紫蓝素化合物、其制备方法及其用途的制作方法

专利名称：紫蓝素化合物、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂环化合物，具体地说是一种与碳环稠合的有三个氮原子作为仅有的环杂原子的环或有两个氮原子和一个氧原子作为仅有的环杂原子的环的杂环化合物，本发明还涉及该化合物制备方法，以该化合物为活性成份的药物组合物，以及其在防治糖尿病，乙型肝炎，和作为抗氧化药物及保健品上的用途，及作为着色剂的用途。
乙型病毒性肝炎，是当前危害人类健康的传染病，具有传染性强、传播途径多，流行面广泛，发病率高，难以治愈等特点。全世界有3亿乙肝病毒携带者，其中亚州2.25亿，我国有1.2亿。我国是乙肝高发区，乙肝病毒携带者占全世界的40％，而且现在有近3000万人因乙肝导致肝功能不正常，其中1200万人成为慢性乙肝患者，每年因乙肝死亡的约有15万人。乙肝病毒携带者中HbsAg，HbeAg双阳性者，生活，社交，就学，就业均受到不同程度的限制，给家庭，社会造成极大的精神负担。慢性乙肝病程长，难治愈，易反复，并引起癌症的发生，患者的身心健康负担很大。据不完全统计，1991年我国用于乙肝治疗的公费医疗费用达223亿元之巨。总之，乙肝对人类有着严重的危害。
对乙型肝炎的治疗，西药有干挠素，干挠素诱导剂、核苷衍生物等等。干挠素为首选药物，但存在用药剂量大，费用高，毒副作用大，有效率不高(30％-40％)，停药后易复发等缺点。其中西药也有类似问题。天然药物有甘草甜素，水飞蓟素，中药有叶下珠，水芹，诃子等单味药和多种复方中药，但效果还不能令人满意，迫切需要提供新的治疗乙肝有效药物。
由于环境因素，饮食因素，生活因素的影响，现代人体内自由基代谢常常容易失去平衡。自由基的生成和清除的平衡对于生命过程的正常进行非常重要，只有氧自由基的产生和清除处于平衡时，身体才能保持健康。自由基过多或清除能力不足，体内就有多余的自由基，引起组织损伤，脂质过氧化，酶失活，蛋白质变化，DNA突变，免疫功能低下，导致疾病的发生，最明显的是癌，心脑血管疾病和衰老的发生。抑制脂质过氧化物生成的药物可以保护组织免受自由基损伤，有补虚，扶正固体的功能，对多种疾病有防治意义并有较广的保健作用，它不但可以延缓衰老，而且还可以减少心、脑血管疾病和癌症的发生，还具有美容作用，被称作体内美容，比化妆品美容效果更好。
山蓝为爵床科植物红丝线Peristrophe baphia(Spreng.)Bremek.[Peristrophe roxbueghiana(schult)Bremek]及五指山蓝Peristrophelancedia Nees，已有提取食用着色剂及药用的报道，且已有人从其中分离、鉴定了不同的化合物，如《药学学报》1999年第34卷第8期596-599页，覃洁萍等所作《红丝线中两个新化合物的结构鉴定》一文中，报道了红丝线酰胺及红丝线素；《广州中医学院学报》1989年第5卷第4期247-249页，胡燕等所作《草药红丝线的降压成分》一文中，报道了其中的羽扇豆醇、羽扇豆酮、β-谷甾醇；《云南植物研究》1989年第11卷第4期476-478页，魏孝义等所作《五指山蓝叶中的一种花青甙》报道了其中的花青甙。
本发明的另一个目的是提供从山蓝中制备上述化合物的方法。
本发明的进一步目的是提供一种防治乙型肝炎、糖尿病、抑制脂质过氧化物的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供上述化合物在制备治疗防治乙型肝炎、糖尿病、抑制脂质过氧化物的药物及作为着色剂的用途。
本发明还提供一种含有紫蓝素为活性成份或指标成分的植物加工品的加工方法。
1>化合物本发明公开一种杂环化合物，该化合物具有如下通式的结构 其中R为γ-羟基谷氨酸HOOCCH(OH)CH2CH(NH2)COOH残基-γ-羟基谷氨酸有2个活性基团被其他基团取代而残余的部分，其中γ-羟基谷氨酸残基的1个羧基残基与-NH-成酰胺，羟基、氨基或另一个羧基之一的残基与取代的醌亚胺环成键相连，其核磁共振谱氢谱(1HNMR，500MHz，氘代吡啶-重水32为溶剂)化学位移为8.7(s，1H)，6.9(s，1H)，6.7(s，1H)，6.5(s，1H)，4.9(m，1H)，4.4(m，1H)，2.9(m，1H)，2.7(m，1H)，为紫蓝素(Zilanine)。
