淀粉样β肽的特异性抗体、其药物组合物及其应用方法

文档序号:892393阅读:520来源:国知局
专利名称:淀粉样β肽的特异性抗体、其药物组合物及其应用方法
技术领域
本发明涉及治疗患有阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease)的患者的方法,包含施用靶向淀粉样β肽或其片段的抗体分子的步骤。在另一个实施方案中,本发明涉及一种治疗以淀粉样蛋白β沉积为特点的疾病或紊乱的方法。在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体分子,其对于淀粉样β肽的N端或C端的游离端具有特异性,并涉及它的一种药物组合物。
背景技术
阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease,AD)的一个主要的组织病理学特征是在杏仁核、海马和新皮层的实质的神经炎性和弥散性蚀斑(plaque)中存在淀粉样蛋白沉淀(Glenner和Wong,1984;Masters et al.,1985;Sisodia和Price,1995)。淀粉样蛋白(Amyloid)是一个一般性的名词,用来描述具有共同的β-褶状(β-pleated)结构的纤维状聚集体。这些聚集体在刚果红和偏振光的存在下表现出双折射的性质(Glemer和Wong,1984)。弥散性蚀斑被认为比神经炎性蚀斑相对良性,后者表现出与反应性和退化性过程强烈相关(Dickson et al.,1988;Tagliavini et al.,1988;Yamaguchi et al.,1989;Yamaguchi et al.,1992)。神经炎性蚀斑的一种主要的成分是含有42个氨基酸残基的淀粉样β(Aβ)肽(Miller et al.,1993;Roher et al.,1993),其是从较大的β淀粉样蛋白前体蛋白-βAPP(或APP)衍生的(Kang et al.,1987)。Aβ1-42产生的量大大少于1-40Aβ肽(Haass et al.,1992;Seubert et al.,1992),但是Aβ1-42的优先沉积源于这种COOH延伸的形式比1-40Aβ更加难溶解,且更易于沉积形成反平行的β-褶状折叠(Joachim et al.,1989;Halverson et al.,1990;Barrow et al.,1992;Burdick et al.,1992;Fabian et al.,1994)。Aβ1-42能够促进Aβ1-40的聚集。
APP基因已被测序并发现被编码定位在染色体21上(Kang et al.,1987)。APP基因的表达产生了几种包含Aβ的有695、751和770个氨基酸的同工型,后两个APP包含一个同Kunitz蛋白酶抑制剂具有结构和功能同源性的结构域(Kang et al.,1987;Kitaguchi et al.,1988;Ponte et al.,1988;Tanzi et al.,1988;Konig et al.,1992)。尽管有越来越多的证据表明APP在介导神经元的粘附和生长(Schubert et al.,1989;Saitoh et al.,1994;Roch,1995)以及可能在G蛋白偶联的信号转导途径中发挥着作用(Nishimoto et al.,1993),但APP在神经系统的功能仍有待于定义。在培养的细胞中,APP通过固有分泌途径成熟(Weidemann et al.,1989;Haasset al.,1992;Sisodia 1992),一些细胞表面结合的APP通过一种酶,叫做α-分泌酶(secretase)(Esch et al.,1990),在Aβ结构域内被切割,这一事件阻止Aβ淀粉样蛋白产生(Amyloidogenesis)。一些研究描述了另外两条产生Aβ淀粉样蛋白的加工APP的途径第一条是内体的(endosomal)/溶酶体的途径,产生了一种APP相关的膜包裹的片段复杂系列,其中一些含有完整的Aβ序列(Haass et al.,1992;Golde et al.,1992);第二条是Aβ1-40通过并未完全了解的机制被分泌到条件培养基中并存在于体内的脑脊髓液中(Haass et al.,1992;Seuber te al.,1992;Shoji et al.,1992;Busciglioet al.,1993)。溶酶体的降解不再被认为对Aβ的产生有显著的贡献(Sisodia和Price,1995)。在Aβ的NH2和COOH端的切割负责的蛋白水解酶分别被称为β(BACE)和γ分泌酶。直到最近,Aβ被广泛的认为是通过其前体的异常代谢产生的。然而,Aβ在许多种培养细胞条件培养基以及在人类脑脊髓液中的存在暗示Aβ是作为细胞的正常功能产生的。
研究人员的主要焦点和与AD药物开发相关的研究者的主要目的是降低Aβ在中枢神经系统(CNS)的沉积。这些研究可以分为几个主要的方面影响Aβ产生的因素,Aβ的清除,以及预防不溶性Aβ纤维形成。另外一个治疗的目的是减低Aβ神经毒性所引发的炎症反应。
由于神经毒性表现为与Aβ的β-褶状聚集体相关,一种治疗的方法是抑制或延迟Aβ的聚集。该方法的优点是引发Aβ过量产生或Aβ在细胞内诱发的效果的机制不需要被完全理解。能够结合Aβ的各种物质能够在体外抑制Aβ的神经毒性,例如,结合Aβ的染料刚果红能够在培养的神经元中完全抑制Aβ诱导的毒性(Yankner et al.,1995)。同样地,抗生素利福平也可以防止Aβ的聚集及随后的神经毒性(Tomiyama et al.,1994)。其它正在开发的一些化合物可作为这个过程的抑制剂,或通过直接结合Aβ,例如溴化十六烷基-N-甲基哌啶鎓(hexadecyl-N-methylpiperidinium(HMP)bromide)(Wood et al.,1996);或通过防止Aβ与其它有助于形成Aβ沉积的分子的相互作用。一个这样的分子的例子是硫酸乙酰肝素或乙酰肝素蛋白聚糖,基底膜聚糖,其已经在所有的淀粉样蛋白中被鉴定并被暗示存在于淀粉样蛋白诱发相关的炎症反应的早期。
硫酸乙酰肝素与Aβ相互作用,并赋予其特征性的二级和三级淀粉样蛋白的结构特征。最近,小分子的阴离子硫酸盐被示为能与该反应相互作用以防止或阻止(arrest)淀粉样蛋白形成(Kisilevsky,1999),尽管这些化合物能否进入CNS并不明显。基于基底膜聚糖结合域序列的一种肽表现为能够抑制Aβ和基底膜聚糖的相互作用,具有抑制自我聚合的能力的Aβ衍生肽被研究作为一种潜在的先导化合物来开发对AD的治疗性的方法。然而,这些化合物在体内的作用可能因为许多种原因是适中的,最显著的需要是对于血脑屏障的慢性渗透。
基于多肽的治疗方法的一个选择是用来解释Aβ的神经毒性的细胞内作用机制并开发以这些细胞内靶为目标的治疗方法。焦点已经集中在自由基介导的神经元损伤的钙离子功能紊乱的调控上。假设Aβ结合到细胞表面的RAGE(晚期糖基化终末产物的受体),进而引起能够产生细胞毒性的氧化刺激物的反应(Yan et al.,1996)。阻断Aβ与细胞表面结合位点的通路可以延迟AD中神经元损伤的进行。到目前为止,还没有发现阻断Aβ诱导的神经毒性的特异的药理学物质。
发明简述本发明涉及治疗患有阿尔茨海默氏症或以β淀粉样蛋白沉积为特征的疾病(disease)或紊乱(disorder)的患者的方法,包含施用靶向β淀粉样肽或其片段的抗体分子的步骤。在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体分子,其对于一种淀粉样蛋白的N端或C端的游离端具有特异性,并涉及一种包含该抗体分子的药物组合物。在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体分子,其靶向N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离C或N端,并涉及一种包含该抗体分子的药物组合物。
在一个实施方案中,本发明涉及一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种治疗患有阿尔茨海默氏症的患者的药物中的用途。
在一个实施方案中,本发明涉及一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种治疗患有以淀粉样蛋白沉积为特征的疾病或紊乱的患者的药物中的用途。这种紊乱的例子包括轻度认知损害(MCI),淀粉样脑血管病变,congiophylic血管病,唐氏综合征相关的阿尔茨海默氏症和包涵体肌炎(inclusion-body myositis)。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种用于延迟(delaying)、抑制(inhibiting)或压制(suppressing)淀粉样β肽或其片段在脑中积聚的药物中的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种用于延迟、抑制或压制淀粉样β肽或其片段的神经毒性的药物中的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体,其对游离端具有特异性,并靶向淀粉样β肽的游离N端。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向淀粉样β肽的游离N端,其中淀粉样β肽的游离N端的第一个氨基酸是天冬氨酸。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离N端。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向淀粉样β肽Aβ1-39,Aβ1-40,Aβ1-41或Aβ1-43的游离C端。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离C端。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种单链抗体,其对游离端具有特异性并靶向淀粉样β肽Aβ1-42的游离C端。
附图简述

图1示出了淀粉样前体蛋白(APP)和α,β,γ-分泌酶切割产物的示意图。各种结构域和分泌酶切割位点(α,β,γ)的定位同时指明。
图2示出了βAPP区域的氨基酸序列(SEQ ID NO1)及其衍生的β淀粉样肽(Aβ)。箭头指出α,β,γ-分泌酶的切割位点。可以用作免疫原的合成肽对应的氨基酸残基由序列下面的线段指明。
图3A-3D用示意图示出了一个完整抗体(图3A)以及可变结构域重链(VH)和轻链(VL)、轻(CL)和重(CH1 CH2,CH3)链的恒定域的结构,Fab片段(图3B)、Fv片段(图3C)和单链Fv片段(scFv)(图3D)。图3B所示的Fab片段由一个重链VH和轻链VL的可变结构域通过二硫桥和第一个恒定结构域(CH1和CL)相接。图3C中所示的Fv片段代表了由非共价键连接的可变区复合物(VH-VL)形成的一种抗体的抗原结合部分,图3D中所示的单链Fv应用可变链VL通过肽连接和可变重链VH相接。
图4A-C图4A示出了淀粉样前体蛋白(APP)的示意代表图及其功能域;图4B是Aβ肽及它N端序列的放大图,给出了A肽和C肽衍生的位置。图4C是APP序列和实验肽A和C的单个字母的氨基酸代码。
图5给出了表位特异性抗体的产生。在一个标准的ELISA试验中,样品1与免疫原(肽A)特异的结合可以被同一个肽所抑制,也可被Aβ1-40肽和跨越前体分子APP内Aβ的切割位点的肽C所抑制。
图6示出了表位特异性的游离端抗体的产生。在一个标准的ELISA试验中,样品2与免疫原(肽A)特异的结合可以被同一个肽所抑制,但不能被跨越前体分子APP内Aβ的切割位点的肽C所抑制。
图7和图8示出了表位特异性的游离端杂交瘤细胞的产生。克隆4D12和2A10是杂交瘤细胞的两个样品,它们识别阳性对照的致免疫肽比识别阴性对照的跨越肽强的多。
