培养和包被的胰腺干细胞的制作方法

专利名称：培养和包被的胰腺干细胞的制作方法
相关申请的交叉参照本申请要求2001年12月21日提交的临时申请第60/342,250号的优先权，其内容在此全文引为参考。
关于由联邦政府资助的研究和进展所作的有关发明权利的声明不适用对“序列表”、表格或以光盘提交的计算机程序列表附件的参照不适用发明领域本发明涉及到发现存在的中间的、分化阶段的胰腺干细胞，该干细胞能在可形成稳定细胞培养物的环境下原位包被并成熟，该培养物可产生葡萄糖反应性的胰岛素。这些细胞的价值在于它们在培养过程中既能扩增而且稳定，并能向后期阶段发展。本发明避免了在体外将这些中间分化阶段的细胞培养成末期阶段的胰腺细胞的步骤。
背景技术：
哺乳动物的胰腺是由胚胎的前肠芽发展而来的，在胚胎的前肠芽生长过程中，通过形态分化形成导管系统。在腹部与背原基融合后，新的组织生长并成熟形成两连锁结构外分泌系统和内分泌系统。胰腺主要是由产生消化酶的腺泡细胞组成。内分泌系统包括产生胰岛素的β-细胞，产生胰高血糖素的α-细胞，产生生长激素抑制素的δ-细胞。这些内分泌细胞聚集在一起形成所谓的胰岛。
动物研究表明，β-细胞的形成至少有两种机制由导管前体细胞再生和由成熟β-细胞复制，分化的β-细胞形成后就一直复制而形成成熟体。对胰岛素的需求增加会加速β-细胞的复制，例如，由于高葡萄糖输入、部分胰切除及怀孕期间导致的胰岛素需求增加。在这些情况下，β-细胞群通过细胞膨大(增大单个细胞的体积)和细胞增生(增加β-细胞的数量)而迅速增加。
在I型或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)中，由于针对β-细胞的自体免疫攻击，β-细胞的数量明显减少。Eisenbarth，N.Eng.J.Med.3141360-1386(1986)。I型糖尿病的治疗包括增加患I型糖尿病患者中β-细胞的数量。Bonner-Weir，Endocrin.1411926-1929(2000)。
用胰岛细胞对糖尿病进行治疗的另一方法包括将免疫匹配的供者胰腺组织移植到移植受者中。一般地，需要对移植受者进行免疫抑制治疗以防止移植器官的排斥。近来，成熟的免疫抑制方案已经改善了人临床胰岛移植的效果。然而，该技术只是试验性的，如果胰岛细胞移植能实现与整个胰腺器官移植一样的功能，那么这种更加简单的治疗方法将会在糖尿病治疗中发挥重要作用。
虽然人胰岛的移植有望成为治疗糖尿病的有效方法，但是目前还存在许多困难而限制了该方法的应用。其主要困难是不能产生足够量的用来使用的胰岛细胞。目前，获得用于移植胰岛的方法一般包括分离胰腺组织，酶消化胰腺组织以从周围组织中释放出单个细胞，及使用梯度离心纯化技术。梯度离心纯化技术是本领域已知的并被多个胰岛移植中心采用的方法。不幸地是用该标准方法处理单个胰腺的胰岛产量通常不够用于移植。因此，人们已经寻求并设计出这种方法的替换方法。
一种选择性地使中间阶段的胰腺干细胞增殖的方法已经形成。简言之，从供者的胰腺中分离细胞后，将细胞在高血清培养液中复性，然后转到低血清培养液中以促进中间阶段胰腺干细胞的生长。通过在条件培养皿中生长成融合单层，这些细胞能成熟形成胰岛素分泌细胞集落。但是，这些聚集的细胞在临床使用中受到限制，因为如果直接移植的话，这些细胞可能会导致宿主产生有害的免疫反应。


图1图1显示了移植前包被的增殖的P3集落。这些细胞针对(A)CK19-1，(B)胰岛素，(C)胰高血糖素，(D)生长激素抑制素进行免疫染色，放大倍数为60×。
图2图2显示了200个液态胶囊中的P3细胞，105HD394i移植前和移植后SCID小鼠的血液葡萄糖水平。
图3图3显示了从动物中切除之后包被的增殖的P3集落。这些细胞用胰岛素特异性抗体染色，放大倍数如下(A)区域1，4×；(B)区域1，10×；(C)区域1，60×；(D)区域2，10×；(E)区域2，60×；(F)区域2，60×。
图4图4显示了对(A)CK19-1，(B)PDX-1，(C)胰岛素，(D)胰高血糖素，(E)生长激素抑制素免疫着色，培养6个月后的包被的分离岛，放大倍数为60×。
图5图5显示了对(A)CK19-1，(B)PDX-1，(C)胰岛素，(D)胰高血糖素，(E)生长激素抑制素和(F)淀粉酶免疫染色，培养28个月后的包被的分离胰岛，放大倍数为60×。
图6图6显示了持续培养9个月以上的4,000个包被的HD357胰岛(在200个胶囊中)移植前和移植后裸鼠的血液葡萄糖水平。在第118天回收100个移植的胶囊。
图7图7显示了4,000个包被的HD357胰岛(在200个胶囊中)受者的口服葡萄糖耐量试验的结果，该检查在移植35天后进行。
图8图8显示了人固有胰腺的蛋白表达，针对下列蛋白(A)CK19-1，(B)PDX-1，(C)胰岛素，(D)胰高血糖素，(E)淀粉酶对样品进行免疫染色。放大倍数为60×。

发明内容
本发明提供通过包被用于繁殖胰腺细胞的细胞培养物来原位向哺乳动物提供胰岛素的方法，其中该细胞培养物具有如下属性(i)具有能够以约180个细胞/平方厘米的初始浓度从一个培养容器传代到另一个容器并扩增到约1800个细胞/平方厘米的能力，及(ii)在扩增和未扩增的细胞中90％是PDX-1阳性，且胰岛素肌动蛋白mRNA比率为1∶100～1000∶1。包被后，将该细胞移植或植入到哺乳动物中以使细胞成熟成胰岛素分泌细胞。
在一个实施方案中，上述细胞成熟成细胞集落，该细胞集落包括CK19-阳性细胞覆盖层和50-5000个胰腺细胞形成的内细胞团，其直径为50-300微米。在本发明的另一实施方案中，哺乳动物是糖尿病人。
在本发明的一个方面中，上述细胞培养物的胰岛素肌动蛋白mRNA比率为1∶10～100∶1。
在另一实施方案中，包被包括如下步骤用藻酸盐包裹细胞以形成胶囊，用二价阳离子交联藻酸盐，及提供多聚赖氨酸膜密封该胶囊。
在另一实施方案中，本发明提供了包被的胰腺细胞，该包被的胰腺细胞具有如下属性(i)扩增的能力，及(ii)在扩增和未扩增的细胞中90％是PDX-1阳性，且胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率为1∶100～1000∶1。
定义“包被”是指将细胞用生物相容性非细胞材料，如藻酸钠和多聚赖氨酸包裹的过程。优选地，小分子，如糖和低分子量蛋白质能从包被细胞的周围环境中吸收或分泌到包被细胞的周围环境中，同时，大分子和免疫细胞进入包被细胞受到限制。
“原位”是指细胞在包被状态下成熟或生长。原位生长或成熟可以在培养容器中或在植入到哺乳动物后发生。
“成熟的”或“成熟”是指细胞从未分化状态发展成为分化状态的过程。例如，未分化的胰腺细胞能增生并表达特征标记，如PDX-1。成熟的胰腺细胞不能增生，能分泌高水平的胰腺内分泌激素，如成熟的β-细胞高水平分泌胰岛素。细胞相互作用和成熟的改变包括细胞丢失未分化细胞的标记或获得分化细胞的标记。单个标记的丢失或获得能表明细胞已经“成熟”。
细胞的“集落”在本文中是指三维结构。
“CK-19”是40Kd的酸性角蛋白，即细胞角蛋白19。
用凝胶扫描仪扫描条带密度或对不同标记的胰岛素和肌动蛋白进行实时PCR检测，分析“胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率”，其是一个细胞群的平均数。
“植入”是细胞向受者的移植或接入。其包括包被的细胞和未包被的细胞。该细胞能用本领域已知的方法皮下、肌肉内、口内(intraportally)或腹腔内(interperitoneally)植入。
以单层附着在表面生长的细胞的“传代”是指被接种的培养容器从部分融合单层状态向融合单层状态的转变，这时细胞能从该培养容器中移出，以低密度再接种到培养容器中。然而，在达到融合单层之前也可传代。在它们生长成融合单层时，传代通常能使细胞数量扩增，细胞群落的扩增依赖于初始接种密度，但一般以1-10、1-5、1-3、1-2倍扩增。因此，传代通常要求培养的细胞大多数是能够分裂的细胞。
细胞“群”是指通过特定的分离或培养步骤获得的多个细胞。当本发明的选择步骤产生具有相对均一特性的细胞群时，在检测标记表达或其它表型时，细胞群可以是异质的。细胞群的特性通常用具有特定特性的单个细胞的百分率(如对特定标记染色阳性的细胞的百分率)或对整个细胞群进行检测时的该特性的大多数平均值(如细胞群产生的细胞裂解产物中mRNA的量)来定义。
“90％ PDX-1阳性的”是指随意挑选的细胞的统计学抽样。采用标准免疫化学技术，在显微镜下对阳性染色细胞进行观察计数。通过与合适的对照样品进行比较来测定百分率，如制备同样的细胞和使用相似种型但对PDX-1无特异性的抗体。
“血清”是指从血液中获得的非血细胞材料。血清一般是通过凝结或通过离心和脱纤维蛋白来物理分离血细胞来获得。如本文所述，可以用其生物学活性对血清进行功能限定当加入到培养液时，血清一般能支持培养液中哺乳动物细胞的生长。血清可以从不同种物种(如人、牛、绵羊、马、猪、兔、鸡等)或不同发展阶段(胎儿、幼年或成年)中获得。在某些实施方案中，“血清”也可从成分血清或其它来源获得，如SelectSoytone(Becton Dickinson)或其它商业可获得的产品中获得的血清代用产品或替代产品。这些血清等同物应完全或部分地定义。
“包膜”是指包裹内细胞群三维的细胞外壳。