紫蓝素(Zilanine)，可从山蓝属植物制备，首先对山蓝鲜料进行加工，使其中的紫蓝胺酚转化为紫蓝素，然后对紫蓝素进行分离纯化，可得化合物紫蓝素；紫蓝素也可直接由鲜山蓝植物中提取的紫蓝胺酚制备，紫蓝素的形成见图3。紫蓝素的化学见图4。
申请人发现上述化合物具有抗乙型肝炎病毒，抗糖尿病，抗氧化等药理活性。可制备为防治乙型肝炎、糖尿病及抗氧化的新药、免疫增强剂、美容、抗衰老保健品。上述化合物亦为色素化合物，可用作着色剂。
2>化合物的制备方法A、山蓝鲜植物的加工本发明对山蓝进行加工方法的技术要点之一是在控制加热升温速率下对山蓝鲜植物进行快速加热。图5为紫蓝素的得率与升温速率的关系。升温速率越快，紫蓝素的得率越高。在10分钟内跨越50-70℃为适宜的加热速率，在6分钟内跨越50-70℃更好，最好是在瞬间(时间接近0)跨越50-70℃。加热升温速率对山蓝加工的影响是始料不及的。
快速升温加热的方法有直接加热方法和间接加热方法。直接加热方法有蒸汽加热，微波加热，热气流加热，热水加热，热油加热等，间接加热方法有通过传热介质传热的电加热、蒸汽加热、热水加热、燃气、燃煤加热等。将物料与热载体直接接触的升温加热，如果混合平衡温度高于70℃，物料从50℃升至70℃的时间几乎为0。
本发明对山蓝进行加工的方法之另一技术要点是采取避氧措施。在快速加热物料的同时，最好加上避氧措施。在避氧下加热处理鲜山蓝原料，与不避氧下加热处理相比，紫蓝素得率显著提高。这在山蓝鲜物料直接处于气体氛围时尤为明显。在不同温度下避氧和不避氧时紫蓝素的得率见图6。
避氧措施包括①液体热载体或热介质经脱氧处理，脱氧方法有超声，真空、加热、通惰性气体等等，惰性气体有N2、CO2、Ar等；②用无氧水产生蒸汽，或以除氧剂除去蒸汽中的氧；③在惰性气氛下用微波加热；④用无氧热气流加热。
本发明对山蓝进行加工的方法的又一技术要点是保温时间的控制。不同温度下，紫蓝素相对得率与保温时间的关系见图7。
在靠近100℃时，合适的保温时间约在5-90min之间，最好在15-80min之间，由于紫蓝素的前体物质——紫蓝胺酚热降解较快，时间范围窄，控制要求较高。在90℃左右时，合适的保温时间在20-150min左右，最好在30-120min之间。在80℃左右时，合适的保温时间在120-450min之间，最好在50-260min之间。不同温度下最佳保温时间可用如下回归关系式确定t＝1066.8-17.15T+0.0675T2T—温度(℃)t—时间(min)不同温度下最佳保温时间见表1表1不同温度下最佳保温时间温度T(℃)75 78 82 8690100最佳保温时间(min)160140115927035本发明对山蓝进行加工的方法的又一技术要点是保温温度的控制。不同保温温度下紫蓝素的得率见图6。适宜的保温温度大致为75-100℃，最好为78-90℃。温度在75℃以下时，紫蓝素得率低。温度在75-78℃左右时，得率受温度波动影响大，不易控制。温度在90-100℃时，鲜山蓝植物中的紫蓝素前体物质——山蓝胺酚热降解程度大，得率降低，且降解程度随时间的增加而明显增加，对时间控制要求高，需对物料及时冷却，工艺控制较为复杂。在78-90℃之间，紫蓝素得率高且较稳定，山蓝胺酚随时间降解不甚明显，对时间控制要求不高，工艺控制较为简单。
山蓝鲜料以蒸汽、微波、热气流或气体介质加热等不带提取过程的加热方式快速升温加热处理后，再经干燥加工可得山蓝干料，与直接晒干、阴干、烘干的山蓝干料相比，其紫蓝素有效成分含量明显提高，暗色物质少，用作药材品质好，并可直接用作着色剂。加上避氧措施及控制温度和时间进行快速升温加热保温，使鲜料中山蓝胺酚最大限度地转化为紫蓝素，所得干品质量进一步提高。干燥可采用阴干、真空干燥、热气流干燥，红外线干燥，微波干燥等方法。快速升温保温热处理加工后的后处理加工过程不需避氧。
