGCT AATGGTGAAC GTCAGTGACA TCTCTTTGGTGGATTACACA AAAGAAGATA AAACCTTCTT TGGAGCCTTC TTACTATAGG ATCCGGAGCCGAATTCCACC ACACTGGACT AAGTGGATTC GAGCTCGGTA CCAAAGCTTA AGTTTAAACGCTAGCCAGCT TGGGTCCCCC TATAGTGAGT CNTATTAATT TCGATAAGCC AGTAAGCAGTGGGTT表3.编码VEGI-251的多核苷酸序列(SEQ ID NO3)TTGTAATACG ACTCACTATA GGGCGGCCGC GAATTCGGCA CGAGATTTAA TGGCCGAGGATCTGGGACTG AGCTTTGGGG AAACAGCCAG TGTGGAAATG CTGCCAGAGC ACGGCAGCTGCAGGCCCAAG GCCAGGAGCA GCAGCGCACG CTGGGCTCTC ACCTGCTGCC TGGTGTTGCTCCCCTTCCTT GCAGGACTCA CCACATACCT GCTTGTCAGC CAGCTCCGGG CCCAGGGAGAGGCCTGTGTG CAGTTCCAGG CTCTAAAAGG ACAGGAGTTT GCACCTTCAC ATCAGCAAGTTTATGCACCT CTTAGAGCAG ACGGAGATAA GCCAAGGGCA CACCTGACAG TTGTGAGACAAACTCCCACA CAGCACTTTA AAAATCAGTT CCCAGCTCTG CACTGGGAAC ATGAACTAGGCCTGGCCTTC ACCAAGAACC GAATGAACTA TACCAACAAA TTCCTGCTGA TCCCAGAGTCGGGAGACTAC TTCATTTACT CCCAGGTCAC ATTCCGTGGG ATGACCTCTG AGTGCAGTGAAATCAGACAA GCAGGCCGAC CAAACAAGCC AGACTCCATC ACTGTGGTCA TCACCAAGGTAACAGACAGC TACCCTGAGC CAACCCAGCT CCTCATGGGG ACCAAGTCTG TATGCGAAGTAGGTAGCAAC TGGTTCCAGC CCATCTACCT CGGAGCCATG TTCTCCTTGC AAGAAGGGGACAAGCTAATG GTGAACGTCA GTGACATCTC TTTGGTGGAT TACACAAAAG AAGATAAAACCTTCTTTGGA GCCTTCTTAC TATAGGAGGA GAGCAAATAT CATTATATGA AAGTCCTCTGCCACCGAGTT CCTAATTTTT TTGTTCAAAT GTAATTATAA CCAGGGGTTT TCTTGGGGCC
GGGAGTAGGG GGCATTCCAC AGGGACAACG GTTTAGCTAT GAAATTTGGG GCCCAAAATTTCACACTTCA TGTGCCTTAC TGATGAGAGT ACTAACTGGA AAAAGGCTGA AGAGAGCAAATATATTATTA AGATGGGTTG GAGGATTGGC GAGTTTCTAA ATATTAAGAC ACTGATCACTAAATGAATGG ATGATCTACT CGGGTCANGA TTGAAAGAGA AATATTTCAA CACCTTCCTGCTATACAATG GTCACCAGTG GTCCAGTTAT TGTTCAATTT GATCATAAAT TGCTTCAATTCANGAGCTTT GAAGGAAGTC CAAGGAAAGC TCTAGAAAAC AGTATAAACT TTCAGAGGCAAAATCCTTCA CCAAATTTTC CACATACTTT CATGCCCTGC CTAAAAAAAA TGAAAAAGAAAAGTTGGTAT GTCTCATGAA TGTTCACACA NAAAGAGTTG GGTTCATGTC ATCCNCAACATATGAGAAAA ANCTACCTTC TTTTGNTTAT GTCACAGATT C表4.VEGI-192a的氨基酸序列(SEQ ID NO4)MQLTKGRLHFSHPLSHTKHISPFVTDAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL表5.VEGI-192b的氨基酸序列(SEQ ID NO5)METSQEHQGPSDIHRIPWSWGQRNSHAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL表6.VEGI-251的氨基酸序列(SEQ ID NO6)MAEDLGLSFGETASVEMLPEHGSCRPKARSSSARWALTCCLVLLPFLAGLTTYLLVSQLRAQGEACVQFQALKGQEFAPSHQQVYAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL表1(SEQ ID NO1)中所示多核苷酸序列通过测序cDNA克隆()获得，它于＿＿保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209)，保藏号为＿＿。
表2(SEQ ID NO2)中所示多核苷酸序列通过测序cDNA克隆()获得，它于＿＿保藏在美国典型培养物保藏中心(10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209)，保藏号为＿＿。
通过比较推断的SEQ ID NO4、5和6氨基酸序列的序列比对(表7)，由这些SEQ ID编码的多肽的C-末端区与VEGI-174中自Val-24到所述蛋白的C-末端完全相同。不过，这4种同种型的N-末端不同。如实施例中证明VEGI-174不抑制血管生成，因为它在表达后不能有效地自细胞中输出。相反，VEGI-251在表达后被有效地运输到胞外基质中，由此它可有效地抑制血管生成。VEGI-251的输出导致前序列的切割；蛋白水解的位置被认为是在VEGI-251的位置61或96；但也可能位于大约定位于VEGI-251的Glu-20和Ser-57之间的另一个位点上。可能的位点包括，但不限于E64、K73、E77、S81、R90和K95。纯化的VEGI-192a多肽也有效地抑制血管内皮细胞的生长。
表7.4种VEGI同种型氨基酸序列的比对*(SEQ ID NO6、4、5、7)VEGT-251MAEDLGLSFGETASVEMLPEHGSCRPKARSSSARWALTCCLVLLPFLAGLTTYLLVSQL 59VEGI-251RAQGEACVQFQALKGQEFAPSHQQVYAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHW119VEGI-192aMQLTKGRLHFSHPLSHTKHISPFVTDAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHW 60VEGI-192bMETSQEHQGPSDIHRIPWSWGQRNSHAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHW 60VEGI-174MRRFLSKVYSFPMRKLILFLVFPVVRQTPTQHFKNQFPALHW 42**VEGI-251EHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV179VEGI-192aEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV120VEGI-192bEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV120VEGI-174EHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITV102VEGI-251VITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT239VEGI-192aVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT180VEGI-192bVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT180VEGI-174VITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYT162VEGI-251KEDKTFFGAFLL251VEGI-192aKEDKTFFGAFLL192VEGI-192bKEDKTFFGAFLL192VEGI-174KEDKTFFGAFLL174
*VEGI-174(SEQ ID NO7)以前被称之为VEGI(GenBank登录号AF039390)**所有同种型中同源序列始于VEGI-174(SEQ ID NO7)中V24、VEGI-251(SE7Q ID NO6)中V101、VEGI-192a(SEQ ID NO4)中V42以及VEGI-192b(SEQ ID NO5)中V42。
从而，本发明提供了分离的核酸分子，其包含与表1、2和3(SEQ IDNO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)所示的新VEGI同种型对应的序列。本发明的多核苷酸，包括本发明多核苷酸的片断，可用作探针、引物、用于表达系统(包括如本文所述的体内和体外表达系统，它也可作为基因治疗的基础)以及筛选系统中。所述多核苷酸尤其有用的应用将在下文讨论。
“分离的”核酸分子旨在指已从其天然环境中取出的核酸分子，DNA或RNA。在有些实施方案中，已除去了至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％与其在天然状态下相关的物质。例如，为本发明的目的，包含在载体中的重组DNA分子被认为是分离的。进一步的分离的DNA分子的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或者溶液中纯化的(部分地或实质上地)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录本。分离的核酸分子进一步包括合成制备的此类分子。从而，“分离的”多核苷酸或多肽也指重组或其它非天然存在形式的多核苷酸或多肽，它们就来源或操作而言(1)不与其天然状态下结合的所有或部分多核苷酸或多肽结合，(2)连接于其在天然状态下不发生连接的多核苷酸或多肽上，或(3)在天然状态下不存在，或对于多肽而言，产生自重组多核苷酸的表达。
本发明也提供了编码本文所述的多肽蛋白的成熟形式的核酸分子(包括分离的和/或重组形式的，正如本领域技术人员所熟知的以及本文所描述的那样)。完整VEGI同种型多肽的氨基酸序列包括前导序列和成熟蛋白。根据信号假说，生长的蛋白链跨越粗糙内质网的向外输出一旦起始，由哺乳动物细胞分泌的蛋白的信号序列或分泌前导序列将从完整多肽上切割下来，产生分泌的“成熟”形式的该蛋白。多数哺乳动物细胞甚至是昆虫细胞以同样的特异性切割分泌蛋白。不过，在某些情况下，分泌蛋白的切割不非始终如一，这就产生两种或更多成熟种类的蛋白。此外，长久以来就已知分泌蛋白的切割特异性最终决定于该完整蛋白的初级结构，也就是说，这是多肽氨基酸序列所固有的性质。
本发明也提供了编码融合蛋白的多核苷酸。正如本领域众所周知的，融合蛋白或多肽是包括处于非天然存在位置的区段的多肽。所述区段可能正常情况下存在于不同的蛋白中，而在融合多肽中被集合在一起，或者它们可能正常存在于同一个蛋白中，但在融合多肽中被以新的排列方式安置。从而，本发明提供了多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以以相同的读框融合于帮助多肽自宿主细胞中表达和分泌的多核苷酸序列(例如，作为分泌序列行使调控多肽从细胞中运输的功能的前导序列)上。具有前导序列的多肽是前蛋白，且其可由宿主细胞切割前导序列而形成成熟形式的多肽。多核苷酸也可以编码成熟蛋白加上额外的5′氨基酸残基的蛋白原。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白为蛋白原，并且是该蛋白的无活性形式。原序列一旦切割则留下活性成熟蛋白。因而，举例来说，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或者具有原序列及前序列(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸提供了在读框中与允许纯化或鉴定本发明多肽的标记序列融合的编码序列。标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签，以便在细菌宿主的情况下允许纯化与该标记融合的成熟多肽，或者，举例来说，当利用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素(HA)标签。HA标签对应于来源于流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson.I.等，Cell，37767(1984))。
因而，术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了仅包括所述多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括了额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。为了本发明的目的，并且为避免麻烦地提及互补链，此类多核苷酸的反义(或互补)链也被表述为编码该序列；也就是说，“编码”多肽的多核苷酸序列既包括传统的编码链，又包括互补序列(或链)。
多核苷酸的突变体或变体可以是天然存在的该多核苷酸的等位基因变体，或者是非天然存在的该多核苷酸的变体。此类核苷酸突变体或变体包括缺失变体、替代变体以及添加或插入变体。变体序列可造成截短的或改变的多核苷酸或多肽，多核苷酸或多肽增加或减小的表达，或其任何组合。变异可以位于编码、非编码、5′或3′侧翼、基因组或编码核苷酸中。
在有些实施方案中，多核苷酸序列包括由于遗传密码子简并性而不同于表1、2或3(SEQ ID NO1、SEQ ID NO2及SEQ ID NO3)中所示的那些序列的序列。遗传密码子是本领域众所周知的。对于本领域技术人员来说产生此类简并变体是常规的。从而，在有些实施方案中，本发明提供了编码SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供了本文所述的分离的核酸分子的片断或截短形式。具有本文核苷酸序列中的一段核苷酸序列或其互补链的分离的核酸分子的片断是指长度为至少5nt、至少10nt、至少15nt、至少20nt、至少30nt、至少40、50、100、150、200、250、300、400或500nt(连续核苷酸)的片断。这些片断具有众多的用途，这包括但不限于如本文讨论的诊断探针和引物。正如本领域众所周知的，一般探针用于通过杂交检测靶。在有些实施方案中，探针可以包括标记或者在杂交反应之前或之后能将标记连接到其上的工具。合适的标记包括，但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和酶。此外，本领域技术人员理解，引物在与靶序列杂交后通常通过聚合延伸。当然，根据本发明，长度50-1500nt的更大片断也是有用的。举例来说，长度为至少20nt的片断，是指包括20个或更多个来自核苷酸序列的连续碱基的片断。在有些实施方案中，这些片断包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸386和387。备选地，片断长度可以小于1500、1250、1000、750、500、250、200、150、100、50、40nt并且包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸386和387。
本发明也提供了包括VEGI-192a的序列(表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93)或VEGI-192b的序列(表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386)的多核苷酸。
在有些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO1中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个以及至少100个或更多个连续的核苷酸(其通常也可以被称之为区段)的多核苷酸，所述连续的核苷酸位于表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93之内。在有些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO1中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个以及至少100个或更多个连续的核苷酸的多核苷酸，所述连续的核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94。
在有些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO2中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个、至少100个、至少150个、至少175个、至少200个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少375个、至少400个或更多个连续的核苷酸的多核苷酸，所述连续的核苷酸位于表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386之内。在有些实施方案中，本发明提供了包含SEQID NO2中至少10个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个、至少100个、至少150个、至少175个、至少200个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少375个、至少400个或更多个连续的核苷酸的多核苷酸，所述连续的核苷酸包括SEQ ID NO2的核苷酸386和387。
本发明提供了包括编码SEQ ID NO4的多肽的序列的分离的多核苷酸。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO4的至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的序列的分离的多核苷酸，所述连续的氨基酸位于表4(SEQ ID NO4)中所示的氨基酸残基1-26之内。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO4的至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的序列的分离的多核苷酸，所述连续的氨基酸包括表4(SEQ ID NO4)中所示序列的氨基酸26和27。本发明也提供了包括编码表4(SEQ ID NO4)中所示序列的氨基酸残基5-192、10-192、15-192或25-192的序列的分离的多核苷酸。
本发明提供了包括编码SEQ ID NO5的多肽的序列的分离的多核苷酸。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO5的至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的序列的分离的多核苷酸，所述连续的氨基酸位于表5(SEQ ID NO5)中所示的氨基酸残基1-26之内。本发明也提供了包括编码SEQ ID NO5的至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续的氨基酸的序列的分离的多核苷酸，所述连续的氨基酸包括表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸26和27。本发明也提供了包括编码表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸残基5-192、10-192、15-192或25-192的序列的分离的多核苷酸。
应当理解，位于给定的氨基酸或核苷酸对之内的连续氨基酸或核苷酸区段可以，但不必要，包括所规定的对的成员。例如，位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93之内的连续的核苷酸可以包括SEQ ID NO1的核苷酸1和/或核苷酸93。
本发明的实施方案排除编码由SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸27-192构成的多肽的多核苷酸，或者此类多核苷酸的任何截短的形式。
本发明也提供了包括编码本文所述的任一VEGI多肽的序列的多核苷酸。
在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸片断编码表现出功能活性的多肽。表现出“功能活性”的多肽是指能够显示出与完整或成熟VEGI多肽相关的一种或多种已知的功能活性的多肽。此类功能活性包括，但不限于生物活性(例如，抑制血管生成、抑制血管内皮细胞增殖、诱导细胞粘附)、抗原性(结合或与VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽竞争结合抗-VEGI-192a和/或抗-VEGI-192b抗体的能力)、免疫原性(产生与VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽结合的抗体的能力)、与其它VEGI多肽形成聚合物的能力以及与VEGI多肽的受体或配体(例如DR3)结合的能力。
