专利名称：乙型肝炎疫苗及其制备方法
发明的所属领域本发明涉及衍生于乙型肝炎病毒衣壳蛋白质的免疫原性多肽，特别是涉及包括乙型肝炎抗原多个HLA限制性表位的复合多肽，其制备方法及其作为预防/治疗性乙型肝炎疫苗的应用。
发明的背景乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的的病毒性传染病。在中国、东南亚和热带非洲地区，人群感染率高达50％-70％，HBV携带者高达8％-15％。其中，中国的HBV携带者多达1亿多人，约占我国人口的10％，占全世2亿多HBV携带者的50％以上。中国的乙型肝炎患者约占所有慢性肝炎患者的80％，而且其中大约有10％的急性乙型肝炎可能转为慢性肝炎、肝硬化或肝癌，因此是严重危害人群健康的传染病之一。
大规模乙型肝炎疫苗接种是预防HBV感染的有效措施，但仍有约10％-20％的乙肝患者对疫苗无反应性。目前，除干扰素可使少部分乙肝患者获得痊愈外，尚没有其它特效的治疗药物。乙肝治疗一直是世界上难以解决的医学及社会难题。因此，开发同时有治疗与预防作用的HBV疫苗具有重要的理论意义及潜在巨大的经济及社会价值。
Dane等人发现乙型肝炎病毒在血液中存在三种不同形态的抗原完整HBV的42μm颗粒，只含病毒外膜结构的22nm颗粒，以及由内病毒外膜结构组成的丝状体。此后，Krugman和Hi lleman等人证明22nm表面抗原颗粒能在猩猩和人体内有效地引发保护性免疫反应，进而使用从HBV携带者血清中分离的22nm的HBV表面抗原颗粒制备了血源性乙型肝炎疫苗。
二十世纪八十年代，Rutter等人和Tiollai等人先后在酵母和哺乳动物细胞中成功表达了HBV表面抗原，并相继投入工业化生产。这些基因重组乙型肝炎疫苗取得了比血源乙型肝炎疫苗更好的免疫效果，为预防乙型肝炎提供了重要措施。
预防性疫苗的接种对象是健康人群。作为一种安全可靠的被动免疫因子，预防性疫苗已在世界范围内广泛用于传染病的预防接种，并在预防和消除许多传染病中发挥了重要作用。相反，治疗性疫苗的接种对象则是持续感染患者或病原体携带者。治疗性疫苗的使用旨在打破机体的免疫耐受，提高机体特异性免疫应答水平。作为一种主动免疫治疗因子，治疗性疫苗的成分相对比较复杂，而且可能对机体的免疫系统造成一定的损伤，但其作为传染病综合治疗中的一种提高免疫力的辅助手段，仍具有广阔的发展前景，特别是对于那些迄今尚无有效治疗方法的传染病(例如肝炎和爱滋病等)。因此，针对乙型肝炎防治的现状，发展有效的治疗/预防性乙型肝炎疫苗，将具有十分重要的意义。
发明的目的本发明的一个目的是提供乙型肝炎病毒免疫原性复合多肽，特征在于所说的免疫原性多肽包括至少部分HBV前S2区的氨基酸序列，和分别来自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、HBV DNA聚合酶的其他四个连续的HLA限制性抗原表位的氨基酸序列。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的复合多肽还包括一个辅助性T淋巴细胞表位PADRE的氨基酸序列和一个CpG岛核心序列。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的乙型肝炎病毒抗原表位分别是相当于乙型肝炎表面抗原前S2区第1-55位氨基酸的肽片段MetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnThrLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuThrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrValSerProIleSerLeuIlePheSerLysIleGlyAspLeuAlaLeuAsn；相当于乙型肝炎核心抗原第18-27位氨基酸的肽片段PheLeuProSerAspPhePheProSerVal；相当于乙型肝炎核心抗原第141-151位氨基酸的肽片段SerThrLeuProGluThrThrValValArgArg；相当于乙型肝炎表面抗原第183-191位氨基酸并且N末端带有甘氨酸接头的肽片段PheLeuLeuThrArgIleLeuThrIle；相当于乙型肝炎病毒核心抗原第98-106位氨基酸的肽片段IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIle，以及相当于乙型肝炎病毒DNA聚合酶第455-463位氨基酸的肽片段GlyLeuSerArgTyrValAlaArgLeu。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的免疫原性肽还可包括具有氨基酸序列AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla(SEQ ID NO7)的辅助性T细胞表位PADRE和具有氨基酸序列AsnVal(SEQ ID NO8)的CpG岛核心序列。