采取本发明的方法，紫蓝素得率明显提高，产品固形物含量基本不变。着色剂色价明显提高，同时影响着色效果的杂质明显减少，产品质量明显提高。可在产品中加入赋形剂等辅料，如麦芽糊精，乳糖等，改善产品的物理性能，如吸湿性，溶能性，并维持高而稳定的有效成分或指标成分含量。同时，控制了从前未加以考虑的不良副反应，工艺的稳定性和产品质量稳定得到明显提高。提取、浓缩、干燥等后处理采用一般天然产物(热敏物质)的加工工艺。由于山蓝胺酚稳定性低，而紫蓝素稳定性高(100℃加热120min损失4.9％)，因此，最好将转化完成后的物料经空气或氧气充分氧化后再作后处理。
与以往技术相比，本发明采用高加热速率快速升温加热山蓝鲜料的方法，附加避氧措施，并控制温度和保温时间的技术，对山蓝植物进行加工。经快速升温加热处理并干燥可得山蓝干品，紫蓝素有效成分含量明显提高，作药材和着色剂质量较高；再加上避氧措施，紫蓝素有效成分含量进一步提高。结合提取、浓缩干燥等常规加工技术，可得山蓝提取物，紫蓝素含量和得率高、质量好，工艺稳定。
B、紫蓝素的精制纯化紫蓝素制备中的精制纯化方法，包括吸附-解吸、加酸沉淀、碱性溶剂洗涤的方法。
紫蓝素在络离子的存在下，或者在盐的存在下，易被非极性或弱极性吸附剂吸附，此吸附具有一定的选择性，因此可用吸附法精制纯化。
由于络离子可使吸附剂对紫蓝素的吸附能力产生选择性的变化，在有络离子和去除络离子存在下进行吸附—解吸或交替吸附—解吸，可使紫蓝素得到精制纯化。
紫蓝素经纯化后，在酸性下难溶于水，析出冻胶状沉淀，可利用此特性进一步精制、纯化。
紫蓝素难溶于有机溶剂，冻胶状沉淀经碱性溶剂分散处理，可进一步除去冻胶状物中的杂质，纯度进一步提高，难以干燥的冻胶状物转变为易干燥的粉末状固体。
络离子为阳离子，如Ca2+，Mg2+，NH4+等，其中最好为Mg2+离子。盐为无机盐或有机盐，如NaCl，KCl，(NH4)2SO4，NH4OAc等。吸附剂可以为合成吸附树脂，键合相硅胶等非极性或弱极性吸附剂。具体的吸附剂有Amberlite XAD-2，Amberlite XAD-4，Amberlite XAD-16树脂，C18键合硅胶等，但本发明不限于上述型号的吸附剂。
吸附可在中性(PH6.5-7.5)下进行，也可在酸性(PH1-6.5)下进行。在络合态下，紫蓝素被吸附剂吸附，在盐存在下吸附容量更大。由于植物原料中含有阳离子，在提取液中紫蓝素以络合态存在，初次吸附可直接用吸附剂吸附。如非初次吸附，可加入镁盐，如醋酸镁、硫酸镁等，保证紫蓝素呈络合态。在去除络离子的状态下，紫蓝素的吸附减弱，但在盐的存在下有较高的吸附力，可在盐的存在下吸附。
解吸可在中性或弱碱性下进行(PH6.5-9.0)，紫蓝素在强碱性下不稳定。解吸剂为水或与水在互溶溶剂的水溶液，如甲醇，乙醇，丙酮等。可用NaOH，KOH，Na2CO3，NaHCO3、乙酸铵，碳酸铵，氨水等调节或控制PH。
第一个吸附—解吸精制纯化方案如下在络离子存在下进行吸附，以获得较高的吸附容量。然后以较低洗脱力的洗脱剂洗涤，以除去比络合离子态紫蓝素吸附力低的组分。洗脱剂可加入络离子，以保持紫蓝素在吸附剂上的吸附。紫蓝素仍留在吸附剂上，与紫蓝素有同等吸附力或更大吸附力的组分也留在吸附剂上。除去比络合态紫蓝素吸附力低的组分后，以络合剂水溶液洗涤去除络离子，使紫蓝素呈非络合态。络合剂可以为EDTA(乙二胺四乙酸)盐，DCTA(环己基二胺四乙酸)盐，8-羟基喹啉及其衍生物等。络合剂可加到浓度在2-40％之间的盐溶液中维持紫蓝素在吸附剂上的吸附。除去络离子后，可用盐溶液洗去络合剂，再以水洗去盐。这时紫蓝素呈非络合态，吸附力降低，以解吸力比解吸紫蓝素络合物低的解脱剂即可将紫蓝素从吸附剂上洗脱，使它与吸附力与紫蓝素络合物同等或更高的组分分开。较低洗脱力的洗脱剂为浓度为5-20％的水溶性有机溶剂水溶液。
第二个吸附—解吸方案如下在络离子存在下进行吸附，然后以较低洗脱力的洗脱剂洗脱，再以较高洗脱力的解吸剂直接解吸络合态的紫蓝素。其吸附及用较低洗脱力洗脱剂洗涤操作如第一方案。较高洗脱力解吸剂为20％-60％的水溶性有机溶剂水溶液。
第三个吸附—解吸方案如下在盐溶液中吸附非络合态紫蓝素，然后水洗除盐，再以较低洗脱力洗脱剂洗脱非络合态的紫蓝素。盐溶液中吸附是在无络离子的料液中加入盐，其浓度在2％-40％之间。水洗除盐及洗脱操作同第一个方案。