同样地，由本文所述的任一多核苷酸编码的VEGI多肽可具有如上文和此处所述的VEGI的一种或多种功能活性。
本发明的另一个实施方案提供了与本文描述的本发明多核苷酸具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分离的多核苷酸。一个实施方案提供了与表1或表2(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)中所示的VEGI-192a或VEGI-192b序列具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分离的多核苷酸。在其它实施方案中，分离的多核苷酸还与上述VEGI-192a或VEGI-192b序列具有小于85％、83％、80％、75％、70％的序列同一性。本发明也包括与表1(SEQ ID NO1)或2(SEQ ID NO2)中所示序列的至少10个连续核苷酸(或更多个，例如15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100个连续核苷酸)的片断具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性的分离的多核苷酸，其中连续核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94，或SEQ ID NO2的核苷酸386和387。在有些实施方案中，所述多核苷酸与表1(SEQ ID NO1)中所示序列或表2(SEQ ID NO2)中所示序列的至少10个连续核苷酸(或更多个，例如15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100个连续核苷酸)的片断具有至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％序列同一性，其中连续核苷酸位于SEQ IDNO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之内。
一个多核苷酸或多核苷酸区段与另一个序列具有一定百分比(例如，80％、85％、90％或95％)“序列同一性”是指，当比对时，两个序列相比所述百分比的碱基是相同的。这种比对和百分比同源性或序列同一性可利用本领域公知的软件程序确定，例如《当代分子生物学方案》(F.M.Ausubel等编辑，1987)增刊30，第7.718节，表4.7.1中所描述的那些程序。百分比同一性可电子测定，例如通过利用MegAlign.TM.程序(DNASTAR，Inc.，Madison Wiss.)。所述MegAlign.TM.程序可根据不同的方法如聚类法(clustal method)(如参见Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73237-244)，在两个或多个序列之间建立比对。聚类运算法则(clustal algorithm)通过检查所有对之间的距离将序列分组为簇。簇成对然后成组对齐。两个氨基酸序列之间的百分比相似性，以序列A和序列B为例，通过序列A的长度，减去序列A中的缺口残基数目，减去序列B中的缺口残基数目，再除序列A和序列B之间匹配残基的总和，然后乘以100计算。在确定百分比相似性时，两氨基酸序列间低相似性或无相似性的缺口不包括在内。核酸序列间的百分比同一性也可以通过本领域公知的其它方法如Jotun Hein法(如参见Hein，J.(1990)Methods Enzymol.183626-645)计数或计算。
本发明以提供了在高度严谨条件下与具有互补于选自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的核苷酸序列的序列的核酸、或者具有互补于编码SEQID NO4或SEQ ID NO5的核苷酸的序列的核酸杂交的分离的核酸，或者它们的互补物。
就杂交条件而言，所需的序列同一性越高，如果此类序列是由它们与本发明的多核苷酸序列杂交的能力确定的话，则杂交条件越严谨。因此，本发明也包括能够与包括如本文所述的本发明多核苷酸的序列杂交的多核苷酸。严谨杂交条件的实例是于42℃在溶液50％甲酰胺，1×SSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×denhardt液，10％硫酸葡聚糖和20ug/ml变性剪切的鲑精DNA中过夜温育，接着于大约65℃在0.1×SSC中洗涤滤膜。有关杂交反应的讨论，参见下文。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括能与包含表1(SEQ ID NO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示序列或如上文所述的其片断的多核苷酸(例如DNA或RNA)杂交的至少10个连续核苷酸(或更多个，例如15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100(或更多个)连续核苷酸)的序列，其中所述杂交的条件是不与来自哺乳动物细胞(优选人类细胞)的其它多核苷酸杂交的条件，或者与具有表1(SEQ IDNO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示序列的多核苷酸的杂交相对于与来自哺乳动物细胞的其它多核苷酸的杂交被富集的条件。在有些实施方案中，所述片断包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94或SEQ ID NO2的核苷酸386和387。在有些实施方案中，所述片断位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之内。
这些实施方案在诊断(检测)情况中尤其有用。
在另一个实施方案中，本发明包括包含表1(SEQ ID NO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示非编码(即侧翼区)的至少10个、优选15个、优选18个、优选20个、更优选25个、更优选35个、更优选50个、还更优选75、100、125、150、200、250个连续核苷酸的多核苷酸序列。这些实施方案尤其可用作为诊断探针或作为引物用于扩增VEGI-192a或VEGI-192b基因的非编码部分。
应当理解(除非另有规定或者需求)，本文描述的本发明多核苷酸的任何实施方案既包括双链形式，也包括已知或者预测可构成双链形式的两互补单链形式中的每一个。
杂交反应可在不同的“严谨”条件下实施。提高杂交反应严谨性的条件在本领域广为人知且已公开。如参见Sambrook等(1989)。相关条件的实例包括(按提高的严谨性的顺序)25℃、37℃、50℃及68℃的温育温度；10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC的缓冲液浓度(其中SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)以及利用其它缓冲液系统的其等同物；0％、25％、50％及75％浓度的甲酰胺；从5分钟到24小时的温育时间；1步、2步或更多的洗涤步骤；1、2或15分钟的洗涤温育时间；以及6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去离子水的洗涤溶液。严谨杂交条件的一个实例是于50℃或更高的温度下在0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)中杂交。严谨杂交条件的另一个实例是于42℃在溶液50％甲酰胺，1×SSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×denhardt液，10％硫酸葡聚糖和20ug/ml变性剪切的鲑精DNA中过夜温育，接着于大约65℃在0.1×SSC中洗涤滤膜。严谨杂交条件是至少与上文的代表性条件一样严谨的杂交条件。其它严谨杂交条件是本领域公知的，并且也可用来鉴定本发明该特定实施方案中的核酸。
本发明也提供了包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的区段的引物和探针，其中所述区段位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之内。本发明也提供了包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的区段的引物和探针，其中所述区段包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94或者SEQ ID NO2的核苷酸386和387。
来自本文提供的一个以上多核苷酸序列的探针，如果它们所来源的cDNA对应于一个mRNA的话，能够与相同核酸杂交。利用探针，尤其是DNA序列的标记探针，人们能够分离同源或相关基因。同源基因的来源可以是任何物种，例如灵长类物种、犬科动物、猫科动物、牛、绵羊、马、酵母、线虫类。可以利用多于10个核苷酸(″nt″)的探针，例如大小在约15nt、18nt、20nt、25nt、75nt或100nt范围内的探针，但是一般约15nt代表了足够用于独特鉴定的序列。
″Tm″是由互补链以反平行方向通过Watson-Crick碱基配对而氢键键合形成的多核苷酸双链体在实验条件下50％解离为单链的摄氏温度。Tm可以根据标准公式预测，例如Tm＝81.5+16.6log[X+]+0.41(％ G/C)-0.61(％ F)-600/L其中[X+]为mol/L的阳离子浓度(通常为钠离子Na+)；(％ G/C)为G和C残基的数目占双链体总残基的百分比；(％ F)为溶液中甲酰胺的百分比(wt/vol)；而L为双链体中每一链的核苷酸数目。
如上文所述，本发明包括VEGI-192a和VEGI-192b多核苷酸的变体或修饰，例如缺失、替代、添加或任何核酸部分在性质上的改变。变体或修饰是与本文所示的多核苷酸相比的核苷酸序列中的任何差异以编码VEGI-192a或VEGI-192b多肽，和/或就多核苷酸的核酸部分而言的任何差异。此类改变可用于方便VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸的克隆及促进其表达改变。此类改变也可用来赋予多核苷酸期望的性质如稳定性。本文提供的多核苷酸的定义给出了这些修饰的实例。因此，本发明也包括保持了功能的本文公开的核酸序列的变体，其包括核酸替代、添加和/和缺失。变体包括天然存在的多核苷酸序列变体(例如，简并变体、等位基因变体等)。一般而言，等位基因变体含有15-25％的碱基对(bp)误配，并且可以含有少至5-15％或2-5％或1-2％ bp的误配，以及单碱基对误配。
如上文所述，本发明涵盖VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸，包括全长(未加工的)、加工的、编码、非编码的或其部分。VEGI-192a基因组区段的部分图谱显示在图6中，包括预测的内含子-外显子边界。本发明还可包括见于成熟mRNA中的3′和5′非翻译区，特定转录和翻译调控序列，例如启动子、增强子等(包括大约1kb)，以及可能地更多的位于转录区5′或3′端的侧翼基因组DNA。基因组DNA可作为100kbp或更小的片断分离，并且基本上不含侧翼染色体序列。3′或5′侧接编码区的基因组DNA、或者有时见于内含子中的内部调控序列，含有恰当组织、阶段特异性或疾病状态特异性表达所需的序列。本发明也包括mRNA和cDNA序列及其片断，包括含有部分VEGI-192a或VEGI-192b编码区段的片断。正常地，mRNA类物质具有连续的外显子，当存在间插内含子时，所述内含子由核RNA剪接除去，产生编码多肽的连续的开放读框。mRNA类物质也可以既存在外显子也存在内含子，其中内含子可通过可变剪接除去。此外，由同一种基因组编码的不同种类的mRNA可以以变化不等的水平存在于细胞中，而这些不同水平的mRNA类物质的检测可指示所编码的基因产物在细胞中的差异表达。
本发明也涵盖编码全长VEGI-192a或VEGI-192b的功能上等同的变体和衍生物及其功能上等同的片断(例如缺失VEGI-192a或VEGI-192bN-末端和/或C-末端氨基酸)的多核苷酸，所述多核苷酸可能增强、降低或不显著影响由此编码的多肽的性质。例如，不改变编码的氨基酸序列的DNA序列中的改变，以及那些导致氨基酸残基保守替代、无害非保守替代、一个或几个氨基酸缺失或添加、以及氨基酸残基被氨基酸类似物替代的改变，是不显著影响编码的多肽性质的改变。不改变编码的氨基酸残基的核苷酸替代可用于在不同系统中优化基因表达。合适的替代是本领域技术人员公知的，并且可以实施，例如，以反映特定表达系统中优选的密码子利用。在另一个实例中，可变剪接的多核苷酸可产生功能上等同的VEGI片断或变体。可变加工的多核苷酸序列变体被定义为对应于彼此序列不同但来源于同一个基因组区段的mRNA的多核苷酸序列，所述mRNA为例如，由于1)可变启动子的使用；2)可变多聚腺苷酸化位点的使用；或3)可变剪接位点的使用而产生的mRNA。
本发明也提供了包括具有SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互补物的核酸的DNA插入物。在其它实施方案中，本发明提供了包括具有SEQ IDNO2的核苷酸序列或其互补物的核酸的DNA插入物。
正如本领域众所周知的，“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合形式，其包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。术语“多核苷酸”和“核酸”在文中可互换使用，并且是本领域众所周知的。多核苷酸可以具有三维结构。术语“多核苷酸”包括双链、单链和三股螺旋分子。除非另有规定或者需求，本文描述的本发明多核苷酸的任何实施方案既包括双链形式，也包括已知或者预测可构成双链形式的两互补单链形式中的每一个。并非多核苷酸中的所有链键都需要相同。
在有些实施方案中，多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。当利用尿嘧啶作为脱氧核糖核酸中胸腺嘧啶的取代物时也被认为是嘧啶的类似形式。
正如本领域广为人知的，核苷酸结构的修饰，如果存在的话，可以在组装聚合体之前或之后给予。在有些实施方案中，核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。如本文所述，多核苷酸可在聚合之后再行修饰，例如通过与标记组分偶联。其它类型的修饰有，例如，“封端(caps)”；用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如象具有不带电荷链键的修饰(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)以及具有带电荷链键的修饰(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含附属部分的那些修饰，例如象蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂的那些修饰(例如，吖啶、补骨脂素等)、含螯合剂的那些修饰(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、含烷化剂的那些修饰、具有修饰的链键的那些修饰(例如，α异头核酸等)、以及多核苷酸的非修饰形式。所有这些修饰是本领域众所周知的。
此外，正常存在于糖中的任何羟基基团都可以由膦酸酯基团、磷酸酯基团取代，由标准保护基团保护，或者活化以制备与附加核苷酸的附加链键，或者可以偶联于固相支持物上。5′和3′末端OH基团可以被磷酸化或用胺或1-20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基也可以衍化为标准保护基团。
多核苷酸也可以含有本领域一般公知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括但不限于2′-O-甲基-，2′-O-烯丙基，2′-氟-或2′-叠氮-核糖、碳环型糖类似物、α端基异构糖、差向立体异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物例如甲基核苷。
虽然一般利用常规的糖和碱基，但糖、嘌呤和嘧啶的类似物形式的替代在终产物的设计中可能具有优势，同样可选择的主链结构如聚酰胺主链或硫代磷酸酯主链也可能具有优势。
本发明涵盖组合物，包括药物组合物，其包含本文所描述的多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂，包括缓冲液，这是本领域众所周知的。
本发明也提供了包括本文所述的任一多核苷酸的试剂盒。在有些实施方案中，试剂盒包括SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2的多核苷酸。在有些实施方案中，试剂盒包括编码SEQ ID NO4和/或SEQ ID NO5的多肽的多核苷酸。在有些实施方案中，试剂盒包括包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或者至少50个连续核苷酸的探针和引物，所述连续核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93或者SEQ ID NO2的核苷酸1-386之内。这些试剂盒可进一步包括试剂和说明书，用于检测存在或不存在VEGI-192a和/或VEGI-192b或其表达水平。本发明的试剂盒被适当包装，并且可任选地提供其它的组分例如缓冲液和说明书。
本发明也提供了结合于固相支持物上的本文所述的多核苷酸。将多核苷酸连接到固相支持物例如阵列表面的方法是本领域众所周知的。固相支持物是任何合适的物质，包括基于聚苯乙烯的珠子和玻璃芯片，例如GeneChip.RTM.产品(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，Calif)。参见国际公开号WO 97/10365、WO 97/29212、WO 97/27317、WO 95/11995、WO90/15070以及美国专利No.5,744,305和5,445,934。
本发明也提供了包括VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸的阵列。多核苷酸阵列提供了可以测定样品中大量多核苷酸或多肽的高通量技术。这种技术可用作为工具测试差异表达。许多制备阵列的方法以及这些方法的变形是本领域公知的，并可考虑用于本发明。例如，阵列可通过将多核苷酸探针点样到基片(例如玻璃、硝化纤维素等)上产生具有结合的探针的二维矩阵或阵列。探针可以通过共价键或者通过非特异性相互作用例如疏水相互作用结合到基片上。多核苷酸样品可以被可检测地标记(例如放射性或荧光标记)，然后与探针杂交。一旦洗去样品的未结合部分，就可以检测包括与探针多核苷酸结合的标记的样品多核苷酸的双链多核苷酸。备选地，试验样品中的多核苷酸可以固定到阵列上，而探针被可检测地标记。构建阵列的技术和利用这些阵列的方法描述在，例如，Schena等(1996)ProcNatl Acad Sci U S A.93(20)10614-9；Schena等(1995)Science 270(5235)467-70；Shalon等(1996)Genome Res.6(7)639-45，USPN 5,807,522，EP799 897；WO 97/29212；WO 97/27317；EP 785 280；WO 97/02357；USPN5,593,839；USPN 5,578,832；EP 728 520；USPN 5,599,695；EP 721 016；USPN 5,556,752；WO 95/22058以及USPN 5,631,734中。
阵列可用来检查基因的差异表达并且可用于测定基因功能。例如，可利用阵列检测与本文所述的多核苷酸对应的VEGI同种型的差异表达，其中表达在测试细胞和对照细胞之间进行比较。例如，特定VEGI同种型信使RNA在来自患病受试者的细胞中高表达，而在相应的正常细胞中未观察到，则可表明该VEGI同种型与此病有关联。阵列的例示性用途进一步描述在，例如，Pappalarado等，Sem.Radiation Oncol.(1998)8217以及Ramsay Nature Biotechnol.(1998)1640中。此外，利用阵列进行检测的方法的许多变形是本领域技术范围之内的事，并且落在本发明的范围内。例如，不将探针固定到固相支持物上，可将测试样品固定在固相支持物上，然后与探针接触。
在来自患病个体的细胞中差异表达的VEGI同种型多核苷酸就该病而言将具有临床意义。如果与来自未患病个体的相同细胞类型的细胞相比，在患病个体的细胞中检测到VEGI同种型多核苷酸更高或更低的水平的话，则该多核苷酸在细胞中是差异表达的。典型地，差异表达的多核苷酸的筛选集中于筛选以如下方式表达的多核苷酸，即，该多核苷酸的表达导致例如，患病个体细胞与不是来自此个体的相同细胞类型的细胞相比，其中的mRNA水平高(如过表达)或低(如次表达)至少约25％、至少约50％到约75％、至少约90％、至少约2倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或者至少约50倍或更高。此比较，例如，如果利用原位杂交或者利用允许在某种程度上区别组织中的细胞类型的另一种测定法的话，可在两个组织之间进行。比较也可以在从组织来源中取出的细胞之间进行。