发明详述在一个实施方案中,本发明涉及一种治疗患有阿尔茨海默氏症的患者的方法,包含施用靶向β淀粉样肽或其片段的抗体分子的步骤,由此治疗患有阿尔茨海默氏症的患者。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种治疗以β淀粉样蛋白沉积为特征的疾病或紊乱的患者的方法,包含施用靶向β淀粉样肽或其片段的抗体分子的步骤,由此治疗以β淀粉样蛋白沉积为特征的疾病或紊乱。
其它的以β淀粉样蛋白沉积为特征的疾病或紊乱是,例如但不限于,轻度认知损害(MCI),淀粉样脑血管病变,congiophylic血管病,唐氏综合征相关的阿尔茨海默氏症和包涵体肌炎。
术语“淀粉样蛋白β”或“Aβ”或“β淀粉样蛋白”在文中是指β淀粉样蛋白中的任何一种,各种表述方式之间可以互相替换。这种蛋白典型地是大约4kDa。在对来自阿尔茨海默氏症的组织和培养的细胞的淀粉样β肽鉴定的基础上观察到几种不同的氨基端和异源的羧基端序列。(Glemer和Wong(1984)Biochem Biophys Res Commun 120885-890;loaclim et al.,(1988)Brain Res 474100-111;Prelli et al.,(1988)JNeurochem 51648-651;Mori et al.,(1992)J Biol Chem 26717082-17806;Seubert et al.(1992)Nature 359325-327;Naslund et al.(1994)Proc NatlAcad Sci USA 918378-8382;Roher et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 9010836-10840;Busciglio et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 902092-2096;Haass et al.(1992)Nature 359322-325)。特别地,对于羧基端,淀粉样β肽被示出是在39,40,41,42,43,或44位结束,位置1如Glenner和Wong(1984)Biochem Biophys Res Commun 120885-890所定义的淀粉样蛋白β序列,是天冬氨酸。
尽管认识到全长Aβ肽的显著作用,本发明并不只限于这些形式。因此,尽管全长Aβ肽作为主要的治疗靶点是非常重要的,本发明也注意使用对具有神经毒性和/或能形成纤维状沉积的Aβ衍生片段的游离端具有特异性的抗体。重要的是,能够识别N或C端截短的Aβ肽类的游离端的特异性抗体不能和它们所衍生的淀粉样前体蛋白起作用。
术语“淀粉样蛋白β片段”或“异源淀粉样蛋白β”或“截短的淀粉样蛋白β”是指衍生在如上定义的全长淀粉样β肽的片段,各种表述方式之间可以互相替换。生物化学研究证明在位置1除了是L-天冬氨酸外,Aβ肽也可以以外消旋的或异构化的天冬氨酸开始。重要的N端截短的Aβ同工型在3位开始于环化的天冬氨酸(焦谷氨酸)残基,在11位是焦谷氨酸,在17位是亮氨酸(Geddes et al 1999)。对这些同工型导致阿尔茨海默氏症的发病的事实的支持是基于这样的研究1)证实N端截短的形式更容易聚集,在体内比Aβ1-40或Aβ1-42毒性更强(Pike et al.1995);2)N端截短的形式是在蚀斑中检测到的最早的同工型之一,并且可以对蚀斑的形成形成病灶(Theo et al 1995)。例如Aβ17-42(p3肽),在AD的脑中普遍存在,但在老化的非AD的脑中是缺失或稀少的(Higgins et al.1996)。利用高效反向液相色谱和质谱对AD的研究证实总是存在另外的N端截短的形式,包括Aβn-42(n=1-11)和Aβ3-40(Larner 1999)。在各种各样培养的细胞以及转染了不同的APP构建体的细胞系所分泌的Aβ的研究已经鉴定Aβ类开始于位置2,3,4,5,6,9,11,16,17,18,19,20,24(Busciglio et al 1993,Haas et al 1992,Haas et al 1994)。“非淀粉样蛋白产生的(nonamyloidogenic)”p3片段(淀粉样蛋白β)是唐氏综合症小脑的前淀粉样蛋白(preamyloid)的主要组分(Lalowski M et al.,J BiolChem 1996 Dec 27;271(52)33623-3)。去除这种主要形式或限制它的神经毒性,能够如预料的减缓唐氏综合症相关的阿尔茨海默氏症并延迟其在意感个体的发作。因此,本发明的抗体在一个实施方案中是针对淀粉样β肽的N或C端,以及在一个实施方案中是针对淀粉样β肽衍生的任何片段的N或C端。
“抗体”的意思是免疫球蛋白,能够结合抗原。文中所用的抗体意指能够结合感兴趣的表位、抗原或抗原片段的整个抗体以及任一抗体片段(如F(ab′)2,Fab′,Fab,Fv)。在一个实施方案中,本发明的抗体是单克隆抗体,人源化的抗体,嵌合抗体,双特异性抗体,scFv抗体,或F(ab)抗体,或它们的片段。
文中术语“单克隆抗体”是指免疫学有效的片段和单链形式。
上文中术语“人源化抗体”是指小鼠或其它非人抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体框架上。这里人抗体框架是指除了CDR外的整个人抗体。
上文中的术语“嵌合抗体”是指小鼠或大鼠抗体的可变区同人的恒定区一同表达的抗体。
上文中的术语“人工抗体”指如美国专利US Pat No.5,630,978使用分子拓印(molecular imprinting)技术制得的抗体。简单的说,人工抗体的制备方法如下所述(i)在生物活性分子,在此是淀粉样β肽或其片段的周围聚合功能性单体(模板);(ii)去除模板分子;然后(iii)在模板的空的左边聚合第二层单体,以提供一种表现出与模板类似的一种或多种期望性质的新的有机分子。因此,在一个实施方案中,本发明涉及能够选择性识别淀粉样β肽及其片段的并作为抗体的分子拓印聚合物(MIP)的人工抗体,以及它们在治疗阿尔茨海默氏症和其它以β淀粉样蛋白沉积为特征的疾病中的应用。
文中的术语“治疗”是指延迟或防止发病,减缓进程,或改善阿尔茨海默氏症或其它以β淀粉样蛋白沉积为特征的疾病相关的症状。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种延迟、抑制或压制淀粉样β肽或其片段在脑中积聚的方法,包括施用靶向淀粉样β肽或其片段的抗体的步骤,由此延迟、抑制或压制淀粉样β肽或其片段在脑中积聚。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种延迟、抑制或压制淀粉样β肽或其片段的神经毒性的方法,包括施用靶向淀粉样β肽或其片段的抗体的步骤,由此延迟、抑制或压制淀粉样β肽或其片段的神经毒性。
因此,本发明涉及使用淀粉样β肽的抗体作为一种方法来选择性抑制淀粉样β肽类的积聚和/或中和它们相关的细胞毒性。应用具有末端特异性的抗体来治疗阿尔茨海默氏症的最有效的靶点可能是Aβ1-40,它是形成循环的淀粉样β肽的大部分(人的CSF,血浆和尿),或者是毒性更强但量更少的Aβ1-42和Aβ1-43类,它们能够引发淀粉样蛋白沉积。神经炎性蚀斑和血管中的淀粉样蛋白沉积包含大量的这些形式,对人的组织和转基因小鼠的模型,从遗传学和生化分子中得出的一致意见是全长形式的淀粉样β肽在阿尔茨海默氏症的发病机制中扮演者最重要的角色。
抗体或包含该抗体的药物组合物将会被施用到外周,或者一种包含抗原的药物组合物用来引起这些抗体的产生,或者在另一实施方案中,本发明的抗体可以通过颅内注射直接加入脑中。
在一个实施方案中,本发明的抗体会穿过血脑屏障,并将与淀粉样β蛋白或片段在脑中形成一种复合物。
在一个实施方案中,本发明涉及用抗体的外周施用来治疗中枢神经系统(CNS)的方法。在癫痫的治疗中使用的IV Ig的有效性由Engelen BG等进行评价(J.Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 Nov 57 Supp 21-5)。这些作者对于癫痫病人在IV Ig治疗前后脑脊液中IgG的浓度的研究的结论是IV Ig制剂的主要成分穿过了血液的CSF屏障并且显著提高了CSF IgG的浓度,并可以到达脑中在中枢系统作用。
中枢神经系统中IgG的存在由免疫细胞化学所证实,并发现该蛋白的分布与血脑屏障之间有紧密的解剖学的关系。通过使用IgG及其亚类的单克隆和多克隆抗体,IgG被免疫定位于正常大鼠的脑中。
静脉内的免疫球蛋白通过CNS及与之的相互作用在Wurster等的综述中得到总结(J.Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 Nov 57 Supp21-5)。
在一个实施方案中,本发明的抗体通过使用方法或载体通过血脑屏障(BBB)渗透进入大脑细胞,该方法或载体的细节如下所述优选的加入配方以提高抗体溶解度的化合物是环糊精的衍生物,优选的是羟基丙基-γ-环糊精。含有环糊精衍生物的以转运多肽到中枢神经系统的药物转运赋形剂已在Bodor,N.,et al.(1992)Science 2571698-1700中描述。
因此,本发明的抗体和环糊精衍生物联合使用与单独使用调制剂(modulator)相比可对β淀粉样蛋白的神经毒性产生更大的抑制作用。环糊精的化学修饰在本领域内是已知的(Hanessian,S.,et al.(1995)J.Org.Chem.604786-4797)。除了在含有本发明的调制剂的药物组合物中作为添加剂使用外,环糊精的衍生物也可以用作修饰基团,并且因此也可以共价偶联到对游离端具有特异性的β淀粉样蛋白抗体上形成本发明的一种调制剂化合物。
Low等在美国专利5,108,921中综述了通过受体介导的胞吞活性机制进行跨膜转运如蛋白和核酸等分子的可行方法。这些受体系统包括那些识别半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)、运钴胺素蛋白(维生素B12)、α-2巨球蛋白、胰岛素和其它的肽生长因子如表皮生长因子(EGF)。Low等也认识到营养素的受体,如生物素和叶酸的受体,由于生物素和叶酸的受体在大多数细胞膜的表面的定位和多重性,并且相关受体介导跨膜转运的过程,因此可以方便的用来提高跨细胞膜的转运。因此,一个在要转入细胞质的化合物和如生物素或叶酸的配体之间形成的复合物引发了受体介导的跨细胞膜转运机制并因此使得所要转运的化合物进入细胞。
一个生物素配体可以被结合到一个DM分子上,例如,通过引入商品化的生物素化的三磷酸脱氧核苷酸,如购自Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA的使用末端脱氧核苷酸转移酶所做的生物素-14-MTP或生物素-14-dCTP(Karger,B.D.,1989)。生物素-14-dATP是一个在嘌呤碱基的6位通过14个原子的连接体(linker)结合生物素的MTP类似物,生物素-14-dCTP是一个在嘧啶碱基的N4位也通过14个原子的连接体结合生物素的dCTP类似物。
在一个实施方案中,本发明的抗体可以通过脂质体转运,其在科学文献和专利申请中广泛应用。
