专利名称：一种喹诺里西啶类生物碱的抗柯萨奇病毒作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种喹诺里西啶类生物碱，更具体指槐定碱(Sophoridine)，经药理试验证明对病毒性心肌炎治疗有效，，它可在制备治疗病毒性心肌炎药物中应用。
背景技术：
病毒性心肌炎是由多种病毒(如柯萨奇B族病毒)引起的，以心肌细胞变性坏死、间质单个核细胞浸润为主要病变的一种临床常见病，严重危害人类健康。
目前，西医临床治疗病毒性心肌炎的主要方法是使用普通抗病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞营养剂等，但疗效并不理想。
近年来，药理研究和临床试验表明，中药在病毒性心肌炎的临床治疗中显示出极大优势。目前临床上针对病毒性心肌炎的中成药只有个别品种，且为粗提物制剂(如芪冬颐心口服液)，大多为医生自拟的处方汤药，急需开发出疗效确切，有效成分和药理作用清楚，剂型先进，服用方便，质量稳定可控的中药制剂。
槐定碱(Sophoridine)可从苦参、苦豆子等植物中提取得到，文献报道有镇痛、抗肿瘤、抗心律失常等药理作用，但未见抗柯萨奇B族病毒(CoxsackieGroup B Virus)及治疗病毒性心肌炎的报道。
发明内容
本发明的目的是克服常规多味汤药存在的不足之处，采用化学方法从苦参等植物中提取分离出一种喹诺里西啶类生物碱——槐定碱，经药理试验，证实该化合物可在制备治疗病毒性心肌炎的药物中应用。
槐定碱的提取方法如下(以苦参为例)中药苦参粗粉用甲醇室温浸渍3次，每次24h。甲醇提取液浓缩后加水稀释，用稀HCl调PH3～4，乙醚洗2次，所得酸水液浓缩后加NaOH调至pH3，加入二氯甲烷提取生物碱，所得二氯甲烷提取液回收后的残留物溶于氯仿中，然后加入适量乙醚，将溶液浓缩，残留液采用氧化铝柱层析，用石油醚-丙酮洗脱，分离获得纯化合物槐定碱(Sophoridine)。它的分子式为C15H24ON2，分子量为248。
它的化学结构式如下 槐定碱提取工艺参考“中药化学成分提取分离手册”，杨云主编，中国中医药出版社，1998年第一版。
本发明采用上述方法提取获得的槐定碱首先进行药效试验。
将槐定碱分成两个剂量组，Balb/c小鼠随机分为4组。
1、正常对照组不给槐定碱，不接种病毒，只给等量蒸馏水；2、病毒对照组每只腹腔接种0.1mlCVB3病毒液(TCID50＝10-7.5，105倍稀释)。
3、给药组I-高剂量同上法接种CVB3病毒液，同日灌胃槐定碱0.15mmol/kg·d(槐定碱用生理盐水配制成2.85mg/ml)，连续给药7天，观察15天；4、给药组II-低剂量灌胃槐定碱，剂量为0.075mmol/kg·d；结果病毒组死亡80％，本发明药物能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，高剂量组可降低到35％，低剂量组可降低到50％。
本发明采用上述试验的剂量分组，连续给药7天，观察15天，然后将小鼠解剖，在解剖前秤小鼠体重，解剖后再秤取其心脏重量，然后计算出它的心指数。计算方法为心指数＝心重/体重当动物被病毒感染后，摄食量减少，体重降低，而心脏却因此膨大，发生纤维化而变重，所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度，心指数越大，心脏病变越严重。
结果显示，本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数。
本发明采用上述试验的剂量、分组，连续给药7天，观察15天，然后将小鼠解剖，心肌标本置于反复冻融使病毒颗粒释放，取病毒稀释液将心肌标本病毒悬液连续做10倍稀释，将其接种于Hep-2细胞上(96孔板)，测定心肌样本的病毒滴度。
实验结果表明，本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心脏病毒滴度。
注以上药理试验方法参考《现代药理实验方法》(下册，P1425，张均田主编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年版)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不对其有任何限制。
实施例1本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响试验取Balb/c小鼠56只，随机分为4组。