根据本发明的一个优选实施方案，构成所说的乙型肝炎病毒免疫原性肽是由上述肽片段以任何排列方式串联连接的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中构成所说的乙型肝炎病毒免疫原性肽的每两个独立的序列之间均有由一个或多个甘氨酸构成的接头。
本发明的另一个目的是提供制备如上限定的乙型肝炎病毒免疫原性多肽的方法，该方法包括以下步骤(1)分别分段合成编码如上限定的氨基酸序列的核苷酸小片段；(2)分步退火连接步骤(1)的核苷酸小片段，得到长度约399bp的全复合基因序列；(3)将步骤(2)的多核苷酸连接到适当的载体中；(4)用步骤(3)的重组载体转化适当的宿主细胞；(5)培养步骤(4)的重组体细胞，并从培养物上清和细胞内分离所需的乙型肝炎病毒免疫原性多肽。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的全复合基因序列也可以是以一次连续方法合成的。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的小片段长度约10-30个碱基。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的载体是质粒pWR450-1。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
本发明的再一个目的是提供上述乙型肝炎病毒免疫原性多肽作为治疗/预防性乙型肝炎疫苗的应用。
附图简要说明
图1显示本发明的治疗/预防性抗原基因HBV-P/T的分步退火拼接方案。
图2显示HBV-P/T抗原基因的全序列。
图3是重组质粒pWR450-1/HBV-P/T的构建图。
图4是重组质粒pWR450-1/HBV-P/T的酶切鉴定图。其中泳道1是100bp的DNA标志物；泳道2是BamHI/EcoRI双酶切的载体质粒pWR450-1；泳道3是BamHI/EcoRI双酶切的重组质粒pWR450-1/HBV-P/T；泳道4是载体质粒pWR450-1；泳道5是重组质粒pWR450-1/P/T。
图5显示重组质粒pWR450-1/HBV-P/T在大肠杆菌中表达产物的纯化和western-blotting免疫印迹分析。其中泳道1是低分子量蛋白质标志物；泳道2和3是纯化的复合多肽；泳道4是空载体表达的β-半乳糖酐酶蛋白。
图6显示本发明的融合多肽和载体蛋白免疫Balb/c小鼠后特异性IgG抗体水平的比较。
图7显示以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测接种本发明融合多肽或载体蛋白的Balb/c小鼠的CTL活性比较。
图8显示被免疫小鼠体内CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的流式细胞分析。
图9显示以RT-PCR方法检测的被免疫小鼠脾细胞内细胞因子特异性mRNA水平。
发明的详细内容本发明涉及衍生于乙型肝炎病毒衣壳蛋白质的免疫原性多肽，特别是涉及包括乙型肝炎抗原的多个HLA限制性表位的重组多肽，其制备方法及其作为预防/治疗性乙型肝炎疫苗的应用。
因此，本发明的一个目的是提供乙型肝炎病毒免疫原性复合多肽，特征在于所说的免疫原性多肽包括至少部分HBV前S2区的氨基酸序列，和分别来自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、HBV DNA聚合酶的其他四个连续的HLA限制性抗原表位的氨基酸序列。
根据本发明的一个优选优选实施方案，所说的复合多肽还包括一个来自乙型肝炎病毒DNA聚合酶的氨基酸序列。