专利名称：水溶性抗癌药紫杉醇复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及水溶性抗癌药紫杉醇复合物及其制备方法，具体涉及四乙烯五胺桥联双环糊精功能分子制备抗癌药紫杉醇的水溶性复合物。水溶性抗癌药紫杉醇复合物可对紫杉醇起到增溶和缓释作用，进而延长药效，从而对抗癌药物紫杉醇试用于临床提供了一种新的可行的途径。
众所周知，紫杉醇具有重大的应用价值和经济效益，作为一种抗癌药物，自从其上市以来其研究方兴未艾。但是它的广泛应用存在着明显的制肘紫杉醇几乎不溶于水(溶解度0.25μg/ml，有机化学21.428-435.2001)，使用中需加入助溶剂。然而其乳针中助溶剂可导致病人严重过敏甚至个别死亡。为解决这一世界难题，各国科学家致力于半合成制备水溶性紫杉醇前体药物，以便制成水剂应用。但是，由于紫杉醇为天然产物，结构复杂，前药合成困难较大，而且所得前药中的各种修饰基团对紫杉醇药物活性有不同程度的影响。
环糊精(Cyclodextrins，Cycloamyloses，通常简称为CD)，是一类由D型吡喃葡萄糖单元以1，4苷键首尾相连的截锥状大环分子，具有疏水的空腔和亲水性的表面。因此，环糊精可选择性键合各种无机、有机、以及生物分子形成超分子复合物。环糊精习惯上用一个希腊字母表示其葡萄糖单元数目，其中最常见的是α-、β-和γ-环糊精，分别拥有6、7和8个葡萄糖单元。
含7个葡萄糖单元的β-环糊精可通过淀粉的酶促降解大量制备，价格低廉，而且性质稳定，无毒害。这些特性使其广泛应用于脂溶性药物载体、食品添加剂、化妆品填料等各个领域(超分子化学——合成受体的分子识别与组装，南开大学出版社，2001年，166页)。因此，使用环糊精作为母体构筑功能分子，可对药物分子的包结作用创造良好的条件(Chem.Rev.，98.1998.1743-1753.)。很多科学家致力于紫杉醇和环糊精复合物的研究，并且研究了环糊精存在时紫杉醇类物质的薄层色谱迁移率(Int.J.Pharm.，108.1994.64-75.)，提出环糊精与紫杉醇作用比较微弱的观点。然而，修饰环糊精(2，6-二-O-甲基-β-环糊精)与母体天然β-环糊精相比，对紫杉醇是更为有效的增溶剂(J.Pharm.Sci.，84.1995.1223-1230)。比利时的西森实验室有限公司对将紫杉醇和乙酰-γ-环糊精及羟-丙基-β-环糊精于乙醇中混合，并冷冻干燥所得固体进行了水溶性研究，并已申请中国专利(申请号98811010.5)。
尽管如此，含有两个环糊精空腔的桥联双环糊精包结紫杉醇分子的固态复合物未见报道。Moser等人研究了桥联双环糊精同紫杉醇在水溶液中的包结作用，但并未得到复合物固体粉末(J.Incl.Phenom.Mol.Chem.39，2001，13-18)。刘育等人(Chem.Eur.J.，7，2001，1281-1288)公开报道了四乙烯五胺桥联双环糊精的合成，发现四乙烯五胺作为一种桥链连接两个环糊精单元拥有相对的分子柔性，可调控两个环糊精空腔对较大客体分子进行协同相互作用。因此，四乙烯五胺桥联双环糊精可作为一种功能受体对紫杉醇进行水溶性复合物的研究。
本发明水溶性抗癌药紫杉醇复合物是四乙烯五胺桥联双环糊精与紫杉醇的复合物，四乙烯五胺桥联双环糊精与紫杉醇复合比为1∶2。
本发明制备四乙烯五胺桥联双环糊精与紫杉醇复合物的方法如下1)室温下将四乙烯五胺单修饰β-环糊精和单(6-氧-6-对甲苯磺酰基)-β-环糊精加入到DMF中在氮气保护下搅拌至溶解，然后升温到80℃下反应三天，然后把反应混合物加入到丙酮中，抽滤收集沉淀，反复进行此操作二次，得粗品产物。
2)将其溶于水中，使用CM Sephadex C-25离子柱分离，以1M氨水为洗脱剂；然后再使用Sephadex G-25凝胶色谱柱分离纯化，以水为洗脱剂，得到四乙烯五胺桥联双环糊精。
3)将紫杉醇溶于少量乙醇中至溶解，将紫杉醇乙醇溶液加入四乙烯五胺桥联双环糊精水溶液中，搅拌，将澄清溶液密封，室温下搅拌14天。紫杉醇与四乙烯五胺桥联双环糊精的重量比为1∶0.91。