在另一个提高通过BBB的转运的方法中,一种多肽的或多肽模拟物的调制剂被结合到第二个多肽或蛋白上,因而形成了一种嵌合蛋白,其中第二种多肽或蛋白通过吸收剂介导的或受体介导的通过BBB的胞转作用。因此,通过将调制剂偶联到第二种多肽或蛋白上,嵌合蛋白可以通过BBB而进行转运。第二种多肽或蛋白可以是一种脑毛细管内皮细胞受体的配体。例如,一种优选的配体是能够特异结合到脑毛细管内皮细胞的转铁蛋白受体上的单克隆抗体(参见如美国专利No.5,182,107和5,154,924以及PCT出版物WO 93/10819和WO 95/02421,这些均由Friden等申请)。其它适合的通过BBB介导转运的多肽或蛋白包括组蛋白(参见如Pardridge和Schimmel等,美国专利No.4,902,505)和配体,如生物素、叶酸、烟酸、泛酸、核黄素、硫胺、pryridoxal和抗坏血酸(参见如美国专利No.5,416,016和5,108,921,二者均由Heinstein申请)。另外,葡萄糖的转运蛋白GLUT-1已被报道能转运糖肽(L-丝氨酸-β-D-葡糖苷[Met5]脑啡肽类似物)穿过BBB(Polt,R.et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 917114-1778)。因此,一种调制剂化合物可以偶联到这样的糖肽上,以靶向该调制剂到GLUT-1葡萄糖转运蛋白上。例如,一种在氨基端用修饰基团Aic(3-(O-aminoethyl-iso)-cholyl,一种有自由氨基基团的胆酸的衍生物)修饰的调制剂化合物能够用标准方法通过Aic的氨基基团偶联到糖肽上。嵌合蛋白可以通过重组DNA的方法形成(如通过编码融合蛋白的嵌合基因形成),或通过化学连接将调制剂连接到第二个多肽或蛋白上以形成嵌合蛋白。许多化学交联剂是已知的(如来自Pierce,Rockford III,是商品化的)。选择一种交联剂需使得调制剂偶联到第二种多肽或蛋白有高的收益,而且随后使得连接体切割以释放出生物活性的调制剂。例如,可以使用以生物素-抗生物素蛋白为基础的连接体系统。
在另一个为提高通过BBB的转运的实施方案中,调制剂被包裹在一种可以介导通过BBB转运的载体介质中,例如,将调制剂包裹在脂质体中,如正电荷单层脂质体(参见如PCT出版物WO 88/07851和WO88/07852,二者均由Faden申请)或聚合微球(参见Khan等,美国专利No.5,413,797,Mathiowitz等,美国专利No.5,271,961和Gombotz等,5,019,400)。而且,载体介质可以被修饰使之靶向地穿过BBB转运。例如,载体介质(如脂质体)可以用活性转运穿过BBB的分子或用一种脑内皮细胞受体的配体,如能特异性结合转铁蛋白受体的单克隆抗体,共价修饰(参见如Collins等,PCT出版物WO 91/04014和Greig等WO94/02178)。
本发明的抗体可以按配方制备成一种药物组合物,其中抗体是唯一的活性化合物,或者,药物组合物也可以包含其它的活性化合物。例如,两种或更多的抗体化合物可以联合使用。而且,本发明的抗体可以和一种或更多的其他的具有抗淀粉样蛋白产生性质的物质组合。例如,抗体可以和非特异性的胆碱脂酶抑制剂他克林(tacrine)(COGNEX.RTM.,Parke-Davis)。
本发明也预期其它的可以可以时时开发的方法。
一旦转运进入脑中,特异性的抗体分子将会被转移进入细胞外的空间、间隙液和脑脊髓液中。然后特异性的抗体分子将会与Aβ肽形成可溶性的复合物。在一个实施方案中,这些可溶性的特异的Aβ肽-抗体复合物会降低Aβ肽在淀粉样蚀斑内的沉积,通过从中枢神经系统中清除Aβ肽削弱其诱导的神经毒性,Aβ肽会从细胞外空间、间隙液和脑脊髓液排泄到常规的血液循环中,并在此被蛋白酶消化清除。因此,对淀粉样蛋白沉积负责的新分泌的可溶性Aβ肽的聚集以及Aβ诱导的神经毒性会被抑制。
进而,根据本发明的可溶性淀粉样β肽的清除预期可以降低在阿尔茨海默氏症中所观察到的炎症反应过程,这可以通过抑制如淀粉样β诱导的补体激活和细胞因子释放以及阻断Aβ和细胞表面受体如RAGE受体相互作用来实现。
在另一个实施方案中,一旦本发明的抗体结合到淀粉样β肽上,它们就会引起细胞免疫反应(即,通过激活Fc受体)。Fc受体能够区别一个结合到抗原上的抗体和一个游离抗体。结果是Fc受体将会使得通常不能识别靶抗原的佐细胞去靶向和吞噬淀粉样β肽。在这种情况下,对抗原和抗体之间的化学计量的关系的需求可被消除。结果是只需要更少的游离末端的抗体来渗透过BBB并清除淀粉样β肽。
在另一个实施方案中,本发明的抗体的加入将会降低Aβ与APOE4基因产物之间的相互作用。
在一个实施方案中,抗体或包含抗体的药物组合物会阻断外周的Aβ肽进入CNS,进而降低淀粉样蚀斑在脑中的沉积。
在另一个实施方案中,药物组合物和本发明的抗体会通过外周效应延迟阿尔茨海默氏症的发作和抑制或压制其进程。从外周清除或去除淀粉样蛋白β会改变血液中的淀粉样蛋白β的平衡,并在脑中产生类似的结果。最近的研究表明淀粉样蛋白β能够从脑脊髓液中转运到血浆中,其脑清除的半衰期大约是一个小时。因此,抗体能够影响血浆中淀粉样蛋白β的水平,导致中枢的淀粉样蛋白β在血浆中的聚集,结果使得淀粉样蛋白β在脑中的降低。
在一个实施方案中,本发明提供了一种抗体分子,其对淀粉样β肽和/或其片段的N端或C端的游离端具有特异性,其能够区别Aβ肽和淀粉样蛋白前体。术语“对游离端具有特异性”意思是指能够特异性结合到Aβ肽或其片段的游离端/末端的分子,其能够减缓或防止淀粉样β肽在细胞外空间、细胞间隙液和脑脊髓液中的聚集,并阻断Aβ肽和其它的有助于Aβ的神经毒性的分子的相互作用。
没有限制之意,检测的方法提供了一种抗体分子,其对淀粉样β肽和/或其片段的N端或C端的游离端具有特异性,也就是“跨越肽的ELISA的检测方法”,过程如下结合淀粉样β肽N端区域序列,(例如肽A残基1-5或Asp-Ala-Glu-Phe-Arg;见图4),同时能够结合与淀粉样前体蛋白(APP)的序列对应的跨越肽C中的一致的氨基酸序列的抗体,在筛选中被清除。只有能够结合拥有游离N端的(NH2)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(例如,全长Aβ1-40的七聚体肽),但不能结合跨越肽的抗体,从检测系统中被选择。这些选择的抗体被描述为“对游离的N末端具有特异性”,是因为它们的结合表位除了识别特别的淀粉样β肽N端氨基酸残基,并插入到游离氨基(NH2)基团高亲和力的识别片段中。设想了一个类似的选择对C末端具有特异性的抗体的检测系统,其使用相应于APP中C端切割位点的两边的持续的氨基酸序列的跨越肽。对游离端具有特异性抗体需要有高度的敏感性,以致于不影响跨膜受体类似的APP分子的正常生物功能,这些分子已经涉及几种重要的生理学功能(如介导粘附、促生长效应、神经保护、神经炎性赘疣、突触囊泡的循环、丝氨酸蛋白酶的凋亡抑制的调节、受体和信号转导功能、钙代谢和核酸转录)。因此,在一个实施方案中,本发明应用对游离端具有特异性的抗体去抑制淀粉样β肽的聚集,去改善或防止淀粉样蛋白沉积的神经毒性作用,去减缓阿尔茨海默氏症或以淀粉样β肽沉积过程为特点的其他疾病或延迟它们的发作。
在另一个实施方案中,本发明涉及对游离端具有特异性的抗体并且靶向淀粉样β肽的游离N端。在另一个实施方案中,本发明涉及对游离末端具有特异性的抗体并且靶向淀粉样β肽的游离N端,其中淀粉样β肽游离N端的第一个氨基酸是天冬氨酸。
在另一个实施方案中,本发明涉及对游离末端具有特异性的抗体并且靶向N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离N端。
在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体对于N端截短的淀粉样β肽的除游离氨基(NH2)基团外的氨基酸1-3是特异性的。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体对于N端截短的淀粉样β肽的除游离氨基(NH2)基团外的氨基酸1-4是特异性的。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体对于N端截短的淀粉样β肽的除游离氨基(NH2)基团外的氨基酸1-5是特异性的。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体对于N端截短的淀粉样β肽的除游离氨基(NH2)基团外的氨基酸1-6是特异性的。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体对于N端截短的淀粉样β肽的除游离氨基(NH2)基团外的氨基酸1-7是特异性的。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体对于N端截短的淀粉样β肽的除游离氨基(NH2)基团外的氨基酸1-8是特异性的。
正如在实施例中所看到的,“跨越肽ELISA检测方法”也可以用于任何一个在阿尔茨海默氏症的发病机制中非常重要的N端截短的淀粉样β肽类的游离N端(Masters CL et al 1985,Haass et al 1993,Miller DL et al1993,Vigo-Pelfrey C et al 1993,Naslund et al 1994,Theo TC et al 1995)。本发明的说明书描述了在一个实施方案中使用对应于开始于位置1(Asp)的淀粉样β肽的N端的氨基酸序列如SEQ ID NO2(Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Cys)和SEQ ID NO3(Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Cys)的短肽作为免疫原的例子来生产对游离端具有特异性的抗体。当使用这些免疫原时,在一个实施方案中,检测了与在“跨越肽ELISA检测方法”中的跨越肽的反应性的缺乏。类似的,使用对应于N端截短的如Aβ1-40/42的淀粉样β肽类序列的免疫作用或选择,以及随后用适宜的跨越肽的筛选,也可以在本发明中使用。文中被包括的例子如SEQ IDNO9 Glu-Val-His-Gln-Sys,对应于全长的Aβ肽11-15残基,并含有一个额外的丝氨酸残基是为结合的目的,这是一个起免疫作用的肽;SEQ IDNO10 Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln是一个跨越肽的例子,其可以在“跨越肽ELISA检测方法”中用于分离末端特异性的抗体。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种对游离端具有特异性的抗体,其靶向淀粉样β肽Aβ1-39,Aβ1-40,Aβ1-41或Aβ1-43的游离C端。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种对游离端具有特异性的单链抗体,其靶向淀粉样β肽Aβ1-42的C端。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种对游离端具有特异性的且靶向淀粉样β肽Aβ1-40的游离C端的抗体,该抗体不结合经蛋白水解衍生淀粉样β肽的淀粉样β前体蛋白。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种对游离端具有特异性的且靶向淀粉样β肽Aβ1-43的游离C端的抗体,该抗体不结合经蛋白水解衍生淀粉样β肽的淀粉样β前体蛋白。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种对游离端具有特异性的抗体,其靶向于N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离C端。因此,本发明也涉及C端的异质性,在此较长的形式,即Aβx-42/3,更倾向于作为纤维状聚集并导致更大量的Aβ1-40的聚集。例如但不作限定,本发明设想了对于Aβx-39、Aβx-40、Aβx-41、Aβx-42和Aβx-43的每种形式的C端游离端具有特异性的抗体用作治疗的用途。例如,在一个实施方案中,Aβ42有如下的序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-ValGly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH。