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的乙型肝炎病毒抗原表位分别是相当于乙型肝炎表面抗原前S2区第1-55位氨基酸的肽片段MetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnThrLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuThrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrValSerProIleSerLeuIlePheSerLysIleGlyAspLeuAlaLeuAsn；相当于乙型肝炎核心抗原第18-27位氨基酸的肽片段PheLeuProSerAspPhePheProSerVal相当于乙型肝炎核心抗原第141-151位氨基酸的肽片段SerThrLeuProGluThr ThrValValArgArg；相当于乙型肝炎表面抗原第183-191位氨基酸的肽片段PheLeuLeuThrArgIleLeuThrIle；相当于乙型肝炎病毒核心抗原第98-106位氨基酸的肽片段IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIle，以及相当于乙型肝炎病毒DNA聚合酶第455-463位氨基酸N末端的肽片段GlyLeuSerArgTyrValAlaArgLeu。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的免疫原性肽还可包括氨基酸序列AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla的辅助性T细胞表位PADRE和具有氨基酸序列AsnVal的CpG岛核心序列。
根据本发明的一个优选实施方案，构成所说的乙型肝炎病毒免疫原性肽是由上述肽片段以任何排列方式串联连接的，并且每两个独立的序列之间均有由一个或多个甘氨酸构成的接头。
众所周知，蛋白质抗原的免疫原性主要是通过表位体现的。这里，所说的“抗原表位”是指有特定基因组区域编码的至少6个连续的氨基酸(例如，HBV前S2抗原表位是指由HBV基因组的前S2区域编码的至少6个连续的氨基酸)。在表位水平上对抗原性的认识已促成这样一种趋势基于抗原分子的免疫干预手段已不再停留于病原体或天然抗原整体分子水平而开始向表位水平过渡。现代保护性免疫理论认为有效的保护性免疫取决于一组表位的合理组合与搭配(Rabinovich NR，et al.，Science2651401，1994)HBV慢性感染的直接原因是感染者不能针对HBV抗原的攻击产生迅速有效的细胞免疫应答。因此，引发并提高病人的细胞免疫应答能力，是化学治疗以外的一个重要治疗策略(Chisari FV，et al. 1997J ClinInvest.99(7)1472-1477；Bocher WO，et al. 2000Hepatology.31(2)480-487)。由于慢性HBV感染者的免疫系统对HBV抗原已经形成程度了不等的免疫耐受，所以要重建或增强HBV抗原特异性免疫应答，必须通过适当地改变抗原结构来增强其免疫原性，或通过提高抗原加工、递呈和上调T淋巴细胞的反应性等途径来激活无反应性或低反应性的HBV抗原特异性T淋巴细胞(Livingston BD，et al.Hepatology，31(2)548-549，2000)。
本发明基于HBV表位的研究进展和我们自己的前期工作，充分分析了HBV疫苗研究中存在的问题，特别是考虑到抗HBV免疫学特征，从HBV基因组中选择出5个分别来自表面抗原、核心抗原和HBV DNA多聚酶(POL)序列之高度保守区DNA编码序列，并将它们与部分pre-S2基因一起组合成包括多个HBV抗原表位的复合基因，基因命名为P/T。这些表位在四种类型HBV中均具有高度保守，而且已证实为它们的表达产物均具有刺激CTL反应的良好免疫原性。
HBV env基因编码一段包括55个氨基酸的pre-S2蛋白，有证据表明该蛋白对产生保护性免疫反应具有重要作用。土拨鼠肝炎病毒、地松鼠肝炎病毒、鸭肝炎病毒基因组中也存在类似区域，推测该区域与乙肝病毒的宿主特异性和器官特异性有关(吴玉章等，1993生物化学和生物物理进展20(3)203)。在不同亚型人乙肝病毒中，该区域高度保守，因此推断该区域激发的免疫反应有可能克服乙肝病毒亚型间的免疫逃避(Neurath RA，et al.，Science.224392，1984)。既往研究也发现，pre-S2蛋白能激发猩猩抵抗HBV攻击的保护性免疫反应。
乙型肝炎基因工程预防性疫苗是最为成功的疫苗之一。但这些疫苗的接种者中，仍有约10-20％不产生特异性免疫应答。一般认为，导致这种无应答状态可能与所使用的疫苗未包含pre-S2有关，因为该区含有介导HBV与肝细胞结合的特异性受体。而目前进入市场的乙肝疫苗，基本都未含有pre-S2抗原。如果在重组基因中加入pre-S2抗原的编码序列，可望能够提高重组基因表达产物的免疫效率和免疫原性。
