专利名称：一种贝壳杉烷型二萜化合物及制法和在抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物及其制法，具体地说是以光叶番荔枝为原料提取的一种抗癌活性物质贝壳杉烷型二萜化合物及其制备方法。
背景技术：
癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症的高发区域，癌症死亡率居高不下。
目前尚无有效的药物治愈大多数癌症患者。化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，如参莲胶曩对肺、胃癌的癌灶缓解率为3.5％，软坚口服液对肝癌的癌灶缓解率为6.0％，疗效均不理想。
本发明人研究了光叶番荔枝(又名圆滑番荔枝，Annona glabra Linn)的根皮或树皮、或枝叶、或种子、或者它们的混合物的乙醇提取物的制剂，经动物试验表明对动物移植性肉瘤S180和肝癌H22均有显著的体内抗癌治疗效果，(见中国专利，抗癌药物光叶番荔枝浸膏及其制法，申请号为01108285.2)。在上述基础上，本发明人又从浸膏中提取出抗癌单体化合物(活性成分)。
发明内容
1、发明目的本发明的目的是提供一种高效低毒、抗癌谱广的抗癌单体化合物，具体地说是以光叶番荔枝为原料提取的一种贝壳杉烷型二萜化合物及其在制备治疗肝癌、食管癌的药物方面的应用。
2、技术方案本发明人在现有技术的基础上又作了进一步的研究，发现光叶番荔枝茎叶的浸膏中其抗癌的活性成分主要是本发明的贝壳杉烷型二萜化合物。并经资料查阅目前还没有文献报道贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid用于抗肝癌、食管癌等癌症的治疗。本发明从光叶番荔枝(又称圆滑番荔枝，Annona glabra Linn)中提取的一种贝壳杉烷型二萜化合物，它是ent-kaur-16-en-19-oic acid，其分子式为C20H30O2，化学结构式如下 一种贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid的制备方法，其步骤是A、将风干的光叶番荔枝茎粉碎后用乙醇加热提取，回收乙醇然后将提取液浓缩，得浸膏；B、把浸膏再用氯仿提取，得氯仿提取液；C、将氯仿提取液进行硅胶(100-200目)柱层析，用3000ml石油醚-氯仿(2∶1)为洗脱剂A洗脱，得到提取物；D、将步骤C中所得的提取物再进行硅胶(200-300目)柱层析，用3000ml石油醚-乙酸乙脂(100∶2)为洗脱剂B，得到首先洗脱下的化合物即为本发明的贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid。它可以用乙酸乙酯重结晶纯化。
本发明涉及一种贝壳杉烷型二萜化合物在制备治疗肝癌的药物方面的应用。
采用常规MTT法。取对数生长期SMMC-7721肝癌细胞，用完全培养液调整细胞浓度为5×105/ml，接种细胞于96孔板(5×104/孔)，24h后实验组分别加入化合物终浓度为10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L、160umol/L，另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)。加药后将96孔板置于CO2温箱37℃培养。加药培养72h后，每孔加入5mg/mlMTT试剂10ul，继续培养4h，再加入DMSO100ul，放震荡器震荡15min，用酶标仪(λ570nm)测每孔OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
实验结果表明，随贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid浓度的升高，对人肝癌细胞的抑制率也升高，二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid在10umol/L以上剂量对人肝癌细胞生长均有明显的抑制作用，其中160umol/L浓度的抑制作用最高，其抑制率达80.49％。
本发明涉及一种贝壳杉烷型二萜化合物在制备治疗食管癌的药物方面的应用。
采用MTT法测定光叶番荔枝贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid(用无水乙醇配制)对食管癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的食管癌细胞调整至1×105/ml，0.2ml接种于96孔板上，置37□、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度光叶番荔枝贝壳杉烷型二萜化合物培养液各0.2ml(每种单体设7个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37□4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
实验结果表明，随光叶番荔枝贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid浓度的升高，对食管癌细胞的抑制率也升高，二萜化合物ent-kaur-16-eh-19-oic acid在0.25×10-7mol/L以上剂量对食管癌细胞生长有明显抑制作用，其中1×10-7mol/L剂量的抑制作用最高，其抑制率达60.42％。