因而，本发明提供了包括如本文所述的VEGI同种型多核苷酸的阵列。在有些实施方案中，本发明提供了包括表1(SEQ ID NO1)中所示的多核苷酸序列或者表1(SEQ ID NO1)中所示序列的多核苷酸区段的阵列，其中所述区段为至少10个连续的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100个连续核苷酸)。在其它实施方案中，该区段还包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94。在其它实施方案中，该区段位于表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93之内。
在有些实施方案中，本发明提供了包括表2(SEQ ID NO2)中所示的多核苷酸序列或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的多核苷酸区段的阵列，其中所述区段为至少10个连续的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100个连续核苷酸)。在其它实施方案中，该区段还包括表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸386和387。在其它实施方案中，该区段位于表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386之内。
阵列也可用于检测突变VEGI同种型多核苷酸。突变VEGI同种型多核苷酸可在基因组DNA中检测，例如分离自个体血液或另一种组织样品的基因组DNA。突变VEGI同种型多核苷酸也可以利用来自具有改变的VEGI同种型多核苷酸的个体的cDNA或mRNA检测，举例来说，如果该突变VEGI同种型多核苷酸产生大小改变的mRNA的话。突变VEGI同种型基因也可能导致VEGI同种型mRNA的差异表达(增加或减少)，这可以如本文所述检测。
本发明也提供了包括能与本文所述的多核苷酸特异性杂交的一种或多种分离的多核苷酸的阵列。在有些实施方案中，本发明提供了包括能与表1(SEQ ID NO1)中所示多核苷酸或者表1(SEQ ID NO1)中所示序列的多核苷酸区段特异性杂交的一种或多种分离的多核苷酸的阵列，其中所述区段为至少10个连续的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100个连续核苷酸)。在其它实施方案中，该区段进一步包括表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸93和94。在其它实施方案中，该区段位于表1(SEQ ID NO1)中所示序列的核苷酸1-93之内。
在其它实施方案中，本发明提供了包括与表2(SEQ ID NO2)中所示多核苷酸或者表2(SEQ ID NO2)中所示序列的多核苷酸区段特异性杂交的一种或多种分离的多核苷酸的阵列，其中所述区段为至少10个连续的核苷酸(或者更多，例如至少15、18、20、25、35、40、45、50、60、75或100个连续核苷酸)。在其它实施方案中，该区段进一步包括表2(SEQ IDNO2)中所示序列的核苷酸386和387。在其它实施方案中，该区段位于表2(SEQ ID NO2)中所示序列的核苷酸1-386之内。
本发明的多肽本发明包括表4(SEQ ID NO4)、5(SEQ ID NO5)和6(SEQ ID NO6)中所示的人类VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251多肽序列。VEGI多肽可以通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析在内的方法从重组细胞培养物中回收和纯化。蛋白折叠步骤可根据需要使用以完成成熟蛋白的构型。最后，高效液相色谱(HPLC)可用于最后的纯化步骤。蛋白折叠和纯化方法的实例描述在美国专利申请20010044521和WO 01/55174中。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或者是化学合成操作的产物，或者通过重组技术由原核(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如CHO细胞)产生。根据重组生成操作中所使用的宿主，本发明的多肽可以被糖基化或者可以不被糖基化。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
如本文所述，本发明的VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251多肽(如本文所述，其包括各种实施方案，例如全长、突变、融合、片断等)具有多种用途。所述多肽在用作指示血管生成相关疾病的遗传或生物化学标记(例如在血液或组织中)和/或用于监测各种疗法以及预防性干预的功效时将尤其有意义。诊断(即检测)和筛选方法在下文更加详细地描述。本发明的多肽也可用于制备与这些多肽结合的抗体，用作为试剂筛选药物候选物(体外和体内)、用于合理(即基于结构的)药物设计中以及包括下文描述的治疗用途在内的其它用途(例如，如果全长VEGI-192a或VEGI-192b通过结合另一个蛋白发挥作用，则竞争性结合VEGI-192a或VEGI-192b的多肽能够作为竞争性抑制剂损害VEGI-192a或VEGI-192b的功能从而发挥治疗活性)。VEGI-192a或VEGI-192b多肽也可用于鉴定尤其是来自于人类的与VEGI-192a或VEGI-192b结合(或者物理作用)从而自身可作为药靶的蛋白。
本发明提供了VEGI-192a和VEGI-192b多肽，截短形式或片断。本发明的VEGI多肽具有一种或多种功能，如在前面部分所描述的。在有些实施方案中，VEGI多肽起着结合特异性抗体的作用。在其它实施方案中，VEGI多肽是免疫原。又在其它实施方案中，VEGI多肽抑制血管内皮细胞生长和/或血管生成。测试VEGI多肽(包括截短形式的VEGI)活性的方法是本领域熟知的，并在实施例中详加描述，例如测试对血管内皮细胞生长、毛细管样管形成、置于鸡胚尿囊绒膜上的胶原凝胶中的毛细管生长、异种移植肿瘤生长的影响的试验。
多肽片断的大小可以变化很大。因而，本发明包括全长VEGI-192a或VEGI-192b的多肽片断，其包含表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所述的部分氨基酸序列，其中该VEGI-192a和VEGI-192b多肽为表4(SEQID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示序列的至少约5个、约10个、约15、25、50、75、100、150或更多个连续的氨基酸。应理解该片断包含位于SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸1-26之内的至少一个氨基酸，优选包含SEQ ID NO4或5氨基酸1-26内的区域。在有些实施方案中，所述的部分氨基酸序列包括表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示的氨基酸26和27。在有些实施方案中，所述的部分氨基酸序列位于SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸1-26之内。对本领域技术人员显而易见的是，这些多肽，不论其大小如何，也可与其它物质或药剂结合或偶联以促进、增强或调节VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的功能和/或特异性。这些片断也可用于多种用途，包括作为免疫原(单独或者联合合适的药剂)或者作为抑制血管生成的药剂。所述片断(与多肽一样)应当具有上文所述的VEGI多肽的一种或多种生物学功能。在有些实施方案中，所述片断抑制血管生成。截短形式可以小于大约如下任何数目的氨基酸185、170、160、150、125、100、80、50、40、25、20、15或10个。
应当理解，位于给定氨基酸或核苷酸对之内的连续氨基酸或核苷酸区段可以，但不必要，包括指定对的任一成员。例如，位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26之内的连续的氨基酸可以包括SEQ ID NO4的氨基酸1和/或氨基酸26。
在本发明的有些实施方案中，本发明的多肽包括位于表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示氨基酸残基1-26之内的至少5个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续氨基酸(其一般也称之为区段)。本发明也提供了包括表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQID NO5)中所示序列的大约5-192、10-192、15-192、20-192或25-192位氨基酸残基的多肽。
本发明的实施方案排除由SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸27-192构成的多肽，或者此类多肽的任何截短形式。
本发明进一步包括与上述多肽具有至少90％相似性、更优选至少95％相似性、并且还更优选至少96％、97％、98％或99％相似性的多肽。本发明的多肽也包括那些与本文所述的多肽具有至少80％同一性、更优选至少90％或95％同一性、还更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的多肽，并且也包括具有至少30个氨基酸且更优选至少50个氨基酸的此类多肽的部分。在有些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO4的多肽或者SEQ ID NO5的多肽具有至少90％相似性、更优选至少95％相似性、并且还更优选至少96％、97％、98％或99％相似性的多肽。本发明的多肽也包括那些与SEQ ID NO4的多肽或者SEQ ID NO5的多肽具有至少80％同一性、更优选至少90％或95％同一性、还更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的多肽。
本发明也提供了包含本文所述的多肽的融合蛋白。本文所示的多肽可与序列(例如增强免疫反应性、促进多肽偶联到支持物或者载体上，或者促进纯化(例如，编码表位如Myc、来源于流感病毒血凝素的HA、His-6或FLAG的序列)的序列)融合。另外，所述蛋白或多核苷酸可以与增强其功能或指导其在细胞中的定位的其它蛋白或多肽融合，例如本文公开的分泌序列。有关上文所述的重组融合蛋白的制备方法是本领域公知的。重组或融合蛋白可通过本领域熟知的方法分离。转化的宿主细胞可用于分析抑制或激活VEGI功能的药物和药剂，例如宿主蛋白或化学来源的药剂或与VEGI多核苷酸相互作用以下调或改变VEGI多肽的表达或影响其抑制血管生成的能力的其它蛋白的效力。测试抗-VEGI或抗血管生成的药物或药剂的效力的方法可以为，例如，对内皮细胞生长抑制剂的封阻。
本发明涵盖包括药物组合物在内的组合物，其包含本文所述的多肽。在有些实施方案中，所述组合物包括SEQ ID NO4的多肽。所述组合物可用于抑制血管生成。这些组合物可以进一步包括本领域熟知的合适的赋形剂，例如药学上可接受的包括缓冲液在内的赋形剂。
本发明也提供了包括本文所述的多肽的试剂盒。在有些实施方案中，该组合物包括SEQ ID NO4的多肽。在有些方面，试剂盒可用于治疗病理性血管生成，抑制血管生成，或者治疗癌症例如减小肿瘤大小。本发明的试剂盒被适当包装，并且可任选地提供附加的组分例如缓冲液和说明书。
本发明也提供了结合于固相支持物上的本文所述的多肽。进行此类结合，例如结合到阵列表面的方法是本领域众所周知的。结合于固相支持物(例如琼脂糖颗粒、SEPHADEX等)的本发明的多肽可用于筛选选择性结合本文所述的多肽的分子。
本发明也涵盖包括本文所述的本发明的VEGI同种型多肽的阵列。因此，在一个方面，本发明提供了包括如本文所述的本发明多核苷酸编码的VEGI同种型多肽的阵列。在其它方面，本发明提供了包括含有表4(SEQID NO4)中所示序列或其区段的多肽的阵列，其中所述区段长度为至少5个连续的氨基酸(或更多，例如长度为至少10、15、25、50、75、100、150或更多个氨基酸)。在有些实施方案中，该区段包括表4(SEQ ID NO4)中所示序列的氨基酸26和27。在其它实施方案中，该区段位于表4(SEQ IDNO4)中所示序列的氨基酸1-26之内。
在其它方面，本发明也提供了包括包含表5(SEQ ID NO5)中所示序列或其区段的多肽的阵列，其中所述区段长度为至少5个连续的氨基酸(或更多，例如长度为至少10、15、25、50、75、100、150或更多个氨基酸)。在有些实施方案中，该区段包括表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸26和27。在其它实施方案中，该区段位于表5(SEQ ID NO5)中所示序列的氨基酸1-26之内。
术语“多肽”和“蛋白”在文中互换使用，如本领域所熟知的，是指任何长度的氨基酸的聚合物。在各种实施方案中，该聚合物可以是线性的或分枝的，它可以包括修饰氨基酸，它可以被非氨基酸中断和/或它可以被组装为具有一个以上多肽链的复合物。正如本领域所熟知的，多肽可以被天然地或者通过干预修饰；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其它操作或修饰，例如偶联标记组分。在有些实施方案中，多肽含一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域公知的其它修饰。
本发明也包括本文所述VEGI多肽的保持了功能的变体。此类变体可利用本领域标准的方法，例如通过保守氨基酸替代制备。在各种实施方案中，保持了功能的变体包括其中包括了(或者在有些实施方案中，组成为)1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个保守氨基酸替代之任一的功能保持变体。
载体和宿主细胞本发明也涉及包括本发明分离的多核苷酸的载体，由所述重组载体遗传改造的、或者以其他方式改造而产生本发明的多肽的宿主细胞，以及本发明的多肽通过重组技术的生产。
术语“载体”是指质粒、病毒或本领域公知的其它运载工具，其已经被操作插入或并入了VEGI-251、VEGI-192a或VEGI-192b基因序列或其片断。使得载体适于操作的这种多核苷酸(通常为DNA)元件可以是在原核或真核细胞中起作用的复制原点。在原核细胞中工作的复制原点的实例是colElori。重组载体还需要选择标记以控制含所述载体的这些生物体的生长。合适的选择标记包括保护生物体免受抗生素(例如，氨苄青霉素、链霉素、氯霉素)破坏的基因(抗生素抗性)，或者在细胞中表达为蛋白时在缺乏化合物的环境条件(营养缺陷型生长条件)下提供生长的基因。在本发明优选的操作重组载体的实施方法中，原核细胞为细菌。在本发明特别优选的形式中，细菌尤其是大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌种(Bacillussp.)。在本发明进一步优选的操作重组载体的实施方案中，真核细胞为细胞系细胞或酵母细胞。在本发明特别优选的形式中，细胞系细胞为CHO、COS、Hela细胞系或3T3细胞系细胞，而酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
本发明包括许多其中已经克隆了VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的载体(即克隆和/或表达载体，以及用于克隆和/或复制的载体)。这些载体可用于表达重组多肽以及作为VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的来源。克隆载体可用于获得它们所含的VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的复制拷贝，或者作为在保藏单位贮存多核苷酸的工具以备将来回收之用。表达载体(以及含这些表达载体的宿主细胞)可用于获得由它们所含的多核苷酸产生的多肽。它们也可用于期望可在个体中表达VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多肽的情况下，例如通过表达载体中编码的多肽引发免疫应答。合适的克隆和表达载体包括任何本领域已知的载体，例如，可用于细菌、哺乳动物、酵母和昆虫表达系统的那些载体。具体的载体及合适的宿主细胞是本领域公知的，而无需在文中详细描述。例如，参见Gacesa和Ramji，Vectors，John Wiley & Sons(1994)。
克隆和表达载体典型地含有选择标记(例如，编码转化有该载体的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白的基因)，虽然此种标记基因可以由共引入宿主细胞中的另一个多核苷酸序列携带。只有已引入了选择基因的那些宿主细胞在选择条件下会存活和/或生长。典型的选择基因编码的蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素物质(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤等)的抗性；(b)补偿营养缺陷型不足；或(c)提供复杂培养基中不可获得的关键营养物。适当标记基因的选择将取决于宿主细胞，而用于不同宿主的合适的基因是本领域公知的。克隆和表达载体也典型地含有为宿主所识别的复制系统。
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以从本领域现有的大量克隆载体中选择。尽管选择的克隆载体可能根据待用的宿主细胞变化，可用的克隆载体一般将具有自我复制的能力，可以具有特定限制性内切酶的单个靶点和/或可以携带可用于选择含所述载体的克隆的标记基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(如pBS SK+)及其衍生物mp18、mp19、pBR322、pMB9、C0lEl、pCRl、RP4，噬菌体DNA以及穿梭载体例如pSA3和pAT28。这些及其它克隆载体可由商家BioRad、Strategene和Invitrogen等获得。
表达载体一般为含有编码目的VEGI多肽的多核苷酸的可复制多核苷酸构建物。编码VEGI多肽的多核苷酸可操作地连接于合适的转录调控元件，例如启动子、增强子和终止子。对于表达(即翻译)，通常也需要一种或多种翻译调控元件，例如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。这些调控元件(转录和翻译的)可来自于VEGI多核苷酸(即VEGI同种型基因之一)，或者它们可以是异源的(即，来自于其它基因和/或其它生物体)。也可以包括编码信号肽的多核苷酸序列，以允许VEGI多肽穿越和/或停留在细胞膜中或者从细胞中分泌。许多适于在包括酵母、禽类和哺乳动物细胞在内的真核细胞中表达的表达载体是本领域公知的。
含有目的多核苷酸的载体可通过任何一种适当的方法引入到宿主细胞中，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染、微粒轰击、脂转染以及感染(其中载体为感染因子，例如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的方式的选择常取决于宿主细胞。
本发明进一步包括宿主细胞和由所述宿主细胞构成的细胞培养物。在前面提及了包含至少一种重组多核苷酸(通常为DNA)载体的宿主细胞。“宿主细胞”是指载体在其中能够繁殖并表达它的DNA的细胞。所述细胞可以是原核或真核细胞。该术语也包括所述宿主细胞的任何子代。应当理解并非所有的子代都与亲代细胞相同，因为在复制期间可能发生突变。不过，当利用术语“宿主细胞”时，此类子代包括在内。稳定转染的方法，即外源DNA持续维持在宿主中的方法，是本领域公知的。当宿主细胞取自原核细胞时，它优选由细菌尤其是大肠杆菌或芽孢杆菌菌种的细胞组成，当宿主细胞由真核细胞组成时，它优选是细胞系细胞，尤其是COS细胞系、Hela细胞系或3T3细胞系细胞或者酵母细胞，尤其是酿酒酵母细胞。
本发明的宿主细胞可用作例如VEGI多核苷酸，和/或产生本文所述的VEGI多核苷酸和/或多肽的运载工具的贮存库。宿主细胞也可作为突变VEGI-192a、VEGI-192b或VEGI-251多核苷酸的贮存库，如本文进一步描述的。此类宿主细胞如本文进一步描述的可用于筛选、生产治疗性蛋白或多肽。
抗体及其制备本发明也提供了选择性结合如本文所述的VEGI-192a和/或VEGI-192b(包括片断)蛋白的抗体。术语“抗体”包括，但不限于完整分子、能够结合表位决定簇的它们的片断，例如Fab、(Fab′)2、Fv。这些保留了选择性与其抗原或受体结合的一定能力的抗体片断定义如下(1)Fab，含抗体分子的单价抗原结合片断的片断，可通过用木瓜蛋白酶消化全抗体制备，产生完整的轻链和一条重链的部分；(2)Fab′，抗体分子的该片断可通过用胃蛋白酶处理全抗体接着还原获得，产生完整的轻链和重链的一部分；每个抗体分子获得两个Fab′片断；(3)(Fab′)2，该抗体片断可通过用胃蛋白酶处理全抗体而无需后续还原获得；(Fab′)2是两个Fab′片断通过两个二硫键结合在一起的二聚体；(4)Fv，定义为基因工程片断，含表达为两条链的轻链可变区和重链可变区；和(5)单链抗体(″SCA″)，定义为基因工程分子，含有由合适的多肽接头连结的轻链可变区及重链可变区作为基因融合的单链分子。