研究表明，急性自限性乙型肝炎的病情转归与患者体内的多特异性CTL反应密切相关(Penna A，et al.1991Exp Med 1741565)。慢性HBV感染者体内的自发性和γ干扰素(IFN-γ)依赖性的HBV病毒的清除也与细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL反应)密切相关(Guidotti LG，et al.，Prol Natl Acad Sci USA.913764，1994)。CTL是HBV感染的一种主要的防御机制，在HBV慢性感染过程中，其可识别肝细胞内表达的HBV抗原，有助于机体清除HBV感染的肝细胞。CTL通过HBV感染的肝细胞表面的HLA-I分子与T细胞受体结合而发挥作用。这些HLA-I类分子主要包括A2.1、Aw68、B7等亚型，其中特别是HLA-A2.1在人群中出现的频率相当高，例如其在中国人、日本人、高加索人等人种中的出现频率分别为55％、43％、46％。因此，本发明人在整个基因的设计中，充分考虑到T细胞特别是CTL作用对HBV疫苗的免疫应答的影响，从HBV基因组中优选了5个可被HLA分子识别的T细胞表位，以期为多表位疫苗诱发高效免疫应答提供条件。
在免疫清除HBV的过程中，针对乙型肝炎核心抗原(HBcAg)或其片段的特异性细胞免疫应答同样具有重要作用(参见美国专利6,479,282)。目前已在HBcAg中鉴定出多个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位，这类表位的合成肽疫苗对健康人能诱导强的抗HBV细胞免疫应答，并且有证据表明它们可有效地增强慢性HBV感染者的细胞免疫应答能力(Heathcote J，et al.，Hepatology30(2)531-536，1999；美国专利6,479,282)。研究显示，急性自限性HBV感染者的外周血单核细胞(PBMC)受重组HBcAg或HBcAg的CTL抗原表位合成肽刺激后，可产生强的增殖或杀伤活性，而慢性HBV感染者的PBMC则不能或仅能产生微弱的这类活性(Tsai SL.，J Gastroenterol hepatol.，12(9-10)227-235，1997)。因此，HBcAg也有可能作为乙肝治疗/预防性疫苗提供有效抗原表位。
Missale G等曾前后先后报道了位于HBcAg 18-27及141-151位氨基酸的CTL表位，其中前者为HLA-A2限制性表位，后者为HLA-A31及AW68限制性表位。这些抗原表位跨越HBV核心抗原的关键性区域，在核心抗原的定位、基因组包装及前核心蛋白的表达中起到关键作用。对HBV急性自限性感染者及接受IFN-r治疗的HBV慢性感染者的外周血单核细胞，两者的相应肽段均可诱发显著的CTL反应(Missale G，J Exp Med.，177751-762，1993Nayersina R，JImmunol.，150(10)4659-71，1993)。
本发明人在多年从事表位研究的基础上，发现HBcAg的第98-106位氨基酸序列(GIRQLLWFHI)是良好的HBV CTL表位。经体外刺激PBMC后，其可有效的诱导CTL效应产生。我们以HepG2细胞为靶细胞并采用标准4小时51Gr释放法证实，在效靶比为100∶1时，溶破靶细胞效率可达到60.1％。
在我们的P/T基因中，除了包括衍生于NBV表面和核心抗原的抗原表位序列外，还进一步包括辅助性T淋巴细胞(HTL)表位及CpG岛核心序列。已知通用型辅助性T细胞(HTL)表位PADRE(AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla)能与和大多数人的HLA-DR分子、小鼠MHC II类分子高亲和力结合，并可有力地激活CD4+T淋巴细胞，使之分泌IL-2、IL-12等细胞因子。所说的这些细胞因子以旁分泌方式作用于HBV抗原特异性T细胞，从而大大提高疫苗的免疫效率(Livingston B，Immunol Res.18(2)79-92，1998)。也有人曾报道辅助性T细胞表位可显著地提高minigeneDNA疫苗的免疫效果。
从急性自限性HBV感染者的外周血中，可检测到针对HBV的多克隆多特异性CTL和辅助性T淋巴细胞(HTL)反应。这些反应被认为是与HBV病毒感染的清除控制有关。而在HBV慢性感染者外周血中，则几乎检测不到抗原刺激的T细胞所诱发产生的TH1型细胞因子(Brian D.，et al.，J Immunol.1623088-3095，1999；Chow YH.et al.，J Immunol.1601320-1329，1998)。因此我们相信，TH1型细胞应答在HBV病毒的清除中起到至关重要的作用。CpGDNA是一类其序列大部分以非甲基化胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基元的寡聚体，其碱基排列大多遵循以下规律5-PurPur CG PyrPyr-3。这种特征性序列可激活多种免疫效应细胞，尤其是对Th1型免疫应答具有显著的加强作用(Sato Y，Science，273(5)352-354，1996)。因此，在本发明的重组基因序列中加入可诱发高水平免应答的CpG岛序列(5-AACGTT-3’，含有CpG基元5’-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3’)，可有效地诱导IFN-r、IL-1等细胞因子的产生并共刺激信号分子的表达，从而提高抗乙型肝炎病毒的体液和细胞免疫反应水平。