详细说明本发明涉及到发现存在的中间的、分化阶段的胰腺干细胞，在包被时该胰腺干细胞能成熟形成产生胰岛素的集落。这些胰腺干细胞能再现包被的直接从胰腺中分离的胰岛细胞的结构和功能。该胰腺干细胞具有在培养液中扩增的优点，同时包被步骤能控制集落的大小和细胞数量。
I、分离胰腺细胞的方法本发明提供了诱导中间阶段胰腺干细胞群成熟形成胰岛素分泌细胞集落的方法。一般地，起始步骤是从胰腺中分离出中间阶段的胰腺干细胞，从胰腺中收集的细胞是可以产生具有外和内分泌功能的分化细胞的不同细胞群。这些分化细胞表达胰腺内分泌分子，如胰岛素、生长激素抑制素、胰高血糖素和其它体内分泌激素，及胰腺外分泌分子，如淀粉酶。另外，一部分培养细胞群能在培养液中复制和扩增。因此，在本发明中使用的这种中间阶段的胰腺干细胞群能从供者的胰腺中分离出来，然后新分离的胰腺细胞在条件培养液中培养以促进中间阶段的胰腺干细胞生长。
A.供体的来源上述供体的来源可以是一个或多个供者的胰腺，可以来源于培养的胰腺细胞或能产生胰腺内和外分泌激素的细胞的其它来源。在优选实施方案中，用于后续培养的分离细胞是从一个或多个供者的胰腺中获得。本发明所描述的方法不依赖于供者胰腺的年龄。因此，从胚胎到成年年龄范围的供者中分离的胰腺材料都可以使用。
在另一实施方案中，胰腺细胞是从培养源中分离得到。例如，可以将用Soon-Shiong等题为“Microencapsulation of cells”的美国专利第5,762,959号中的微包被方法而制备的细胞收集作为供体细胞的来源。
B.胰腺细胞群的分离一旦从供者中收集到胰腺，一般就用不同的方法处理胰腺以产生单个细胞或小群的细胞用于培养。这种方法的一种是洗净收集的胰腺组织并预备用酶消化。用酶处理以消化连接组织从而使收集组织的腺细胞组织裂解成更小的胰腺细胞材料单元。用一种或多种酶处理收集的胰腺组织以使胰腺细胞材料、亚结构和单个胰腺细胞与收集器官的整个结构分离。胶原酶、脱氧核糖核酸酶、释放制剂(参见美国专利第5,830,741和5,753,485号)和其它的酶预期可用于本发明所揭露的方法。
可以进一步处理分离的原材料以富集一种或多种目的细胞群。然而，未做成分分离的胰腺组织一旦分离培养，其也可直接用本发明的培养方法培养而不需要进一步分离，并能产生中间细胞群。在一个实施方案中，该分离的胰腺细胞材料通过密度梯度(如Nycodenz，Ficoll或Peroll)离心纯化，例如，在美国专利第5,739,033号中描述的梯度方法可以用作富集胰岛中处理后的胰腺材料的方法。从供者源中收集的混合细胞一般是异质的，因此含有α-细胞、β-细胞、δ-细胞、导管细胞、腺泡细胞、兼性祖细胞和其它的胰腺细胞型。
一般的纯化方法会使分离的细胞材料分离成许多层或界面。一般地形成两个界面。上层界面是胰岛富集的，含有10-100％胰岛细胞的悬液；第二层界面一般是混合细胞群，含有胰岛细胞、腺泡细胞和导管细胞。底层是沉淀物，其在梯度的底部形成。这一层一般主要(＞80％)含有腺泡细胞、一些残余胰岛(entrapped islets)和一些导管细胞。可以分别收集导管树组分(ductal tree component)以用于进一步的处理。
根据挑选的梯度部分和每个分离的最后结果，用于进一步处理的所挑选部分的候选细胞将会不同。当胰岛细胞是目标细胞型时，分离部分中合适的富集胰岛细胞群将含有10％-100％的胰岛细胞。通过富集，也能收集到其它胰腺细胞型。例如，根据所用的纯化梯度，本发明所描述的培养方法可以用来培养从第二界面、从沉淀物或从其它部分中分离出的细胞。
在一个实施方案中，从胰岛富集(上层)部分中产生中间胰腺细胞培养物。另外，一般含有胰岛细胞、腺泡细胞和导管细胞的混合细胞群的更异质的第二层界面或一般含有导管树组分、腺泡细胞和一些残余胰岛的底层部分也能用于培养。因这两层都含有本发明所描述的能产生中间阶段的细胞群，所以每一层对于使用本发明所揭露的方法都可能具有特定的优点。
II、中间阶段胰腺干细胞群的产生和繁殖A.常规细胞培养步骤一旦获得并分离出胰腺细胞，就将它们在选择中间阶段细胞群为目的繁殖条件下培养，或在其它实施方案中，在分化更成熟细胞型的条件下培养。常规的细胞培养方法在Freshney，Culture of Animal CellsAManual of Basic Technique 4th ed.，John Wiley & Sons(2000)中可以找到。一般地，胰腺细胞在适于其它哺乳动物细胞培养的条件下培养，例如在37℃，含5％CO2空气的加湿培养箱中培养。细胞可以在本领域已知的不同基质材料上培养，如硼硅酸盐玻璃管、瓶、盘、带有阴性表面电荷的克隆环、塑料的组织培养管、盘、瓶、多孔板、带有增加生长表面积(GSA)或食管多普勒监测器(EDM)的容器、带有多个内薄层以增加GSA的瓶、Fenwal包和其它的培养容器。
一旦收集并挑选了用于培养的胰腺细胞材料，或如果细胞群发生融合可将其转移到新的基质材料，那么细胞群就被接种入合适的组织培养容器中来培养。接种密度对于用本发明所揭露的方法而培养的胰腺细胞的生存能力有影响，可以通过以不同范围的密度接种细胞并监测最终细胞存活和扩增的比率来试验性地测定特定培养条件的最优接种密度。经证实，接种密度的范围对于分泌激素的培养细胞是有影响的，一般地，细胞的浓度范围为大约102-108个细胞/100mm培养皿，如102、103、104、105、106、107或108个细胞/100mm培养皿，虽然更低的细胞浓度也可以用于克隆步骤。其它培养容器的细胞浓度可以通过计算不同容器的相对的基质材料表面积和/或培养液气体交换表面积来调整。例如，常规的100mm培养皿的基质材料表面积为55平方厘米(参见Freshney，见上文)，细胞浓度为10,000个细胞/皿，相应于每平方厘米约180个细胞，当细胞浓度为100,000个细胞/皿时，则相应于每平方厘米约1,800个细胞。通过在每培养表面积上使用合适体积的培养液(对于静止培养液的常用范围是0.2-0.5ml/cm2)，可以将根据培养容器表面积确定的细胞浓度与根据培养液体积确定的细胞浓度建立比例关系。为了测定是否发生10倍的扩增，通过酶消化除去细胞，在已知体积的液体中显微镜下计数。细胞还可以在预包被了确定的细胞外基质成分的培养表面生长以促进其生长和分化(如纤维连接蛋白、胶原I、Engelbreth-Holm-Swarm基质和优选的胶原IV或层粘连蛋白)。
标准细胞培养繁殖技术适于实施本发明。当细胞附着在培养液表面生长时，单层生长一般达到80％-90％融合，这时采用蛋白水解消化使细胞从表面释放，将其以1∶2或1∶3稀释在新的容器中培养。对细胞进行更高稀释也适用，一般的稀释范围为1∶4到1∶10，虽然更低的细胞浓度也适合于克隆步骤。当将细胞传代到无血清培养液中时，通常降低蛋白水解酶和螯合剂的浓度(如0.025％胰岛素和0.53mM EDTA)。一般每星期更换两次培养液，或者当培养液的pH表明需要新鲜的培养液时更换培养液。
本发明的胰腺细胞可以在不同的培养液中培养。如本发明所述，含有或缺乏特定成分的培养基，特别是血清在分离或繁殖方法的某些步骤中是优选的。例如，从胰腺中新鲜分离的细胞可以维持在高血清培养液中以使细胞从分离步骤中恢复；相反地，中间阶段细胞群的挑选和繁殖需要低浓度血清培养液。因此，许多种培养液配方都可用于实施本发明。本申请所揭露的培养液配方仅是举例的目的，使用本申请描述的检测方法，通过分析检测变化对细胞群复制或分化的影响，该培养液的非关键成分可以省略、替换、改变。参见如Stephan等，Endocrinology 1405841-54(1999))。
培养液通常包括基本培养液，其含有无机盐、缓冲液、氨基酸、维生素和能量源，在一些情况下，还含有其它的与蛋白质、核苷酸、碳水化合物或脂代谢有关的有机中间体和前体形式的附加营养物。基本培养液包括F12、Eagle’s MEM、Dulbecco’s改性的MEM(DMEM)、RPMI 1640、F12和DMEM的1∶1混合物等。参见Freshney，见上文。为了支持细胞生长，基本培养液通常补充有生长因子、其它蛋白、激素和痕量元素，这些补充物促进了细胞的生长、维持和/或分化，抵消了培养液其它成分的杂质或毒性，并提供了基本培养液中缺乏的微量营养素。在许多培养液中，血清是这些补充物的来源，血清可以从不同哺乳动物源中得到，如人、牛、绵羊、马等，可以从成年、幼年或胎儿中得到。参见Freshney，见上文。胎儿牛血清通常用作补充物，血清的浓度用血清的体积占整个培养液体积的百分比来表示，一般的范围是0.1-25％，如0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25％。在一些应用中，基本培养液中补充入除血清以外的确定的或半确定的生长因子、激素和微量营养素的混合物。血清替代补充物的配方在此处有揭露。其它的配方是本领域已知或从商业源中能得到的(参见Freshney，见上文)。在一些实施方案中，降低了血清的浓度，但并不消除，并向基本培养液中加入确定或半确定的补充混合物。此处描述了含有高或低浓度血清的培养液的优选应用。
B.分离的胰腺细胞在高血清中的维持和繁殖在供者死亡之后分离步骤开始之前，从供者的胰腺中收集到的细胞，通常要经受一段时间的热或冷缺血。此外，在分离过程中，胰腺细胞通常会遭受蛋白水解消化及机械和剪切应力作用。尽管不希望限制于特定的理论，但这些细胞所经受的各种损伤可能会正向调节各种细胞过程而使胰腺干细胞群如兼性祖细胞群扩增。分离或纯化后，将细胞直接置于低血清培养液中可以非常有效地产生中间细胞群。但是，由于细胞在分离步骤中所经受的损伤可能对细胞的生存和对培养液的适应性会有副作用，所以有时需要将新分离的细胞维持在含有高浓度血清(如大于4％)的稳定培养液中以提高培养效率。该维持的期间可以是短暂的(如过夜)。可选择地，细胞在扩增繁殖期间都维持在高血清培养液中。