Aβ41、Aβ40和Aβ39与Aβ42不同在于在C端分别省略了Ala、Ala-Ile和Ile-Val。Aβ43与Aβ42的不同在于在C端存在一个苏氨酸。
作为例子,在一个实施方案中,对应于淀粉样β肽的C端的短区域的特定抗原序列如SEQ ID NO4 Cys-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val(Aβx-40)和SEQ ID NO11 Cys-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr(Aβx-43)所述。用于在“跨越肽ELISA检测方法”可以用来检测C端末端特异性抗体的跨越肽是SEQ ID NO12(Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val)和SEQ IDNO13(Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr),分别是Aβx-40和Aβx-43。类似的肽可以设计用来靶向Aβx-42类。因此,例如,但不限定,在一个使用淀粉样蛋白β1-40的代表性例子中,在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体靶向C端截短的淀粉样β肽除游离的羧基(COOH)基团外的氨基酸33-40。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体靶向C端截短的淀粉样β肽除游离的羧基(COOH)基团外的氨基酸34-40。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体靶向C端截短的淀粉样β肽除游离的羧基(COOH)基团外的氨基酸36-40。在一个实施方案中,对游离端具有特异性的抗体靶向C端截短的淀粉样β肽除游离的羧基(COOH)基团外的氨基酸37-40。请注意淀粉样β肽1-40可以作为代表性的样品;相同的片段可以衍生自淀粉样β肽1-39,1-41,1-42和1-43。
如图1所示(见Schehr,1994),以及在背景领域部分所讨论的那样,淀粉样蛋白前体(APP)也被认为是蛋白水解产物可溶性淀粉样蛋白前体(sAPP)的前体,被认为具有促进生长和神经保护的作用。容易为本领域技术人员所理解的是对游离端具有特异性的抗体的引入和施用不会对与Aβ肽形成无关的APP或sAPP的正常生物学功能存在影响。
单链抗体作为对游离端具有特异性的分子也可以通过本发明产生。这些单链抗体可以使单链组成的多肽,其拥有对游离端具有特异性的Aβ肽结合能力,并包含一对与免疫球蛋白轻和重链(连接的VH-VL,或单链Fv)同源或类似的氨基酸序列。VH和VL可以拷贝天然抗体序列,或者一条或两条链包含在美国专利5,091,513中所述的类型的CDR构建体。轻和重链的可变区类似的独立多肽通过一个肽的连接体接在一起。在生产这种单链抗体,如单链Fv(scFv),特别是编码VH和VL链的多肽结构的DNA被鉴定或容易的通过序列分析被确定的方法可以根据在下列所描述的方法来完成美国专利4,946,778,美国专利5,091,513,美国专利5,096,815,Biocca et al.,1993,Duan et al.,1994,Mhashilkar et al.,1995,Marasco et al.,1993,和Richardson et al.,1995。图3A-3D(Biocca et al.,1995)用示意图表示出一个完整的抗体(图3A),一个Fab片段(图3B),一个由非共价连接可变区复合物(V,-V,和组成的Fv片段(图3C);一个单链Fv抗体(图3D)。
设计产生免疫的肽用于免疫动物和产生生成抗体的杂交瘤细胞是建立在类似的肽的基础上的,这些肽在以前被几个实验室用来产生识别Aβ类的游离端并在体外应用的多克隆抗体(Harrington et al.,1993;Iwatsuboet al.,1994;Konig et al.,1996;Murphy et al.,1994;Gravina et al.,1995)。尽管长度较长的肽在一些例子中已经成功地被用来产生Aβ末端特异性的抗体,Theo和他的同事(1993;1994)发现,对于任何一个给定的多肽,其保证在N端特异性的游离氨基基团组成一个由新抗体识别的表位的基本部分,其有5个氨基酸的长度。因此,一个针对免疫原性的肽产生的抗体,其抗体的选择性通过在识别Aβ肽游离的N或C端中被衡量。一个竞争性的试验,使用对应于Aβ不同区域以及βAPP的细胞外结构域的β-分泌酶切割位点前的直接区域的肽,做酶联免疫吸附分析(ELISA)或免疫沉淀法,能够测定抗体的选择性。
本领域的技术人员会理解一个半胱氨酸残基可以被加到上述的免疫原性肽的末端,该末端与对应于Aβ肽的游离的N端或C端的末端相反,以便于偶联上一载体蛋白。钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)、卵清蛋白和牛血清白蛋白(BSA)是能够用作免疫原的载体的非限定性的蛋白例子。合成的免疫原性的肽的N端或C端的半胱氨酸残基的存在提供了游离的巯基基团,使之能够共价偶联到马来酰亚胺激活的蛋白上。其他的双功能的试剂,如N-马来酰亚胺-6-氨基辛酯酯(N-maleimido-6-aminocaproylester)或m-马来酰亚胺苯基N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester,MBS),可以用来共价的偶联合成的免疫原性肽到受体蛋白上(参见例如Hartlow,E.et al.,AntibodiesA Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.1988)。商业化的试剂盒也可以用作将多肽抗原偶联到马来酰亚胺激活的大的载体蛋白上。
本发明进一步提供了一种产生单克隆抗体或单链抗体的杂交瘤细胞,该抗体对于淀粉样β肽或其片段的N端或C端的游离端具有特异性,并且能区别Aβ肽和经蛋白水解衍生Aβ肽的淀粉样蛋白前体。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞通过由Kohler和Milstein,Nature,256,p.495(1975)中所描述的一般程序产生。在这个程序中,杂交瘤通过使用身体细胞杂交程序融合抗体产生细胞(典型的是先前用淀粉样蛋白β免疫过的小鼠的脾脏细胞)和来自永生化的肿瘤细胞系的细胞。
对于抗体的产生,各种各样的宿主包括羊、兔、大鼠、消暑、人源化的小鼠、任何其他等可以通过注射带有免疫原性性质的相关表位或任意片段或其寡肽等进行免疫。根据宿主的种类,不同的佐剂可用于增强免疫反应。这些佐剂包括,但不限于Freund′s,矿物胶乳氢氧化铝,表面活性剂如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、KLH和二硝基酚。
来自融合过程的杂交瘤允许生长。随后,所得的上清液通过免疫方法的程序进行筛选,以检测上清中存在的能够结合特异性抗原的抗体。
在另一个实施方案中,组合抗体库技术,即基于抗原的筛选来自于表达在M13丝状噬菌体表面的抗体库,其可用于产生单克隆抗体并且相对于杂交瘤方法具有许多的优势(Huse,et al.,1989;Barbas,et al.,1991;Clackson,et al.,1991;Burton和Barbas,1994)。本发明的抗体可以从噬菌体抗体库中产生。在应用噬菌体展示技术产生的大组合文库中涉及的一般方法在1993年1月29日发布的美国专利5,223,409中所描述和公开。
一旦单克隆抗体产生了,其选择性和结合亲和力(Kd)可以通过ELISA来衡量,抗体的体外生物试验可以通过检验Aβ末端特异性抗体在阻断Aβ诱导的细胞毒性的效力来衡量。体外的生物试验也可以通过检验抗体对淀粉样蛋白APP的功能干预的缺乏来检测。在另一个实施方案中,如果需要的话,抗体可以通过施用如淀粉样β肽或其片段的抗原在患者体内产生。抗体的滴度将会通过本领域技术人员已知的技术来测定,如需要其他的抗原可被施用。
在另一个实施方案中,提供了一个包含上述抗体的药物组合物以及用该药物组合物来抑制淀粉样β肽在神经元细胞外环境中的聚集的方法。在所需的患者中,淀粉样β肽聚集的减少将进一步延迟阿尔茨海默氏症或以淀粉样蛋白β沉积为特点的其他疾病的进展。
在一个实施方案中,组合物包括一个治疗的或预防疾病的有效的足以抑制天然的β淀粉样肽的神经毒性的量的抗体,和一个药学上可接受的载体。“治疗有效量”是指一个有效量,在必须的剂量和时间期间,达到所期望的治疗效果,如阿尔茨海默氏症进程的减缓,延迟的发病,淀粉样蛋白β沉积的减少或逆转和/或Aβ神经毒性的降低或逆转。本发明的抗体的治疗有效量根据如个体的疾病状态、年龄、性别和重量,以及调制剂在个体中激发期望的反应的能力等因素而变化。剂量的状况可以通过最佳的治疗反应来调节。治疗有效量也可以是调制剂的毒性或恶性作用被其治疗有效作用所超出。
“预防有效量”是指有效量,在必须的剂量和时间期间,达到所期望的预防效果,如阻止或抑制淀粉样蛋白沉积的速率和/或在有淀粉样蛋白β沉积倾向的患者中淀粉样蛋白β的神经毒性。预防有效量可以通过上述治疗有效量的方法来测定。典型的,在疾病前或疾病的早期使用预防剂量,预防有效量要少于治疗有效量。
当确定淀粉样蛋白β的抗体的有效治疗或预防有效量时,应该考虑的一个因素是患者中的生物区室,如患者的脑脊液(CSF)或血浆,的天然的淀粉样蛋白β的浓度。应该注意的是剂量值可以病情严重程度的减轻而变化。进一步应该理解的是对于任何特定的患者和特别的剂量服用方法都应该根据个体的需要以及使用或管理组合物施用的人的专业判断并通过时间来调整。例如,可以单剂施用,也可以在一段时间内按几个分开的剂量施用,或者剂量应该根据治疗状况出现的紧急事件的预示来按比例减少或增加。
药物组合物可以通过皮下、静脉注射、皮内、肌内、腹腔内、脑内、鼻内、口服、透皮、面颊、动脉内、颅内或头部内(intracephalically)给药。更加有利的是将胃肠外的组合物以剂量单位的形式佩服易于施用和保持剂量的一致性。文中所用到的剂量单位形式是指形体上分散的并为治疗的哺乳动物患者的单一剂量形式匹配的单位;每个单位包含预先定量的计算好的以产生预期的治疗效果的活性化合物以及所需的药物学载体。本发明的剂量单位形式的规格规定于并直接依赖于(a)活性化合物的独特性质及所要达到的治疗效果;(b)为个体治疗的敏感性混合该活性化合物的方案所固有的限制条件。
文中所用到的“药物学可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌物质、等渗和延迟吸收的物质、以及生理相容的类似物。在一个实施方案中,载体适于胃肠外施用。更适合的,载体可以用于静脉内、腹膜内或肌内施用。作为选择的,载体适于中枢神经系统施用(脊髓内或脑内)。在另一个实施方案中,载体适于口服施用。药学上可接受的载体包括灭菌水溶液或分散液以及适于临时制备灭菌注射剂或分散剂的灭菌粉末。这种用于药学上活性物质的介质和物质的使用在本领域是公知的。除了与活性化合物不相容的常规介质或物质的范围外,其在本发明的药物组合物中的应用已在预期之内。辅助的活性化合物也可以被引入到本组合物中。
代表性的治疗组合物在制备和储存的条件下是无菌和稳定的。组合物可以被配方成为溶液、微乳剂、脂质体、或其它适于高药物浓度的规定的结构。载体可以是一种包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态的聚乙二醇等)的溶液或分散介质及其适合的混合物。适当的流动性可以通过例如使用如卵磷脂的包衣,在分散剂的情况下保持所需颗粒的大小以及使用表面活性剂来保持。在许多情况下,适宜在组合物中包括等渗物质,例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质如一硬脂酸盐和明胶等来实现。而且,抗体可以通过按时间释放的例如在一个包含缓慢释放聚合物的组合物中配方来施用。活性化合物可以与阻止化合物快速释放的载体制备,如包含微胶囊化转运系统的控制释放配方。可以使用生物可降解和生物相容性的聚合物,如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚原磷酯、聚乳酸、和聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物(PLG)。许多制备这些配方的方法都已申请专利或对本领域的技术人员是已知的。