在有些实施方案中，本发明的抗体可以是如下任一种或多种多克隆、单克隆、单链(ScFv)、这些实施方案的突变体、包括部分抗体(例如一个或多个CDR区)的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、人类抗体或包括具有所需特异性的抗原识别位点的该免疫球蛋白分子的任何修饰构型。
正如本领域所理解的，“单克隆抗体”是指均质抗体群，其中的单克隆抗体由参与抗原选择性结合的氨基酸(天然存在的及非天然存在的)组成。单克隆抗体具高度特异性，指向单个抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且包括其片断(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包括部分抗体的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、以及包括具有所需特异性的抗原识别位点和结合抗原的能力的该免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。就抗体的来源和制备它的方式而言(例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)，并不刻意限制。
“人源化”抗体是指这样一种分子，其具有基本上来源于非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点，而该分子其余的免疫球蛋白结构基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包括移植到可变结构域合适的构架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者可以通过一个或多个氨基酸替代修饰，例如，修饰以更接近地类似于人类免疫球蛋白。有些形式的人源化抗体保有全部的CDR序列(例如，含来自小鼠抗体的所有6个CDR的人源化鼠抗体)。其它形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变了的一个或多个CDR(1个、2个、3个、4个、5个、6个)，它们也被称之为“衍生自”该抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
制备抗体和抗体片断的方法是本领域公知的。(例如参见Harlow和Lane，《抗体实验室手册》(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约，1988，特此并入作为参考)。
本发明也提供了选择性结合包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或其片断的多肽的抗体，其中所述片断位于SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸1-26之内，或者该片断包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸26和27。本发明也提供了选择性结合VEGI-192a和VEGI-192b而非其它VEGI同种型的抗体(不选择性地结合其它VEGI同种型例如VEGI-251)。本发明也提供了选择性结合VEGI-192a或VEGI-192b的抗体。
本发明进一步提供了选择性结合由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或其片断编码的多肽的抗体。
在有些实施方案中，本发明提供了与包括SEQ ID NO4或SEQ IDNO5的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续氨基酸的区段的多肽选择性结合的抗体，其中所述区段位于表4(SEQ ID NO4)或表5(SEQ ID NO5)中所示氨基酸残基1-26之内。在其它实施方案中，本发明提供了与包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或更多个连续氨基酸的区段的多肽选择性结合的抗体，其中所述区段包括SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸残基26和27。
在有些实施方案中，本发明的抗体抑制VEGI活性；例如，此类抗体可以促进血管生成。筛选此类抗体的方法在下文描述。
在有些实施方案中，本发明的抗体可以是激动剂抗体，原因在于它促进VEGI活性。筛选此类抗体的方法在下文描述。
应当理解在存在各种VEGI同种型的本上下文中，选择性结合(除非早已另行指出)指较之于另一种同种型，偏好地(或者甚至排它地)结合给定的同种型。在有些实施方案中，较之于非人VEGI同种型，所述抗体选择性地结合本发明的VEGI多肽。作为实例，本发明的抗体能够选择性地结合人类VEGI-192a而不结合小鼠(非人)VEGI-192a。
本发明的抗体可连接于(即偶联于)可检测的药剂或半抗原。使用标准免疫化学技术例如由Harlow和Lane(1988)(同前)所描述的免疫组织化学法，该复合物可用于检测样品中与该抗体特异性结合的多肽(或多肽片断)。可利用本发明的单克隆抗体的免疫测定试验类型的实例有直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定法。此类免疫测定法的实例有酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和夹心(免疫度量)测定法。利用本发明的单克隆抗体的检测可在生理学样品上通过使用或者以正向、反向或者以正向反向同时的模式进行的免疫测定法，包括免疫组织化学测定法来实现。本领域技术人员将知晓，或者能够无需过度的试验容易地辨别其它免疫测定形式。
也能产生更大敏感性的另一种技术包括将抗体偶联于低分子量的半抗原。然后可以通过第二反应特异性地检测这些半抗原。例如，通常利用诸如与抗生物素蛋白反应的生物素、或者能与特异性抗半抗原抗体反应的二硝基苯、吡哆醛及荧光素等半抗原。参见Harlow和Lane(1988)同前。
本发明的抗体可以与许多不同的载体结合。因而，本发明也提供了含有抗体和载体的组合物。载体可以是活性和/或惰性的。众所周知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。对于本发明的目的，载体的形式可以是可溶或者不可溶的。本领域技术人员将知晓用于结合单克隆抗体的其它合适的载体，或者利用常规实验将能够辨别此类载体。
有许多不同的标记和标记方法是本领域普通技术人员公知的。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物以及生物发光化合物。本领域技术人员将知晓用于结合单克隆抗体的其它合适的标记，或者利用常规实验将能够辨别此类标记。此外，这些标记与本发明单克隆抗体的结合可以利用本领域普通技术人员常见的标准技术实现。
为本发明的目的，本发明的多肽存在于样品如体液和组织中时，可通过本发明的抗体检测。抗体的这种用途在下文更加详细地讨论。
含有所述抗体、其片断或产生所述抗体的细胞系的组合物涵盖在本发明之中。当在药学上利用这些组合物时，它们与药学上可接受的赋形剂组合。包括所述抗体或其片断的阵列涵盖在本发明之中。抗体可固定在表面上，例如，如下文详述的用于检测和诊断测定法的阵列。抗体也可以固定在支持物上，用于纯化本文所述的多肽或片断。
组合物本发明进一步提供了包括药物组合物在内的组合物，其包含本发明的多肽、多核苷酸、抗体、重组载体以及宿主细胞。这些组合物可以包括缓冲液，其根据所述多肽、多核苷酸、抗体、重组载体或宿主细胞的预期用途选择，并且也可以包括适用于目的用途的其它物质。本领域技术人员能够容易地选择适用于目的用途的合适的缓冲液，其中许多是本领域公知的。在一些情况下，所述组合物是药物组合物并且可以包括药学上可接受的赋形剂一一其中的许多是本领域公知的，因而无需在本文详加讨论。药学上可接受的赋形剂在许多出版物中有充分的描述，包括，例如A.Gennaro(2000)″RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy″，第20版，Lippincott，Williams，& Wilkins。
包括本发明的多核苷酸、多肽和/或抗体的试剂盒如本文所述，本发明也涵盖含有本发明的多核苷酸、多肽和/或抗体的试剂盒，例如用于诊断、用于治疗的试剂盒。本发明的试剂盒包括允许人们测定VEGI多核苷酸、多肽和/或抗-VEGI抗体(例如本文所述的任何一种)的存在，从而检测和/或定量这些分子的那些试剂盒。从而，本发明包括(a)用于检测或定量包括本文所述的任何一种VEGI多核苷酸的样品中的VEGI多核苷酸的试剂盒；(b)包括本文所述的任何一种抗体用以检测或定-量样品中VEGI多肽的试剂盒；(c)包括本文所述的任何一种多肽用于检测或定量样品中的抗-VEGI抗体的试剂盒。本发明也提供了包括本发明的多核苷酸或多肽用于治疗的试剂盒。
本发明试剂盒被适当包装，并且可任选地提供操作中可用的附加组分。这些任选的组分包括，但不限于缓冲液、捕获试剂、显色试剂、标记、反应表面、检测工具、对照样品、说明书以及解释性信息。
利用多核苷酸、多肽和抗体的方法检测系统本发明也提供了利用本发明的VEGI-192a和VEGI-192b多核苷酸、多肽和/或抗体检测样品中合适的靶的方法。正如本公开内容所澄清的，检测方法是指检测存在、不存在以及定量的任何一种方法。利用多核苷酸、多肽或抗体进行诊断(即检测)测试的操作是本领域广为人知的，并且对于普通技术人员是常规的。一般地，为实施本发明的诊断方法，提供本发明的一种组合物作为试剂检测样品中与之进行反应的靶。所述靶由从待测量诊断参数的个体中获得的合适的样品供应。许多类型的样品适用于此目的。如果需要，所述靶可以在进行测定前从样品中部分纯化或者扩增。
本发明涉及检测样品中VEGI-192a或VEGI-192b多肽的存在或不存在或者水平的方法，包括使来自人类或动物的样品与选择性结合本文所述多肽的抗体接触，并检测所述多肽和抗体之间形成的复合物的存在或不存在或者量。此类检测可用于诊断、预后和/或监测血管生成相关疾病的目的。在有些实施方案中，本发明提供了诊断病理性血管生成的方法，包括步骤使来自怀疑具有病理性血管生成的人类或动物的样品与识别本文所述多肽的抗体接触，并检测存在或不存在所述肽和抗体之间形成的复合物。
可以使用竞争性测定法，其中，选择性结合VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的抗体被结合到固相支持物上，使标记的VEGI-192a和/或VEGI-192b以及来自宿主的样品通过该固相支持物，由例如液体闪烁层析检测的标记的量能够与样品中VEGI-192a和/或VEGI-192b的量相关。
“夹心”测定类似于ELISA测定。在“夹心”测定中，使VEGI-192a和/或VEGI-192b通过固相支持物，并与连接在固相支持物上的抗体结合。然后使二抗与VEGI-192a和/或VEGI-192b结合。然后使二抗特异性的标记三抗通过该固相支持物，并与二抗结合，然后可以进行定量。
利用本领域熟知的标准方法学，可以通过在表面(即固相支持物)，例如，微量滴定板或膜(如硝化纤维素膜)上包被VEGI-192a或VEGI-192b多肽或两者特异性的或者与之选择性结合的抗体，然后使包被的表面与取自怀疑患有血管生成相关病的个体的血清、组织或其它生物学或化学样品接触来建立诊断测定。所得的在样品中的VEGI-192a或VEGI-192b多肽与其特异性抗体之间形成的复合物的存在或不存在可通过本领域常见的任何公知方法检测，例如荧光抗体光谱法或比色法。这种检测方法可用于例如，癌症的诊断或预后。
可利用本领域熟知的任何基于抗体的技术测定样品中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的水平。例如，可利用经典免疫组织化学方法研究组织中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的表达(Jalkanen，M.等，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.等，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。其它可用于检测VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽基因表达的基于抗体的方法包括免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域公知的，并且包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶和放射性同位素，例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)以及荧光标记，例如荧光素和罗丹明，以及生物素。
除了在取自个体的样品中测定VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的水平，还可以通过成像在体内检测VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽。用于VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽体内成像的抗体标记或标志包括可被X-射线照像术、NMR或ESR检测的那些标记。对于X-射线照像术，合适的标记包括放射性同位素如钡和铯，它们发射可检测的放射线，但对于受试者无明显害处。用于NMR和ESR的合适标志包括那些具有可检测的特征性自旋的标志例如氚，它可以通过标记相关杂交瘤的营养物而掺入到抗体中。
选择性结合VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的抗体或抗体片断，在用合适的可检测成像成分，例如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)、不透射线的物质或者可由核磁共振检测的物质标记后，可以引入(例如，肠胃外、皮下或者腹膜内)到待检查免疫系统紊乱的哺乳动物中。本领域将会理解受试者的大小和所用的成像系统将决定为产生诊断影像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受试者，注射的放射活性量正常地在从大约5到20毫居里99mTc的范围内。然后标记的抗体或抗体片断将优先地在细胞中含VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的位置上积聚。体内肿瘤成像描述于由Burchiel及其同事(《肿瘤成像》第13章癌症的放射化学检测(The Radiochemical Detection of Cancer)，Burchiel，S.W.和Rhodes，B.A.编辑，Masson Publishing Inc.(1982))。
正如本领域所理解的，VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽可利用与这些多肽选择性结合的任何试剂检测。
在另一个实施方案中，本发明涉及诊断试剂盒，其包括与本发明的多肽选择性结合的抗体(例如，与VEGI-192a或VEGI-192b多肽或两者选择性结合的抗体)，以及适用于检测样品中所述多肽存在的辅助试剂。这些试剂是本领域熟知的，并且适用于检测血清、组织或其它样品中存在或不存在VEGI多肽。考虑的组织样品可获自猴子或人类或其它哺乳动物。该试剂盒可进一步包括使用说明书、对照以及解释性信息。
本发明也提供了检测本文所述的多核苷酸的存在或不存在或者水平的方法，包括使来自个体的人类或动物的样品与选择性结合本文所述多核苷酸的多核苷酸(在有些实施方案中为寡核苷酸)接触，并检测所用多核苷酸与样品中多核苷酸之间形成的双链体的存在或不存在或者量。在有些实施方案中，本发明可用于诊断病理性血管生成的方法，包括使来自怀疑患有病理性血管生成的人类或动物的样品与能结合本文所述多核苷酸的多核苷酸(例如寡核苷酸)接触，并检测存在或不存在所用多核苷酸与样品中多核苷酸之间形成的双链体的步骤。在另一个实施方案中，本发明涉及RNA、DNA或其它核苷酸序列，其可用于由聚合酶链式反应(PCR)或反转录PCR(RT-PCR)检测存在或不存在VEGI多核苷酸。可以利用其它基于引物的扩增方法。可利用表1(SEQ ID NO1)或表2(SEQ ID NO2)中所示的本发明DNA序列设计引物，所述引物在PCR情况下与VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸序列特异性结合，或者与由编码VEGI-192a或VEGI-192b多肽的RNA反转录产生的VEGI-192a或VEGI-192bcDNA特异性结合，以便通过与标准比较用于检测存在、不存在或者定量VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸。引物可以是任何长度范围，例如7-40个核苷酸，优选10-15个核苷酸，最优选18-25个核苷酸。PCR或RT-PCR反应所必需的试剂和对照是本领域熟知的。然后扩增产物可用于分析存在或不存在VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸序列，例如通过凝胶分级分离(伴有或不伴有杂交)、通过放射化学以及免疫化学技术。这种方法是有利的，因为仅需要小份的样品就能产生足够量的模板DNA用于进行PCR或RT-PCR。
在有些实施方案中，所述检测方法需要使用一个或多个引物来扩增目的VEGI-192a和/或VEGI-192b序列。在其它实施方案中，检测利用能检测存在或不存在(或者可量化)目的VEGI-192a和/或VEGI-192b序列的特异性探针(例如标记探针)实现。在有些实施方案中，所述探针包括标记。
在有些实施方案中，所述方法通过检测编码本文所述的VEGI-192a或VEGI-192b或其片断的细胞RNA的存在或不存在或者含量用来检测VEGI-192a或VEGI-192b的水平。总细胞RNA可利用任何适当的技术从样品中分离，例如由Chomczynski和Sacchi(Anal.Biochem.162156-159(1987))描述的单步-硫氰酸胍-酚-氯仿法。然后利用任何适当的方法测定编码VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的mRNA的水平。这些方法包括RNA印迹分析、S1核酸酶图谱、聚合酶链式反应(PCR)、联合聚合酶链式反应的反转录(RT-PCR)以及联合连接酶链式反应的反转录(RT-LCR)。
在其它实施方案中，本发明涉及诊断试剂盒，其包含PCR或RT-PCR引物，即一种或多种引物，例如VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸特异性引物和/或其它VEGI同种型如VEGI-251、VEGI-174特异性引物，以及本领域熟知的辅助试剂，这些试剂适用于在PCR或RT-PCR或者一种或多种其它扩增方法中检测样品中存在或不存在VEGI同种型多核苷酸、或者定量编码VEGI同种型多肽的RNA。所考虑的样品可获自于人类或动物。
在其它实施方案中，本发明涉及诊断试剂盒，其包含探针，即一种或多种探针，例如VEGI-192a或VEGI-192b多核苷酸特异性探针和/或其它VEGI同种型如VEGI-251、VEGI-174特异性探针，以及本领域熟知的辅助试剂，这些试剂适用于在诸如RNA印迹法等方法或者一种或多种其它方法中检测样品中存在或不存在VEGI同种型多肽、或者定量编码VEGI同种型多肽的RNA。所考虑的样品可获自于人类或动物。
正如本领域所理解的，“样品”可以是获自个体(常称之为“生物样品”)、体液、细胞系、组织培养物或含有或可能含有VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽或mRNA的其它来源的任何样品。正如所指出的，生物样品包括含有游离VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的体液(例如血清、血清、尿、滑液及脊髓液)、免疫和循环系统组织、以及发现表达完整或成熟VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽或VEGI-192a和/或VEGI-192b受体的其它组织来源。自哺乳动物获得活检组织和体液的方法是本领域熟知的。当生物样品包括mRNA时，活检组织为优选的来源。
“测定编码VEGI-192a和/或VEGI-192b蛋白的基因的表达水平”是指定性或定量地直接(例如，通过测量或估计绝对多肽水平或mRNA水平)或者相对地(例如，通过与第二样品中的VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平进行比较)测量或估计在第一样品中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的水平或者编码VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的mRNA的水平。优选地，测量或估计第一样品中VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平，并与标准VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平进行比较，标准取自从未患所述紊乱的个体获得的第二样品、或者由未患免疫和循环系统紊乱的个体的群体的平均水平确定。正如本领域将会理解的，一旦知晓标准的VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽水平或mRNA水平，它就可以作为比较标准而重复使用。