4)蒸发除去溶剂乙醇，抽滤除去未参与包结的紫杉醇，将所得滤液旋干，即得淡黄色固体粉末，真空干燥，可得四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇复合物。
本发明所得固体产物经过1H NMR、电子扫描显微镜(SEM)、X射线粉末衍射、热重-差热分析(TG-DTA)、傅立叶变换红外光谱等手段证明。
本发明四乙烯五胺桥联双环糊精做为一种低毒性且易溶于水的药物载体，在对抗癌药物紫杉醇进行包结后，大大提高了该药物在水中的低溶解性，溶解度提高到2.0mg/ml。所得复合物可以做为紫杉醇的替代品应用于临床，为紫杉醇的临床试用提供了新的水溶性缓释复合物。
图2四乙烯五胺桥联双环糊精、紫杉醇及其组成的复合物的扫描电子显镜照片。
图3四乙烯五胺桥联双环糊精、紫杉醇及其组成的复合物的X射线粉末衍射图。
图4四乙烯五胺桥联双环糊精、紫杉醇及其组成的复合物的热重-差热分析联用图。
图5四乙烯五胺桥联双环糊精、紫杉醇及其组成的复合物的傅立叶变换红外光谱图。
图6四乙烯五胺桥联环糊精的合成路线图。
在100ml干燥圆底烧瓶中加入1.3g四乙烯五胺单修饰β-环糊精和1.3g单(6-氧-6-对甲苯磺酰基)-β-环糊精，然后加入50ml处理过的DMF做为溶剂，在氮气保护下搅拌至溶解，然后升温到80℃，氮气保护下反应三天，将反应混合物滴到300ml丙酮中，布氏漏斗抽滤收集沉淀。反复进行此操作二次，得粗品产物。将其溶于水中，使用CM SephadexC-25离子柱分离，以1M氨水为洗脱剂；然后再使用Sephadex G-25凝胶色谱柱分离纯化，以二次蒸馏水为洗脱剂。最后产品收率17％。化合物2的表征数据如下MALDI-TOF MS m/z 2447(M+Na+-2H2O)；1H NMR(D2O，TMS，ppm)δ2.6-2.9(m，16H)，3.2-3.6(m，28H)，3.6-4.0(m，56H)，4.9(m，14H)；13C NMR(D2O，TMS，ppm)δ104.71，103.91，86.76，83.99，75.93，74.82，74.66，63.04，55.05，47.90，38.51；元素分析实测值C 45.15，H 6.52，N 3.09；计算值(C92H159O68N5·2H2O)C44.93，H 6.68 N 2.85。
2)四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇复合物的合成方法将24.3mg(约0.01mM)的四乙烯五胺桥联双环糊精溶于10ml二次蒸馏水中，将26.7mg(约0.03mM)的紫杉醇溶于少量乙醇中，将紫杉醇乙醇溶液加入搅拌中的环糊精水溶液中，将此澄清溶液密封，室温下搅拌14天。旋转蒸发(用旋转蒸发仪)除去溶剂中所含的乙醇，抽滤除去未参与包结的紫杉醇。将所得滤液旋干，即得淡黄色固体粉末，真空干燥，可得四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇复合物，产率93％。
3)四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇复合物的表征该复合物通过以下方法表征1H NMR(Varian INVOA 300M核磁共振氢谱仪)此复合物的1H NMR谱图如
图1所示。由图可知，化学位移为7-8ppm处质子峰可归属于紫杉醇三个苯环上的15个氢原子；且由于紫杉醇较低的溶解度，它自身并不能在D2O溶剂中得到1H NMR谱图。由此可知，四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇的复合比约为1∶2。
扫描电子显微镜(日立S-3500N扫描电子显微镜)由图2可知四乙烯五胺桥联双环糊精(图2a)和紫杉醇(图2b)的表面形态信息。复合物形成后，紫杉醇由原来的长针状晶形，变为较小的颗粒状(图2c)，且其半径增大了约10倍；四乙烯五胺桥联双环糊精的晶型也发生了改变。而二者的物理混合物均以本身形貌特征表现于SEM图象中，这表明所得复合物固体粉末并非1和2的简单混合，而是桥联双环糊精2对紫杉醇键合形成的复合物。