可以应用上述吸附—解吸方案之一或多个方案进行组合，对紫蓝素进行精制纯化。
紫蓝素经初步纯化后，可用加酸沉淀的方法进一步纯化。初步纯化可采用吸附—解吸方法。酸可用盐酸，硫酸等无机酸或乙酸，甲酸等有机酸，酸用量一般在1％以内。酸化后析出冻胶状沉淀，可用离心，过滤等方法收集。
冻胶状沉淀尚含有一定的杂质，难干燥。用碱性溶剂分散，洗涤，可改变沉淀形态，由冻胶状变为无定形粉状，纯度进一步提高，易干燥。碱性溶剂可以是含吡啶，氨，二乙胺，三乙胺等碱性挥发物的有机溶剂，最好为易溶于水的有机溶剂，如甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丙酮等等。
3.浓缩将碱化液F002于60℃以下真空浓缩，得浓缩液F003。
4.柱层析将浓缩液上C18键合相硅胶柱(40-60μ)，以水，30％甲醇梯度洗脱，收集色带的洗脱液F004，将F004洗脱液真空浓缩，拌硅胶，置于硅胶柱(青岛硅胶100-200目)柱面，以异丙醇-吡啶-水(3∶1∶1)洗脱，收集色带，以HpLC检查纯度(5％乙腈-水-80％乙腈-水梯度洗脱，UV250nm检测)，得紫蓝素。
表2紫蓝素氢谱，碳谱及二维谱相关关系a碳/氢位置 氢化学位移 碳化学位移 DEPT 和 H-HCOSY谱 HMBC谱C/HδHδCAPT谱 相关关系 相关关系苯环1 133.660 C 3，62 147.497 C 3，63 6.498(s，1H)102.852 CH 4，5，2，14 175.505 C 3，65 154.233 C 3，66 6.861(s，1H)105.884 CH 4，5，2，1OCH355.685 CH35a 170.367 C b，db 6.715(s，1H)101.449 CH d，d，c，fc 130.589 C b，dd 146.225 C b，de 8.653(s，1H)115.272 CH d，d，c，ff 128.030 C b，d甘氨酸残基1 173.017bC 2，32 4.366(m，1H)53.160 CH3 1，3，43 2.701(m，1H)34.553 CH22，4 1，2，4，52.902(m，1H)4 4.921(m，1H)70.417 CH3 2，3，55 172.843bC 3，4其中a溶剂为C5D5N-D20(3∶2).根据DEPT，APT，HMQC，HMBC谱归属。b数据可互换。s——单峰，m——多重峰，DEPT——无畸变极化传递增益，APT——连接质子检测，HMQC——异核多量子相关，HMBC——异核多键相关，H-H COSY——氢-氢相关谱。
紫蓝素黑色无定形固体。C18H17N3O8(分子量M＝403)，紫外-可见光谱(UV-Vis)图见

图1，吸收峰λmax(ε)在pH3.0 0.05mol/甘氨酸-HCl缓冲液中239(24925)，477(17271)nm；在pH7.0 0.1mol/L Na2HPO4缓冲液中235(肩峰，23944)，248(62150)，279(11580)，319(8505)，550(肩峰，34347)，382(38926)nm；在pH8.0 0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液中235(肩峰，23944)，248(62150)，279(11580)，319(7916)，550(肩峰，35066)，582(41347)nm。红外光谱IR(KBr)νmax806，844，876，938，993，1013，1090，1131，1158，1177，1204，1223，1259，1284，1308，1335，1370，1402，1458，1477，1508，1521，1572，1603，1641，1680(肩峰)，2500-3600(宽峰)，其谱图见图2。紫蓝素的核磁共振谱见表2。用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测得准分子离子，[M+2H]+404.98，[M+Na]+426.02，[M-H]-402.3。