如上文所指出的，VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸和多肽可用于诊断涉及VEGI-192a和/或VEGI-192b活性异常高或低表达的疾病。对于表达VEGI-192a和/或VEGI-192b，以及由VEGI-192a和/或VEGI-192b调节活性的细胞和组织，很显然与标准或“正常”水平相比，个体中VEGI-192a和/或VEGI-192b实质性改变(提高或降低)的表达水平将导致与VEGI-192a和/或VEGI-192b在其中表达和/或具活性的身体系统相关的病理性疾病。
本发明也提供了辅助诊断VEGI相关紊乱或疾病的方法。这些方法有助于就病理性血管生成的分类或性质或者癌症的预后作出临床判定，而且对于确定诊断而言这种临床判定可以是或可以不是决定性的。因此，辅助诊断病理性血管生成或癌症或者有关疾病预后的方法，可以包括检测来自个体的样品中VEGI同种型(即VEGI-192a、VEGI-192b)的表达水平的步骤。辅助诊断血管生成相关病的方法也可以包括检测来自个体的样品中VEGI同种型多核苷酸和/或多肽水平的改变和/或检测来自个体的样品中VEGI同种型多核苷酸和/或多肽水平的提高或降低的步骤。
本发明也提供了在由本文所述的方法治疗前检测处于风险中的个体的方法，所述个体可能或可能未患有可检测的血管生成相关病和/或与VEGI-192a或VEGI-192b的异常水平相关的疾病，且可能已表现出或可能未表现出可检测的疾病。“处于风险中”是指个体根据常规风险评估方法被确定为更可能出现症状或者具有与血管生成相关病发展有关联的一个或多个风险因素。具有这些风险因素之一个或多个的个体比没有这些风险因素的个体具有更高的可能性患上血管生成相关病。风险组的实例(即分类)是本领域熟知的，并在文中讨论。
VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸也可作为探针用于检测存在或不存在VEGI-192a和/或VEGI-192b基因突变或多态性，以及任何目的VEGI-192a或VEGI-192b序列，而不论是否为突变体。突变VEGI-192a和/或VEGI-192b可能与血管生成或者各种免疫和循环系统有关的紊乱相关。检测突变多核苷酸序列的方法是本领域熟知的，并且包括例如，单链构象多态性(SSCP)以及用于检测序列突变(包括点突变)的各种以序列扩增为基础的方法，例如LCR、NASBA、PCR、有限引物延伸等。检测改变的蛋白序列的方法包括蛋白质印迹分析、毛细管电泳、质谱分析和WAVE。一般而言，检测实验将与对照VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸或多肽平行进行，或者，在评价改变的表达水平的情况下，与具有正常水平的VEGI-192a和/或VEGI-192b多核苷酸或多肽正常水平的对照样品平行进行。
本发明的序列对于染色体鉴定很有价值。该序列特异性地靶向个体人类染色体上的特定位点并可以与之杂交。而且，目前存在鉴定染色体上特定位点的需要。根据本发明对染色体进行DNA绘图是与这些序列建立关联的重要的第一步。
简要地，可以通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)对染色体进行序列绘图。利用序列3′非翻译区的计算机分析快速选择不跨越基因组DNA中多于一个外显子而使得扩增过程复杂化的引物。然后利用这些引物对含个体人类染色体的体细胞杂合体进行PCR筛选。只有那些含与引物对应的人类基因的杂合体会产生扩增片断。
体细胞杂合体的PCR绘图是将特定DNA分配到特定染色体上的快速操作。利用本发明与相同的寡核苷酸引物，由来自特定染色体的片断集合或者大基因组克隆库可以以类似方式实现亚定位。可类似地用来对染色体绘图的其它绘图策略包括原位杂交，用标记的流式分选染色体预筛并通过杂交预选以构建染色体特异性cDNA文库。
可利用cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)一步提供精确的染色体定位。这种技术可使用短至50或60个碱基的cDNA。有关该技术的综述，参见Verma等，《人类染色体基础技术手册》“HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques”，Pergamon Press，纽约(1988)。
一旦序列被绘图到精确的染色体位置，该序列在染色体上的物理位置能够与基因图谱数据关联。例如，此类数据见于V.McKusick，“人类孟德尔遗传”中。然后通过连锁分析(物理学相邻基因的共遗传)鉴定被绘图到同一染色体区域上的基因和疾病之间的关系。
接下来，有必要确定患病和未患病受试者之间cDNA或基因组序列的差异。如果在有些或所有患病个体中而未在任何正常受试者中观察到突变，则该突变很可能是所述疾病的病因；定位于和所述疾病相关的染色体区中的基因可能是50到500个潜在致病基因之一。这假定1兆碱基的绘图分辨率，且每20kb一个基因。利用上文所述的技术，VEGI的染色体定位被高度可信地确定为9q32。早先的染色体绘图研究已将数种发育缺陷与染色体该区域中的基因座位联系起来。
本发明也可用于诊断或治疗哺乳动物尤其是人类的各种与免疫和循环系统有关的紊乱。此类紊乱包括细菌、病毒及其它寄生虫感染、免疫缺陷、炎症、淋巴结病、自身免疫病、移植物对抗宿主疾病以及任何免疫和循环系统细胞功能的失调，包括但不限于自身免疫、白血病、淋巴瘤、免疫抑制、免疫、体液免疫、炎症性肠病、骨髓抑制等。对于许多紊乱，可在取自患有此类紊乱的个体的多种组织(例如循环组织)或其它细胞或体液(例如血清、血浆、尿、滑液及脊髓液)中检测到相对于“标准”VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表达水平，也就是，未患所述紊乱的个体的VEGI-192a和/或VEGI-192b表达水平，VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表达水平的实质性改变(提高或降低)。因而，本发明提供了在VEGI相关紊乱诊断期间可用的诊断方法，它包括测量个体样品中编码VEGI-192a和/或VEGI-192b蛋白的基因的表达水平，并将测得的基因表达水平与标准VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表达水平进行比较，由此与标准相比的基因表达水平的提高或降低可指示所述紊乱。
因而，本发明提供了在VEGI相关紊乱诊断期间可用的诊断方法，它包括测量个体样品中编码VEGI-192a和/或VEGI-192b蛋白的基因的表达水平，并将测得的基因表达水平与标准VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表达水平进行比较，由此与标准相比的基因表达水平的提高或降低可指示所述紊乱。
当已经根据常规方法作出紊乱诊断时，本发明可用作预后和/或监测指数，由此表现出下降的VEGI-192a和/或VEGI-192b基因表达的患者和以接近标准水平的水平表达所述基因的患者相比，将经历更差的临床结果。
利用多核苷酸、多肽和抗体的方法筛选测定本发明的多核苷酸和多肽可用作为研究试剂和材料用于发现人类疾病的治疗和诊断法。
本发明提供了用于鉴定调节VEGI-192a和/或VEGI-192b的活性的药剂的方法；用于鉴定调节VEGI-192a和/或VEGI-192b在细胞中的表达的药剂的方法。在有些实施方案中，所述测定为无细胞测定。在其它实施方案中，所述测定是以细胞为基础的测定。
如本文所用，术语“调节”包括“提高”和“降低”。在有些实施方案中，尤其有意义的是抑制VEGI-192a和/或VEGI-192b活性的药剂。此类药剂可用于促进血管生成。在其它实施方案中，目的药剂是提高VEGI-192a和/或VEGI-192b活性的那些药剂。此类药剂对于抑制血管生成和治疗血管生成相关病具有意义。
一般地，筛选或测试方法可以使用任何一种来源的药剂或药物。药剂或药物可以是，例如生物学或化学化合物，例如简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、碳水化合物或脂蛋白。可以合成大量的化合物，例如寡聚体，例如寡肽和寡核苷酸，以及基于各种核芯结构的合成有机化合物，而且这些物质也包括在术语“药剂”中。另外，各种天然来源可提供用于筛选的化合物，例如植物或动物提取物等。化合物可以单独或者与另一个化合物组合进行测试。
本发明提供了鉴定与VEGI-192a和/或VEGI-192b结合后调节VEGI-192a和/或VEGI-192b活性的药剂的方法。该方法一般包括使选择性结合VEGI-192a和/或VEGI-192b的测试药剂与含VEGI-192a和/或VEGI-192b的样品接触；并测定VEGI-192a和/或VEGI-192b在存在或不存在所述药剂时的活性。与不存在所述药剂时相比，VEGI-192a和/或VEGI-192b在存在所述药剂时活性的升高或降低表明所述药剂提高(激动剂)或降低(拮抗剂)VEGI-192a和/或VEGI-192b的活性。潜在的激动剂或拮抗剂包括与本发明的多肽结合并由此提高或降低它的活性的小有机分子、肽、多肽及抗体。
检测药剂选择性结合本发明的多肽的能力的测定法是本领域公知的。例如，本发明的多肽可连接于固相支持物，而选择性与所述多肽结合的药剂可利用本领域公知的方法鉴定。备选地，VEGI-192a和/或VEGI-192b激动剂和/或拮抗剂可通过在合适的条件下将VEGI-192a或VEGI-192b以及潜在的激动剂和/或拮抗剂与膜结合的VEGI-192a或VEGI-192b受体(如果已鉴定了此类受体的话)或者重组受体组合进行竞争性抑制测定而检测。VEGI-192a或VEGI-192b可以，例如通过放射活性标记，从而与受体结合的VEGI-192a或VEGI-192b分子的数目能够确定潜在的激动剂和/或拮抗剂的效力。
测试VEGI活性的测定法是本领域公知的。此类基于细胞的测定法的实例在实施例中进一步详细描述，例如测试对血管内皮细胞生长、内皮细胞形成和组织为毛细管样管状结构或者内皮细胞组织成鸡胚尿囊绒膜中的毛细血管的影响。
选择性结合VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽的抗体可以通过与VEGI-192a和/或VEGI-192b结合并阻止其发挥活性可用作为拮抗剂。
本发明也提供了鉴定调节本文所述的VEGI同种型活性而无需与所述VEGI同种型结合的药剂的方法。此类药剂包括，但不限于调节VEGI的上游或下游活性的药剂。这些方法包括在存在或不存在待测药剂时测定VEGI的活性。
本发明也提供了鉴定调节本文所述的VEGI mRNA和/或多肽水平的药剂的方法。
因此，本发明提供了鉴定调节细胞中VEGI表达水平的药剂的方法，所述方法包括使待测试候选药剂与包括编码本文所述的VEGI多肽的核酸的细胞接触，并测定所述药剂对VEGI多肽表达的效果。在有些实施方案中，所述效果通过利用本文所述的VEGI多核苷酸检测编码VEGI多肽的mRNA的水平测量。在其它实施方案中，所述效果通过利用本文所述的抗体检测VEGI多肽的水平测量。
其它潜在的拮抗剂包括反义分子。反义技术可通过反义DNA或RNA或通过三股螺旋形成用于控制基因表达。反义技术在许多研究中讨论(例如，Okano，J.Neurochem.56560(1991)；″Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression.″CRC Press，Boca Raton，Fla.(1988))。三股螺旋形成也在许多研究中讨论(例如，Lee等，Nucleic AcidsResearch 63073(1979)；Cooney等，Science 241456(1988)；Dervan等，Science 2511360(1991))。所述方法建立在多核苷酸与互补DNA或RNA的结合的基础上。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸的5′编码部分可用于设计长度为约10到40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。可以设计DNA寡核苷酸以和所述基因中参与转录的区域互补，从而阻止转录和产生VEGI-192a和/或VEGI-192b。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并封闭所述mRNA分子翻译成VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽。上文所述的寡核苷酸也可递送到细胞中，从而所述反义RNA或DNA可在体内表达以抑制产生VEGI-192a和/或VEGI-192b多肽。
本发明也提供了鉴定药剂(例如突变体或变体VEGI-192a和/或VEGI-192b)的方法，其可竞争性结合VEGI-192a和/或VEGI-192b结合的靶，并阻止VEGI-192a和/或VEGI-192b与它们的靶相互作用。此类突变体或变体可能是VEGI-192a和/或VEGI-192b的激动剂或拮抗剂。
本发明提供了鉴定与VEGI-192a和/或VEGI-192b结合的药剂的方法，包括使所述药剂与VEGI-192a和/或VEGI-192b接触，然后检测与VEGI-192a和/或VEGI-192b结合的药剂。
利用多核苷酸、多肽和抗体的方法治疗疾病本发明提供了抑制血管内皮细胞生长、抑制血管生成、治疗或缓和由非控制性血管生成介导的疾病和进程、治疗癌症(例如抑制肿瘤生长)的方法。与VEGI-251为膜结合蛋白的教导相反，实施例表明VEGI-251为分泌蛋白，抑制血管内皮细胞生长，并且在表达后具有抗-血管生成效果。另外，实施例还表明VEGI-192a抑制血管内皮细胞生长。
从而，可用于本发明的方法的组合物包括，但不限于本文所述的多核苷酸，例如编码SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸；本文所述的多肽，例如SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQID NO6的多肽，或者包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式；以及本文所述的VEGI多肽的激动剂或拮抗剂，例如封闭所述VEGI多肽活性的抗体。
本发明也包括延迟个体的血管生成相关病的发展的方法。
本发明的VEGI同种型多肽(以及编码VEGI同种型多肽的多核苷酸)可用于在体外降低由内皮细胞形成毛细管样管状结构。本发明的VEGI同种型多肽可用于抑制内皮细胞响应血管生成因子例如FGF-2形成并组织为毛细管样管状结构。此外，本文所述的本发明的分离的VEGI同种型多肽也可用于抑制内皮细胞在改良的鸡胚尿囊绒膜(CAM)中生长并组织为毛细血管。因此，本发明的VEGI同种型多肽可用于在体外抑制由内皮细胞形成毛细管或毛细管样结构。
应当理解，个体中由于标准或正常VEGI同种型多肽活性水平的下降引起的疾病，尤其是免疫和循环系统紊乱，可通过给药本文所述的VEGI同种型多肽(或者编码VEGI同种型多肽的多核苷酸)治疗。因此，本发明也提供了治疗需要提高的VEGI同种型活性水平的个体的方法，包括向此个体给药包括一定量的本发明的分离的VEGI同种型多肽(或多核苷酸)，例如成熟形式的本发明的VEGI同种型多肽的药物组合物，以有效地提高此个体中VEGI同种型多肽的活性水平。本发明也提供了治疗需要降低的VEGI同种型活性水平的个体的方法，包括向此个体给药包括一定量的VEGI同种型拮抗剂(例如封闭VEGI同种型活性的VEGI同种型特异性抗体)的药物组合物，以有效地降低此个体中VEGI同种型多肽的活性水平。
基于多核苷酸的递送在有些实施方案中，本发明包括抑制组织或细胞中血管生成的方法，包括使有效量的具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽，或者包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式与所述组织或细胞接触，或在其附近表达，由此抑制血管生成。在有些实施方案中，本发明包括抑制血管生成的方法，包括向个体(例如人类或动物)给药足以抑制血管生成剂量的、包含编码SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽的核酸分子、或者编码包括SEQ IDNO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式的核酸分子的组合物。在有些实施方案中，所述核酸分子可操作地结合可控制基因表达的调控序列。此类调控序列是本领域公知的。
当个体为动物时，在有些实施方案中，个体可以是哺乳动物。
本发明也提供了治疗或缓和由非控制性血管生成介导的疾病和进程的方法，包括向个体(例如人类或动物)给药足以控制血管生成剂量的、包含编码SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的核酸分子、或者编码包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式的核酸分子的组合物的步骤。在有些实施方案中，所述核酸分子可操作地结合控制基因表达的调控序列。
本发明也提供了治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法，包括向个体(例如人类或动物)给药足以抑制肿瘤生长剂量的、包含编码SEQ ID NO4、SEQID NO5或SEQ ID NO6的核酸分子、或者编码包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式的核酸分子的组合物的步骤。在有些实施方案中，所述核酸分子可操作地结合控制基因表达的调控序列。
应当理解，如果利用截短形式的VEGI，并且截短发生在分泌信号序列处，则该截短形式包括同源或异源的分泌信号序列，以指导所述蛋白分泌。异源分泌信号序列是本领域公知的。
递送多核苷酸用于在个体中(离体及体内)表达的方法是本领域公知的。一般地，制备并给药合适的多核苷酸载体。
可以利用含多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。例如，受体介导的DNA递送技术描述在Findeis等，TrendsBiotechnol.(1993)11202；Chiou等，Gene TherapeuticsMethods AndApplications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff标记)(1994)；Wu等，J.BioL Chem.(1988)263621；Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269542；Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)873655；Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266338。在基因治疗方案中，含多核苷酸的治疗组合物可以在约100ng到约200mg DNA的范围内局部给药。在基因治疗方案期间也可以利用约500ng到约50mg、约1μg到约2mg、约5μg到约500μg以及约20μg到约100μg DNA的浓度范围。本发明的治疗多核苷酸可利用基因递送工具递送。基因递送工具可以是病毒或非病毒起源的(一般参见Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)151；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1185以及Kaplitt，NatureGenetics(1994)6148)。此类编码序列的表达可利用内源哺乳动物启动子或异源启动子诱导。编码序列的表达可以是组成型的或者是调控型的。
用于递送目的多核苷酸并在目的细胞中表达的以病毒为基础的载体是本领域熟知的。例示性的以病毒为基础的工具包括，但不限于重组反转录病毒(例如参见，PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利No.5，219,740和4,777，127；英国专利No.2,200,651以及EP 0 345 242)、以甲病毒为基础的载体(例如，新培斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross River Virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)以及委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCCVR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))以及腺相关病毒(AAV)载体(例如参见PCT公开号WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。也可以使用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147中所述的给药与杀死的腺病毒连接的DNA。