正常对照组6只，不给本发明药物，也不接种病毒，只给等量蒸馏水。
病毒对照组10只，每只腹腔接种0.1mlCVB3病毒液(TCID50＝10-7.5，105倍稀释)。
给药组高剂量20只，接种CVB3病毒液，同日按0.15mmol/kg·d灌胃给予本发明药物，连续给药7天，观察至第15天。
低剂量20只，接种病毒及给予本发明药物，剂量为0.075mmol/kg·d观察记录给药(饲养)期间动物的精神状态、饮食、毛色及死亡等情况。
结果本发明药物两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，见表1。
表1 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响组别 动物数(只) 死亡率(例数)正常对照组6 0(0)病毒对照组10 80％(8)给药高剂量组 20 35％(7)**给药低剂量组 20 50％(10)*注采用卡方检验，给药组与病毒组比较，*有统计意义。
实施例2本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响试验Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例1。连续给药7天，观察到第15天，将所有小鼠全部解剖。在解剖前秤小鼠的体重，解剖后再秤取其心脏重量。
心指数＝心重/体重当动物被病毒感染后，摄食量减少，体重降低，而心脏却因此膨大、发生纤维化而变重，所以可以用心指数来衡量心脏的病变程度，心指数越大，心脏病变越严重。
结果本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心指数，见表2。
表2本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心指数的影响组别 心指数(×10-3)正常对照组5.80±0.60病毒对照组6.56±1.33给药高剂量组 6.08±1.17*
给药低剂量组 6.40±0.84注给药组与病毒组比较*p＜0.05，**p＜0.01实施例3本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心脏病毒滴度的影响试验Balb/c小鼠分组及给药剂量同实施例1。连续给药7天，观察到第15天，将所有小鼠全部解剖。将心肌标本置于0.5ml无菌水中反复冻融三次后，病毒颗粒将从心肌中释放出来，取病毒稀释液将心肌标本病毒悬液连续做101-105倍稀释，将其接种于Hep-2细胞上(96孔板)，每个样本接种3个孔，连续观察5天，观察细胞的TCID50，记录最后一天细胞出现TCID50病毒稀释度。记录方法如出现50％以上细胞病变的冻融病毒液的最低稀释度为10-5，即为TCID50＝10-5，为便于统计，取负对数将其换算，即-LgTCID50＝5。取3个孔的平均值即为该样品的病毒中和指数。
中和指数的大小与病毒毒力成正比，指数越大则毒力越强；指数小则毒力弱，提示药物的抗病毒药效。
结果本发明药物的高剂量组能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的心脏病毒滴度，结果见表3。
表3 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠心脏病毒滴度的影响病毒滴度正常对照0病毒对照1.26给药高剂量组0.67*给药低剂量组1.2注给药组与病毒组比较*p＜0.05，**p＜0.01注以上药理试验方法参考《现代药理实验方法》(下册，P1425，张均田主编，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年版)。
权利要求
1.一种如下结构 的喹诺里西啶类生物碱中的槐定碱，其特征在于它可用于制备抗柯萨奇B族病毒及治疗病毒性心肌炎药物中应用。
全文摘要
本发明涉及一种喹诺里西啶类生物碱的抗柯萨奇病毒作用，具体指槐定碱(Sophoridine)，经药理试验证明可抑制柯萨奇B族病毒(Coxsackie Group B Virus)及治疗病毒性心肌炎，可在制备抗柯萨奇B族病毒及治疗病毒性心肌炎药物中应用。
文档编号A61K31/4353GK1537852SQ0311640
公开日2004年10月20日 申请日期2003年4月14日 优先权日2003年4月14日
发明者黄成钢, 朱海燕, 张媛媛, 王新亮, 王冰 申请人:中国科学院上海药物研究所