用电喷雾傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(ESI-FTICRMS)测得高分辨质谱[M+H]+404.1070820，得分子式C18H17N3O8(计算值[M+H]+404.1088266)。高分辨快原子轰击质谱(FAB)测得[M+2H]+405.1197，计算值405.1172229。电喷雾二级质谱(ESI-MS/MS)结合高分辨电喷雾傅立叶变换回旋共振质谱(ESI-FTICRMS)测得化合物的碎片离子质量及元素组成分别为386.0983790(C18H16N3O7，(M+H-H2O)+)、259.0707490(C13H11N2O4；(M+2H-COCHOCH2CHNH2COOH)+)。以上数据表明紫蓝素分子式C18H17N3O8正确无误。根据紫蓝素的1HNMR，13CNMR，DEPT，APT，H-HCOSY，HMQC，HMBC谱(1HNMR——核磁共振氢谱，13CNMR——核磁共振碳谱，DEPT——无畸变极化传递增益，APT——连接质子检测，HMQC——异核多量子相关，HMBC——异核多键相关，H-H COSY——氢-氢相关谱)，结合该化合物与母体化合物(紫蓝胺酚)及旁系衍生物(紫蓝氨酸、紫蓝酮以及2，4-二乙酰氧基-5-甲氧基乙酰苯胺和γ-羟基谷氨酸)的化学结构关系，表明它含有如下结构片段 根据化合物的紫外—可见光谱，它是一种色素化合物，应具有高度共轭发色体系，推断两芳环通过氮川基(-N＝)共轭，发色体系结构为 以上结构体系的非解离态与质量数为259的质谱碎片相符。紫蓝素的结构为(I) 实施例2紫蓝素的制备1.植物材料处理取山蓝属植物山蓝(Peristrophe baphia(Spreng.)Bremek.[Peristropheroxbueghiana(schult)Bremek])鲜枝叶100g，置500ml圆底烧瓶中，通氮气驱去空气。快速冲入已沸腾3分钟(脱除溶解氧)的沸水400ml，置于86℃水浴中，转动烧瓶使温度均匀，沸水直接与处于室温(22℃)下的山蓝物料接触，使物料在2分钟内升温到80℃，混合物料在86℃左右保温90分钟。倾出提取液，取出料渣。料渣加水400ml，煮沸提取10分钟，过滤，重复提取3次。合并上述4份提取液，得1758ml料液(T001)。
2.紫蓝素分离纯化1>吸附上述提取液上Amberlite XAD-16吸附树脂柱(100g)，以蒸馏水1000ml洗涤，然后用35％乙醇洗脱，收集深紫红色洗脱液(T002)。
将上述洗脱液(T002)真空蒸发除去乙醇，重上Amberlite XAD-16吸附树脂柱(经80％乙醇再生)，以0.2M NH4OAc+0.02MEDTANa2+0.01M 8-羟基喹啉-5-磺酸1000ml洗涤去除络离子(Mg2+)，然后以0.2M NH4OAc 500ml洗涤，再以300ml水洗涤，然后以12％乙醇水溶液洗脱，收集深红色洗脱液(T003)。
将洗脱液T003真空蒸发除去乙醇，浓缩，得浓缩液(T004)2.酸沉将浓缩液T004滴加88％甲酸酸化，析出冻胶状沉淀。离心分离，得粗冻胶状物(T005)。
将粗冻胶状紫蓝素(T005)用0.1％稀氨水50ml溶解，离心取上清液，滴加88％甲酸酸化，再酸沉处理一次，得精冻胶状物(T006)。
3.碱性溶剂洗涤将精冻胶状物(T006)以吡啶-异丙醇(1∶9)50ml分散，过滤，滤饼用吡啶-异丙醇(1∶9)50ml洗涤，再以异丙醇30ml洗涤，然后以丙酮30ml洗涤，干燥得纯紫蓝素191mg，黑色无定形固体。实施例3升温速度的影响取山蓝鲜料50g，置于500mL三角瓶中，通入N2，加入经沸腾脱氧的蒸馏水400mL。分快速升温组和控制升温组。快速升温试验采用89℃热水与物料(室温22℃)快速混合(试料瓶在混合前0.7min左右预先置入82℃水浴中预热)，物料一经混合即可到达平衡温度82℃左右，这样物料从50℃至70℃的时间几乎为0，于82℃水浴中保温110min。控制升温试验采用冷水与物料混合，在搅拌下控制50℃至70℃的加热速度，将物料混合物加热至82℃，于82℃水浴中保温110min。倾出料液，料渣再提取3次，定容至1000mL。取0.50mL，加PH8.0 0.1MNa2HPO4-KH2PO4缓冲液5.00mL，于585nm测定吸光度，换算成紫蓝素得率(以吸光系数