也可以使用非病毒递送工具和方法，包括但不限于单独与杀死的腺病毒连接或不连接的聚阳离子凝聚的DNA(例如参见，Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3147)；配体连接的DNA(例如参见，Wu，J.Biol.Chem.(1989)26416985)；真核细胞递送工具细胞(例如参见，美国专利No.5,814,482；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763和WO 97/42338)以及核电荷中和或者与细胞膜融合。也可使用裸DNA。例示性的裸DNA引入方法描述在PCT公开号WO 90/11092和美国专利No.5,580,859中。可作为基因递送工具的脂质体描述在美国专利No.5,422,120；PCT公开号WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445和EP 0524968.中。另外的方法描述在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)142411以及Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)911581中。
因而，例如，来自患者的细胞可由编码多肽如VEGI-251的多核苷酸(DNA或RNA)离体改造，然后向待用所述多肽治疗的患者提供改造的细胞。此类方法是本领域熟知的，并因本文的教导显而易见。例如，细胞可通过利用含编码本发明的多肽的DNA或RNA的病毒或反转录病毒颗粒改造。
同样地，细胞可以通过例如本领域公知的操作在体内改造以在体内表达蛋白。例如，可以向患者给予产生含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产细胞，以在体内改造细胞并在体内表达所述多肽。根据本发明的教导，通过此类方法给药本发明的多肽的这些和其它方法对本领域技术人员来说应当是显而易见的。例如，用于改造细胞的表达工具可以是反转录病毒以外的工具，例如，腺病毒，其在与合适的递送工具组合后可用于在体内改造细胞。
上文提及的反转录病毒质粒载体可以来源于如下反转录病毒，包括，但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾脏坏死病毒、反转录病毒例如罗斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒以及乳腺肿瘤病毒。在一个实施方案中，所述反转录病毒质粒载体来自于莫洛尼鼠白血病病毒。
载体通常包括一个或多个启动子。可使用的合适的启动子包括，但不限于反转录病毒LTR、SV40启动予以及由Miller及其同事(Biotechniques7980-990(1989))所述的人类巨细胞病毒(CMV)启动子或者任何其它启动子(例如细胞启动子，如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白启动子、polIII启动子以及β-肌动蛋白启动子)。可使用的其它病毒启动子包括，但不限于，腺病毒启动子、胸腺嘧啶激酶(TK)启动子以及B 19细小病毒启动子。根据本文所含的教导，合适启动子的选择对本领域技术人员将是显而易见的。
使编码本发明的多肽的核酸序列处于合适的启动子的控制之下。可使用的合适的启动子包括，但不限于，腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或者异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞体病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，例如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶激酶启动子，例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动；反转录病毒LTR(包括本文上述修饰的逆转录病毒LTR)；β-肌动蛋白启动子以及人类生长激素启动子。启动子也可以是控制编码所述多肽的基因的天然启动子。
如果选择反转录病毒载体系统，可以利用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系形成生产细胞系。可被转染的包装细胞的实例包括，但不限于如Miller(Human Gene Therapy15-14(1990))所述的PE501、PA317、b-2、b-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、CRE、β-CRIP、GP+E-86，GP+envAm12以及DAN细胞系，特此全文并入作为参考。载体可以通过本领域公知的任何方法转导包装细胞。此类方法包括，但不限于，电穿孔、脂质体的使用以及CaPO4沉淀法。在替代方法中，反转录病毒质粒载体可以包囊在脂质体中，或者偶联于脂质，然后向宿主给药。
生产细胞系产生包含编码所述多肽的核酸序列的感染性反转录病毒载体颗粒。然后可利用此类反转录病毒载体颗粒在体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码所述多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括，但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
这些一般原理适用于其它以病毒为基础的递送系统，例如AAV。
多肽递送本发明也提供了抑制血管生成的方法，包括向个体(例如人类或动物)给药足以抑制血管生成剂量的本文所述的多肽，例如SEQ ID NO4、SEQID NO5或SEQ ID NO6的多肽，或者包括SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式。
本发明也提供了治疗或缓和由非控制性血管生成介导的疾病和进程的方法，包括向个体(例如人类或动物)给药足以控制血管生成剂量的包括SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的多肽，或者含有SEQ IDNO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式的组合物的步骤。
本发明也提供了治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法，包括向个体(例如人类或动物)给药足以抑制肿瘤生长剂量的包括SEQ ID NO4、SEQ IDNO5或SEQ ID NO6的多肽，或者含有SEQ ID NO4的氨基酸1-26、SEQ ID NO5的氨基酸1-26或SEQ ID NO6的氨基酸1-85区段中至少一个或多个氨基酸的截短形式的组合物的步骤。
测试VEGI多肽(包括截短形式的VEGI)活性的方法是本领域熟知的，并在实施例中详加描述，例如用于测试对血管内皮细胞生长、毛细管样管形成、置于鸡胚尿囊绒膜上的胶原凝胶中的毛细管生长、异种移植肿瘤生长的影响的测定法。
如本文所用，“血管生成相关疾病”是与不期望的和/或非调控性的血管生成相关的疾病或状况，或者抑制血管生成较为有利的疾病或状况。它包括由不期望的和/或非控制性血管生成介导的疾病或进程。此类血管生成相关病的实例，例如肿瘤生长，在文中描述。
本文所述的VEGI同种型多肽可用于抑制内皮细胞，例如大动脉内皮细胞的增殖。所以，VEGI-192a、VEGI-192b和/或VEGI-152多肽可用于治疗其中抑制内皮细胞生长较为有利的疾病或紊乱。
VEGI同种型多肽组合物的配制和剂量将以与优良的医学实践协调的的方式进行，考虑个体患者的临床状况(特别是单独用VEGI同种型多肽治疗的副作用)、VEGI同种型多肽组合物的递送部位、给药方法、给药时间安排以及行医者公知的其它因素。因此，用于本文目的的VEGI同种型多肽的“有效量”由此类因素确定。
本发明的VEGI同种型多肽以及激动剂和拮抗剂可与合适的药学载体组合使用。此类组合物包括治疗有效量的所述化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。此种载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡聚糖、水、甘油、乙醇及其组合。所述制剂应当适合给药模式。
本发明也提供了药物包装或试剂盒，其包括填充了一种或多种本发明药物组合物的成分的一个或多个容器。伴随此类容器的可以是由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的通告形式，该通告反映了得到所述机构对制造、使用或销售用于人类给药的产品的批准。另外，本发明的药物组合物可与其它治疗化合物联合使用。
药物组合物可以通过便利的方式给药，例如局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或真皮内路径。药物组合物以对于治疗和/或预防特定适应征有效的量给药。一般而言，它们以至少约10g/kg体重的量给药，并且在多数情况下，它们将以不超过约8mg/Kg体重/天的量给药。在多数情况下，考虑到给药路径、症状等，日剂量为约10g/kg到约1mg/kg体重。
各种递送系统是已知的，并且可用于给药本发明的VEGI同种型多肽，例如包囊在脂质体中、微颗粒、微囊、受体介导的胞吞作用(如参见Wu和Wu 1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)。引入方法包括但不限于，局部、真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼及口服路径。化合物可以通过任何便利的路径给药，例如通过输注或者快速注射(bolusinjection)，通过上皮或粘膜皮肤衬里吸收(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，并且可连同其它生物学活性剂一起给药。
在具体的实施方案中，可能期望向需要治疗的区域局部给药本发明的药物组合物。这可以通过，例如，但不限于手术期间局部输注、局部施用(例如由创伤敷料传导)、通过注射、通过导管、通过栓剂或者通过植入物实现，所述植入物是多孔的、无孔的、或者凝胶物质，包括膜如sialastic膜或纤维。
疾病的评价利用本领域的标准技术进行，例如成像方法并监测合适的标志物。
普通技术人员也应当理解，由于本发明的VEGI同种型多肽是TNF家族成员，成熟分泌形式的蛋白可以通过蛋白酶解切割以可溶形式从表达本文所述的VEGI同种型多肽的细胞中释放出来。因此，当由外界来源向个体的细胞、组织或身体中添加VEGI同种型多肽的成熟形式或可溶胞外结构域时，所述多肽将对该个体中其靶细胞发挥其生理学活性。同样，可以向个体的细胞、组织或身体中添加表达该II类跨膜多肽的细胞，并且这些添加的细胞将与表达本文所述VEGI同种型多肽的受体的细胞结合，由此，表达VEGI同种型多肽的细胞能够对携带受体的靶细胞行使作用(例如，调节内皮细胞的生长和调控)。
如上所述，VEGI对内皮细胞生长表现出强烈的抗-增殖效果。因此，VEGI也可用于调节来自造血和循环内皮前体细胞的内皮细胞的发育。
因此，本发明提供了增强血管生成的方法，包括给药VEGI-192a或VEGI-192b抑制剂，如此血管生成得以增强。此类增强可能，例如，在血管阻塞相关疾病(例如局部缺血情况或者心脏病发作)的情况下是期望的。所述制剂可利用本领域公知的方法局部或系统给药。
封阻或抑制VEGI多肽活性的本发明的抗体可用于促进或增强血管生成。
实施例下文描述的是本发明的实施例，它们仅提供用于举例说明的目的，而并非限制本发明的范围。在本公开的启示下，权利要求书范围之内的众多实施方案对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
本发明将参照下列实施例进一步说明，不过，应当理解本发明不限于此类实施例。
最近报道了内皮细胞特异性基因产物-血管内皮细胞生长抑制剂(VEGI)的发现(Zhai Y，等，FASEB J.，13181-189，1999；Zhai，Y，等，Int.J.Cancer，82131-136，1999)。该蛋白由174个氨基酸组成，也就是VEGI-174，其与TNF超家族成员具有20-30％的序列同源性。广泛种类的细胞系和原代细胞培养物的RNA印迹分析显示所述VEGI-174基因主要在内皮细胞中表达。另外，所述VEGI-174mRNA在许多成人器官中是可检测的，提示该基因在正常血管结构中的生理作用。在许多细胞和动物模型中检查了VEGI-174的功能。重组截短形式的VEGI-174以显著的力度抑制内皮细胞增殖，但对于所检查的任何其它类型的细胞没有作用。该蛋白的截短形式也抑制内皮细胞在胶原凝胶中形成毛细管样结构以及毛细血管生长进入置于鸡尿囊绒膜上的胶原凝胶中。分泌形式的VEGI-174在鼠结肠癌细胞(MC-38)中的过表达几乎完全阻止了这些细胞在同系基因C57/BL小鼠中生长肿瘤。而且，共接种人类乳腺癌细胞和过表达分泌形式的VEGI-174的中国仓鼠卵巢细胞，导致乳腺癌异种移植肿瘤在裸鼠中生长受到显著抑制。
实施例1.人类血清的ELISA分析
正常男性和女性成年个体的正常人类血清获自伦巴第癌症中心血清库(Lombardi Cancer Center serum bank)。利用夹心ELISA测量血清VEGI含量。将血清样品(100μl)或处于3％ BSA中的不等量的重组VEGI蛋白添加到包被有多克隆抗-VEGI抗体并用3％ BSA封闭的96孔板上。添加针对VEGI的单克隆抗体(3-12D)(100μl，2μg/ml)。添加生物素标记的抗-小鼠IgG抗体(2μg/ml，Vector laboratories，Burlingame，CA)，继之加入抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶，并以3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Vectorlaboratories)作为底物。样品于室温下温育10分钟，用50μl 1M H2SO4终止反应，然后由分光光度计板读数器于450nm处利用标准曲线y＝-0.72+0.409*log(x)进行分析。所用的标准蛋白的范围为0.32-1000ng/ml。
实施例2.RNA印迹多组织RNA印迹和多组织印迹板(Clontech，Palo Alto，CA)在ExpressHyb溶液(Clontech)中与双链cDNA探针杂交。所用的全长VEGI-174探针为pCDNA3.1(Invtrogen，Carlsbad，CA)中的Hind III-BamHI cDNA片断(GenBank登录号#AF03990)。对于同种型特异性探针，通过PCR扩增制备编码其N-末端99个氨基酸的297-bp VEGI-251模板，并用32P-dCTP通过随机引物法标记(Life Technologies，Invitrogen，CA)。对应于其N-末端22个氨基酸的VEGI-174特异性探针通过末端标记66-bp的PCR产物制备。斑点于42℃过夜杂交并在洗涤缓冲液1(2×SSC，0.1％十二烷基硫酸钠)和洗涤缓冲液2(1 X SSC，1％ SDS)中于42℃洗涤，接着用增感屏于-70℃放射自显影。
实施例3.5′RACE以及VEGI同种型克隆根据制造商的说明，自多组织RACE板(ORIgene，Rockville，MD)中扩增5′VEGI序列。该板含有从24个人类个体组织中制备的cDNA样品，在所述cDNA的5′端连有衔接物。利用两对寡核苷酸引物进行两轮巢式PCR。在第一轮PCR中，利用衔接物引物ADP1，5′CGG AATT CGT CA CTCAGCG 3′(SEQ ID NO8)和VEGI基因特异性引物GSP1，5′CCC GGATCCT ATA GTAAGAA GGCTCC 3′(SEQ ID NO9)。然后用水以1∶10稀释反应产物。稀释的PCR样品随之与另一个衔接物引物ADP2，5′AGCGCGTGAA TCAGATCG3′(SEQ ID NO10)以及VEGI基因特异性引物GSP2，5′CGGTGGATCC CGAGTTTGTC TCACAACTG3′(SEQID NO11)用于第二轮PCR。将PCR产物于琼脂糖凝胶中分离，纯化并在ABI自动测序仪中测序。
实施例4.VEGI-251和VEGI-192a的分离利用根据RACE产物的测序结果设计的基因特异性引物重复第二轮PCR以证实它们的序列身份。然后将凝胶纯化的RACE产物克隆到质粒pCR3.1(Invitrogen，Frederick，MD)中并测序。根据这些序列，设计同种型特异性引物。共用的反向引物Vgl61(161)，5′GTGTAATCCA CC AAAGAG3′(SEQ ID NO12)与表8中所列的正向引物一起使用。
表8.人类VEGI同种型的5′序列*(SEQ ID NO13、14、15)
*表中显示了分离的VEGI同种型独特的5′cDNA序列。用于筛选cDNA文库以分离全长克隆的正向PCR引物以下划线标出。共用的反向PCR引物序列在方法中给出。
实施例5.细胞培养和TNFα处理人类脐静脉内皮细胞(HUVE)和胎牛心脏内皮(FBHE)细胞获自Clonetics(Walkersville，MD)并在EGM-2(Clonetics)中培养。人类皮肤微血管内皮(HMVE)、人类冠状动脉内皮(HCAE)细胞和NIH3T3细胞获自美国典型培养物保藏中心并在EGM2-MV(Clonetics)中培养。成年牛大动脉内皮(ABAE)细胞以及小鼠脑内皮细胞瘤bEND.3由ImClone Inc(纽约)的Dr Peter Bohlen馈赠。人类冠状动脉平滑肌细胞(HCASM)(Clonetics)和ABAE细胞在IMEM(Biofluids，Biosource International，Camarillo，CA)、10％ FBS、1ng/ml成纤维细胞生长因子-2(Promega，Madison，WI)中培养。EA.Hy926，一种人类内皮来源的细胞系，由北卡罗来纳大学的Dr Cora-Jean Edgell馈赠。这些细胞连同小鼠脑bEND.3和心脏H5V内皮细胞瘤细胞系维持在具有10％ FBS的IMEM中。在对100-mm板中生长至次汇合的细胞进行RNA分析之前用不同剂量的肿瘤坏死因子α(TNFα)(Biosource International，Camarillo，CA)处理。
实施例6.核糖核酸酶保护试验对于同种型特异性探针，通过PCR产生来自人类VEGI-174(862-1062bp)、VEGI-251(1-160bp)、VEGI-192a(277-656bp)的cDNA片断，并以反义方向插入在pcDNA3(Invitrogen)的EcoRI和NotI位点之间。将小鼠β-肌动蛋白(824-942)探针克隆到pSP72(Promega)的HindIII和BamHI位点之间。VEGI和β-肌动蛋白模板分别由HindIII和EcoRI线性化。反义试验探针用SP6 RNA聚合酶利用Maxiscript转录试剂盒(Ambion，Woodward TX)合成。对于利用RPAIII试剂盒(Ambion，TX)的核酸酶保护，15-20μg总RNA与1-3×105cpm的各探针于52℃杂交过夜。RNase消化用1∶100稀释度的RNase A/Tl混合物(Ambion)于37℃进行30分钟。沉淀消化产物，于6％聚丙烯酰胺凝胶中解析，并于-70℃进行放射自显影。
实施例7.基因结构分析人类VEGI基因的组织通过PCR利用细菌人工染色体(BAC)克隆(Genome Systems，Inc，St Louis，MO)分析。设计来自外显子序列的PCR引物，产生重叠PCR产物。对这些PCR产物测序以确定它们的相对位置。内含子区段的引物根据9号染色体Contig NT-017568 GenBank条目(其对应于碱基2,643,881和2,694,724之间序列)设计。这些引物列于表9中。利用人类胎盘DNA作为模板，使用来自Perkin Elmer(Foster City，CA)的rTth XL PCR试剂盒以及如下特长PCR条件进行特长PCR95℃，1分钟，97℃，15秒，60.5℃，10分钟，17个循环；97℃，15秒，60.5℃，10分钟15秒延伸，13个循环，接着于72℃最后延伸11分钟。PCR片断用表9中所示的引物对产生。对PCR产物进行测序。
表9.用于对人类VEGI基因绘图的PCR引物*(SEQ ID NO16-33)
*在对人类VEGI基因进行PCR分析中所用的寡核苷酸引物的核苷酸序列。PCR产物2b也用引物61、57、51和53进行了测序。
实施例8.表达质粒和瞬时转染将VEGI-174和VEGI-251的开放读框插入到pcDNA3.1-myc(InvitrogenMD)中以产生携带C-末端myc标签的肽。将所得的质粒转染到ABAE和HUVE细胞中用于细胞定位研究。对于细胞转染，将3×104细胞接种于Lab-Tek带室的盖玻片(chambered coverglass)(Nalge，Naperville，IL)上过夜。将处于25μl无血清IMEM中的质粒DNA(400ng)与PLUS试剂(4μl)(GIBCO-BRL)混合。LipofectAMINE(GIBCO)试剂(1μl)为200倍的，并与该DNA溶液混合15分钟。然后将DNA-lipofectAMINE混合物与200μlIMEM添加到细胞中，并于37℃温育3小时。在免疫印迹和随后的荧光显微镜检之前使细胞在含血清生长培养基中恢复36小时。也将VEGI-174或VEGI-251的全长编码区插入到pEGFP-C2(Clontech)的EcoRl和BamHl位点之间制备GFP-VEGI融合蛋白。将GFP-VEGI融合构建物如上文所述转染到ABAE细胞中。转染后48小时，通过荧光显微镜检查融合蛋白的细胞定位。
实施例9.用于亚细胞定位的免疫染色转染的成年牛大动脉(ABAE)和HUVE细胞用PBS洗涤，并用3.7％多聚甲醛/0.1％ Triton X-100在PBS中固定10分钟，用溶于PBS中的0.5％Triton X-100透化处理5分钟，然后与1∶300稀释度的抗-myc单克隆抗体9-10E(Sigma)温育1小时。细胞用PBS洗涤并与1∶60稀释度的抗-鼠IgG，即德克萨斯红偶联的单克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Labs，IncWest Grove，PA)温育，然后用PBS洗涤三次。细胞通过共聚焦荧光显微镜(Olympus IX70-SIF)观察。