灭菌的注射溶液可以通过将活性化合物(如所需剂量的淀粉样蛋白β的抗体)加入到一个适宜的溶剂中,如果需要的话,加入上述所列举的成分的一种或组合物,然后进行过滤除菌。一般说来,分散剂可以通过将活性化合物加入到一种灭菌的包含一个基本的分散介质和所需的来自上述列举的其它成分的灭菌载体。在制备灭菌注射溶液的灭菌粉末时,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,其产生活性成分的粉末,加上其它所需的来自其先前过滤灭菌溶液的成分。
局部应用可来自透皮(intransdermal)或皮内应用。局部施用可以通过共施用霍乱毒素或其去毒的衍生物或亚基而得以促进。可供选择的,透皮转运可以通过使用皮肤帖(skin patch)或使用转移装置(transferosome)而实现。
其它的转运系统包括时间释放、延时释放、或持续释放转运系统。这些系统能够避免本发明的活性化合物的反复施用,增加患者和医生的便利。许多形式的释放转运系统对本领域一般的技术人员十已知和可行的。这些包括基于聚合物的系统如聚乳酸和聚羟基乙酸、聚酐和聚已酸内酯;非聚合物的系统是脂类,包括甾体如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂类如单、二和甘油三酯;水凝胶释放系统;硅橡胶系统;基于肽系统;蜡包衣,用常规的粘合剂和赋形剂压片,部分融合的植入体等。另外,一种基于泵的硬件转运系统也可使用,其中一些适用于植入。
一种长期持续释放的植入体也可以使用。这里所用到的“长期”释放是指构建和处理该植入体使之能转运治疗水平的活性成分至少30天,优选是60天。长期持续释放的植入体对本领域普通的技术人员是已知的,并包括一些上述的释放系统。这些植入体通过替换由淀粉样β肽聚集物所影响的脑的区域附近的植入体,在治疗以该聚集物为特点的病症特别有用,由此影响了局部的、高剂量的本发明的化合物。
在充分描述本发明后,本领域的技术人员可以理解同样的技术方案可以在一个具有相当的参数、浓度和条件的,无需脱离本发明的精神和范围且无需过度的实验的范围内实行。
尽管本发明连同其相实施方案描述,可以理解的是它能够做进一步的修饰。本申请旨在覆盖那些总体上遵从本发明的原则而对本发明做出的任何变更、使用或适应,并覆盖那些与在此所记载的内容不同,但属于本领域已知的或惯用的实践且适用于如以下所附的权利要求书中所示的实质特征的方案。
文中所有引用的参考文献,包括杂志文章或摘要、发表或未发表的美国或国外的专利申请、公布的美国或外国专利或其它的参考文献,包括引用文献中的所有的数据、表格、图片和文字,全部并入参考。另外,文中所引用的参考文献所引用的整个内容也完全被并入参考。
对于已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知的方法或常规的方法的引用不应以任何方式被认为是本发明的任何方面、说明书或实施方案在相关领域已经被公开、教授或暗示。
特定实施方案的先前描述将会如此全部的公开本发明的基本实质,以至于其他人可以通过应用本领域技术内的知识(包括文中所引用的参考文献的内容)容易的修改和/或适应这些特定的实施方案的各种应用,不需要过度的实验,不需有偏离本发明的一般概念。因此,这种适应或修饰倾向于在所公开的实施方案的同等物的意义和范围内。可以理解的是文中的措辞或术语是为本发明的目的而不是限制,这样本说明书的术语或措辞能够被技术人员根据文中所呈现的教导或指导并结合本领域通常的知识来解释。
实施例如本发明一般描述的,下列实施例更加容易通过参考文献理解,它们是以解释的方式而没有限制本发明的倾向。
实施例1证实“跨越肽”ELISA检测方法可检测对淀粉样β肽游离端具有特异性的抗体肽H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-氨基己酸酯-Cys-酰胺(PeptideH2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-aminohexanoate-Cys-amide)通过SMCC连接体结合到BSA上。Swiss Webster小鼠用100μg在Freund′s完全佐剂中的这种结合物进行免疫,进而用100μg在Freund′s不完全佐剂中的这种结合物进行两次刺激。抗血清通过使用说明书中所描述的“跨越肽ELISA检测方法”进行筛选。简单的说,Aβ1-40被包被在96孔的培养板上,然后在竞争性肽A(免疫原),C(跨越肽)或Aβ1-40存在的情况下与样品进行温育。通常的结果如图5中所示。正如所预料的,这些动物所产生的抗体结合Aβ1-5残基,这是用作免疫的肽,以及全长Aβ1-40肽。然而,当Aβ1-5表位在其N端(肽C)侧翼有其它的序列时,正如在完整的淀粉样前体蛋白APP中的一样,这些抗体同样能与Aβ1-5表位反应。这些抗体被称为是表位特异性的(AβN端的序列1-5)。
在实验样品是一种更为稀少的结果在图6中示出。这些抗体结合免疫的肽(Aβ1-5)和Aβ1-40序列,但是不识别从在全长APP中跨越同样的5个氨基酸序列的区域所衍生的肽(肽C)。这些抗体灵敏的选择性在于其只能够在所述1-5序列被置于该分子的游离N端时与其结合;这些抗体被称为对游离端具有特异性。
实施例2证明“跨越肽”ELISA检测方法选择对淀粉样β肽游离端具有特异性的杂交瘤肽H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-氨基己酸酯-Cys-酰胺通过MBS连接体结合到KLH上。Balb/c×C57B1/6 F1小鼠用50μg在Freund′s完全佐剂中的这种结合物进行免疫,进而用50μg在Freund′s不完全佐剂中的这种结合物进行四次刺激。抗血清的检验和融合使用标准的方法进行。杂交瘤使用如说明书中所述的“跨越肽ELISA检测方法”进行筛选。简单的说,阳性肽(H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His与BSA结合)或阴性对照跨越肽(乙酰基-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His)被包被在96孔板上,然后与杂交瘤上清温育。正如在图7和8中看到的那样,一些杂交瘤以相似的方式(即克隆5E2,2A8和2F8)识别这两种肽,而一些有非显著性的差异(即克隆4H9,1C12,和3H3)。然而,一些克隆证明其具有末端特异性,因为它们识别用于免疫的阳性肽比它们识别阴性对照跨越肽要强得多,该跨越肽实际上包含用于免疫的相同序列。例子示于克隆4D12和这个融合体的2A10。
实施例3预示性实验检测Aβ末端特异性抗体在阻断Aβ纤维形成和Aβ诱导的细胞毒性的效力的体外生物试验Aβ诱导的神经元毒性高级糖化末端产物(RAGE)的受体介导一些Aβ对神经元和小胶质细胞的神经毒性效应(Yan et al.,1996)。
通过竞争性抑制的方法检测了具有末端特异性的抗体抑制受体介导的神经毒性的能力。抗体通过纯化的RAGE受体制剂和检测它们对于Aβ诱导的细胞氧化应激的效应进行试验。
RAGE受体是从溶解于包含辛基-p-葡萄糖(1%)和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride)(2nm)的tris缓冲盐溶液的牛肺提取物中纯化的,并放置于肝素hyperD柱子(Biosepra)上。柱子用梯度NaCl进行洗脱,有最大结合125I-标记的Aβ的部分被鉴定。该部分被汇集并上载于羟磷灰石Ultragel(Biosepra)上,然后用递增浓度的磷酸盐洗脱。
最大结合125I-标记的Aβ的部分被用于制备性的非还原聚丙烯酰胺SDS凝胶(10%)。
RAGE受体蛋白Mr50,000由考马斯亮蓝染色来鉴定,临近条带的区域被切割和洗脱。末端特异性抗体结合125I-标记的Aβ(1-40/1-42)到RAGE受体的竞争性抑制通过许多种方法测定(1)不同量(0-150μg)纯化蛋白固定到微孔板上,并与100nM125I-标记的Aβ(1-40/1-42)温育;(2)不同量(0-250nM)的125I-标记的Aβ(1-40/1-42)放在预先包被有5μg纯化的RAGE受体的微孔板中并温育;(3)不同量(0-500μg/ml)的125I-标记的Aβ(1-40/1-42)固定到微孔板上,并与50nM的125I-标记的RAGE受体温育。在每一个试验中,配体在不同量抗体的存在下结合到板孔上的量通过用γ闪烁计数仪计数板孔的放射性的量来测定。
为了衡量不同的末端特异性的Aβ抗体作为Aβ诱导的细胞氧化应激的抑制剂的效力,培养的小鼠脑微脉管内皮细胞(Breitner et al.,1994)在不同量的抗体的存在下与0.25μM的Aβ温育,细胞氧化应激使用先前所描述的TBARS试验,通过测定剂量依赖的硫代巴比妥酸反应性物质的产生来衡量(Demery et al.,1990;Yan et al.,1996)。在一个平行的试验系统(由Khoury et al.,1996所开发)中,抗体的抑制效应通过对Aβ诱导小鼠N9小胶质细胞产生的活性氧(oxygen-reactive species)来测定。N9细胞(5×104)在37℃,在包含1μM的一种在包被有Aβ肽的多点载玻片上遇到氧化发出荧光(Wan et al.,1993)的染料H2DCF(2’,7’二氯荧光黄乙酰乙酸盐)的50μl PD-BSA(缺乏二价阴离子、含有1mg/ml BSA的磷酸缓冲盐溶液)中温育。在不同的时间点,培养基的等份样品被取出,荧光在一个荧光微孔板读取仪上测定(Cytofluor II)。
与蛋白多糖相互作用的效应血管细胞衍生的硫酸类肝素多糖蛋白,基底膜蛋白多糖,在所有的淀粉样沉积中被鉴定,并且通过与Aβ高亲和力的结合反应(Snow et al.1989;1995)说明其存在于炎症相关的淀粉样蛋白诱导的早期阶段。基底膜蛋白多肽和Aβ的结合是淀粉样蛋白二级和三级结构特征,这说明影响该相互作用的分子可以预防或延迟淀粉样蛋白产生。
衡量了结合对应于所述肽的N端的肽的具有游离端特异性的Aβ抗体阻断基底膜蛋白结合到AβN端区域的基底膜结合位点(Snow et al.,1995)的能力。该评价基于使用从培养的自小牛胸主动脉制备的内皮细胞所分离的基底膜蛋白的固相结合试验,细节如(Snow et al.1995)所述。聚乙烯微孔板包被有100μl的硝酸纤维溶液并使之干燥。孔加入未标记的基底膜蛋白并在室温包被过夜,以使得每个孔结合有0.28μg的蛋白,然后在室温用200μl的5%的脱脂牛奶进行封闭。
不同量的125I Aβ(7000cpm/pM)在100μl TBS/0.05%Tween 20(TBST)中稀释,并平行三份加入到孔中,然后在室温在一个轨道摇床上温育2.5h。在温育阶段的最后,游离的125I Aβ通过6次TBST洗去。结合的125I通过1N氢氧化钠提取,然后“结合”对“游离”的放射性通过液体闪烁计数来定量。在增加的抗体的量的存在下,温育125I Aβ并进行斯卡查德分析(Scatchard analysis)。