HBV是一种部分双链环状的DNA病毒，长度为3200bp，有四个重叠的读框编码不同的病毒产物。DNA聚合酶是最大的读框，大约有2500bp，它不仅是普通的DNA聚合酶，还对RNA的中间产物起逆转录的作用。当HBV进入肝细胞，基因组进入细胞核，转化为共价闭环的DNA，并被转录为RNA的中间物。这个中间物可以向细胞膜移动，在那里病毒聚合酶通过逆转录将中间物转化为新的DNA。病毒的聚合酶是治疗慢性HBV感染的逆转录酶抑制剂的作用靶点，也是本发明基因设计的一个重要切入点。
本发明针对HBV的免疫学特征，根据已报道的HBV表位资料及我们先前在HBV CTL表位研究方面的积累，选择了5个可诱发高水平CTL应答的表位，与pre-S2基因共同组合成一个新的表达HBV CTL免疫原性肽的重组基因P/T，预期本发明的HBV多表位CTL免疫原性肽和基于该免疫原性肽制备的乙型肝炎疫苗不仅能够诱发特异性细胞和体液免疫应答，而且可有效地激活CTL反应并进而杀伤IIBV感染的肝细胞。可为乙型肝炎的预防与治疗提供一条新的途径。
为了得到本发明的包括多个HBV抗原表位的免疫原性肽序列，我们首先根据已知的HBV抗原表位设计并合成如下所示的核苷酸序列(图2)(SEQ ID NO9)。下示序列的下方注明了其中各片段的来源和氨基酸(aa)数，并在双链DNA的下面分别给出相应的氨基酸序列。其中划下线部分分别为5′和3′端附加的Hind III/BamH I和Sal I/EcoR I酶切位点，并且给出各抗原表位编码序列间头的甘氨酸密码子(以黑体字示出)。
5′-AGCTTGGATCCATGCAGTGGAACTCCACTACCTTCCACCAGACT3′-ACCTAGGTACGTCACCTTGAGGTGATGGAAGGTGGTCTGAGACGTC CTGCAGGACCCGCGTGTTCGTGGCCTGTACTTCCCGGCTGGTGGCCTGGGCGCACAAGCACCGGACATGAAGGGCCGACCACCGAGAAGGLeu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Thr Phe Pro Ala Gly Gly-----------------------------------------------------------------TCTTCCTCTGGTACTGTTAACCCGGTACCGACCACTGTTAGACCATGACAATTGGGCCATGGCTGGTGACAAAGGGGCSer Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Val-----------------------------------------------------------------
TCCCCGATCTCTCTGATCTTCTCCAAAATCGGCGACCTGGCACTGAAC` TAGAGAGACTAGAAGAGGTTTTAGCCGCTGGACCGTGACTTGCCASer Pro Ile Ser Leu Ile Phe Ser Lys Ile Gly Asp Leu Ala Leu Asn GGTGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAGGCTGCAGCGCGATTTAAGCAACGACGTACCTGAGACTTCCGACGTCGCCCAGly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala GGTTTCCTGCCGTCTGACTTTTTCCCGTCTGTGAAGGACGGCAGACTGAAAAAGGGCAGACACCCAGly Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val GGTTCCACTCTGCCGGAAACTACCGTTGTACGTCGCAAGGTGAGACGGCCTTTGATGGCAACATGCAGCGCCAGly Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg GGTAACGTTTTGCAACCAGly Asn Val GGTTTCCTGCTGACTCGTATCCTGACCATCAAGGACGACTGAGCATAGGACTGGTAGCCA(SEQ ID NO14)Gly Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile GGTATCCGTCAGCTGCTGTGGTTCCACATCTAGGCAGTCGACGACACCAAGGTGTAGCCA(SEQ ID NO15)Gly Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile GGTGGCCTGTCCCGTTACGTAGCTCGTCTG