起稳定作用的高血清培养液一般地含有至少4％的血清，在一些实施方案中含有更高浓度的血清，如10％或20％。用于稳定或繁殖作用的培养液可以源于基本培养液，如RPMI 1640，其可从多种商业途径得到，并被Moore等在J Am Med Assoc 199519-524(1967)中所公开。用于维持和繁殖的高血清培养液的例子有培养液3(RPMI 1640+10mM HEPES、2mM谷氨酸盐、5μM ZnSO4和10％的胎牛血清(FBS))和培养液7(RPMI1640+10mM HEPES、2mM谷氨酸盐、5μM ZnSO4和20％FBS)。还可以通过将一定体积的高血清培养液，如培养液3或培养液7与一定体积的无血清培养液，如SM95、SM96或SM98(如本文所述)混合以达到所需要的血清浓度(如4％-9％)而得到高血清培养液。
收集后为了达到稳定，通常将细胞以高密度培养在含有高血清培养液的培养容器中(如在70ml培养液7(20％FBS)中培养109个细胞)。但是，也可以使用低细胞密度和低血清浓度。一般在最初的容器中维持细胞相对短的时间(如过夜)以使其从收集步骤中恢复。
在维持期间之后，可以将细胞转移到低血清培养液中用来挑选和繁殖如本文所述的中间细胞群。可选择地，可将细胞培养在高血清培养液中以使混合细胞群扩增。在典型实施方案中，将从维持培养液中获得的细胞重新接种到含有培养液3(10％FBS)、培养液7(20％FBS)或培养液3和培养液7的混合物的新培养容器中，细胞在这种培养液中一般培养7-10天，此期间它们可生长成融合状态。一旦细胞达到融合状态时，可以将它们传代到低血清培养液中来选择性地扩增本文所述的中间细胞群。
C.低血清培养液中培养的中间阶段胰腺干细胞群的扩增与繁殖一旦分离出胰腺干细胞，就将该细胞转移到选择性培养液中以促使产生繁殖的中间阶段群，该选择性培养液有利于细胞的繁殖，其中这些细胞保留有分泌胰腺内分泌激素的能力或保留有进一步分化成熟为高水平分泌胰腺内分泌激素的增生细胞的潜力。虽然本发明方法中没有要求纯化的上皮培养物来更好的发挥胰腺细胞的有利作用，但一般来说选择性培养液有利于上皮或类上皮细胞的繁殖，同时抑制纤维原细胞和间质细胞。一般地，经过一定时间的培养后，如根据每次传代扩增的细胞数量进行的2、3、4或5次传代后，上皮选择性培养液会产生出接近纯化的细胞群(如纤维原细胞或间质细胞小于10％)。
所使用的一种选择性培养液是无血清培养液，该培养液有利于来自胚胎组织的上皮细胞的生长(参见如Stephan等，见上文；Peehl和Ham，InVitro 16526-40(1980))。上皮特异性培养液、更优选地含有生长激素源的低血清培养液可以用来选择性繁殖特定的胰腺细胞群，其中这些胰腺细胞来自成年哺乳动物，保留有胰腺细胞发育标记(如PDX-1)，但在合适条件下能进一步分化而高水平表达胰腺内分泌激素。本申请公开了适于培养胰腺细胞的具体的上皮选择性培养液，但是有利于上皮或类上皮细胞优先扩增的本领域已知的其它培养液配方也可以使用。
可以在高血清培养液中维持一段时间后再转移到上皮选择性低血清培养液中(“禁食(weaning)”)，或者在分离和分开步骤后直接将细胞转移到低血清培养液中(“休克(shock)”)，这两种方法都适于产生目标中间细胞群。
1.选择性低血清培养液的制备本文所使用的“低血清培养液”是指含有血清少于约1％的培养液，因此，无血清培养液是一类低血清培养液。血清浓度在0％-1％之间，如约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％的培养液可以通过将合适浓度的血清加入到无血清培养液中或通过将无血清培养液与含血清的培养液混合使其达到合适的血清浓度来制备。
向基本培养液(如SM96或1∶1的F12/DMEM)中补加入取代血清生物学功能的生长因子、其它蛋白、激素和微量营养素的混合物来制备完全无血清的培养液。无血清培养液的优点在于能容易地操纵补加的混合物组分从而促进目标细胞群(如中间细胞群)的增生并抑制非目标细胞(如腺泡细胞或结缔组织细胞，如纤维原细胞)的生长。还可以操纵该补加的混合物以促使干细胞群分化成更成熟细胞，或防止干细胞群的分化以维持高增殖率。
a)生长激素使用含有生长激素(GH)的上皮选择性培养液来促使产生可利用的中间分化的胰腺细胞群。尽管不希望限制于特定的理论，只是猜测GH能代替通常在血清中发现的可支持细胞生长的有丝分裂物质，但是血清中含有能促使非必需细胞群(如成纤维细胞和间质细胞)过度生长的其它有丝分裂因子。因此，用含有GH的补加混合物替代血清对分化的中间阶段的细胞群的繁殖产生选择性。而在本发明可选择的具体实施方案中，无血清培养液中的GH的功能可以用其它的补加成分来代替，在天然提取物中的或作为重组蛋白的GH的应用使含有GH的培养液适于本申请所公开方法的上皮选择性培养液。
生长激素(growth hormone，也被称为somatotropin)是在垂体前叶合成的多肽激素，其能促进正常个体的生长和哺乳并影响细胞代谢的各个方面。GH能直接作用细胞，也能通过IGF-I和相似分子介导间接作用细胞。在完整胰腺中，胰岛细胞的生长与GH、同源激素催乳素和催乳激素的表达有关(参见如Nielsen等，J Mol Med 77(1)62-6(1999))。在人体中，成熟的GH含有191个氨基酸残基，分子量为22kDa。然而，除了常见的二硫二聚体外，在血清中已经检测到部分人GH由两个肽组成(残基1-43和44-191)，其对成人的胰岛组织具有不同的作用(参见Lewis等，Endocr J 47SupplS1-8(2000))。人GH的各种天然存在的衍生物、变体、代谢产物和构建的衍生物是已知的，包括糖基化GH、甲硫氨酸GH、20kDa GH、乙酰化的GH、蛋白水解GH、酰胺GH、亚砜GH和截短形式的GH。
GH是激素保守家族的一员，包括人中的GH-V1和GH-V2，来自于其它脊椎动物的绒毛膜催乳素、催乳素和蛋白，如啮齿动物胎盘催乳激素I和II和其它的牛和羊催乳激素，鼠增殖素I、II和III和增殖素相关蛋白I、II和III，鼠类催乳素蛋白A和B，和来自各种鱼的生长催乳激素(somatolactin)。这个家族的成员的特征是具有相同序列C-x-[ST]-x(2)-[LIVMFY]-x-[LIVMSTA]-P-x(5)-[TALIV]-x(7)-[LIVMFY]-x(6)-[LIVMFY]-x(2)-[STA]-W或C-[LIVMFY]-x(2)-D-[LIVMFYSTA]-x(5)-[LIVMFY]-x(2)-[LIVMFYT]-x(2)-C。
适于实施本发明的生长激素可以从各种天然或人工的来源获得。与常需要同一物种来源的治疗用GH相比，在培养胰腺细胞的低血清培养液的配方中，可以使用来源于灵长类动物、哺乳动物或脊椎动物种的GH。生长激素的常规来源是牛垂体提取物(BPE)，其富含天然GH。培养液中可以含有BPE(75μg/ml蛋白)，浓度为大约0.1-100μl/ml，优选为0.5-50μl/ml，更优选为5μl/ml或37.5mg/l。来源于其它物种(如猪、羊等)的垂体提取物也可以以相似浓度使用。垂体提取物中存在的其它因子可以增强其效果，但使用纯的GH和使用重组GH也能达到令人满意的效果。重组的牛和人GH可以广泛使用，并是GH活性的合适来源。可以将重组GH加到培养液中，其浓度为0.01-100mg/l，优选为0.1-10mg/l，更优选为约0.2、0.5、0.75、1、1.25、2或5mg/l，更优选为约1.25mg/l，其中1mg重组蛋白约相当于3IU的GH。
b)其它的补加物为制备完全无血清培养液而加入基本培养液中的成分一般包括重组人胰岛素(0.1-100μg/ml)、转铁蛋白(0.1-100μg/ml)、表皮生长因子(0.1-100ng/ml)、乙醇胺(0.1-100μg/ml)、抑肽酶(0.1-100μg/ml)、葡萄糖(0.1-100mg/ml)、磷酸乙醇胺(0.1-100μM)、三碘甲状腺氨酸(0.1-100pM)、硒(0.1-100nM)、氢化可的松(0.01-100μM)、黄体酮(0.1-10nM)、佛司可林(forskolin)(0.1-100μM)、B细胞生长因子(heregulin)(0.1-100nM)和牛垂体提取物(0.1-500μg/ml)。并不需要所有的补加组分都支持细胞生长，对于具体补加物，其最佳浓度或必要性可以通过去除或减少单一组分的浓度并观察对细胞增殖的效果试验来确定(参见Stephan等，见上文)。
一般而言，可以用天然或合成的具有同样生物学属性的产品来替代补加的成分。例如，三碘甲状腺氨酸、氢化可的松和黄体酮都可以用天然或合成的激活同一细胞内受体(甲状腺受体、糖皮质激素受体和黄体酮受体)的已知激素代替。胰岛素是用重组DNA技术生产的典型人蛋白，但是可以用从天然来源中纯化或来源于其它物种的多肽或其它的胰岛素和EGF受体的激动剂来代替。在某些情况下，可以用其它的GH受体拮抗剂来代替GH。同样，ErbB3受体的配体B细胞生长因子可以用B细胞生长因子异构体和其它ErbB3激动剂，如Ebp-1、B细胞生长因子α、B细胞生长因子β、B细胞生长因子γ、神经调节蛋白-1和神经调节蛋白-2(NRG-1α、NRG-1β、NRG-2α和NRG-2β)来代替。