1026计)。
紫蓝素在不同的升温速度下的得率见表3。升温速度应尽量快，在4分钟内物料从50℃升至70℃时，山蓝胺酚转化率可达85％以上。
表3紫蓝素在不同升温速度下的得率
实施例4不同温度下紫蓝素得率与保温时间的关系取两个500mL上下口抽滤瓶，用软胶管将下口连通，抽滤瓶加塞并设有气体进出口。在其中的一瓶加入山蓝鲜料25g，通入惰性N2，软胶管设止水夹一个，并预置于预定温度T的水浴中，为物料保温温度。在物料(室温22℃)中迅速加入预热至温度Tw的热脱氧水450mL，根据热量衡算，混合物料温度为t＝T，保温15min。放开止水夹，将料液压至另一惰性气氛的瓶中，保温，在不同保温时间用注射器从软胶管取样5mL左右，置于三角瓶中，放置6hr左右，取0.50mL，加PH8.0 0.1MNa2HPO4-KH2PO4缓冲液调节吸光度值0.2-0.7，于585nm以蒸馏水对照，测吸光度值，并换算成料液的吸光度值，以一定温度下测得最大吸光度值为100，计算不同时间的相对得率。Tw、T、t见表4。
表4紫蓝素在不同温度下得率与时间关系研究条件保温温度t(℃)热水温度Tw(℃) 水浴温度T(℃)7881 788285 828690 869094 9098 100 98几个不同温度下紫蓝素相对得率与时间的关系见表5。
表5在不同温度下紫蓝素相对得率与时间的关系保温时间(min)保温温度(℃)2030 4050 6070 8090100 110 120 130 140 160 180 200 270 360 4507850.0 /74.6 /86.9 /938 / 982 / 99.8 / 100 99.6 99.0 98.4 94.4 88.2 80.78258.4 /79.0 /90.2 /972 / 99.4 / 100 / 99.6 99.0 97.6 95.48661.8 /84.5 /94.8 /990 / 100 / 98.3 / 95.4 92.0 88.5 85.39065.0 85.8 95.0 98.5 99.4 10.0 98.1 94.3 90.5 86.6 82.7 79.2 74.69885.7 98.0 100 98.0 91.8 85.2 77.66 70.0实施例5氧的影响和最佳保温温度设避氧组和不避氧组。取山蓝鲜料50g，置于250mL瓶中，避氧组通以惰性气体，不避氧组处于空气气氛中。将其预热至不同温度t并保温(不同温度t下最佳保温时间见表1)。保温后，放冷，空气中放置一天，再提取4次，定容至1000mL，测吸光度，计算得率。
紫蓝素在避氧与不避氧及不同温度下的得率见表6。
表6紫蓝素在避氧与不避氧及不同温度下的得率氧温度(℃) 得率(％，) 平均(％)1000.15990 0.099不避氧组 0.12282 0.11175 0.1191000.19190 0.275避氧组 0.22282 0.30075 0.123结果表明，避氧条件与不避氧条件比较得率有显著的提高，最佳保温温度为80-90℃。
实施例6抗乙肝病毒(HBV)作用(国家新药筛选中心测定)(1)材料与方法①体外细胞模型HepG2.2.1.5(乙肝病毒基因转染人肝癌细胞株2.2.1.5)②MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测样品对细胞的毒性③ELISA(酶联免疫吸附)法(上海实业科华生物技术公司HbeAg和HbeAg诊断试剂盒)检测样品对HbsAg和HbeAg的抑制作用④阳性药物对照阿西洛韦(ACV)⑤样品紫蓝素，纯度98％(2)检测结果表7紫蓝素的抗乙肝病毒(HBV)活性样品编号最大无毒浓度 对HbsAg抑制率 对HbeAg抑制率(TCDo) (％)(％)(μmol/ml)紫蓝素 0.2 43.931.9ACV最大无毒浓度为2μmol/ml，在0.4μmol/ml时，对HbsAg抑制率为52.9％，对HbeAg抑制率为44.2％.