X-射线粉末衍射(Rigaku D/max-2500 X-射线衍射仪)图3中给出了四乙烯五胺桥联双环糊精2(图3a)、紫杉醇1(图3b)和本发明所得的复合物(图3c)的X-射线粉末衍射图。众所周知，两种物质的简单物理混合物的X-射线粉末衍射仅是两物质衍射峰的简单叠加。而复合物却非如此在图3b中可观察到的紫杉醇特征衍射峰(2θ5.24)，在图3c中却消失了，这可归因于紫杉醇被包结后形态的改变；而且桥联双环糊精衍射峰(2θ28.5)，在图3c中位移至25.3。这些均可说明环糊精空腔对于紫杉醇的包结作用。
热重-差热分析(TG-DTA)联用(日本理学标准TG-DTA型分析仪)
为了比较四乙烯五胺桥联双环糊精2、紫杉醇1和本发明所得的复合物的热稳定性，我们对它们进行了热重和差热分析研究。2(图4a)、1(图4b)和复合物(图4c)的分解温度均在240℃附近。DTA结果表明2的放热峰是315℃和437℃；而1的是244℃和487℃附近。对于复合物，除了一个属于成分2的317℃放热峰外，出现了一个处于472℃的新的放热峰，亦可说明复合物的形成。
傅立叶变换红外光谱(Bio-Rad FTS 135傅立叶红外光谱仪)化合物1、2和复合物的傅立叶变换红外光谱如图5所示。环糊精，包括四乙烯五胺桥联双环糊精2(图5a)，都在波数为3500-2500cm-1的范围内有特征峰。紫杉醇1(图5b)则在1725cm-1和1244cm-1处有特征峰。但在复合物(图5c)的光谱图中，紫杉醇处于1725cm-1处的特征峰，有微小位移至1720cm-1；但其它特征峰仍在原位。与此同时，桥联双环糊精的特征峰也没有移动。
溶解度制备紫杉醇复合物的目的之一就是提高它在水中的溶解度。将一定量的复合物溶于5ml水中，超声振荡一段时间至不再有固体溶解，过滤，将所得固体干燥称重，可大约得知本复合物的溶解度值。结果是紫杉醇复合物将紫杉醇本身几乎为零的水溶性，提高到2.0mg/ml。
权利要求
1.一种水溶性抗癌药紫杉醇复合物，其特征在于它是四乙烯五胺桥联双环糊精与紫杉醇的复合物。
2.按照权利要求1所述的水溶性抗癌药紫杉醇复合物，其特征在于所述的复合物中四乙烯五胺桥联双环糊精与所述的紫杉醇复合比为1∶2。
3.权利要求1所述的水溶性抗癌药紫杉醇复合物制备方法，其特征在于它包括下列步骤1)室温下将四乙烯五胺单修饰β-环糊精和单(6-氧-6-对甲苯磺酰基)-β-环糊精加入到在DMF中在氮气保护下搅拌至溶解，然后升温到80℃下反应三天，然后把反应混合物加入到丙酮中，抽滤收集沉淀，反复进行此操作二次，得粗品产物；2)将其溶于水中，使用离子柱分离，以1M氨水为洗脱剂；然后再使用凝胶色谱柱分离纯化，以水为洗脱剂，得到四乙烯五胺桥联双环糊精；3)将紫杉醇溶于少量乙醇中至溶解，将紫杉醇乙醇溶液加入四乙烯五胺桥联双环糊精水溶液中，搅拌，将澄清溶液密封，室温下搅拌14天；4)蒸发除去溶剂乙醇，抽滤除去未参与包结的紫杉醇，将所得滤液旋干，即得淡黄色固体粉末，真空干燥，可得四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇复合物。
4.按照权利要求3所述的水溶性抗癌药紫杉醇复合物制备方法，其特征在于所述的紫杉醇与四乙烯五胺桥联双环糊精的重量比1∶0.91。
全文摘要
本发明是水溶性抗癌药紫杉醇复合物及其制备方法。本发明是在溶液中将四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇直接混合制备。四乙烯五胺桥联双环糊精和紫杉醇的复合物中四乙烯五胺桥联双环糊精与所述的紫杉醇复合比为1∶2。本发明水溶性抗癌药紫杉醇复合物可对紫杉醇起到增溶和缓释作用，进而延长药效，并对抗癌药物紫杉醇的临床应用提供了一种新的可行的途径，即为紫杉醇的临床试用提供了新的水溶性缓释复合物。
文档编号A61K31/337GK1440748SQ0311949
公开日2003年9月10日 申请日期2003年3月14日 优先权日2003年3月14日
发明者刘育, 陈国颂, 李莉, 张衡益 申请人:南开大学