CCGGACAGGGCAATGCATCGAGCAGACCCA(SEQ ID NO16)Gly Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu GGTTGAGTCGACGAATT-3′ACTCAGCTGCTTAA-5′GlySal I/EcoR I位点本发明的HBV多抗原表位的复合基因的核苷酸序列(SEQ ID NO9)如下所示5’AGCTTGGATCCATGCAGTGGAACTCCACTACCTTCCACCAGACTCTGCAGGACCCGCGTGTTCGTGGCCTGTACTTCCCGACCTAGGTACGTCACCTTGAGGTGATGGAAGGTGGTCTGAGACGTCCTGGGCGCACAAGCACCGGACATGAAGGGCGCTGGTGGCTCTTCCTCTGGTACTGTTAACCCGGTACCGACCACTGTTTCCCCGATCTCTCTGATCTTCTCCAAAATCGGCGACCACCGAGAAGGAGACCATGACAATTGGGCCATGGCTGGTGACAAAGGGGCTAGAGAGACTAGAAGAGGTTTTAGCCCGACCTGGCACTGAACGGTGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAGGCTGCAGCGGGTTTCCTGCCGTCTGACTTTTGCTGGACCGTGACAAGCCACGATTTAAGCAACGACGTACCTGAGACTTCCGACGTCGCCCAAAGGACGGCAGACTGAAAATCCCGTCTGTGGGTTCCACTCTGCCGGAAACTACCGTTGTACGTCGCGGTAACGTTGGTTTCCTGCTGACTCGTATCCTGAGGGCAGACACCCAAGGTGAGACGGCCTTTGATGGCAACATGCAGCGCCATTGCAACCAAAGGACGACTGAGCATAGGACACCATCGGTATCCGTCAGCTGCTGTGGTTCCACATCGGTGGCCTGTCCCGTTACGTAGCTCGTCTGGGTTGAGTCTGGTAGCCATAGGCAGTCGACGACACCAAGGTGTAGCCACCGGACAGGGCAATGCATCGAGCAGACCCAACTCAGCTGC5’因此，本发明进一步提供了制备具有上述序列的免疫原性复合多肽的方法，该方法包括以下步骤(1)分别分段合成编码如上限定的氨基酸序列的核苷酸小片段；
(2)分步退火连接步骤(1)的核苷酸小片段，得到长度约399bp的核苷酸；(3)将步骤(2)的核苷酸连接到适当的载体中；(4)用步骤(3)的重组载体转化适当的宿主细胞；(5)培养步骤(4)的重组体细胞，并从培养物上清和细胞内分离所需的乙型肝炎病毒免疫原性肽。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的小片段长度约10-30个碱基。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的全复合基因序列也可以是一次连续合成的。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的载体是质粒pWR450-1。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
可以使用本领域熟知的方法并使用适当的DNA合成装置合成如上给出的核苷酸序列。为了便于全序列的合成和纯化，可以按照如上所示的双链DNA序列分别合成定名为F1-F18的18个小片段，然后按照本发明的分步退火方案(参见图1)首先在DNA聚合酶存在下，将这些小片段中的F2-F17连接成三个较长的双链DNA片段。然后，再连接这三个较长的双链DNA片段，得到包括小片段F2-F17的大片段。最后，分别在如上得到的大片段的5′和3′末端加入Hind III/BamH I和Sal I/EcoR I酶切位点，即得到本发明所需的复合基因P/T。由于各表位序列间有甘氨酸编码序列作为接头或分割序列，所以可确保各表位的基本独立。另外，在不影响氨基酸密码和宿主菌可识别密码子的情况下，我们还对复合基因的个别碱基进行调换，尽可能地删除某些有害的二级结构。