根据本发明人的研究，光叶番荔枝贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid可以用于制备抗肝癌或抗食管癌药物。
3、有益效果本发明的贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid是从植物光叶番荔枝中提取的抗癌单体化合物，毒副作用小，抗癌谱广，对癌细胞有很明显的抑制作用。本发明的贝壳杉烷型二萜化合物经抗癌药理实验，结果表明其抗癌活性高。光叶番荔枝贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid在0.25×10-7mol/L浓度以上，对食管癌细胞生长有明显的抑制作用，在1×10-7mol/L剂量时抑制作用最高，其抑制率达60.42％；在10umol/L以上剂量对人肝癌细胞生长均有明显抑制作用，其中160umol/L剂量的抑制作用最高，其抑制率达80.49％。
具体实施例方式
实施例1光叶番荔枝贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid提取方法①光叶番荔枝植物样品采自海南，经自然风干后粉碎，粉碎的光叶番荔枝茎3.5kg，用95％的酒精3000ml回流提取，回收乙醇后浓缩得浸膏300g；②将浸膏再用氯仿提取，得到氯仿提取液；③将氯仿提取液，经硅胶(100-200目，2kg)进行柱层析，以3000ml石油醚-氯仿(2∶1)为洗脱剂A，得到提取物部分；④将提取物再用硅胶(200-300目)300g进行柱层析，以3000ml石油醚-乙酸乙酯(100∶2)为洗脱剂B进行洗脱，每50ml洗脱液为一个单位分别接受，将洗脱液分别作硅胶薄板层析，薄板喷香草醛硫酸溶液后在105℃下加热3分钟显色，合并相同的洗脱液，最先洗脱下的化合物即为本发明的贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oicacid。
实施例2贝壳杉烷型二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid结构鉴定ent-kaur-16-en-19-oic acid为无色块状结晶，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，熔点166-169℃(CHCI3)。1HNMR提示ent-kaur-16-en-19-oic acid为贝壳杉烷型二萜化合物。分子式C20H30O2，其化学结构式如下 实施例3ent-kaur-16-en-19-oic acid的抗食管癌作用1、细胞培养与单体化合物食管癌细胞株(Eca-109)由南京中医药大学微生物教研室提供。细胞培养于199培养液中，内加10％小牛血清，培育在37℃、5％CO2培养箱内。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜化合物ent-kaur-16-eh-19-oic acid。
2、实验方法采用MTT法测定光叶番荔枝二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid(用无水乙醇配制)对食管癌细胞生长抑制作用。取对数生长期的食管癌细胞调整至1×105/ml，0.2ml接种于96孔板上，置37℃、5％CO2培养24h后弃原培养液，加入含不同浓度光叶番荔枝二萜化合物培养液各0.2ml(每种单体设7个浓度)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)，并设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)。作用24h后倾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶标仪570nm处测OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
3、实验结果结果如表1显示，随光叶番荔枝二萜化合物浓度的升高，对食管癌细胞的抑制率也升高，二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid在0.25×10-7mol/L以上剂量对食管癌细胞生长有明显抑制作用。表1 光叶番荔枝二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid对食管癌细胞生长抑制作用(n＝9)药物浓度(mol/L)OD值(A+S) 抑制率(％)0 0.331+0.0110.0二萜化合物 1×10-70.131±0.006**60.420.5×10-70.190±0.008*42.600.25×10-70.229±0.005*30.82*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较实施例4二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid的抗肝癌作用1、细胞培养与化合物将人肝癌细胞株SMMC-7721常规培养于含10％灭活小牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMl1640培养液中，置饱和湿度、37℃的5％CO2温箱培养。单体化合物是经化学结构鉴定的光叶番荔枝二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid。