无血清培养液的例子包括基本培养液SM96和完全培养液SM95，SM95由SM96补加下表中的物质组成。SM98由1∶1的F12/DMEM补加改性的培养液补加物14F(由Stephan等描述，见上文)组成。SM98含有的B细胞生长因子比14F少(1ng/ml v.8ng/ml)。因此，SM98由1∶1的F12/DMEM组成，其补加有10μg/ml的重组人胰岛素、10μg/ml的转铁蛋白、10ng/ml的表皮生长因子、61ng/ml的乙醇胺、3.365pg/ml的三碘甲状腺氨酸、4.325ng/ml的硒、181ng/ml的氢化可的松、3.15ng/ml的黄体酮、410ng/ml的佛司可林、1ng/ml的B细胞生长因子和75μg/ml的牛垂体提取物。SM95和SM98中的EGH来源的例子有重组人EGF(SigmaE9644)和人B细胞生长因子-β1的EGF区域(氨基酸176-246)(R&D系统369-HB/CF)。
RPMI 1640培养液(Moore等，A.M.A.，199519(1967))无机盐Mg/L氨基酸 Mg/LCa(NO3)2-4H2O 100L-赖氨酸·HCl 40.00KCl 400.00 L-甲硫氨酸 15.00MgSO4(无水) 48.84 L-苯丙氨酸 15.00NaCl 5850.00L-脯氨酸 20.00Na2HPO4(无水) 800.00 L-丝氨酸 30.00L-苏氨酸 20.00L-色氨酸 5.00其它组分 Mg/LL-酪氨酸·2Na2H2O 29.00D-葡萄糖 2000.00L-缬氨酸 20.00谷胱甘肽(减少的) 1.0HEPES 5958.00维生素 Mg/L酚红 5.00 生物素 0.20D-泛酸钙0.25氯化胆碱3.00氨基酸Mg/L叶酸1.00L-精氨酸 200.00 i-肌醇 35.00L-天冬酰胺(自由基)50.00 烟酰胺 1.00L-天冬氨酸20.00 维生素B6·HCl 1.00L-胱氨酸·2HCl65.00 核黄素 0.20L-谷氨酸 20.00 硫胺·HCl 1.00L-谷氨酸盐300.00 胸苷0.005甘氨酸10.00 维生素B121.04L-组氨酸(自由基) 15.00L-异亮氨酸50.00L-亮氨酸 50.00
SM95无机盐 Mg/L其它组分 Mg/LCaCl278.3 D-葡萄糖 3000CuSO4·5H2O 0.00165 HEPES 1787.25Fe(NO3)3·9H2O 0.025 钠次黄嘌呤 3.2FeSO4·7H2O 0.61亚油酸 0.066KCl 271 硫辛酸 0.1525MgCl228.36酚红 4.675MgSO439.06腐胺钠·2HCl 0.191KH2PO434 丙酮酸钠 137.5NaCl7262.75NaHCO31600Na2HPO4101.5NaH2PO4·H2O31.25ZnSO4·7H2O 0.416维生素 Mg/L生物素 0.037抗坏血酸维生素C22.5氨基酸 Mg/LD-泛酸钙 1.37L-丙氨酸 11.225 氯化胆碱 11.49L-精氨酸·HCl 283.75 叶酸 1.826L-天冬酰胺·H2O 18.75L-肌醇 24.3L-天冬氨酸 16.325 烟酰氨 1.03L-半胱氨酸·H2O(非动物) 43.78维生素B6·HCl 1.046L-胱氨酸·2HCl 15.65核黄素 0.13L-谷氨酸 18.675 硫胺·HCl 1.23L-Glutamax I 328.5胸苷 0.5325甘氨酸 89.375 维生素B121.04甘氨酸-组氨酸-赖氨酸 0.000005L-组氨酸HCl·H2O 38.69L-异亮氨酸 31.24补充物 Mg/LL-亮氨酸 42.5 Selenous酸钠 0.0034L-赖氨酸·HCl 82.125 上皮生长因子 0.005L-甲硫氨酸 13.12乙醇胺 0.03L-苯丙氨酸 22.74磷酸乙醇胺 0.07L-脯氨酸 43.625 抑肽酶 12.5L-丝氨酸 23.625 黄体酮 0.0016L-苏氨酸 38.726 佛司可林 0.205L-色氨酸 6.51 B细胞生长因子 0.004L-酪氨酸·2Na2H2O(非动物) 35.9 牛垂体提取物 37.5L-缬氨酸 38.125 氢化可的松 0.0923r.h.胰岛素 5.05T3 0.0000015L-T4甲状腺素钠 0.00002牛转铁蛋白APG 7.5
SM96无机盐 Mg/L其它组分 Mg/LCaCl278.3 D-葡萄糖 3000CuSO4·5H2O 0.00165HEPES 1787.25Fe(NO3)3·9H2O 0.025 钠次黄嘌呤 3.2FeSO4·7H2O 0.61 亚油酸 0.066KCl271 硫辛酸 0.1525MgCl228.36 酚红 4.675MgSO439.06 腐胺钠·2HCl 0.191KH2PO434 丙酮酸钠 137.5NaCl 7262.75NaHCO31600Na2HPO4101.5NaH2PO4·H2O 31.25维生素Mg/LZnSO4·7H2O 0.416 生物素0.037抗坏血酸维生素C 22.5D-泛酸钙 1.37氨基酸 Mg/L氯化胆碱 11.49L-丙氨酸 11.225 叶酸 1.826L-精氨酸·HCl 283.75 L-肌醇24.3L-天冬酰氨·H2O 18.75 烟酰氨1.03L-天冬氨酸 16.325 维生素B6·HCl 1.046L-半胱氨酸·H2O(非动物) 43.78 核黄素0.13L-半胱氨酸·2HCl 15.65 硫胺·HCl 1.23L-谷氨酸 18.675 胸苷 0.6325L-Glutamax I 328.5 维生素B121.04甘氨酸 89.375甘氨酸-组氨酸-赖氨酸 0.000005L-组氨酸HCI·H2O 38.69L-异亮氨酸 31.24L-亮氨酸 42.5L-赖氨酸·HCl 82.125L-甲硫氨酸 13.12L-苯丙氨酸 22.74L-脯氨酸 43.625L-丝氨酸 23.625L-苏氨酸 38.726L-色氨酸 6.51L-酪氨酸·2Na2H2O(非动物) 35.9L-缬氨酸 38.1261
2.细胞向低血清培养液中的转移将胰腺细胞的培养物转移到低血清培养液中可促进明确分化为中间阶段细胞群的挑选。如果传代培养，这些细胞将会继续扩增，且保持高水平表达胰腺标记，如PDX-1。如果不经刺激，这些群就分泌相对低水平的胰腺内分泌激素，如胰岛素，但根据本发明的方法能使其成熟产生高分泌细胞。为了将胰腺细胞的培养物转移到低血清培养液中，可以将细胞在由高血清转移到低血清的培养液中培养，也可以在分离后直接将细胞置于低血清培养液中。诸如SM95和SM98等培养液是合适的培养液，虽然SM95对于成熟的胰腺细胞有轻微促胰岛素分泌作用。
中间细胞群一般保留有增生的能力和进一步分化为高分泌内分泌细胞的能力。增生的能力可以用由一个密度接种培养扩增到另一个密度的能力来衡量，如在一次传代中180个细胞/平方厘米的细胞可以扩增到1,800个细胞/毫升。通过繁殖和传代的重复循环，分离的胰腺细胞的起始群可以扩增约10,000倍或更多(如约100倍、500倍、1000倍、5000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、500,000倍或1,000,000倍)且保留有内分泌标记，如表达PDX-1和胰岛素mRNA，和保留有分化为成熟的高分泌的内分泌细胞的能力。
III、适应性细胞培养作为成熟方法的预备步骤，中间阶段的胰腺干细胞在适应性培养条件下生长。简单地，该中间阶段的胰腺干细胞在条件性培养皿或新的培养皿中生长，仔细看护使细胞不达到融合状态。混合上述两种类型培养皿中的细胞，或者如下文所描述的那样进行包被，或再接种到培养皿上。
A.条件性培养皿条件性培养皿是事先已用来生长中间阶段胰腺干细胞的培养皿。一旦该细胞形成了单层(一般约5天，根据最初的传代接种密度)，通过胰蛋白酶化作用将其移出。制备条件性培养皿并不需要100％的融合细胞培养物，优选使用更低浓度的胰岛素(一般为标准细胞培养方法中使用浓度的1/2或1/4)来防止基质发生大范围的降解。可选择地，上述细胞单层可以通过用去污剂分离底物来移出，其中的去污剂会移出细胞而留下分泌基质(参见Gospodarowicz等，Proc Natl Acad Sci USA 774094-8(1980))。
方便地，可以将以前生长在底物或培养皿上的上述移出细胞分成几份，并再接种在同样的、条件性培养皿中。但是，对底物有条件要求的培养及接种在底物上的培养并不要求是一样的培养。因此，一种细胞培养可以是生长在底物上，而使底物、移出细胞及接种在条件性底物中的另一培养细胞条件化。作为后续的培养细胞，该条件细胞可以来源于同一或不同的供者或物种。
B.使用适应性培养液的细胞的生长将中间阶段的胰腺干细胞分开到条件性的和新的培养皿中，只要该细胞仍然能够增殖，培养的时间长度并不重要。在优选实施方案中，使用从胰腺中最近分离的细胞(如仅传代过1或2次)。如前所述，为了促进中间阶段胰腺干细胞群的生长，将细胞置于低血清培养液中生长。细胞以其互不接触的密度接种，优选在达到融合状态之前收集。本领域所属技术人员能够理解接种的细胞的数量会影响培养到融合状态的时间。
从条件性和新的培养皿中收集细胞后，将其合并。只要有一些细胞在条件性培养皿中生长，生长在新培养皿中的细胞与生长在条件性培养皿中的细胞的比例对于本发明就不重要。