对Aβ纤维形成的影响由动态可溶性多肽如Aβ1-40形成的淀粉样纤维可以被包含特别的C端残基41(ILe)和42(Ala)的如Aβ1-42的肽成核或“接种”。C端或N端末端特异性的Aβ抗体阻断Aβ1-42的接种或防止淀粉样多肽聚集的能力通过标准聚集的试验来检测(Wood et al.,1996)。Aβ1-40肽在1,1,1,3,3,3-六氟代-2-丙醇中可以溶解到5mg/ml。该肽浓缩至干燥并且重新溶解在pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)中,得到最终浓度是230μm。Aβ1-42溶液(20μm)摇晃三天并超声30min,以产生淀粉样纤维。2nM的先聚集的Aβ1-42加入到pH7.4的上清中以种得Aβ1-40沉积。在存在和不存在每种Aβ末端特异性的抗体的情况下,聚集体的形成通过使用微孔板读取仪在405nm监测在微孔板中制得的样品的浊度来测定。该反应也可以通过硫代黄素-T荧光(thioflavin-T fluorescence)来监测,如Wood et al.(1996)所描述的。对游离端具有特异性的抗体促进淀粉样肽纤维的解聚集的能力通过检测从包含包被在96孔的微孔塑料包被板上的非聚集肽的胶原基质中替换VI-标记的淀粉样聚集肽来测定。另外,对游离端具有特异性的抗体保护神经元避免Aβ诱导的损害是通过锥虫蓝排除法、细胞内钙离子测定、扫描和透射电子显微镜术以及共聚焦显微镜的方法来评价。
确立Aβ抗体治疗潜能的动物模型动物模型可以用来证实抗体的施用可以减缓或防止脑中AD类似的病理的发展。尽管AD是一类独特的人类疾病,但许多过渡表达人类APP和PS1的转基因小鼠已经开发。阿尔茨海默氏症的相关的行为、生化和病理性异常记忆在转基因小鼠中出现,这为研究药剂在减缓或防止Aβ诱导的该疾病的病理生理学上的效用提供了机会。
APP/PS1双转基因的模型(Holcomb et al,Nat Med 1998,497-100)具有特别稳定的、可重复的表型,其发生的非常快并在12周龄时表现出淀粉样蛋白沉积和行为的病损。这些因素组合在一起产生了一个模型,可用来快速筛选和评价对阿尔茨海默氏症的候选药物。重要的是,PS1/APP的表型与几种重要的人类阿尔茨海默氏症的特征相一致,包括如氧化应激标记、反应性神经胶质增生、炎症、神经变性、异常的神经元生长、胆碱能末梢的改组、以及出现作为形成混乱状态的中间体的超磷酸化的tau。与许多其它的认知损害的模型不同,PS1/APP有一个不与运动缺陷相伴随的选择性的“工作记忆”丧失。
一个典型的用来衡量抗体在阿尔茨海默氏症的APP/PS1双转基因小鼠模型中的作用的实验方法如下治疗开始于5-6周龄。转基因小鼠随机分为三个主要的组(对照和2个剂量的化合物),每组10-12只动物。每个组处理至多至8(在蚀斑沉积前)、12(当蚀斑开始形成时)和18-19周龄(当淀粉样负担非常显著时),如上所述。
在每个时间点,小鼠会被无痛致死并用生理盐水或蔗糖进行灌注,脑被收集,大脑半球被分开。一个半球会通过浸入多聚甲醛而固定、剖面、然后用Campbell-Switzer Alzheimer银染的方法来检测蚀斑,以及其它的染色步骤。另外一个半球将会被冷冻,然后进行ELISA检测,并定量可溶性与非可溶性的1-40和1-42β淀粉样蛋白。
在处死之前,可以进行行为试验如Y-迷宫、“空间放置”(place set)Morris水迷宫以及形迹训练(trace conditioning)。
参考文献Andra,K.et al.,″Expression of APP in transgenic micea comparison ofneuron-specific promoters″.Neurobiol Aging17183-190(1996).
Barrow,CJ et al.,″Solution conformations and aggregational properties ofsynthetic amyloid beta-peptides of Alzheimer′s Disease.Analysis of circulardichroism spectra″,J Mol Biol2251075-1093(1992).
Biocca,S et al.,″Intracellular expression of anti-p21 ras single chain Fvfragments inhibits meiotic maturation of xenopus oocytes″,Biochem BiophysRes Commun197422-427(1993).
Biocca,S et al.,″Intracellular immunizationAntibody targeting to subcellularcompartments″,Trends in Cell Biol5248-253(1995).
Blacklow,NR et al.,“Epidemiology of adenovirus-associated virus infectionin a nursery population”,Am J Epidemiol88368-378(1968).
Breitner J et al.,“Inverse association of anti-inflammatory treatments andAlzheimer’s Diseaseinitial results of a co-twin control study”,Neurology44227-22(1994).
Brinster RL et al.,“Somatic expression of herpes thymidine kinase in micefollowing injection of a fusion gene into eggs”,Cell27223-231(1981).
Burdick,D et al.,“Assembly and aggregation properties of syntheticAlzheimer’s A4/beta amyloid peptide analogs”,J Biol Chem267546-564(1992).
Busciglio,J et al.,“Nucleic acidration of beta-amyloidin the secretorypathway in neuronal and nonneuronal cellsProc Nat Acad Sci USA902092-2096(1993).
Cai,XD et al.,“Release of excess amyloid beta protein from a mutant amyloidbeta protein precursor”,Science259514-516(1993).
Carter,B.J.InHandbook of Parvoviruses,ed.,Tijssen P.L.(CRC Press,BocaRaton FL)2,247-284(1990).
Cattaneo,A et al.,“Polymeric immunoglobulin M is secreted by transfectantsof non-lymphoid cells in the absence of immunoglobulin J chain”,EMBO J62753-2758(1987).
Chartier-Harlin,MC et al.,“Early-onset Alzheimer’s Disease caused bymutations at codon 717 of the beta-amyloid precursor protein nucleic acid”,Nature353844-846(1991).
Citron,M et al.,“Excessive production of amyloid beta-protein by peripheralcells of symptomatic and presymptomatic patients carrying the Swedishfamilial Alzheimer disease mutation”,Proc Nat Acad Sci USA9111993-11997(1994).
Clements,A et al.,“Effects of the mutations Glu22 to Gln and Ala21 to Glyon the aggregation of a synthetic fragment of the Alzheimer’s amyloidbeta/A4 peptide”,Neurosci Lett16117-20(1993).
Dennery,P et al.,“Effects of fatty acid profiles on the susceptibility ofcultured rabbit tracheal epithelial cells to hyperoxic injury”,Am J Resp CellMol Biol3137-144(1990).
Du,B et al.,“Efficient transduction of human neurons with anadeno-associated virus vector”.Nucleic acid Therapy3254-261(1996).
Dickson,D et al.,″Alzheimer′s Disease.A double-labelingimmunohistochemical study of senile plaques″,Am J Pathol13286-101(1988).
Duan,L et al.,″More convenient13C-urea breath test modifications still meetthe criteria for valid diagnosis of Helicobacter pylori infection″,Proc NatAcad Sci USA915075-5079(1994).
El Khoury,J et al.,″Scavenger receptor-mediated adhesion of microglia tobeta-amyloid fibrils″,Nature382716-719(1996).
Engvall,E et al.,″Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).
Quantitative assay of immunoglobulill G″Imnunochemistry8871-874(1971).
Esch,F S et al.,″Cleavage of amyloid beta peptide during constitutiveprocessing of its precursor″,Science2481122-1124(1990).
Fabian,H et al.,″Synthetic post-translationally modified human A betapeptide exhibits a markedly increased tendency to form beta-pleated sheets invitro″.Eur J Biochem221959-964(1994).
Gleaner,GG et al.,″Alzheimer′s Diseaseinitial report of the purification andcharacterization of a novel cerebrovascular amyloid protein″,BiochemBiophys Res Commun120885-890(1984).
Goate,A et al.,″Predisposing locus for Alzheimer′s Disease on chromosome21″,Lancet1352-355(1989).