实施例10.单克隆抗体的产生六周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)以50μg/鼠经皮下注射处于0.1ml完全弗氏佐剂(Life Technologies)中的纯化重组VEGI蛋白(残基29-174)。在腹膜内加强注射后，具有较高效价的小鼠接受30μg/鼠的末次腹膜内抗原注射。分离脾细胞并利用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)与小鼠骨髓瘤SP2/O细胞融合。杂交瘤由HAT培养基选择并通过ELISA筛选。克隆阳性杂交瘤，并利用小鼠Ig同种型试剂盒(SIGMA，MO)确定单克隆抗体的同种型。杂交瘤培养在INTEGRA CL 350(INTEGRA Biosciences，Inc.，Iiamsville，MD)中，收集上清，并用AffiGel蛋白质A琼脂糖(Bio-Rad)纯化单克隆抗体。
实施例11.多克隆抗体的产生4-6月龄的SPF新西兰白兔(Charles River)皮下接种与完全弗氏佐剂(Life Technologies)混合的100μg大肠杆菌表达的重组VEGI(如上)。在肌内加强注射后，从表现出实质性免疫应答的兔子中收集血清。血清通过用大肠杆菌(转化有空表达载体)细胞裂解物、然后用人类冠状动脉平滑肌细胞裂解物吸附纯化。
实施例12.哺乳动物细胞和条件培养基中VEGI的分析将全长VEGI-251编码区插入到pcDNA3(Invitrogen)的Hind III和BamHI位点之间。这些pcDNA3质粒，包括载体，通过电穿孔转染到MDA-MB231乳腺癌细胞中。稳定转染子在2mg/ml G418硫酸盐(GIBCO)中选择。条件培养基用Centricon柱(分子量截留10,000)浓缩。细胞裂解物和条件培养基都用蛋白质A/G琼脂糖(Oncogene，Boston，MA)和针对VEGI的多克隆抗体免疫沉淀。样品通过蛋白质印迹分析。检测由1∶1000稀释度的小鼠单克隆抗体1-8F实现，并用偶联有辣根过氧化物酶的抗-鼠IgG抗体(ECL试剂盒，Amersham)观察。
实施例13.慢病毒基因转移含VEGI-174、sVEGI和VEGI-251的慢病毒载体利用以前描述的方法制备(Dull等J Virol 72，8463-8471，1998；Naldini等Proc Natl Acad Sci(USA)93，11382-11388，1996；Naldini等Science 272，263-267，1996；Stewart等Proc Natl Acad Sci(USA)96，12039-12043.1999)。简要地，慢病毒载体用3个质粒转导质粒pHR′CMV-VEGI、包装质粒pCMVAR8.2Δvpr以及包膜质粒pCMV-VSV-G在293T细胞中产生。从转染后两天起每24小时收集病毒上清，由0.45μm过滤器纯化，并由p24测定法滴定(Duu等J Virol72，8463-8471，1998；Naldini等Proc Natl Acad Sci(USA)93，11382-11388，1996；Naldini等Science 272，263-267，1996；Stewart等Proc Natl Acad Sci(USA)96，12039-12043.1999)。1pg p24计数定义为1组织培养物感染剂量(TCID)。对于细胞毒性测定，HUVE细胞以2×104/孔的密度在24孔板中接种，20h后用病毒上清感染。细胞数目预期在接种后20小时加倍。向HUVE细胞中添加增加剂量的病毒载体。感染复数(MOI)以感染时每个细胞的TCID估算。病毒感染后24小时保留在培养物中的贴壁细胞的数目由Coulter计数器测定。
实施例14.体内致瘤性测定将稳定转染的含有空pcDNA3载体、VEGI-174、VEGI-251和sVEGI的MDA-MB-231细胞注射到雌性无胸腺裸鼠的乳房脂垫中(1×106细胞/次注射)。每只动物有2个注射部位，且每组有15只动物接受了VEGI-174、VEGI-251或sVEGI转染子。利用注射有pcDNA3载体转染子的5只动物作为对照组。以不知情方式监测产生的异种移植肿瘤的大小。微血管密度按照描述(Weidner等N Engl J Med 324，1-8，1991)进行测定。简要地，肿瘤内微血管用大鼠抗-小鼠CD31(PECAM-1)单克隆抗体(clone MEC13.3，Pharmingen International，San Diego，CA)免疫染色。抗体以1∶100在PBS中稀释，与5μm石蜡固定的肿瘤切片温育过夜，并用生物素标记的抗-大鼠IgG抗体(Vector Laboratories)通过Vectastain ABC方法(VectorLaboratories)观察。在低倍(×10物镜及×10目镜)下检查每个样品以鉴定肿瘤的大多数血管区(“热点”，参考(Weidner等N Engl J Med 324，1-8，1991))。在这些区域内，以×400放大倍数(×40物镜及×10目镜；0.16mm2/视野)检查最多10个视野，然后计算平均值。排除具有肌肉壁的大血管。无需腔来鉴定血管。任何阳性染色的、清楚地与毗邻的微血管、肿瘤细胞和结缔组织元件分开的内皮细胞或细胞簇，被认为是清晰可计数的微血管。所有测量均以不知情的方式进行。结果由单向方差分析(ANOVA)进行分析。显著性的演绎水平设为P值小于0.05。
实施例15.人类血清中VEGI蛋白的检测作为确定VEGI是否以可溶形式存在的初始筛选，我们用单克隆抗体分析了健康成人的血清库。我们利用针对C-末端的抗体通过ELISA能够检测在1和10ng/ml范围之间的VEGI浓度(图1)。这表明，除了以前表征的据信是膜结合的VEGI之外，可溶形式的VEGI也具有显著的生理学相关性。由于以前的研究显示了重组C-末端肽的细胞凋亡活性，而且全长VEGI-174的过表达对于由转染的癌细胞形成的异种移植肿瘤无效，我们因此推理存在于人类血清中含C-末端的可溶性肽不可能来源于VEGI-174。这个结论促使我们提出VEGI基因可能在人类组织中表达可变形式。
实施例16.多个VEGI转录本的检测和新VEGI同种型的克隆利用最初发现的人类VEGI的全长cDNA作为探针，正常人类组织的RNA印迹一致地显示了以下大小的多个条带7.5kb、2.0kb和1.5kb(图2)。这多个VEGI转录本表现出几分重叠的组织分布，并证明了VEGI家族的存在。为了阐明VEGI相关转录本的结构，我们通过PCR进行了VEGI同种型的分离。用VEGI特异性3′引物，使用5′RACE自许多人类组织扩增5′端VEGI信息。然后将RACE产物克隆到pCR3.1中并测序(图3)。序列分析显示了两个新的VEGI序列，即VEGI-251和VEGI-192a(表8和图3)。根据这些5′序列，设计同种型特异性引物，并从阵列cDNA板中分离全长cDNA克隆。如此从胎脑、成人子宫和肺中分离到3种VEGI同种型(图3A和B)。新cDNA含251及192个氨基酸的开放读框(图3B)，计算的分子量分别为28 086和21 952道尔顿。这两个新的VEGI肽，即VEGI-251和VEGI-192a，与最初VEGI(Zhai等Int J Cancer 82，131-136，1999)，现称之为VEGI-174，共有羧基端的151个氨基酸残基。这些蛋白的亲水特性显示了VEGI-251中靠近其N-末端的20个氨基酸残基的疏水区(图3B)，该疏水区不存在于VEGI-174和VEGI-192a中。这个序列预测包括信号肽。以前在VEGI-174的N-末端鉴定了另一个高度疏水的可能跨膜区(图3B)。
实施例17.VEGI同种型的表达进一步通过RNA分析多组织印迹调查了同种型的个体表达模式。在胎盘、肾、肺和肝中检测到7.5kb VEGI-251转录本，而在肝、肾、骨骼肌和心脏中观察到2kb VEGI-174转录本(图4)。当这些同样的探针用于多组织RNA印迹时，除了观察到VEGI251和174之间在前列腺、唾液腺和胎盘中的重叠表达外，VEGI-251与VEGI-174相比在胎肾和胎肺中更丰富，而VEGI-174在心脏、骨骼肌、胰腺、肾上腺和肝中更丰富(表10)。此表达模式的重要性目前对我们来说还不太清楚。VEGI-192amRNA由于它低的丰度，不能够容易地由RNA印迹检测到。
也通过RNase保护测定调查了VEGI在体外的表达。与以前有关VEGI-174的观察结果一致，VEGI-251和VEGI-192a在与VEGI-174相同的细胞类型中检测到，存在于人类内皮细胞中，包括冠状动脉内皮(HCAE)、人类脐静脉内皮(HUVE)和人类微血管内皮(HMVE)细胞中，而且不能在人类冠状动脉平滑肌(HCASM)、ABAE和小鼠内皮瘤bEND.3中检测到(图5)。还应当注意一种以上同种型在同一个细胞类型中表达，而VEGI-251是最丰富的。这表明这些同种型的表达在VEGI的功能中起着调控作用。
表10.人类组织中VEGI-174和VEGI-251RNA的表达*
*利用多组织人类polyA+RNA印迹比较VEGI-174和VEGI-251RNA的表达。-不可检测；±不显著高于背景；+很低；++++丰富。VEGI-192a的表达不可检测。
实施例18.人类VEGI基因组织为了确定这三个VEGI转录本的结构关系，分析了人类VEGI基因的组织。这是利用BAC克隆和利用分离自人类胎盘样品的基因组DNA完成的。发现人类VEGI基因全距超过17kb，具有4个外显子和3个内含子(图6)。内含子-外显子衔接处符合了GT-AG法则。根据片断2的大小，内含子1估计为13-15kb，但序列信息不能由该PCR产物获得。所有三个同种型共有由外显子IVb(图6)编码的438bp区段，此区段编码VEGI-174(表12)的29-174残基，但是它们的5′区段是由选择性的外显子利用产生的。有趣的是，VEGI-251和VEGI-192a使用外显子剪接受体位点产生它们各自的产物(表11)。利用基因组探针和HUVE RNA的核糖核酸酶保护和5′RACE研究显示推断的VEGI-251转录起始位点位于其ATG上游约100bp处(未发表，Chew LJ)，但是VEGI-174和VEGI-192a的转录起始位点尚有待绘图。由于VEGI-192aRNA极低的丰度，后来的研究集中于VEGI-251。虽然目前尚不清楚是否所有的同种型由相同的启动子启动，但我们仍然推论产生多转录本的意义可能在于对合成的差异调控，而这又可能指向一种特定VEGI同种型的相对重要性。
表11.人类VEGI基因组织(SEQ ID NO34-41)
人类VEGI基因的组织，显示每个外显子的大小和内含子的大概大小。外显子编号在图6中给出。大写字母表示外显子序列，而小写表示内含子序列。共有剪接点以下划线标出。*VEGI-192a和VEGI-174mRNA最5′端尚未鉴定，因而这些区段的内含子-外显子衔接点未知。
表12.VEGI多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO42)PTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL(SEQ ID NO42)实施例19.VEGI同种型转录本由TNFα并行诱导为测试VEGI同种型转录中差异调控的可能性，利用抗-血管生成典范——TNFα处理分析VEGI基因的调控。尽管许多研究描述了促炎细胞因子象TNFα对内皮细胞的抗-增殖作用，但这些细胞因子也可以有血管生成作用，这取决于所用的剂量和系统(参见讨论)。对内皮细胞的此种调节作用可能起着调控内皮细胞特异性细胞因子如VEGI的水平的作用。我们发现15ng/ml或更高浓度的TNFα在大血管(脐静脉)和小血管(皮肤微血管)内皮细胞中都能够诱导VEGI RNA水平的增加(图7)，而且所有的同种型在这些内皮细胞类型中都被诱导。也清楚VEGI-251仍然是同种型中最丰富的。TNFα对VEGI转录本的并行上调不仅表明VEGI介导的活性是TNFα作用的潜在的靶，而且表明通过合成多种肽对VEGI功能进行调节最可能存在于转录后水平上。
实施例20.亚细胞定位由于TNF样肽常以膜结合及可溶两种形式存在，故研究了利用重组VEGI转染的ABAC细胞的可能性。
利用在VEGI编码区C-末端携带myc标签的构建物进行定位实验(图8)。将pcDNA3.1-myc中的VEGI同种型表达构建物转染到ABAE细胞中，并利用抗-myc抗体通过免疫细胞化学分析VEGI-myc产物的分布。检测到VEGI-174在细胞中呈内质网/高尔基体样分布(图8A)。然而，VEGI-251表现出更为限制的核周颗粒染色(图8B)。在两种情况下，共聚焦荧光显微镜检显示细胞表面定位不明显。在HUVE细胞中，发现含VEGI-251-myc的囊泡不是内皮细胞的怀布尔-帕拉德体(Weibel-Palade bodies)，因为myc信号不与冯·威利布兰德因子(vWF)染色共分布(图8C)。因此有可能，与vWF相反，VEGI-251在内皮细胞中的加工不包括被调控的分泌途径。
为确定是否同种型可能表现出N-末端指导的亚细胞定位差异，用全长VEGI和它们相应的独特N-末端序列构建了嵌合GFP-VEGI表达构建物。将这些在其N-末端具有GFP标签的构建物(图8)瞬时转染到ABAE细胞中。如图8E到8J所示，除了8G例外，GFP-VEGI的分布不同于未靶向的GFP。全长VEGI-174表现出ER/高尔基分布，就如之前看到的myc-标记的VEGI-174一样，然而VEGI-174的头22个残基似乎不足以将GFP靶向到特异的胞内细胞器(图8G)。相反，VEGI-251的头99个氨基酸足以导致GFP定位在与质膜毗邻的囊泡中。这种分布作为勾出细胞边界轮廓的荧光带观察到(图8H到J)。我们的观察表明VEGI-251可能分布在经历组成型胞吐作用的分泌囊泡中。
与GFP-VEGI-251不同，VEGI-251-myc质膜定位的缺乏(图8B)强烈提示C-末端myc标签自细胞中丢失，这很可能是由于分泌信号的切割和可溶性C-末端片断的分泌。已知置于N-末端下游的真正的信号序列(例如在GFP-VEGI-251和GFP-VEGI-1-99中的)在处于ER中的合成期间不切割。具有C-末端和N-末端标签的VEGI-251的这种分布模式的差异与涉及在释放到胞外环境之前在N-末端序列之内切割VEGI-251的分泌机制相符。
实施例21.细胞条件培养基中VEGI的证明考虑到VEGI-251N-末端的疏水残基及观察到的其亚细胞定位，似乎VEGI-251可能是分泌蛋白。为测试这种假说，建立了在MDA-MB-231乳腺癌细胞中的VEGI-251稳定转染子。作为阴性对照，也制备了pcDNA3载体的转染子。通过RNase保护测定证实构建物在MDA-MB-231中表达。应当注意，这些细胞在体外的存活和增殖不受载体和VEGI转染的影响。收集MB-231转染子的条件培养基，浓缩并利用多克隆VEGI抗体进行免疫沉淀，且利用抗-VEGI单克隆抗体3-12D进行蛋白质分析。我们的结果揭示了分子量约25kD的蛋白(图9A)。出现的成对物不易解释，但可能是转染的MB231细胞中重组肽的可变糖基化或其它翻译后修饰的结果。在未转染细胞或携带空pcDNA3载体的细胞的培养基中没有检测到VEGI蛋白(图9A)。在类似的实验条件下不能在条件培养基中检测到VEGI-174(未显示)。在不同的实验中，浓缩的HUVE细胞条件培养基的蛋白质分析也揭示了与VEGI-251转染子中获得的相似分子量的条带，而由多克隆抗体免疫沉淀HUVE细胞条件培养基亦得到相同结果(图9B)。这些结果表明VEGI-251不是膜结合的而是分泌蛋白。
实施例22.内皮细胞中VEGI-251的过表达导致细胞死亡为了测试VEGI-251对内皮细胞的生物学活性，选择慢病毒基因递送系统用VEGI表达构建物转染HUVE细胞。首先用GFP构建物测试慢病毒基因递送系统，并证实超过90％的HUVE细胞能够被转导(未显示)。我们利用VEGI-174、VEGI-251以及具有IL-6信号肽的分泌形式的VEGI(即sVEGI)的观察结果证明只有分泌形式的VEGI，包括VEGI-251和sVEGI，对HUVEC有细胞毒性(图10A)，而VEGI-174无效。这些结果表明HUVE细胞携带能够通过自分泌机制激活的VEGI膜受体。
实施例23.VEGI-251的抗肿瘤活性先前已经证明携带IL-6分泌信号肽的重组形式的VEGI-174，即sVEGI，可有效地在体内抑制MC38结肠癌肿瘤的生长(Zhai等Int JCancer 82，131-136，1999)。由于天然VEGI-251是分泌蛋白，我们测定它是否也能够在体内抑制人类异种移植肿瘤的生长。针对每个构建物，选择了稳定转染的MDA-MB-231克隆的15个细胞系，连同载体转染的对照的5个细胞系。合并每组的细胞，并注射到雌性无胸腺裸鼠的乳房脂垫中。肿瘤尺寸作为注射后时间的函数测定。比较了类似合并的VEGI-174和sVEGI转染克隆的细胞培养物。合并的载体转染的克隆用作对照。也测定了未转染的亲代细胞并且发现其与载体转染的克隆一致。
我们的结果证明癌细胞中全长VEGI-174的过表达对异种移植肿瘤的生长少有影响(图10B)。然而，完整VEGI-251以及sVEGI融合蛋白的过表达显著延缓肿瘤的生长。这些结果与慢病毒体外转染的效果完全相符(图10A)，证明了天然VEGI-251的生物学活性。
然后我们测定了癌细胞过表达全长VEGI-251对肿瘤新血管形成的影响。发现肿瘤相关微血管密度随着VEGI-251的表达显著下降。下降程度比得上sVEGI过表达的肿瘤中的下降。由于sVEGI融合蛋白由IL6分泌信号肽与VEGI-174的残基23-174组成，该结果表明残基23-174含天然VEGI-251的生物学等同物。综合考虑，这些发现证明VEGI-251分泌到胞外基质对于它的抗肿瘤活性是必需的。另外，与sVEGI类似，VEGI-251的这种抗肿瘤活性不是由于对肿瘤细胞的直接作用，而是由于对肿瘤相关血管结构形成的干扰而致。
实施例24.潜在的VEGI同种型的鉴定已观察到当用VEGI cDNA探针分析人类组织RNA印迹膜时，不同组织中出现多个数目的mRNA条带(图11)。由于这些实验中所用的实验条件不利于探针的非特异性结合，而且根据mRNA分子的近似大小判断，至少存在分别与7.5kb、2.0kb和1.5kb相对应的3种同种型。这些同种型在多种组织中的差异分布表明它们起着不同的生理学作用。
实施例25.新VEGI同种型的确认应用cDNA末端快速扩增(RACE)(商业上可得自OriGene Technology，Rockville，MD)，利用代表多种人类组织的cDNA文库板寻找VEGI同种型。该板含从24个人类个体组织中制备的cDNA样品，各cDNA分子的5′端连有衔接物。利用与部分VEGI cDNA对应的基因特异性寡核苷酸引物(GSP)和衔接物引物(ADP)进行聚合酶链式反应(PCR)(图12)。利用两对寡核苷酸引物进行两轮巢式PCR。在利用衔接物引物(ADP1，5′-CGGAATTCGT CACTCAGCG-3′)(SEQ ID NO8)和VEGI基因特异性引物(GSP1，5′-CCCGGATCCT ATAGTAAGAA GGCTCC-3′)(SEQ IDNO9)的第一轮PCR(94℃ 3分，4个循环的94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃2分；16个循环的94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 2分；然后72℃ 6分)之后，反应产物在水中以1∶10稀释。稀释的PCR样品和另一个衔接物引物(ADP2，5′-AGCGCGTGAA TCAGATCG3′)(SEQ ID NO10)以及VEGI基因特异性引物(GSP2，5′-CGGTGGATCC CGAGTTTGTC TCACAACTG 3′)(SEQ ID NO11)用于第二轮PCR(94℃ 3分，35个循环的94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 2分；然后72℃ 6分)。PCR产物在琼脂糖凝胶中分级分离。从凝胶中切下阳性DNA片断，纯化用以测序分析。从不同组织中获得了不同长度的4个PCR产物(图13)。这些PCR产物进行了DNA测序，证实这些PCR产物的核苷酸序列彼此不同。根据由这些cDNA分子编码的蛋白中的氨基酸数目，这些同种型现命名为VEGI-174、VEGI-192a、VEGI-192b和VEGI-251。
实施例26.同种型全长cDNA的克隆利用根据由上文所述的RACE实验中获得的PCR产物的测序结果设计的基因特异性引物重复第二轮PCR以证实它们序列的特异性。然后将纯化的RACE产物克隆到Invitrogene的质粒pCR3.1(San Diego，CA)以制备高质量的DNA样品用于测序。根据VEGI192a和VEGI192b5′-序列中存在的读框相符的终止密码子和起始密码子，VEGI192a的全长cDNA分子由两对巢式PCR引物构建Vg3A5′-AATCTCACCT GTCTCTGCCT G-3′(SEQID NO43)和Vg-3′-15′-CTAAACCGTT GTCCCTGTGG-3′(SEQ IDNO44)；Vg3B5′-CCTGTAAAAA TGGTTATAGT AG-3′(SEQ ID NO45)和Vg-3′-25′-GGTGGCAGAG GACTTTC-3′(SEQ ID NO46)。VEGI192b的全长cDNA分子由引物vg4b 5′-CTCTACTTACGCCAAGG-3′(SEQ ID NO47)和引物JY2 5′-CCCGGATCCTATAGTAAGAA GGCTCC-3′(SEQ ID NO48)构建。鉴定到同种型的cDNA文库被用于PCR。VEGI192a和VEGI192b都被克隆到Invitrogen的pCR3.1(San Diego，CA)中。由于在VEGI251的5′序列中未能发现读框相符的翻译起始密码子，利用一对基因特异性引物vg5B5′-CACCACATACCTGCTTG-3′(SEQ ID NO49)和vgl615′-GTGTAATCCACCAAAGAG-3′(SEQ ID NO12)从OriGene的阵列cDNA文库板(Rockville，MD)中分离全长VEGI251cDNA克隆。VEGI192a的cDNA序列示于表13中。