然后将收集的细胞如下文所述进行包被，或者接种到新的组织培养板上。经过适应性培养，然后在培养液中生长过的细胞能增殖并以葡萄糖调节的方式分泌高水平胰岛素。胰岛素与肌动蛋白的比率与适应性培养之前的比率相似。
IV、中间增殖的胰腺细胞的包被适应性培养后，对中间的增生干细胞进行包被从而在胶囊内形成细胞集落，该集落具有与从胰腺中新分离的包被胰岛集落相似的细胞结构和蛋白表达表型。
包被使胰腺细胞能移植到糖尿病宿主中，而产生最小的宿主动物免疫反应。挑选的包被膜的多孔性能允许生物物质，如胰岛素从胶囊中分泌，同时限制针对外源细胞的宿主免疫系统的介入。
包被方法是本领域已知的，在下列参考文献中有披露vanSchelfgaarde & de Vos，J.Mol.Med.77199-205(1999)，U1udag等，Adv.Drug Del Rev.4229-64(2000)和美国专利第5,762,959、5,550,178和5,578,314号。下面是对中间阶段胰腺干细胞包被的一般性描述，在本发明的实施例部分有具体例子。
A.包被材料用水凝胶包裹包被的细胞。水凝胶可由各种材料制成如藻酸盐、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)。这些材料在水中离子或共价地交联而形成水凝胶。
用于包被胰腺细胞的优选材料是藻酸盐(一种由甘露糖醛(M)酸和葛罗(G)酸组成的多聚糖)。藻酸盐与二价阳离子如钙或钡交联从而形成水凝胶。
B.胶囊的形成作为细胞包被的实例，描述了含有多聚赖氨酸膜的藻酸盐胶囊的形成，本领域所属技术人员能够理解还可以利用藻酸盐和多聚赖氨酸的变体或其它材料来制备胶囊，对制备方法可以进行不影响该包被细胞的功能的相似性改进。在本申请中关于包被细胞植入的IV部分和关于表型检测的VI部分中公开了细胞功能的测试方法。
在微滴形成装置如气体驱动微滴生成器或高压静电脉冲系统中制备含有细胞和藻酸盐的微滴，利用重力也可以形成微滴。通过将微滴溶液在含有离子交联剂如钙的溶液中孵育可使藻酸盐溶液形成凝胶。
为了形成膜，将上述微滴悬浮在含有多聚赖氨酸的溶液中，从而使多阴离子藻酸盐被多阳离子多聚赖氨酸包被。本领域所属技术人员能够理解，改变多聚赖氨酸的分子量和浓度以及孵育时间会影响膜的多孔性。
一旦在水凝胶周围形成膜，使用者可以通过去掉钙离子，通常是在柠檬酸钠溶液中浸泡胶囊来使凝胶液化。本领域所属技术人员能够理解液化的合适条件。为促进生物适应性的最后步骤是将胶囊悬浮在与带正电的多聚赖氨酸结合的藻酸盐或其它的带电分子中。
C.将微胶囊合并成大胶囊本领域所属技术人员能够理解，在一些情况下可以采用附加步骤来降低宿主对植入的包被的胰腺细胞所产生的反应。优选的方法是将微胶囊整合成大胶囊，该技术在美国专利第5,545,423号中有描述，在此将该专利引为参考。
简言之，微胶囊基本按照上述部分的描述制备，虽然可以使用液化内核的微胶囊，但是使用胶体内核的胶囊是优选的。然后用厚层的凝胶材料覆盖多个微胶囊，因而微胶囊的多阳离子层是更有效的免疫系统保护罩。
覆盖微胶囊的大胶囊层可以是任何厚度，但至少是约1微米厚，优选为至少约50微米厚。该大胶囊可以由适于形成上文所述的用于微胶囊的水凝胶的任何聚合物组成，并可以用离子或共价方法使其交联。大胶囊可制作成不同的形状，包括但不限于圆柱形、球形或圆盘形。本领域所属技术人员能够理解大胶囊的具体组分并不影响包被细胞的功能，而且根据本申请的教导能够检测包被细胞的功能。
D.包被细胞的聚集和培养维持包被后，中间增殖的干细胞形成集落。可以根据本申请VI部分所述的免疫染色方法来分析该集落的细胞结构和蛋白表达方式。细胞集落一般具有如下表型单层细胞环绕在集落的周围且表达CK-19，而集落内部的细胞表达胰岛素、生长激素抑制素和胰高血糖素。该CK-19表达细胞可能是未分化细胞，位于中心的激素表达细胞可能是成熟细胞。
包被的细胞可以与包被胰岛一样在培养液中生长，因此，包被的中间增殖干细胞能以与包被胰岛相似的方式在培养液中维持，可以将二价阳离子加到培养液中以维持其液体状态。例如，当水凝胶是钙交联的藻酸盐时，可以向培养液中加入0.03mM CaCl2·2H2O。
V、包被胰腺细胞的植入按照胰岛移植所使用的一般方法，进行向哺乳动物的植入或移植以及后续的内分泌功能监测，参见如Ryan等，Diabetes 50710-19(2001)；Peck等，Ann Med 33186-92(2001)；Shapiro等，N Engl J Med 343(4)230-8(2000)；Carlsson等，Ups J Med Sci 105(2)107-23(2000)和Kuhtreiber，WM，Cell Encapsulation Technology and Therapeutics，Birkhauser，Boston，1999。优选的植入位点包括腹膜腔、肝和肾被膜。
A.微胶囊的剂量本领域所属技术人员能够测定目的受者的合适的微胶囊剂量，该剂量依赖于受体的胰岛素需求，可以通过免疫学或生物活性量来测定微胶囊分泌的胰岛素水平。当测量该剂量时还应考虑受者的体重。如果需要，在监测受者对包被细胞的反应时可以进行多个植入。因此，对植入的反应可以作为确定包被细胞剂量的指导。(Ryan等，Diabetes 50710-19(2001))。
B.监测包被细胞在动物中的功能包被细胞在受体中的功能可以通过监测受体对葡萄糖的反应来检测，植入包被细胞可以产生控制血糖水平的效果。另外，胰腺内分泌激素、胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素的水平增加也能证实移植的包被细胞的功能。
本领域所属技术人员能够理解可以用不同的方法来监测血糖调控。例如，就象检测体重和胰岛素需求一样可以直接检测血糖，也可以使用口服葡萄糖耐量试验。肾功能也可以象检测代谢参数那样来检测。(Soon-Shiong，P等，PNAS USA 905843-5847(1993)；Soon-Shiong，P等，Lancet 343950-951(1994))。
VI、表型检测为了弄清楚什么时候出现成熟的胰腺细胞，检测培养的特定阶段和包被后胰腺细胞的表型是有用的，而不论是在体内还是在体外生长。因为特定蛋白的表达与细胞特征或分化阶段有关，因此可以分析细胞标记基因或蛋白的表达来测定其特征或分化阶段。例如，在新分离的胰腺组织中，淀粉酶表达就能确定该细胞为外分泌胰腺细胞，胰岛素表达就能确定该细胞为内分泌胰岛细胞。同样，在分化的早期阶段胰岛细胞通常是细胞角蛋白CK-19阳性，而成熟胰岛细胞表达很少的CK-19。
可以基于逐一细胞(cell-by-cell)或作为一群细胞的平均数来分析表型特征，检测方式将依赖于检测技术的特定需要和方法。因此，可用免疫组织化学分析固定细胞，用FACS分析悬浮细胞的标记表达，检测单个细胞表达给定标记的频率和强度。另一方面，可以检测整个细胞群的特性，如胰岛素与肌动蛋白mRNA的平均表达比率。在这种情况下，一般是通过收集细胞群中的mRNA并测量胰岛素和肌动蛋白转录本的总丰度来进行测试。许多表型属性既可以在细胞，也可在群的基础上测定。例如，胰岛素的表达可以通过单个细胞染色来测定是否产生胰岛素分泌颗粒，或通过裂解细胞群并测量总胰岛蛋白来测定。相似地，mRNA丰度可以通过裂解细胞并收集mRNA来针对细胞群进行测量或通过原位杂交在单个细胞的基础上进行测量。
A.细胞分化标记有许多细胞标记可以用来鉴定胰腺细胞群。分离和培养的供体细胞开始就表现出分化胰腺细胞的不同表型和基因型标记，可以认为，无论是最初增生阶段之后或分离和就在分离和纯化后，这些标记的改变与胰腺细胞转移到无血清环境下有关。表型或基因型标记的例子包括在经调节(如上调或下调)的兼性祖细胞群中存在的各种分子标记，这些分子标记包括CK-19，其可能是胰腺兼性干细胞的标记。
一般地，当哺乳动物干细胞成熟到它们的最终发育终点时，它们要经过许多发育阶段，通常可以通过鉴定发育细胞中存在或缺乏的标记来鉴定发育阶段。由于人内分泌细胞以相似的方式发育，因此它们从干细胞样表型转变为假胰岛表型时可以使用各种标记来鉴定细胞。
本发明方法中细胞诱导增生和分化的标记表达与正常人胰腺发育中的标记表达序列具有一些相似之处。在发育的早期，原始上皮细胞表达PDX-1，是同源区核因子(homeodomain nuclear factor)的早期细胞标记。当细胞发育时，它们开始出芽并形成导管，这些细胞表达上皮导管细胞的标记细胞角蛋白19，短暂表达的PDX-1引导其发育为内分泌细胞。当细胞继续发育时，它们获得表达胰岛素、生长激素抑制素或胰高血糖素的能力。最终的分化细胞仅能表达其中一种并成为α细胞(胰高血糖素)、β细胞(胰岛素)和δ细胞(生长激素抑制素)。此处所用的中间细胞群被认为低于完全分化发育阶段，保留有增生的能力和分化成成熟内分泌细胞的潜能。如果该细胞确实是发育途径或体外简单操作所获得的前体，那么该中间阶段的细胞就能增生并表达内分泌激素，因此具有用来改正任何类型的胰岛细胞的缺陷的潜能。
理想的标记是在胰腺中时间性-和组织-特异性表达的分子(参见Hollingsworth，Ann N Y Acad Sci 88038-49(1999))，这些分子标记分成三大类转录因子、notch信号路径标记和中间纤维标记。转录因子标记的例子包括PDX-1、NeuroD、Nkx-6.1、Isl-1、Pax-6、Pax-4、Ngn-3和HES-1，notch信号路经标记的例子包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、Jagged2、D111和RBPjk，中间纤维标记的例子包括ck19和Nestin。