或者，根据本发明方法的一个优选实施方案，也可以使用自动合成装置，一次连续合成编码本发明免疫原性多肽的复合基因序列。
经进一步纯化和鉴定后，将所得到的复合基因P/T连接到分别用Hind III/BamH I和Sal I/EcoR I酶切成线性的质粒载体启动子的下游。然后，用所得到的重组载体转化适当的宿主细胞，得到包含本发明的复合基因的重组体细胞。可以使用任何适于在原核、真核或酵母细胞中复制的质粒作为携带本发明复合基因的载体，并可使用任何原核、真核或酵母细胞作为本发明重组质粒载体的宿主细胞。然而，根据本发明的优选实施方案，最好使用质粒pWR450-1作为用于本发明的表达载体，并使用大肠杆菌作为重组质粒的宿主细胞。
可以在适于表达本发明的外源性复合基因的条件下，常规培养如上得到的重组体细胞，然后从细胞培养物上清和细胞裂解产物中回收基因表达产物。以常规方法分离并纯化所需的的蛋白质后，按下述方法进行蛋白质产物的理化性质鉴定和生物学活性分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示，如上得到的表达产物为分子量约为14KD的碱性蛋白质。
然后，进一步使用本领域技术人员熟知的抗体检测实验、淋巴细胞增殖实验、CTL细胞杀伤活性实验、淋巴细胞亚群分析、免疫小鼠细胞因子检测等方法，分析本发明的复合多肽对被免疫动物(Balb/c小鼠)的体液免疫和细胞免疫的影响。
我们的实验结果清楚地表明，本发明的复合多肽可在接受免疫的动物体内有效地诱导特异性抗体的生成、强有力地促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的增殖，并提高CTL的靶细胞杀伤活性。另一方面，我们的安全性试验证明，本发明的复合多肽在10倍有效剂量下使用对动物仍未见任何明显的不良付作用。
因此，有可能以本发明的包括多个HBV表位的免疫原性多肽作为复合免疫原，免疫人或其他哺乳动物并在接受者体内引发主动或被动免疫反应，进而达到预防或治疗乙型肝炎病毒感染的目的。
因此，本发明的再一个目的是提供如上限定的复合多肽作为乙型肝炎疫苗的应用。根据本发明的优选实施方案，按本发明方法得到的多肽可以作为治疗和/或预防性疫苗，用于接种任何可能遭受HBV感染的健康个体、HBV携带者，特别是急性或慢性乙型肝炎病人，以作为主动或被动免疫因子用于治疗或预防HBV感染。
本发明的免疫原性复合多肽可以单独使用，但最好是将所说的多肽与医药生产领域已知的并且医药上可接受的载体或赋形剂以及其他辅助成分混合在一起，制成疫苗组合物使用。例如，在制成溶液剂的情况下，所说的载体或赋形剂可以是无菌蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠或葡萄糖溶液，或低浓度(如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液态聚乙二醇)的溶剂或分散介质等。其他辅助成分例如可以是抗氧化剂(如抗坏盐酸)、抗微生物素(如青霉素和链霉素或其他抗真菌剂等)及防腐剂(如苯甲酸钠、三氯叔丁醇、度米酚、山梨酸等)，以及增溶剂和用于维持分散剂中所需颗粒大小的表面活性剂。为了可制成冷冻干燥的疫苗制剂，免除了疫苗生产、运输、储存和使用过程中的“冷链”压力并保证疫苗的接种效果，还可在所说的疫苗组合物中加入适当的稳定剂，例如由海藻糖、谷氨酸、抗坏血酸、尿素、山梨醇、肌醇和低分子右旋糖酐等成分组成的冻干稳定剂(参见中国专利00120743.1)，将含有本发明的复合多肽的疫苗组合物制成冻干制剂。
实施例下列实施例旨在举例描述本发明的免疫原性复合多肽的制备方法及其生物学活性。在不改变本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。特别是，就本发明免疫原性复合多肽的氨基酸结构而言，在不改变所说的多肽的空间结构的前提下，对所说氨基酸序列中个别氨基酸的任何取代、置换、加入或删除，都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1复合多肽的核苷酸编码序列的制备(1)HBV抗原表位的分析和鉴定经PCGENE软件分析，从HBcAg的氨基酸序列中找出一段具有独立结构的9氨基酸疏水序列(GIRQLLWFHI)(98-106aa)，并合成与该肽序列重叠或交叉一系列短肽。使用标准4小时51Cr释放法检测这些短肽诱导CTL杀伤活性的能力。