表13.VEGI-192a的cDNA序列(SEQ ID NO50)TTTTTTNTTTTNCTCAACNCCCCCCNATATTTATAACTGNATTTGGACCCNTGCNTAACCCAACATATATNTTTGAGANCCAAAGGGAANTTTTAGGTTTTCTCAAGAANTAATAGACAAACAGAGGCCCNGAGAGGGAAAGGGATTCNCCCAAAGTCATATAGCTAAAGANTAGTTCCCACCCACTCTTCATCCCATTTCTTNTGGCCATCTATTCAGTGAATATAGTTAAAGGGCCCTTGGANGANGGCAAAAAGCCAATTCACTCCTGTGAAAGAATTTTGTGGGAAAGAGCAGTGAGTTGTGCTTTATTGAGCATTGGCCATGTGCAAAATTCATGNTAAGCACCNCCATNTATACTGTGCCCATCTTAGATGAGATGAGAAAACAGGGTCTCAGGCAGGNTAGATAAACTTGCCCAAAGCCATGGGGCCAAGATTCATTTGTGTTCAAGACTCTTTCTTGTGAGTCACCCTGTCCTTGGTGGTGCTTGCTGCGGGTGCCACATTCCAATCCAAAATCCTGCAAGGAGTGGCACTGGACCAAGCTGGAGGAGATCAAGGTTTCTCTCCTATCATAGGCGCCATGCAACTCACAAAGGGCCGTCTTCATTTCAGTCACCCTTTGTCTCATACAAAGCACATTTCTCCTTTTGTTACAGATGCACATCTTAGGGCAGACGGAGATAAGCCAAGGGCACACTTGACAGTTGTGAGACAAACTCCCACACAGCACTTTAAAAATCAGTTCCCAGTTCTGCACTGGGAACATGAACTAGGCCTGGCCTTCACCAAGAACCGAATGAACTATACCAACAAATTCCTGCTGATCCCAGAGTCGGGAGACTACTTCATTTACTCCCGGGTCACATTCCGTGGGATGACCTCTGAGTGCAGTGAAATCAGACAAGCAGGCCGACCAAACAAGCCAGACTCCATCACTGTGGTCATCACCAAGGTAACAGACAGCTACCCTGAGCCAACCCAGCTCCTCATGGGGACCAAGTCTGTGTGCGAAGTAGGTAGCAACTGGTTCCAGCCCATCTACCTCGGAGCCATGTTCTCCTTGCAAGAAGGGGACAAGCTAATGGTGAACGTCAGTGACATCTCTTTGGTGGATTACACAAAAGAAGATAAAACCTTCTTTGGAGCCTTCTTACTATAGGAGGAGAGCAAATATCATTATATGAAAGTCCTCTGCCACCAGCC实施例27.VEGI251的抗血管生成和抗癌活性由截短形式的VEGI174制备的、由氨基酸29-174组成的重组蛋白是有力的肿瘤发生抑制剂(Zhai Y等FASEB J.，13181-189，1999；Zhai，Y等，Int.J.Cancer，82131-136，1999)。已经证明VEGI对于癌细胞的生长没有直接影响，而且VEGI抑制肿瘤生长的作用机制是抑制肿瘤中血管的形成。因此将VEGI251的全长cDNA转染到人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，然后植入雌性无胸腺裸鼠的乳房脂垫中，以证明该基因产物能够抑制这些细胞的肿瘤生长。为了抑制紧靠癌细胞周围的内皮细胞的生长，VEGI基因产物必需释放到转染细胞的外部。已证明a)在培养的转染细胞的条件培养基中能够发现基因产物，和b)转染细胞能够在裸鼠中生长肿瘤。
MDA-MB-231乳腺癌细胞用空载体、全长VEGI-174cDNA、全长VEGI-251cDNA或者用其中VEGI蛋白连接了来自白介素-6的分泌信号肽的融和基因(IL6/VEGI)转染。当利用VEGI的单克隆抗体(13-2D)通过蛋白质印迹分析时，在转染细胞的条件培养基中发现VEGI-251的基因产物(图14)。相反，VEGI-174的基因产物在条件培养基中不可检测。
将稳定转染的MDA-MB-231克隆注射到无胸腺雌性裸鼠的乳房脂垫中(1×106细胞/注射)。肿瘤大小作为时间的函数测定。也分析了肿瘤中的微血管密度。癌细胞中全长VEGI-174的过表达对异种移植肿瘤的生长少有影响，而过表达分泌形式的推断的VEGI胞外域和全长VEGI-251显著抑制肿瘤生长(图15)。此外，利用VEGI单克隆抗体通过对肿瘤切片进行免疫组织化学分析证明了VEGI蛋白存在于肿瘤中。与由载体转染的细胞形成的肿瘤(G10-2R)相比，有些肿瘤(G9-1R)具有的癌细胞产生显著量的VEGI-251，而其它肿瘤具有的癌细胞产生很少VEGI-251(G9-2R)(图16)。肿瘤产生的VEGI-251越多，肿瘤的生长速率越慢(图17)。这些发现表明VEGI-251由转染的癌细胞分泌，并且分泌的VEGI-251通过抑制周围内皮细胞的生长而是有力的肿瘤生长的抑制剂。 相反，VEGI-174不被细胞分泌，因此不能抑制内皮细胞的生长。
实施例28.VEGI表达的组织分布与其它TNF家族成员不同，VEGI-174特异性地在内皮细胞中表达。来自23个细胞系和原代细胞培养物的总RNA制备物的RNA印迹分析表明VEGI仅在HUVE和人类静脉内皮细胞中检测到(图18)。在人类动脉内皮细胞中也未见到VEGI-174。利用多组织RNA印迹，在许多成人组织，包括胎盘、肺、骨骼肌、肾、胰腺、脾、前列腺、小肠和结肠中发现VEGI-174转录本(图18)，表明基因产物可能在正常血管结构的功能中发挥作用。
实施例29.VEGI对内皮细胞生长的特异性抑制产生截短形式的VEGI-174，其相应于由残基39-174组成的推断的胞外域。此蛋白在大肠杆菌中表达，纯化至如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所判断的明显的均质性，并在多种细胞测定中进行检测。所述截短的蛋白能够特异性地抑制成年牛大动脉内皮(ABAE)细胞的增殖(图19)。在10μg/ml时实现内皮细胞生长几乎完全的抑制，半数最大抑制浓度值(IC50)约为1μg/ml(约70nM)。相反，在相似的实验条件下该蛋白对人类乳腺癌细胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)的生长没有影响(图19)。VEGI也不抑制人类T细胞白血病细胞(Jurkat)、人类伯基特氏淋巴瘤细胞(Raji)、人类单核细胞白血病细胞(THP-1)、或人类早幼粒细胞白血病细胞(HL60)、通常响应TNF的细胞毒活性的细胞的增殖。VEGI的能力似乎低于可能预期到的细胞因子的能力；然而，它比得上已知的血管生成蛋白抑制剂例如制管张素和内抑素(endostatin)，以及CD40配体(另一个TNF家族成员)。观察到的截短VEGI相对低的能力也可能部分是由于非优化的截短位点或者翻译后修饰如糖基化的缺乏，因为该重组蛋白是在大肠杆菌中表达的。
实施例30.VEGI基因在汇合的内皮细胞中的上调VEGI的内皮细胞特异性抑制活性显示该蛋白作为血管生成的负调节剂发挥作用。为证明VEGI基因在增殖的内皮细胞中下调、而当细胞静止时上调，通过RNA印迹检查了VEGI在培养的HUVE细胞中的表达(图20)。低水平的VEGI mRNA见于新近接种的HUVE细胞；不过，随着培养中细胞数目的增加，VEGI mENA水平相应增加，并且在细胞培养物汇合时达到一个平台。
实施例31.对培养于胶原凝胶上的内皮细胞的毛细管样管形成的抑制用体外血管生成模型(Montesano，R.和Oorci，L.，Cell 42469，1985))检查了截短VEGI的抗血管生成活性。培养在三维胶原凝胶表面的内皮细胞在培养物达到汇合时形成静止单层。不过，在用血管生成因子例如FGF-2刺激所述单层细胞时，细胞侵入凝胶并在凝胶中形成毛细管样管状结构。这种管形成可被抗血管生成因子抑制。管形成的程度可利用计算机辅助的成像分析定量评价(Li，L.Y.，Biochemistry 3310999，1994)。截短的VEGI-174能够抑制ABAE细胞形成毛细管样管(图21)。所述抑制的IC50值约为1μg/ml，类似于所观察到的抑制内皮细胞生长的IC50。
实施例32.对置于鸡胚尿囊绒膜上的胶原凝胶中毛细管生长的抑制利用改进的鸡胚尿囊绒膜(CAM)测定法进一步证明了VEGI-174的抗血管生成活性(Nguyen，M.等，Microvasc.Res.4731，1994)。该方法以新毛细血管生长进入置于CAM上的胶原凝胶球为基础。在血管生成因子的存在下(例如包埋在凝胶中的FGF-2或VEGF)，血管被刺激垂直生长进入聚合的胶原凝胶中。将抑制剂掺入到凝胶中以便确定它对毛细管生长的影响。凝胶中血管生成的程度利用注射到CAM循环中的FITC-葡聚糖评价。重组VEGI-174(5.0μg/ml)抑制约50％由FGF-2(2.0μg/ml)诱导的新生毛细管生长进入胶原凝胶(图22)。
实施例33.共注射过表达VEGI的CHO细胞对乳腺癌异种移植肿瘤生长的抑制VEGI的抗癌活性由异种移植肿瘤模型，利用在植入雌性无胸腺裸鼠的乳房脂垫中高度致癌的乳腺癌细胞证明。分泌形式的VEGI-174通过用来自人类白介素-6的分泌信号肽取代VEGI-174的N-末端和推断的跨膜区段(残基1-25)构建。分泌的VEGI-174构建物被克隆到真核表达载体中，然后将它转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。相应构建物的表达通过RNA印迹分析证实。转染细胞对修饰VEGI的分泌由条件培养基抑制ABAC细胞生长的能力证实。然后将转染的CHO细胞与人类乳腺癌细胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)混合，并将细胞混合物注射到裸鼠的乳房脂垫中。注射后监测异种移植肿瘤的生长。虽然所用乳腺癌细胞系存在高致癌性，仍观察到对由MDA-MB-231(图23A)或MDA-MB-435细胞(图23B)形成的异种移植肿瘤生长的显著抑制。在利用MDA-MB-435细胞的重复实验中，共注射也导致肿瘤形成的完全抑制。载体转染的CHO细胞在任一种情况下对肿瘤生长均无效。由于VEGI不抑制培养物中这些乳腺癌细胞的生长，该蛋白的抗癌活性是由其抗血管生成活性所致。
实施例34.VEGI-192a对ABAE细胞增殖的抑制全长VEGI-192a在大肠杆菌中表达，且利用美国专利申请20010044521和PCT WO01/55174中描述的方法重折叠和纯化。具体地，构建含有编码全长VEGI-192a多肽的多核苷酸插入物的表达载体(PET11，Novagen)。将该表达载体转化到大肠杆菌中，并培养转化的大肠杆菌以表达VEGI-192a多肽。收获细胞并从破碎细胞中纯化包涵体。用8M尿素溶液将含包涵体的溶液的OD280调整到pH5.0。终溶液含如下还原试剂10mMβ-巯基乙醇，10mM DTT(二硫苏糖醇)，1mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)。溶液的终pH为10.0。将上述溶液迅速稀释到20倍体积的20mM TRISTM碱中，pH调整至9.0，然后用1M HC1缓慢调整至8.0(通过24小时调整pH至8.8。然后24小时调整至8.6等，直至pH为8.0)。或者，蛋白可以利用透析重折叠。将8M尿素溶液的OD280调整至0.5，并在20倍体积的TRISTM碱中透析。再次将该溶液的pH缓慢调整至8.0。然后通过超滤浓缩重折叠的物质，并通过凝胶过滤分离，例如在由20mMTRISTM，HC1，0.4M尿素，pH8.0平衡的SEPHACRYLTMS-300柱子上。S-300级分可通过在非还原性SDS-PAGE上电泳检测。错误重折叠的蛋白以非常高的分子量跑胶，而正确重折叠的蛋白以正常分子量跑胶。
测试来自S-300级分中的VEGI-192a蛋白抑制内皮细胞生长的能力。将成年牛大动脉内皮(ABAE)细胞以8,000细胞/孔一式三份种在24孔板的IMEM(GIBCO，Gaithersburg，MD)，10％胎牛血清中。向培养基中添加FGF-2(1ng/ml)。培养于37℃、5％ CO2中维持6天。然后用胰蛋白酶作用细胞，并利用Coulter(Hialeah，FL)计数器测定细胞数目。
如图24所示，来自S-300级分的正确折叠的VEGI-192a而非误折叠的VEGI-192a能够抑制ABAE细胞的生长。在1000ng/ml时达到内皮细胞生长的几乎半数完全抑制，半数最大抑制浓度值(IC50)约为10ng/ml。
权利要求
1.分离的多核苷酸，其包含(a)SEQ ID NO1的序列；(b)SEQ ID NO1中至少约15个连续的核苷酸，其中所述连续的核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸1-93之内；(c)SEQ ID NO1中至少15个连续的核苷酸，其中所述连续的核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸93和94；(d)编码SEQ ID NO4的多肽的核苷酸序列；(e)编码SEQ ID NO4中至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，其中所述连续氨基酸位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26之内；(f)编码SEQ ID NO4中至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，其中所述连续氨基酸包括SEQ ID NO4的氨基酸26和27；或者(g)上述的互补物。
2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO1的序列。
3.权利要求1的多核苷酸，其中所述(b)或(c)的多核苷酸包含至少约20个连续的核苷酸。
4.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含可检测标记。
5.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸被固定在表面上。
6.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗-血管生成生物活性的多肽。
7.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO4的多肽的融合蛋白。
8.载体，包含根据权利要求1的多核苷酸。
9.权利要求8的载体，其中载体为表达载体。
10.宿主细胞，其包含根据权利要求8的载体。
11.药物组合物，其包含根据权利要求6的多核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
12.分离的多核苷酸，其包含(a)SEQ ID NO2的序列；(b)SEQ IDNO2中至少约15个连续的核苷酸，其中所述连续的核苷酸位于SEQ IDNO2的核苷酸1-386之内；(c)SEQ ID NO2中至少15个连续的核苷酸，其中所述连续的核苷酸包含SEQ ID NO2的核苷酸386和387；(d)编码SEQID NO5的多肽的核苷酸序列；(e)编码SEQ ID NO5中至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，其中所述连续氨基酸位于SEQ ID NO5的氨基酸1-26之内；(f)编码SEQ ID NO5中至少10个连续氨基酸的核苷酸序列，其中所述连续氨基酸包含SEQ ID NO5的氨基酸26和27；或者(g)上述的互补物。
13.权利要求12的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO2的序列。
14.权利要求12的多核苷酸，其中所述(b)或(c)的多核苷酸包含至少约20个连续的核苷酸。
15.权利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含可检测标记。
16.权利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸被固定在表面上。
17.权利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有抗-血管生成生物活性的多肽。
18.权利要求12的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO5的多肽的融合蛋白。
19.载体，其包含根据权利要求12的多核苷酸。
20.权利要求19的载体，其中载体为表达载体。
21.宿主细胞，其包含根据权利要求19的载体。
22.药物组合物，其包含根据权利要求17的多核苷酸和药学上可接受的赋形剂。
23.分离的多肽，其包含(a)SEQ ID NO4的序列；(b)SEQ ID NO4中至少10个连续的氨基酸，其中所述连续的氨基酸位于SEQ ID NO4的氨基酸1-26之内；或者(c)SEQ ID NO4中至少10个连续的氨基酸，其中所述连续的氨基酸包含SEQ ID NO4的氨基酸26和27。
24.权利要求23的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO4的序列。
25.权利要求23的多肽，其中多肽抑制血管内皮细胞生长。
26.权利要求23的多肽，其中多肽具有血管生成抑制活性。
27.融合蛋白，其包含根据权利要求23的多肽。
28.权利要求27的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO4的多肽。
29.药物组合物，其包含权利要求26的多肽和药学上可接受的赋形剂。
30.分离的多肽，其包含(a)SEQ ID NO5的序列；(b)SEQ ID NO5中至少10个连续的氨基酸，其中所述连续的氨基酸位于SEQ ID NO5的氨基酸1-26之内；或者(c)SEQ ID NO5中至少10个连续的氨基酸，其中所述连续的氨基酸包含SEQ ID NO5的氨基酸26和27。
31.权利要求30的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO5的序列。
32.权利要求30的多肽，其中多肽抑制血管内皮细胞生长。
33.权利要求30的多肽，其中多肽具有血管生成抑制活性。
34.融合蛋白，其包含根据权利要求30的多肽。
35.权利要求34的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO5的多肽。
36.药物组合物，其包含权利要求33的多肽和药学上可接受的赋形剂。
37.抗体，其选择性地与根据权利要求23的多肽结合。
38.权利要求37的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO4。
39.抗体，其选择性地与根据权利要求30的多肽结合。
40.权利要求39的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO5。
41.抗体，其选择性地与SEQ ID NO4的多肽和SEQ ID NO5的多肽结合。
42.抑制组织或细胞中血管生成的方法，包括使有效量的由SEQ IDNO3的多核苷酸编码的多肽与该组织或细胞进行接触，或者在该组织或细胞附近表达。
43.抑制血管生成的治疗方法，包括向个体给药剂量足以抑制血管生成的包含编码SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸的组合物。
44.根据权利要求43的治疗方法，其中多核苷酸可操作地连接控制基因表达的调控序列。
45.抑制肿瘤生长的治疗方法，包括向个体给药剂量足以抑制肿瘤生长的、在药学上可接受的载体中包含编码SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸的组合物。
46.根据权利要求45的治疗方法，其中多核苷酸可操作地连接控制基因表达的调控序列。
47.抑制血管生成的治疗方法，包括向个体给药剂量足以抑制血管生成的权利要求29的组合物。
48.根据权利要求47的治疗方法，其中组合物包含SEQ ID NO4的多肽。
49.抑制肿瘤生长的治疗方法，包括向个体给药剂量足以抑制肿瘤生长的权利要求29的组合物。
50.根据权利要求49的治疗方法，其中组合物包含SEQ ID NO4的多肽。
51.测试药剂或药物的血管生成抑制活性的方法，所述方法包括测量所述药剂或药物提高权利要求23的多肽的抗-血管生成活性的能力。
52.测试药剂或药物是否促进血管生成的方法，所述方法包括测量所述药剂或药物降低或消除权利要求23的多肽的抗-血管生成活性的能力。
53.检测VEGI-192a的方法，包括使来自个体的样品与选择性结合权利要求23的多肽的抗体接触；并检测样品中的多肽与该抗体之间形成的复合物的存在或不存在。
54.检测VEGI-192a多核苷酸的方法，包括使来自个体的样品与选择性结合权利要求1的多核苷酸的寡核苷酸接触；并检测该寡核苷酸与样品中的多核苷酸之间形成的双链体的存在或不存在。
55.检测VEGI-192b的方法，包括使来自个体的样品与选择性结合权利要求30的多肽的抗体接触；并检测样品中的多肽与该抗体之间形成的复合物的存在或不存在。
56.检测VEGI-192b多核苷酸的方法，包括使来自个体的样品与选择性结合权利要求12的多核苷酸的寡核苷酸接触；并检测该寡核苷酸与样品中的多核苷酸之间形成的双链体的存在或不存在。
全文摘要
本申请公开了命名为VEGI
文档编号A61K39/395GK1668630SQ02826970
公开日2005年9月14日 申请日期2002年11月12日 优先权日2001年11月9日
发明者李鲁远, 潘宏光 申请人:乔治敦大学