检测培养液或分离细胞中的蛋白质和核酸表达的方法是本领域的标准方法，包括定量逆转录酶多聚酶链反应(RT-PCR)、Northern印迹和原位杂交(参见如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.2001supplement))和免疫检测，如切片材料的免疫组织化学分析、Western印迹、全细胞标记的流式细胞计分析(FACS)(参见如Harlow和Lane，UsingAntibodiesA Laboratory Manual，New YorkCold Spring HarborLaboratory Press(1998))。可以使用常规的内分泌细胞分化的组织化学标记，用免疫组织化学检测的细胞可以培养在小室中的玻片上以进行显微镜观察。可选择地，在常规组织培养的细胞可以通过手工从培养物中移出，包埋在石蜡中用于切片。按照Leonard J等，Mol.Endocrinol，1993，Oct7，(10)1275-83的教导可以制备PDX-1抗体。
细胞分化标记是不同的，可以用常规的免疫组织化学方法检测，一般的可用方案如下。
移出小室中玻片时开始染色处理，在缓冲液中非常轻柔地漂洗细胞，在多聚甲醛溶液中固定。然后室温下在含有正常血清的封闭溶液中孵育细胞，用含非离子去污剂的封闭溶液增加细胞通透性，一抗如下表所示，在封闭溶液中进行适当稀释制备这些抗体，将其加到细胞中孵育。在用一抗孵育后，用缓冲液漂洗细胞，再用封闭溶液封闭。
将用封闭溶液适当稀释而制备的二抗加到细胞中，黑暗条件下孵育，孵育后，漂洗细胞并用Hoechst染料重染色核，除去过量液体，用盖玻片盖住玻片。干燥玻片并将其保藏在黑暗中。
可选择地，可以使用ABC免疫组织化学方法制备细胞。简言之，将细胞包埋在石蜡中，37℃过夜染色含有石蜡切片的玻片。将细胞去石蜡化，浸泡在过氧化氢甲醇溶液中以抑制内源过氧化酶活性。将玻片在0.01的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸30分钟以修复特定抗原决定基。用缓冲液漂洗玻片，在湿盒中室温下正常血清封闭。
将封闭溶液制备的一抗加到样品中，在湿盒中孵育。冲洗玻片，与在封闭溶液中制备的二抗一起孵育，在用缓冲液漂洗，与商业试剂盒(如Dako Corporation)中的Avidin-House Reddish过氧化试剂或ABC复合体一起孵育。再漂洗玻片并用二氨基对二氨基联苯(diaminobenzidin)展开液及包裹在金中的尿素过氧化氢一起孵育。在用蒸馏水冲洗后，将玻片浸泡在Mayer’s Hematoxylin中5分钟，然后放在自来水中冲洗直到水无色，核变蓝。将玻片脱水并放置盖玻片用于观察。
B.胰岛素mRNA表达可以用来鉴定胰岛细胞特性、分化或成熟的一个标记是胰岛素mRNA的水平。例如，本发明的中间细胞群的胰岛素mRNA在一定范围内显现出表达，对胰岛素mRNA定量的方法包括Northern印迹、核酶保护、引物延伸。在一个实施方案中，从培养的细胞群中提取mRNA，用定量逆转录PCR测量前胰岛素转录的量。逆转录后，用与胰岛素cDNA序列杂交的引物特异性地、定量地扩增胰岛素cDNA，在扩增条件下，扩增产物的量与样品中存在的mRNA的量有关(参见如Zhou等，J Biol Chem27225648-51(1997))。为了精确，动力学定性步骤是优选的，利用其能测定起始mRNA的水平。
通常，使胰岛素mRNA的量标准化为组成性表达的mRNA，如肌动蛋白，其能利用肌动蛋白特异性引物特异性地从同一RNA样品中扩增。因此，胰岛素mRNA表达的水平可以表示为胰岛素mRNA扩增产物与肌动蛋白mRNA扩增产物的比例或简单地表示为胰岛素∶肌动蛋白mRNA比例。编码其它胰腺激素(如生长激素抑制素或胰高血糖素)的mRNA的表达可以用同样的方法定量。
C.葡萄糖刺激的胰岛素分泌β细胞的重要功能之一是根据葡萄糖水平调节其胰岛素的分泌。一般对增殖粘附的胰腺细胞进行静态葡萄糖刺激(SGS)分析以鉴定它们是否能分泌与不同水平葡萄糖水平相应的胰岛素，细胞通常培养在合适的底物中直到接近融合。SGS测试前3天，将培养液用缺乏胰岛素和仅含1g/L的葡萄糖的相似性质的培养液替换，每天更换培养液一次，连续三天，在第四天进行SGS测试。
测试之前，可以收集培养液以进行葡萄糖和胰岛素分析。为了制备用于检测的细胞，用Dulbecco’s磷酸缓冲盐(DPBS)+0.5％ BSA冲洗细胞两次，每次冲洗孵育5分钟，然后单独用DPBS冲洗一次，也孵育5分钟。冲洗后，用10ml(在100mm的培养皿中)或5ml(在60mm培养皿中)含60mg/dl葡萄糖(KRB-60)的Krebs-Ringers SGS溶液在37℃的培养箱中孵育细胞30分钟，然后重复该培养。
为了进行SGS检测，37℃下在3ml(在100mm的培养皿中)或2ml(在60mm培养皿中)KRB-60中孵育20分钟，向培养液中吹气并使其快速旋转。收集培养液用于胰岛素检测作为LG-1(低葡萄糖刺激步骤)。然后加入等体积的KRB-450+theo(KRB和450mg/dl葡萄糖和10mM茶碱)，在如上相同的条件下孵育细胞。收集上清液用于胰岛素分析作为HG(高葡萄糖刺激步骤)。然后再用KRB-60培养细胞，收集培养液作为LG-2，再一次作为LG-3。收集的培养液用于胰岛素分析，可在-20℃下保藏，直到用放射免疫测定(RIA)或其它合适方法来测定胰岛素含量。
SGS测试结果通常表示为刺激指数，定义为HG胰岛素值除以LG-1胰岛素值。一般地，认为SGS检测中刺激指数大于或约等于2是阳性结果，虽然其它的值(如1.5、2.5、3.0、3.5等)也可用来定义特定的细胞群。
实施例下面的实施例是用来举例说明，而不是用来限定要求保护的发明。
实施例1可原位成熟的中间阶段胰腺干细胞群的产生中间阶段的胰腺干细胞一般从供者的胰腺中分离，在促进中间阶段的胰腺干细胞生长的条件下培养分离胰腺的混合细胞群。
器官的获得从尸体的胰腺中分离胰腺细胞，该胰腺收集自多器官供者，59岁的男性白种人。器官收集由器官共享联合网(UNOS，United Network forOrgan Sharing)和当地的器官捐赠组织协调组织。
为了取出胰腺，首先在与肾动脉连接处的下面进行腹主动脉插管，通过下肠系膜静脉插管进行门静脉灌注(portal perfusion)，将该管向上插入到门静脉和脾静脉连接处的上面，在与门静脉的连接处的脾静脉上系上2-0结，同时在脾动脉上系上另一个2-0结。
结扎脾静脉，沿脾一侧切开血管，然后立即开始灌输。这种方法能使灌输更有效而不产生损伤胰岛的高压。这也能避免灌输液从脾和胰腺排出到肝中。更少的囊得到开放，并在胰腺上使用了生理盐水，在对主动脉进行了1升的灌注后，结扎脾动脉。
当肝和肾小组将脾静脉和下面的胃部血管切开时将胰腺很好地保护。沿十二指肠边缘分离胰腺，以减小损伤胰腺的风险，同时减小污染。
将器官保藏在充有UW溶液的塑料包中，放置在装有无菌生理盐水的Nalgene罐运输。
从供者的胰腺中分离人胰岛通过机械破碎和HBSS(1.5mg/ml)中溶解的消化酶(Liberase)消化裂解胰腺组织。将240ml Liberase溶液通过导管灌输到胰腺中，在800ml耐热烧杯中37℃孵育该器官，直到组织变软，大约要10-20分钟。
除去组织块中的主要导管，然后将其转移到金属裂解室中，开始自动循环分解。当在样品中出现游离胰岛时，收集200ml的裂解物，向系统中加入120ml(0.75mg/ml)新鲜Liberase溶液用于进一步消化。
在大多数胰岛从周围组织中释放出来后，收集裂解物，用培养液A10(溶于RPMI的10％ FBS)稀释，用A10冲洗细胞3次，4℃下以1,000rpm离心2分钟。
在如美国专利第5,739,033号中所述的PIPS(溶于UW溶液的Nycodenz(Nycomed AS，Norway))溶液中用三层密度梯度分离法从腺泡细胞中分离胰岛。
将冲洗过的胰腺细胞沉淀与320ml PIPS(密度为1.114)混合，在冰上孵育10分钟。在8个250ml的平底离心管中装入70ml PIPS(密度为1.090)，向每管的底部装入40ml的细胞/PIPS悬液，将60ml含有2％ FBS的RPMI装入到PIPS的上层，用带有05，ARC转头的Sorvall RC-3C Plus在1500rpm下不间断地离心6分钟。
分别收集最上层界面(413，400IEQ，纯度为67％)、较低层的界面(残余胰岛、胰岛碎片、腺泡和导管细胞的混合物)和沉淀(主要指腺泡和导管细胞)。
用培养液A10冲洗细胞超过两次，然后用于临床移植(75％)或扩增研究(25％)。
中间阶段胰腺干细胞的优化培养分离出胰岛后，立即将含有大约57％胰岛的细胞部分置于组织培养皿中培养以使其扩增，最初的培养物称作0代(p0)细胞。开始将细胞在由87％的无血清SM95和13％的含20％ FCS的培养液#7组成的混合培养液中培养，培养液组分列在本申请的IIIA2部分中。在第四天第一次更换培养液，将p0细胞转移到100％的无血清SM95培养液中。在整个培养过程中每星期更换培养液2次，漂浮的细胞与用完的培养液一起丢弃。