Goate,A.et al.,″Segregation of a missense mutation in the amyloid precursorprotein gene with familial Alzheimer′s Disease″,Nature349704-706(1991).
Golde,TE et al.,″Processing of the amyloid protein precursor to potentiallyamyloidogenic derivatives″,Science255728-730(1992).
Gordon,TW et al.,″Nucleic acidtic transformation of mouse embryos bymicroinjection of purified DNA″,Proc Nat Acad Sci(USA)777380-7384(1980).
Gouras,G eta.,″Expression of human APP in vitro and in vivo in rodent brainvia adeno-associated virus(AAV)vectors″,Soc Neurosci Abst221661(1996).
Gravina SA et al.,″Amyloid beta protein(A beta)in Alzheimer′s Disease brain.Biochemical andimmunocytochemical analysis with antibodies specific forforms ending at A beta 40 or A beta 42(43)″,J Biol Chem270(13)7013-7016(1995).
Griffiths et al.,InHbridoma TeclmologJy in Biosciences and Medicine,ed.Springer,T.A.(Plenum New York).pp 103-105(1985).
Haass,C et al.,″The vacuolar H(+)-ATPase inhibitor bafilomycin A1differentially affects proteolytic processing of mutant and wild-typebeta-amyloid precursor protein″,J Biol Chem.2706186-6192(1995).
Haass,C.et al.,″Amyloid beta-peptide is produced by cultured cells duringnormal metabolism″,Nature359322-325(1992).
Halverson,K et al.,″Moleculardeterminants of amyloid deposition inAlzheimer′s Diseaseconformational studies of synthetic beta-proteinfragments″,Biochemistry292639-2664(1990).
Harbers,K et al.,″Microinjection of cloned retroviral genomes into mousezygotesintegration and expression in the animal″,Nature293540-542(1981).
Hardy,JA et al.,″Alzheimer′s Diseasethe amyloid cascade hypothesis″,Science256184-185(1992).
Harrington CR et al.,″Characterisation of an epitope specific to theneuron-specific isoform of human enolase recognized by a monoclonalantibody raised against a synthetic peptide corresponding to the C-terminus ofbeta/A4-protein″,Biochim Biophys Acta1158(2)120-128(1993).
Hendriks,L et al.,″Presenile dementia and cerebral haemorrhage linked to amutation at codon 692 of the beta-amyloid precursor protein nucleic acid″,Nat Nucleic acidt1218-221(1992).
Higaki,J et al.,″Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolyticprecursors and subcellular site of catabolism″,Neuron14651-659(1995).
Howland,DS et al.,″Mutant and native human beta-amyloid precursorproteins in transgenic mouse brain″.Neurobiol Aging16685-699(1995).
Hsiao,K,et al.,″Correlative memory deficits,A beta elevation,and amyloidplaques in transgenic mice″,Science27499-102(1996).
Iwatsubo T et al.,″Visualization of A beta 42(43)and A beta 40 in senileplaques with end-specific A beta monoclonalsevidence that an initiallydeposited species is A beta 42(43)″,Neuron13(1)45-53(1994).
Jarret,JT et al.,″Seeding″one-dimensional crystallization″of amyloidapathogenic mechanism in Alzheimer′s Disease and scrapie?″,Cell731055-1058(1993a).
JalTett,JT et al.,″The carboxy terminus of the beta amyloid protein is criticalfor the seeding of amyloid formationimplications for the pathonucleicacidsis of Alzheimer′s Disease″,Biochemistry324693-4697(1993b).
Kang,J et al.,″The precursor of Alzheimer′s Disease amyloid A4 proteinresembles a cell-surface receptor″,Nature325733-736(1987).
Kaplitt MG,et al.,″Preproenkephalin promoter yields region-specific andlong-term expression in adult brain after direct in vivo nucleic acid transfervia a defective herpes simplex viral vector″,Proc Nat Acad Sci USA918979-8983(1994).
Kisilevsky,R et al.,″Arresting amyloidosis in vivo using small-moleculeanionic sulphonates or sulphatesimplications for Alzheimer′s Disease″,Nature Med1143-148(1995).
Kitaguchi,N et al.,″Novel precursor of Alzheimer′s Disease amyloid proteinshows protease inhibitory activity″.Nature331530-532(1988).
Knops,J et al.,″Cell-type and amyloid precursor protein-type specificinhibition of A beta release by bafilomycin A1,a selective inhibitor ofvacuolar ATPases″,J Biol Chem2702419-2422(1995).
Kohler et al.,″Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity″,Nature256495-496(1975).
Konig,G et al.,″Identification and differential expression of a novelalternative splice isoform of the beta A4 amyloid precursor protein(APP)mRNA in leukocytes and brain microglial cells″,J Biol Chem26710804-10809(1992).
Konig,G et al.,″Development and characterization of a monoclonal antibody369.2B specific for the carboxyl-terminus of the beta A4 peptide″,Ann NYAcad Sci777344-355(1996).
Kotin,RM et al.,″Site-specific integration by adeno-associated virus″,ProcNat Acad Sci USA872211-2215(1990).
Kotin,RM et al.,″Mapping and direct visualization of a region-specific viralDNA integration site on chromosome 19q13-qter″,Genomics10831-834(1991).
Kotin,RM.Et al.,″Characterization of a preferred site on humanchromosome 19q for integration of adeno-associated virus DNA bynon-homologous recombination″,EMBO J115971-5078(1992).
La Fauci,G et al,″Characterization of the 5′-end region and the first twoexons of the beta-protein precursor nucleic acid″,Biochem Biophys ResComm159297-304(1989).
Lahiri,DK,et al.,″Promoter activity of the nucleic acid encoding thebeta-amyloid precursor protein is up-regulated by growth factors,phorbolester,retinoic acid and interleukin-1″,Brain Res Mol Brain Res32233-240(1995).
Luthman.H et al.,″High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquinetreated cells″.Nucl Acids Res111295-1308(1983).
Ma,J et al.,″Amyloid-associated proteins alphal-antichymotrypsin andapolipoprotein E promote assembly of Alzheimer beta-protein into filaments″,Nature37292-94(1994).
Maniatis,T et al.,Molecular cloninga laboratory manual.(Cold SpringHarbor Lab.Cold Spring Harbor NY)(1989).
Marasco,W et al.,″Design,intracellular expression,and activity of a humananti-human immunodeficiency virus type 1 gp120 single-chain antibody″,Proc Nat Acad Sci USA907889-7893(1993).
Masters,CL et al.,″Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease andDown syndrome″,Proc Nat Acad Sci USA824245-4249(1985).
Mhashilkar,A et al.,″Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivationand HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies″,EMBO J141542-1551(1995).
Miller,DL et al.,″Peptide compositions of the cerebrovascular and senileplaque core amyloid deposits of Alzheimer′s Disease″,Arch BiochemBiophys30141-52(1993).
Mullan,M et al.,″A pathogenic mutation for probable Alzheimer′s Disease inthe APP nucleic acid at the N-terminus of beta-amyloid″,Nat Nucleic acidt1345-347(1992).
Murphy,GM Jr.et al.″Development of a monoclonal antibody specific forthe COOH-terminal of beta-amyloid 1-42 and its immunohistochemicalreactivity in Alzheimer′s Disease and related disorders”,Am J Path144(5)1082-1088(1994).
Murrell,J et al.,″A mutation in the amyloid precursor protein associated withhereditary Alzheimer′s Disease″,Science25497-99(1991).
Muzyczka,N,″Use of adeno-associated virus as a nucleic acidral transductionvector for mammalian cells″,Curl Top Microbiol Immunol158(97)97-129(1992).
Neve,RL et al.,″Expression of the Alzheimer amyloid precursor nucleic acidtranscripts in the human brain″,Neuron1669-677(1988).
Nishimoto,I et al.,″Alzheimer amyloid protein precursor complexes withbrain GTP-binding protein G(o)″,Nature36275-79(1993).
Orlandi et al.,″Cloning immunoglobulin variable domains for expression bythe polymerase chain reaction″,Proc Nat Acad Sci USA863833-3837(1989).
Palmiter,RD et al.,″Metallothionein-human GH fusion nucleic acidsstimulate growth of mice″,Science222809-814(1983).
Pericak-Vance,MA et al.,″Linkage studies in familial Alzheimer diseaseevidence for chromosome 19 linkage″,Am J Hum Nucleic acidt481034-1050(1991).
Piccioli,P et al.,″Neuroantibodiesmolecular cloning of a monoclonalantibody against substance P for expression in the central nervous system″,Proc Nat Acad Sci USA885611-5615(1991).
Piccioli,P et al.,″Neuroantibodiesectopic expression of a recombinant anti-substance P antibody in the central nervous system of transgenic mice″,Neuron15373-384(1995).
Pleasure,SJ et al.,″NTera 2 cellsa human cell line which displayscharacteristics expected of a human committed neuronal progenitor cell″,JNeurosci Res.35,585-602(1993).
Ponte,P.et al.,“A new A4 amyloid mRNA contains a domain homologous toserine proteinase inhibitors”,Nature331525-527(1988).
Richardson,JH et al.,“Phenotypic knockout of the high-affinity humaninterleukin 2 receptor by intracellular single-chain antibodies against thealpha subunit of the receptor”,Proc Nat Acad Sci USA923137-3141(1995)Roch,JM et al.,“Biologically active domain of the secreted form of theamyloid beta/A4 protein precursor”,Ann NY Acad Sci.695149-157(1993).
Roher,AE et al.,″Morphological and biochemical analyses of amyloid plaquecore proteins purified from Alzheimer disease brain tissue″,J Neurochem611916-1926(1993).
Rumble,B et al.,″Amyloid A4 protein and its precursor in Down′s syndromeand Alzheimer′s Disease″,N Engl J Med3201446-1452(1989).
Theo,TC et al.,″Spatial resolution of fodrin proteolysis in postischemicbrain″,J Biol Chem26825239-25243(1993).
Theo,TC et al.,″Spatial resolution of the primary beta-amyloidogenic processinduced in postischemic hippocampus″.J Biol Chem26915253-15257(1994).
Saitoh,T et al.,InAmyloid Protein Precursor in Development,Aging andAlzheimer′s Disease,C.L.Masters,ed.(Heidelberg,Germany,Springer-Verlag(1994).
Salbaum,JM,et al.,″The promoter of Alzheimer′s Disease amyloid A4precursor nucleic acid″,EMBO J72807-2813(1988).
Samulski,RJ et al.,″A recombinant plasmid from which an infectious adeno-associated virus genome can be excised in vitro and its use to stuay viralreplication″,J Virol613096-3101(1987).
Samulski,RJ et al.,″Helper-free stocks of recombinant adeno-associatedvirusesnormal integration does not require viral nucleic acid expression″,JVirol633822-3828(1989).