2、实验方法采用常规MTT法。取对数生长期SMMC-7721细胞，用完全培养液调整细胞浓度为5×105/ml，接种细胞于96孔板(5×104/孔)，24h后实验组分别加入二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid终浓度为10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L、160umol/L，另设无药物(含配制药物的乙醇)培养液和空白对照孔(同时作3个板)，每个浓度设9个复孔(分3次重复)。加药后将96孔板置于CO2温箱37℃培养。加药培养72h后，每孔加入5mg/mlMTT试剂10ul，继续培养4h，再加入DMSO100ul，放震荡器震荡15min，用酶标仪(λ570nm)测每孔OD值。抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。
3、实验结果结果如表2显示，随光叶番荔枝二萜化合物浓度的升高，对人肝癌细胞的抑制率也升高，二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid在10umol/L以上剂量对人肝癌细胞生长均有明显抑制作用。表2 光叶番荔枝二萜化合物ent-kaur-16-en-19-oic acid对肝癌细胞生长的抑制作用(n＝9)药物浓度(umol/L) OD值(A±S) 抑制率(％)0 1.435±0.132 0.0二萜化合物10 0.983±0.084*31.5020 0.831±0.096**42.0940 0.734±0.057**48.8580 0.465±0.023**67.60160 0.280±0.031**80.49*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较
权利要求
1.一种抗癌药物贝壳杉烷型二萜化合物，其特征是它是ent-kaur-16-en-19-oicacid，分子式为C20H30O2，其化学结构式如下
2.一种制备权利要求1所述的ent-kaur-16-en-19-oic acid的方法，其特征是包括下列步骤A、将风干的光叶番荔枝茎粉碎后用乙醇加热提取，回收乙醇然后将提取液浓缩，得浸膏；B、把浸膏，再用氯仿提取，得氯仿提取液；C、将氯仿提取液进行硅胶(100-200目)柱层析，用石油醚-氯仿为洗脱剂A洗脱，得到提取物；D、将步骤C中所得的提取物再进行硅胶(200-300目)柱层析，用石油醚-乙酸乙脂为洗脱剂B，得到首先洗脱下的化合物即为本发明的ent-kaur-16-en-19-oic acid。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤A中乙醇浓度为95％，用量为3000ml。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤C中洗脱剂A石油醚-氯仿以2∶1配比，用量为3000ml。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤D中洗脱剂B石油醚-乙酸乙脂以100∶2配比，用量为3000ml。
6.权利要求1所述的ent-kaur-16-en-19-oic acid在制备抗食管癌或肝癌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的ent-kaur-16-en-19-oic acid在制备抗食管癌或肝癌药物中的应用，其特征是ent-kaur-16-en-19-oic acid在0.25×10-7mol/L以上剂量对食管癌细胞生长有明显抑制作用；在10umol/L以上剂量对人肝癌细胞生长均有明显抑制作用。
8.根据权利要求7所述的ent-kaur-16-en-19-oic acid在制备抗食管癌或肝癌药物中的应用，其特征是ent-kaur-16-en-19-oic acid在1×10-7mol/L剂量时，对食管癌细胞生长的抑制作用最高，其抑制率为60.42％；在160umol/L剂量时，对人肝癌细胞生长的抑制作用最高，其抑制率为80.49％。
全文摘要
一种抗癌药物贝壳衫烷型二萜化合物，它是从光叶番荔枝茎中提取得到的抗癌单体化合物，其制备方法是首先将风干的光叶荔枝茎粉碎后用乙醇提取，浓缩得浸膏；其次，再用氯仿提取，经柱层析，用洗脱剂脱洗后再柱层析；最后再用洗脱剂脱洗而得到贝壳杉烷型二萜化合物，经抗癌药理实验，对食管癌细胞，人肝癌细胞的生长有明显的抑制作用，并具有高效低毒、毒副作用小、抗癌谱广、抗癌活性高等优点。
文档编号A61K31/185GK1431187SQ0311270
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月17日 优先权日2003年1月17日
发明者章永红 申请人:南京中医药大学