培养12天后，p0细胞达到融合状态，在培养皿的底部用胰蛋白酶/EDTA消化细胞约10分钟，然后用10％ FBS HBSS培养液冲洗，一分为二地将p0细胞接种到新的组织培养皿中，形成第1代(p1)细胞。在该次或后续的细胞传代中，细胞接种的密度为每平方厘米培养皿表面约12,000个细胞。
实施例2中间阶段胰腺干细胞的适应性培养作为成熟的预备步骤，中间阶段胰腺干细胞同时在条件性培养皿和新培养皿中生长。
p1细胞培养7天后接种，形成第2代(p2)细胞，将大约2/3的从p1收集的细胞接种到条件性细胞培养皿中，该条件性细胞培养皿曾用于培养过来自另一移植体HD386i的胰腺细胞。剩余的1/3的细胞接种到新的非条件性组织培养皿中。在条件性培养皿和新培养皿中的细胞都持续扩增。
培养p2细胞7天，估计第1和2代的细胞合起来扩增了大约10倍，收集新的和条件培养皿中的细胞并将其合并，将这些增生的细胞部分接种到新的组织培养皿中，形成培养的第3代(p3)细胞。将细胞的另一部分包被在藻酸盐-多聚赖氨酸微胶囊中，称之为包被的p3细胞。
实施例3来包被的在培养液中生长的p3细胞的特征将p3细胞种在新的培养皿上，让其在标准培养条件下在无血清SM95培养液中生长。与p1和p2细胞相比，该细胞的体外分析表明胰岛素和胰高血糖素mRNA以稳定水平表达。但是，培养液中的p3细胞以葡萄糖调节的方式高水平分泌胰岛素，这表明p3细胞具有正常的胰岛类功能。
胰岛素和胰高血糖素mRNA水平分析用PT-PCT测定由培养的P0、P2和P3细胞表达的胰岛素和胰高血糖素，用RNeasy mini试剂盒根据制造商的说明书分离RNA。简言之，向细胞中加入裂解缓冲液(每10cm的培养皿中加650μl)，用一次性细胞刮片(Fisher #087732)收集细胞，然后用QIAshredder(QIAGEN #79654)裂解。从裂解液中分离总RNA，然后利用RiboGreen RNA定量检测法(分子探针为#R-11490)进行定量。将RNA样品在-80℃下贮藏至cDNA分析。用Omniscript RT试剂盒(QIAGEN #205111)按照制造商的说明书使用20pmmol寡(dT)16逆转录每个样品，每个样品分两份(0.5μg每份)。然后用pH8.0的TE缓冲液将每个样品稀释到100μl，-20℃下保藏。在RocheMolecular LightCycler上进行实时PCR，使用2μl的各cDNA样品和指示引物。用杂交探针方法和DNA Master杂交混合试剂盒(Roche #2158825)按照制造商的说明书测定肌动蛋白和胰岛素。通过比较平行扩增的每种产品的标准曲线定量PCR产物。

测定培养的P0、P2和P3细胞表达的胰岛素和胰高血糖素，结果如表1所示。在这三种细胞的传代过程中，胰岛素和胰高血糖素mRNA稳定表达。
表1.HD394-P0～P3的胰岛素和胰高血糖素mRNA的表达

静态葡萄糖刺激(SGS，static glucose stimulation)测试培养细胞直到接近融合。在SGS测试三天前，用性质接近但不含胰岛素和仅含1g/L葡萄糖的培养液替换原培养液，每天更换培养液培养3天，在第4天进行SGS测试。
在测试前，收集培养液以进行葡萄糖和胰岛素分析，为了准备用于测试的细胞，用Dulbeco’s磷酸缓冲盐(DPBS)+0.5％ BSA冲洗细胞两次，每冲洗一次孵育5分钟，然后单独用DPBS冲洗一次，也孵育5分钟。冲洗后，用100ml(在100mm的培养皿中)或5ml(在60mm的培养皿中)含60mg/dl葡萄糖(KRB-60)的Krebs-Ringers SGS溶液在37℃下孵育细胞30分钟，重复该孵育。
为了进行SGS测试，用3ml(100mm培养皿)或4ml(T75烧瓶)或2ml(60mm培养皿)KRB-60在37℃下孵育细胞20分钟，吹起并转动培养液，收集培养液用于胰岛素测试作为LG-1(低葡萄糖刺激步骤)。然后加入同体积的KRB-450+theo(含450mg/ml葡萄糖的KRB和10mM茶碱)，在如上相同的条件下培养细胞。收集悬浮液用于胰岛素分析作为HG(高葡萄糖刺激)。再用KRB-60培养细胞，收集培养液作为LG-2。重复一次作为LG-3。收集用于胰岛素分析的培养液，贮藏在-20℃下直至用放射免疫检测(RIA)测定胰岛素的量。
SGS测试的结构通常表示为刺激指数，被定义为HG胰岛素值除以LG-1胰岛素值。一般地，认为SGS检测中刺激指数大于或约等于2是阳性结果。
表2显示了未包被培养的P3细胞的SGS测试结果。该细胞的基础胰岛素释放水平为149.5μU/60mm培养皿/小时，刺激的葡萄糖水平为781.6μU/60mm培养皿/小时，葡萄糖刺激的胰岛素释放增加了5.2倍。而且细胞在刺激后恢复到正常的、基础的胰岛素释放水平。因此，培养的P3细胞显示出了正常的胰岛类功能。
表2.未包被的HD394-P3胰岛的SGS测试结果

实施例4P3细胞的包被和聚集在高G藻酸盐和高M藻酸盐的混合物中包被约1.4×107个培养的P2细胞，从而形成包被的P3细胞。将P2细胞悬浮在3ml的1.4％的藻酸钠溶液中，然后通过喷头喷洒到0.33％的CaCl2·2H2O溶液中形成含有细胞且直径大约为700微米的藻酸盐凝胶球，将该凝胶球在0.33％的CaCl2·2H2O溶液中浸泡5-9分钟，然后在0.13％的CaCl2·2H2O溶液中浸泡8分钟，接着用0.1％的聚-L-赖氨酸处理凝胶球2分钟以形成膜而将细胞包被在内。然后用0.33％的CaCl2·2H2O溶液浸泡该胶囊1分钟，用盐冲洗胶囊，在0.2％的藻酸盐中浸泡10分钟，再用盐冲洗。将胶囊放入0.05％的多聚赖氨酸中浸泡5分钟，用盐冲洗。接着用55mM柠檬酸钠处理5分钟使胶囊里边的藻酸盐凝胶液化，用盐再一次冲洗后，用0.2％的藻酸盐处理胶囊10分钟，再用盐冲洗。为了完成包被，将胶囊在RPMI中浸泡8分钟。
24小时后，胶囊中的细胞开始聚集并形成胰岛类结构，在装有含0.03mM(30μM)CaCl2·2H2O和10％的胎牛血清的M4培养液的T75烧瓶中培养该包被的P3细胞，每星期更换培养液两次，体外保持该包被的细胞13天，然后用于移植。
实施例5包被、聚集的P3胰岛素生成细胞的表征包被24小时后，扩增的胰腺细胞聚集并显示出与直接从胰腺中分离的包被的胰岛相似的细胞结构，体内和体外检测证实包被扩增的胰腺细胞具有与体外发生改变的胰岛相似的功能。
在培养液中生长的包被、聚集的P3细胞的组织学用于免疫组织化学检测的细胞可以培养在小室中玻片上以进行显微观察。可选择地，在常规组织培养液中生长的细胞和包被的细胞可以通过手工从培养物中移出，包埋在石蜡中用于切片。按照Leonard J等，Mol.Endocrinol，1993，Oct 7，(10)1275-83的教导可以制备PDX-1抗体。
细胞分化标记是可变化的，可以用常规的免疫组织化学方法来检测。通常的可用方法如下。
移出小室中玻片时开始染色处理，在缓冲液中非常轻柔地漂洗细胞，在多聚甲醛溶液中固定。然后室温下在含有正常血清的封闭溶液中孵育细胞，用含非离子去污剂的封闭溶液使增加细胞通透性，一抗如下表所示，在封闭溶液中进行适当稀释制备这些抗体，将其加到细胞中孵育。在用一抗孵育后，用缓冲液漂洗细胞，再用封闭溶液封闭。
将用封闭溶液适当稀释而制备的二抗加到细胞中，黑暗条件下孵育，孵育后，漂洗细胞并用Hoechst染料重染色核，除去过量液体，用盖玻片盖住玻片。干燥玻片并将其保藏在黑暗中。
可选择地，可以使用ABC免疫组织化学方法制备细胞。简言之，将细胞包埋在石蜡中，37℃过夜染色含有石蜡切片的玻片。将细胞去石蜡化，浸泡在过氧化氢甲醇溶液中以抑制内源过氧化酶活性。将玻片在0.01的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸30分钟以修复特定抗原决定基。用缓冲液漂洗玻片，在湿盒中室温下正常血清封闭。
将封闭溶液制备的一抗加到样品中，在湿盒中孵育。冲洗玻片，与在封闭溶液中制备的二抗一起孵育，在用缓冲液漂洗，与商业试剂盒(如Dako Corporation)中的Avidin-House Reddish过氧化试剂或ABC复合体一起温浴。再漂洗玻片并用二氨基对二氨基联苯(diaminobenzidin)展开液及包裹在金中的尿素过氧化氢一起孵育。在用蒸馏水冲洗后，将玻片浸泡在Mayer’s Hematoxylin中5分钟，然后放在自来水中冲洗直到水无色，核变蓝。将玻片脱水并放置盖玻片用于观察。
表3通常使用的一抗及与其联合使用的二抗

为了组织学分析，针对CK-19、PDX-1和内分泌激素对微胶囊集落进行免疫染色，结果如表1A所示，CK-19染色显示了单层的CK-19阳性细胞，其与环绕在内部细胞团周围的基层上皮细胞相似。内部的细胞团显示出明显的胰岛素、生长激素抑制素和胰高血糖素着色(图1B-D)。因此，包被的P3集落的染色图案显示出了与重建的胰岛相似的细胞结构。包被的P3细胞聚集后在体外的功能包被的P3细胞集落在体外的功能通过SGS检测法来测定(表4)，该细胞的基础胰岛素释放水平为3.7μU/胶囊/小时，刺激的葡萄糖释放水平为2.3μU/胶囊/小时，该速率低于培养的P3细胞。这种弱化反应的原因是因为藻酸盐与胰岛素发生了结合。在细胞包被后，但在胰岛素结合藻酸盐的能力达到满意程度之前进行SGS测试，胰岛素与藻酸盐的结合通过胰岛素生成细胞周围的藻酸盐染色胰岛素的存在来显示。
表4、包被的HD394-P3胰岛的SGS测试