Samulski,R.J et al.,″Targeted integration of adeno-associated virus(AAV)into human chromosome 19″,EMBO J103941-3850(1991).
Schellenberg,G.D.et al.,″Nucleic acidtic linkage evidence for a familialAlzheimer′s Disease locus on chromosome 14″Science258668-671(1992).
Schehr,RS,″Therapeutic approaches to Alzheimer′s Disease.An informalsurvey of promising drug discovery strategies″.Biotechnology 12140-144(1994).
Schubert,D et al.,″The regulation of amyloid beta protein precursor secretionand its modulatory role in cell adhesion″,Neuron3689-694(1989).
Seubert,P et al.,″Isolation and quantification of soluble Alzheimer′sbeta-peptide from biological fluids″,Nature359325-327(1992).
Shoji,M et al.,″Production of the Alzheimer amyloid beta protein by normalproteolytic processing″,Science258126-129(1992).
Sisodia,S et al.,″Role of the beta-amyloid protein in Alzheimer′s Disease″,FASEB J366-369(1995).
Sisodia,S et al.,″Beta-amyloid precursor protein cleavage by amembrane-bound protease″,Proc Nat Acad Sci USA896075-6079(1992).
Snow,AD et al.,″Differential binding of vascular cell-derived proteoglycans(perlecan,biglycan,decorin,and versican)to the beta-amyloid protein ofAlzheimer’s Disease”,Arch Biochem Biophys32084-95(1995).
Snow AD et al.,“Proteoglycans in the pathnucleic acidsis of Alzheimer’sDisease and other amyloidoses”,Neurobiol Aging10(5)481-97(1989)Solomon B et al.,“Disaggregation of Alzheimer beta-amyloid by site-directedmAb”,Proc Nat Acad Sci USA944109-4112(1997).
Steward,TA et al.,“Human beta-globinnucleic acid sequences injected intomouse eggs,retained in adults,and transmitted to progeny”,Science2171046-1048(1982).
Suzuki,N et al.,“An increased percentage of long amyloid beta proteinsecreted by familial amyloid beta protein precursor(beta APP717)mutants”,Science2641336-1340(1994).
Tagliavini,F et al.,“Preamyloid deposits in the cerebral cortex of patientswith Alzheimer’s Disease and nondemented individuals”,Neurosci Lett93191-196(1988).
Tanzi,RE et al.,“Protease inhibitor domain encoded by an amyloid proteinprecursor mRNA associated with Alzheimer’s Disease”,Nature331528-530(1988).
Tanzi,RE et al.,“Assessment of amyloid beta-protein precursor nucleic acidmutations in a large set of familial and sporadic Alzheimer disease cases”,Am J Hum Nucleic acidt51273-282(1992).
Van Broeckhoven,C et al.,“Failure of familial Alzheimer’s Disease tosegregate with the A4-amyloid nucleic acid in several European families”,Nature329153-155(1987).
Wagner,EF et al.,“The human beta-globin nucleic acid and a functional viralthymidine kinase nucleic acid in development mice”,Proc Nat Acad Sci USA785016-5020(1981).
Wan,CP et al.,“An antomated micro-fluorometric assay for monitoringoxidative burst activity of phagocytes”,J Immunol Meth159131-138(1993).
Ward,ES et al.,“Binding activities of a repertoire of single immunolobulinvariable domains secreted from Escherichia coli”,Nature341544-546(1989).
Weidemann,A et al.,“Identification,binucleic acidsis,and localization ofprecursors of Alzheimer’s Disease A4 amyloid protein”,Cell57115-126(1989).
Wertkin,AM et al.,“Human neurons derived from a teratocarcinoma cell lineexpress solely the 695-amino acid amyloid precursor protein and produceintracellular beta-amyloid or A4 peptides”,Proc Nat Acad Sci USA909513-9517(1993).
Wigler,M.et al.,“DNA-mediated transfer of the adeninephosphoribosyltransferase locus into mammalian cells,”Proc Nat Acad SciUSA761373-1376(1979).
Wirak et al.,″Regulatory region of human amyloid precursor protein(APP)nucleic acid promotes neuron-specific nucleic acid expression in the CNS oftransgenic mice″,EMBO J10289-296(1991).
Wisniewski,T et al.,″Acceleration of Alzheimer′s fibril formation byapolipoprotein E in vitro″,Am J Pathol1451030-1035(1994).
Wisniewski,T et al.,″Peptides homologous to the amyloid protein ofAlzheimer′s Disease containing a glutamine for glutamic acid substitutionhave accelerated amyloid fibril formation″.Biochem Biophys Res Commun1791247-1254(1991).
Wood,SJ et al.,″Selective inhibition of Abeta fibril formation″,J Biol Chem2714086-4092(1996).
Wu,P et al.,″Differential neuropeptide Y nucleic acid expression inpost-mitotic versus dividing neuroblastoma cells driven by anadeno-associated virus vector″,Brain Res Mol Brain Res2427-33(1994).
Wu,P et al.,″Sendai virosomal infusion of an adeno-associated virus-derivedconstruct containing neuropeptide Y into primary rat brain cultures″,NeurosciLett19073-76(1995).
Yamaguchi,H et al.,″Electronmicrograph of diffuse plaques.Initial stage ofsenile plaque formation in the Alzheimer brain″,Am J Pathol135593-597(1989).
Yamaguchi,H et al.,″Ultrastructural localization of Alzheimer amyloidbeta/A4 protein precursor in the cytoplasm of neurons and senileplaque-associated astrocytes″,Acta Neuropathol8213-20(1992).
Yan,SD et al.,″RAGE and amyloid-beta peptide neurotoxicity inAlzheimer′sdisease″,Nature382685-691(1996).
Yankner.BA et al.,″Seminars in medicine of the Beth Israel Hospital,Boston.beta-Amyloid and the pathonucleic acidsis of Alzheimer′s Disease″,N Eng JMed3251849-1857(1991).
Zhu,N et al.,″Systemic nucleic acid expression after intravenous DNAdelivery into adult mice″,Science261209-211(1993).
序列表<110>明德赛特生物制药美国公司<120>淀粉样β肽的特异性抗体、其药物组合物及其应用方法<130>ILATA0057<140>PCT/US02/31590<141> 2002-10-21<150>10/084,380<151>2002-02-28<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>59<212>PRT<213>human<400>1Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Ala His Asp Ser Gly Tyr Glu Val1 5 10 15His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25 30Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val35 40 45Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys50 55<210>2<211>6<212>PRT<213>human<400>2Asp Ala Glu Phe Arg Cys1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>human<400>3Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Cys1 5<210>4<211>8
<212>PRT<213>human<400>4Cys Leu Met Val Gly Gly Val Val1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>human<400>5Cys Val Gly Gly Val Val Ile Ala1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>human<400>6Asp Ala Glu Phe Arg His1 5<210>7<211>13<212>PRT<213>human<400>7Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His1 5 10<210>8<211>4<212>PRT<213>human<400>8Glu Phe Arg His1<210>9<211>6<212>PRT<213>human<400>9Glu Val His His Gln Cys1 5<210>10
<211>12<212>PRT<213>human<400>10Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln1 5 10<210>11<211>8<212>PRT<213>human<400>11Cys Gly Gly Val Val Ile Ala Thr1 5<210>12<211>13<212>PRT<213>human<400>12Asn Lys Gly Ala Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val1 5 10<210>13<211>14<212>PRT<213>human<400>13Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr1 5 10
权利要求
1.一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种用于治疗患有阿尔茨海默氏症的患者的药物中的用途。
2.一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种用于治疗患有以淀粉样蛋白β沉积为特征的疾病或紊乱的患者的药物中的用途。
3.一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种用于延迟或抑制或压制淀粉样β肽或其片段在脑中聚集的药物中的用途。
4.一种靶向淀粉样β肽或其片段的抗体在制备一种用于延迟或抑制或压制淀粉样β肽或其片段的神经毒性的药物中的用途。
5.权利要求1-4中任一项的用途,其中所述抗体针对淀粉样β肽或其片段。
6.权利要求1-4中任一项的用途,其中所述抗体针对N端截短的淀粉样β肽片段。
7.权利要求1-4中任一项的用途,其中所述抗体针对C端截短的淀粉样β肽片段。
8.权利要求1-4中任一项的用途,其中所述抗体针对淀粉样前体蛋白或其片段。
9.权利要求1-4中任一项的用途,其中所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人工抗体、scFv抗体或F(ab)、或其片段。
10.权利要求2的用途,其中所述的以淀粉样蛋白β沉积为特点的紊乱或疾病是轻度认知损害(MCI)、淀粉样脑血管病变或congiophylic血管病、唐氏综合征相关的阿尔茨海默氏症或包涵体肌炎。
11.一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向淀粉样β肽的游离N端。
12.一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向淀粉样β肽的游离N端,其中所述淀粉样β肽的第一个氨基酸是天冬氨酸。
13.一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离N端。
14.一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向淀粉样β肽Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41或Aβ1-43的游离C端。
15.一种抗体,其对游离端具有特异性并靶向N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离C端。
16.一种单链或人工抗体,其对游离端具有特异性并靶向淀粉样β肽Aβ1-42的游离C端。
17.权利要求11-15中任一项的抗体,其中所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人工抗体、scFv抗体或F(ab)、或其片段。
18.一种药物组合物,其包含一定量的权利要求11-16中任一项的抗体和一种药学可接受的载体。
19.权利要求18的药物组合物,其中所述组合物通过皮下、静脉、皮内、肌内、腹腔内、脑内、鼻内、口服、透皮、面颊、动脉内、颅内或头部内给药。
20.权利要求11-16中任一项的抗体在制备一种用于治疗患有阿尔茨海默氏症的患者的药物中的用途。
21.权利要求11-16中任一项的抗体在制备一种用于治疗患有以淀粉样蛋白β沉积为特征的疾病或紊乱的患者的药物中的用途。
22.权利要求11-16中任一项的抗体在制备一种用于延迟或抑制或压制淀粉样β肽或其片段在脑中聚集的药物中的用途。
23.权利要求11-16中任一项的抗体在制备一种用于延迟或抑制或压制淀粉样β肽或其片段的神经毒性的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及治疗患有阿尔茨海默氏症的患者的方法,包含施用靶向淀粉样β肽或其片段的抗体分子的步骤。在另一个实施方案中,本发明涉及一种治疗以淀粉样蛋白β沉积为特点的疾病或紊乱的方法。在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体分子,其对于淀粉样β肽的N端或C端的游离端具有特异性,并涉及它的一种药物组合物。在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗体分子,其靶向N和/或C端截短的淀粉样β肽片段的游离的C或N端。
文档编号A61K48/00GK1649623SQ02828857
公开日2005年8月3日 申请日期2002年10月21日 优先权日2002年2月28日
发明者丹尼尔·G.·钱恩 申请人:明德赛特生物制药美国公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1