结果表明化合物紫蓝素在0.2μmol/ml时，对HbsAg和HbeAg有一定程度抑制作用。
实施例7抗脂质过氧化活性(国家新药筛选中心测定)(1)模型名称脂质过氧化物(MDA)测定。(2)测定原理过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。(3)测定方法老年SD大鼠处死，取肝脏，用生理盐水制成10％匀浆，对照组与空白组各加入0.9ml的匀浆及0.1ml生理盐水，测定组加入0.9ml的匀浆及不同浓度测试药物0.1ml，每组3复管。37C温育1.5小时。(空白管不温育)然后加1ml10％三氯醋酸(TCA)及1ml0.67％硫代巴比妥酸(TBA)混匀后，于沸水浴中100℃加热30分钟，3000转离心1分钟，冷却后取上清液，532nm测吸光度值，结果以吸光度表示(A532)。(4)测试体系体外(5)结果评定①吸光度降低，表示有抗氧化作用。②各浓度实验组与对照组进行T检验P＞0.05 无效P＜0.005与对照比有明显差异。
表8紫蓝素的抗脂质过氧化活性样品名 测定浓度 A平均 SD(标准偏 P值 抗氧化作mol/L差) 用(有/无)对照0.224 0.001紫蓝素 10-70.206 0.001 0.0000有，明显紫蓝素 10-60.213 0.002 0.0123有实施例8抗糖尿病活性(1)蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTPIB抑制活性(国家新药筛选中心测定)①原理PTP1B是第一个被鉴定的蛋白酪氨酸酯酶(protein tyrosine phosphatase)，通过PTP1B剔除的老鼠实验表明，PTP1B通过对胰岛素受体的脱磷酰化，进而在调节胰岛素敏感性和脂质代谢过程中起着非常重要的作用。因而，选择性的、高活性的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B抑制剂在糖尿病和肥胖症的治疗中有重要的价值。②实验方法用于筛选的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B是从大肠杆菌中表达并纯化的GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合蛋白。采用紫外底物PNPP(对硝基苯酚磷脂)，观察不同化合物对重组酶的活性的抑制，以初步评价化合物的药用效果。PTP1B水解底物对硝基苯酚的磷脂得到的产物在410nm处有很强的光吸收。因此可以直接监测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。实验中所采用的阳性参照物为正钒酸钠(2μM)。③实验结果表9紫蓝素对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTPIB的抑制活性样品 PTP1B抑制率％ IC50(半数抑制浓度)(化合物浓度为50μg/ml)(μmol/L)紫蓝素55.66.8测定结果显示，此化合物对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B有较好的抑制作用(2)链脲霉素小鼠高血糖模型(日本星药科大学药学院测定)①模型链脲霉素(streptozotocin)诱发高血糖小鼠模型。正常对照组8只，模型组对照组8只，模型给药组8只。②给药口服给药(p.o.)，每天紫蓝素10mg/kg，连服5天。②结果表10紫蓝素的降血糖作用组别 血糖浓度mg/dl(x±SD)P值正常对照组143.2±6.0模型对照组893.3±42.0 ＜0.001模型给药组564.6±12.9 ＜0.001结果表明，紫蓝素有显著的降血糖作用综上所述紫蓝素具有显著的抗糖尿病活性。
权利要求
1.一种具有如下结构的化合物 其中R为γ-羟基谷氨酸残基，γ-羟基谷氨酸残基的1个羧基残基与-NH-成酰胺，羟基、氨基或另一个羧基之一的残基与取代的醌亚胺环成键相连。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征是以氘代吡啶-重水3∶2为溶剂在500MHz测定其核磁共振谱氢谱时化学位移为8.7，单峰，1个氢；6.9，单峰，1个氢；6.7，单峰，1个氢；6.5，单峰，1个氢；4.9，多重峰，1个氢；4.4，多重峰，1个氢；2.9，多重峰，1个氢；2.7，多重峰，1个氢，为紫蓝素。
3.权利要求1或2所述的化合物在制备防治乙型肝炎、糖尿病或抗脂质过氧化药物及保健品中的应用，和作为着色剂的应用。
4.权利要求1或2所述的化合物的单体化合物，标准对照品，组合物或含有上述化合物作为活性成分的植物提取和分离部位，制剂，及复方制剂，酒、食品。