包被的P3细胞聚集后在体内的功能为了测定包被的P3集落在体内的功能，将包被的细胞移植到STZ诱导的糖尿病SCID小鼠中。通过单一的腹膜内注射链脲菌素(220mg/kg)使实验动物(SCID小鼠)患有糖尿病。一个星期内该动物出现高血糖(＞400mg/dl)。
为了移植包被的细胞，将动物的腹壁消毒，用1ml的注射器和14-号血管导管，将含有120,000个细胞的800个微胶囊在全身麻醉的情况下无菌地移植到上述糖尿病鼠的腹腔中。
移植后周期性地测量血液葡萄糖和体重。用肝素化的玻璃毛细管从任一眼眶中收集血液样品，离心毛细管，将血浆收集到eppendorf管中，用Beckman II葡萄糖分析仪测定葡萄糖水平。
图2显示了包被的P3细胞在体内的功能。移植后，受体鼠保持高水平葡萄糖18天。但是，在移植后第48天，受体鼠显示出正常的葡萄糖水平。在移植后第55天进行再一次测试证实了该正常的葡萄糖水平。
从受体鼠中回收上述移植的包被P3集落用于组织学分析，移植块和从网膜、肝和肾中收集的活组织切片用于组织学分析。图3A-F显示了两倍放大的回收集落的两个区域。免疫染色显示移植后在包被的P3集落中存在胰岛素生成细胞。环绕的藻酸盐也是胰岛素阳性，这显示了与藻酸盐结合的胰岛素(图3E)。
实施例6体外发生改变的胰岛包被后的特征为了对照，将P3胰腺细胞与直接分离自胰腺的胰岛细胞比较，该胰岛是糖尿病治疗的模式系统。该胰岛细胞从胰腺中分离后包被到藻酸盐微胶囊不久就产生可辨认的结构，将这种包被的胰岛细胞保持在培养液中并保留用胰岛素表达和SGS测试来确定的功能性胰岛活性。当移植到糖尿病大鼠中时该包被的岛细胞在体内也显示出功能。
体外重建胰岛的包被如上所述从供者的胰腺中分离人胰岛，其纯度在60％以上。在包被之前，新分离的岛细胞在装有含血清的M7培养液的非粘附性Fenwall袋中悬浮培养4-48小时。包被后，包被的岛细胞在培养液中培养到两年半。对包被的在培养液中培养6个月(HD302)和28个月(HD314)的胰岛的两个群进行了分析。
将胶囊固定并切片用于组织学分析，如上文所述。针对CK-19、PDX-1、内分泌激素和淀粉酶染色胶囊内的细胞(图4A-E是6个月的胰岛，图5A-E是28个月的胰岛)。
在原始和包被的胰岛中，CK-19细胞着色有明显的不同。原始胰岛中的CK-19阳性细胞着色很弱，不能识别出细胞的组织结构。相反，有一单层CK-19阳性细胞环绕在体外培养的岛周围。细胞结构上的不同表明从胰腺中分离并在体外培养后的胰岛已经发生重建。重建胰岛的CK-19阳性细胞的独特单层结构代表上皮基层。对内分泌激素进行染色表明胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素阳性细胞存在于被CK-19细胞环绕的内细胞群中。
CK-19阳性细胞大部分是PDX-1阳性，这表明其是胰腺的祖细胞，如B.Weir的报道(Bonner-Weir等.PNAS USA 977999-8004(2000))。该环绕的CK-19、PDX-1阳性细胞层随着时间的推移数量变少且着色减弱。
体外重建胰岛的包被及体外的功能在培养液中维持包被的胰岛9个月后，用静态葡萄糖刺激(SGS)测定法测定细胞在不同的葡萄糖水平时分泌胰岛素的能力以检测其体外功能。
每个微胶囊相当于0.75个胰岛单位(EQ)，结果如表5所示，SGS测试表明基本胰岛素释放水平为17nU/胰岛EQ/小时，刺激的葡萄糖水平为73nU/胰岛EQ/小时，刺激指数为4。
表5.对包被的HD357胰岛进行的移植前SGS测试，胰岛素输出(μU/ml)

体外重建胰岛的体内功能在培养液中培养9个月后，将其移植到STZ诱导的糖尿病裸鼠中检测包被胰岛在体内的功能(图6)。在大鼠1中，血液葡萄糖水平在移植后的两天内从移植前的495mg/dl降低到99mg/dl。在大鼠2中，血液葡萄糖水平在移植后的两天内从移植前的561mg/dl降低到79mg/dl。
移植后第35天对大鼠进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT)，将动物禁食过夜，或者约10-16小时。禁食后，抽取血液样品以进行血浆葡萄糖测定(样品0)。喂给动物1.75gm/kg葡萄糖P.O.(45％的溶液)，喂给后30分钟(样品1)、1小时(样品2)、90分钟(样品3)和2小时(样品4)收集血液样品。通过尾静脉穿刺获得血液样品，用肝素花毛细管来收集血液和分离血浆。用Beckman II葡萄糖分析仪测定血糖，在移植后第35天，对正常和接近正常的移植鼠进行OGTT，为进行比较，正常值如表6所示。
表6.口服葡萄糖耐受性测试的标准值

在移植后第59天，大鼠1死于眼部感染，在第118天，从大鼠2移出50％的包被胰岛块，不久，该动物的血糖水平开始出现波动，在移出胰岛块43天后，血糖水平增加到300mg/dl。在移出胰岛块93天后，血糖水平是403mg/dl。
最近研究的结果进一步证实了前述的临床前和临床研究直接从胰腺中分离的包被的胰岛在体内和体外都具有功能。
实施例7人胰腺原始胰岛的特征为了比较，分析胰岛以测定CK-19和PDX-1阳性细胞的位置和结构，在胰腺组织中没有发现与CK-19和PDX-1阳性细胞有关的可识别结构。
供者胰岛的组织表征在修整用于分离胰岛的供者胰腺的同时采集该供者胰腺组织样品，处理样品用于组织学鉴定，针对CK-19、PDX-1、内分泌激素和淀粉酶对原始胰岛和其周围的胰腺组织进行免疫染色(图8A-F)。
CK-9染色表明，CK-19阳性细胞分散在整个胰腺中，如同预料的一样它们位于胰腺的导管中。在胰岛的内部是弱着色的CK-19阳性细胞，但没有可识别的组织结构。PDX-1染色表现出胰岛内许多PDX-1阳性细胞的核染色图案。在CK-19和PDX-1阳性细胞之间没有发现直接的重迭染色，内分泌激素和淀粉酶表现出典型的标准细胞染色图案。
可以理解本申请所描述的实施例和实施方案式仅仅是为了说明的目的，本领域所属技术人员可对其做出的各种修饰或改变，而这种修饰或改变包含在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围之内。本申请所引用的所有出版物、专利和专利申请在此将其全文引为参考。
序列表SEQUENCE LISTINGCCTCGCCTTTGCCGATCCSeq.ID No.1GCCATCAAGCACATCACTGT Seq.ID No.2AGCCACACGCAGCTCATTGTAGA Seq.ID No.3AGAGGGAGCAGATGCTGGTA Seq.ID No.4CCCATCGAGCACGGCATCGTCACCAASeq.ID No.5CAGCCTGCAGCCCTTGGCC Seq.ID No.6TGGGACGACATGGAGAAAATCTGGCACCACSeq.ID No.7TGGAGGGGTCCCTGCAGAAG Seq.ID No.8
权利要求
1.原位向哺乳动物提供胰岛素的方法，所述方法包括(a)包被用于繁殖胰腺细胞的细胞培养物，所述的细胞培养物具有如下属性(i)具有能够以约180个细胞/平方厘米的初始浓度从一个培养容器传代到另一个容器并扩增到约1800个细胞/平方厘米的能力，及(ii)在扩增和未扩增的细胞中90％是PDX-1阳性，且胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率为1∶100～1000∶1；(b)将所述包被的细胞插入到哺乳动物中以使所述细胞成熟成胰岛素分泌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞成熟成细胞集落。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞成熟成细胞集落，所述集落包括由CK-19阳性细胞形成的包被覆盖层和由50-5000个胰腺细胞形成的内细胞团，其直径为50-300微米。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物是糖尿病人。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物的胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率为1∶10～100∶1。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述包被步骤包括用藻酸盐包裹细胞以形成胶囊，用二价阳离子交联藻酸盐，及提供多聚赖氨酸膜密封所述胶囊。
7.一种含有包被的胰腺细胞的组合物，所述包被的胰腺细胞具有如下属性(i)具有能够以约180细胞/平方厘米的初始浓度从一个培养容器传代到另一个容器并扩增到约1800个细胞/平方厘米的能力，及(ii)在扩增和未扩增的细胞中90％是PDX-1阳性，且胰岛素∶肌动蛋白mRNA比率为1∶100～1000∶1。
全文摘要
本发明涉及到发现存在的中间的、分化阶段的胰腺干细胞，该干细胞能在原位成熟成稳定的细胞系，该细胞系可产生葡萄糖反应性的胰岛素。这些细胞的价值在于它们在培养过程中既能扩增而且稳定。本发明避免了将中间阶段的干细胞培养成末期阶段的胰腺细胞的步骤。
文档编号A61K47/36GK1620251SQ02828230
公开日2005年5月25日 申请日期2002年12月23日 优先权日2001年12月21日
发明者臧文治, 郑天立, 王燕萍 申请人:艾姆赛特有限公司