5.用于防治乙型肝炎、防治糖尿病、抗脂质过氧化的药物组合物，中含有治疗有效量的紫蓝素化合物和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求1或2所述化合物的制备方法，该方法包括以下步骤a)将山蓝植物鲜料加热，对山蓝植物加热时，物料从50℃升至70℃的时间在10分钟之内；b)加热后的物料在75℃-100℃下保温5-450分钟，得含紫蓝素化合物的物料A。
7.根据权利要求6所述的化合物的制备方法，其特征在于在步骤a)中，对山蓝植物加热时，物料从50℃升至70℃的时间在6分钟之内。
8.根据权利要求6所述的化合物的制备方法，其特征在于在步骤b中加热后的物料在75℃-100℃下保温20-260分钟。
9.根据权利要求7所述的化合物的制备方法，其特征在于在步骤b)中加热后的物料在78℃-90℃下保温20-260分钟。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于在步骤b)中，至少保温阶段的前5分钟是在避氧下进行的。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在步骤b)中，至少保温阶段的前5分钟是在避氧下进行的。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于在步骤b)中，至少保温阶段的前5分钟是在避氧下进行的。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于在步骤b)中，至少保温阶段的前5分钟是在避氧下进行的。
14.根据权利要求6～13中任何一项所述的方法，其特征在于将制得紫蓝素提纯，其提纯方法是将含紫蓝素化合物的物料A在络离子控制下进行吸附-解吸处理，即在初次吸附时有络离子存在，在解吸前除去络离子然后解吸，或者在首次解吸后除去络离子，再在盐的存在下再次吸附然后解吸，得解吸液B。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于其中络离子为镁离子。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于还需将解吸液B加酸沉淀得沉淀物C。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于还需将解吸液B加酸沉淀得沉淀物C。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于还需将沉淀物C经碱性溶剂洗涤得固体D，为纯紫蓝素。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于还需将沉淀物C经碱性溶剂洗涤得固体D，为纯紫蓝素。
20.含有紫蓝素为活性成份或指标成分的植物加工品的加工方法，该方法包括以下步骤a)将山蓝植物鲜料加热，对山蓝植物加热时，物料从50℃升至70℃的时间在10分钟之内；b)加热后的物料在75℃-100℃下保温5-450分钟，得含紫蓝素化合物的物料A。
21.根据权利要求20所述的含有紫蓝素为活性成份或指标成分的植物加工品的加工方法，其特征在于在步骤a)中，对山蓝植物加热时，物料从50℃升至70℃的时间在6分钟之内。
22.根据权利要求20或21所述的化合物的制备方法，其特征在于在步骤b)中加热后的物料在75℃-100℃下保温20-260分钟。
23.根据权利要求20或21所述的方法，其特征在于在步骤b)中，至少保温阶段的前5分钟是在避氧下进行的。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于在步骤b)中，至少保温阶段的前5分钟是在避氧下进行的。
全文摘要
本发明公开一种杂环化合物，该化合物具有如(I)通式的结构其中R为γ－羟基谷氨酸残基，γ－羟基谷氨酸残基的1个羧基残基与－NH－成酰胺，羟基、氨基或另一个羧基之一的残基与取代的醌亚胺环成键相连，为紫蓝素(Zilanine)。本发明还涉及该化合物制备方法，以该化合物为活性成份的药物组合物，以及其在制备防治糖尿病、乙型肝炎、抗氧化药物、免疫增强剂、美容、抗衰老保健品上的用途，及作为着色剂的用途。
文档编号A61P39/00GK1431200SQ03117188
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月14日 优先权日2003年1月14日
发明者谢运昌, 蒋小华, 文永新, 程菊英, 方宏 申请人:广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所