简单地说，该方法包括用所说的短肽免疫动物后第6周，取作为靶细胞的HLA-A2外周血单核细胞(5×106细胞/mL)，在含有10％灭活胎牛血清、Con-A和IL-2的RPMI 1640/DMEM培养基中，于HBV短肽(10μmol/L)存在下培养8天。同时取作为效应细胞的HLA-A2限制性HepG2细胞(2×106细胞/ml)，在含20％胎牛血清和3.7MBq51Cr及HBV短肽的培养基中37℃保温2小时。洗涤并离心分离细胞后，用含10％胎牛血清的RPMI 1640/DMEM培养基稀释细胞至105/ml。然后，按效应细胞/靶细胞(E∶T)20～100∶1比例(各100μl)加入96孔板中。每组设3个复孔。用100μl RPMI 1640培养基取代效应细胞作为自然释放孔，并用等体积的10％Triton X-100取代效应细胞作为最大释放孔。保温5小时后，离心分离培养物上清，并使用γ计数器测定各孔的cpm值。结果表明，所选择的九肽作为HbcAg表位序列，确实可诱发针对外周血单核细胞的CTL杀伤活性。
以上述同样方法筛选并分析HBV蛋白中其他活性抗原表位序列。
(2)HBV复合抗原表位基因的设计基于HBV表位的现有资料及我们的前期工作，从HBV基因组中筛选出5个分别来自HBV表面抗原、核心抗原、HBV DNA多聚酶的高度保守的HLA识别表位肽。此外，为了进一步提高本发明复合多肽的免疫原活性，我们还在基因序列中加入了了辅助性T淋巴细胞(HTL)表位及CpG岛核心序列。根据计算机分析数据，借助甘氨酸接头将这些表位序列与HBV前S2基因序列连接在一起，得到长度约399bp的复合多表位抗原基因。
(3)编码HBV抗原表位的核苷酸片段的拼接分别分段合成包括上述6个HBV抗原表位的核苷酸编码序列的18个小DNA片段。然后按照图1所示的方案进行分步退火连接。
除片段FI和片段F18外，取其余各片段(各1μl)分别将F2与F11、F3与F12、F4与F13、F5与F14、F6与F15、F7与F16、F8与F17混和在一管中。各管中分别加入14μlddH2O，2μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4多核苷酸激酶；F1和F18管则分别加入7μlddH2O，1μl 10x多核苷酸激酶缓冲掖，1μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4多核苷酸激酶，然后在37℃下保温30分钟。在F9和F10中分别加入1μl F18和F1，再各加入9μl ddH2O，。所有9管均沸水浴20分钟，然后自然冷却退火至室温(约10小时)。
退火后，分别混合F2/F11与F3/F12、F4/F13与F5/F14、F6/F15、F7/F16与F8/F17，并各加1μ 10mmol/L ATP，1μl T4连接酶存在下16℃连接过夜，得到三个较大的片段。然后将这三个段混合在一起，于1μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4连接酶存在下16℃连接过夜。最后，混合所有片段，并于1μl10mmol/L ATP，0.5μl T4连接酶存在下16℃连接过夜。电泳回收约400bP的目的片段后，用T4多核苷酸酶使两5’末端磷酸化，得到5’末段带有BamHI/EcoRI双酶切位点的HBV多表位免疫原基因，其序列如图2所示。
实施例2携带HBV多表位免疫原基因的重组质粒的构建和宿主细胞转化用已知的插膜法和1％琼脂糖凝胶电泳分离并纯化如上得到的免疫原基因后，按常规方法将其连接到BamHI/EcoRI双酶切的质粒载体pWR450-1((由中国科学院上海细胞生物研究所郭礼和构建，参见Li-He Guo，et al.，ChineseJourney of Biotechnology1(2)14-33，1985)上，重新环化后用所得到的重组质粒转化大肠杆菌DH5a菌株。在含IPTG和X-gal的氨苄青霉素平板上挑取白色菌落抽提质粒进行鉴定。经BamHI/EcoRI双酶切并进行1％琼脂糖凝胶电泳后，筛选阳性克隆并切出相当于399bp的条带(图4)，从而得到携带HBV多抗原表位基因的重组质粒，并将其命名为p WR450-1/HBV-P/T(图3)。
用如此得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株的细胞，常规培养后按下述方法筛选阳性重组克隆先在含IPTG和X-gal的平板上进行初步筛选包含重组质粒的转化体，然后挑取白色菌落并抽提质粒DNA。以酶切鉴定法和核苷酸序列分析法进一步鉴定阳性克隆质粒。酶切鉴定结果如图4所示。
实施例3转化体细胞的培养和表达产物的分离与纯化在通用的LB培养基中，于37℃下培养如上得到的重组体细胞并加入诱导剂(IPTG)，诱导复合基因与载体质粒β-半乳糖酐酶基因融合表达后，离心分离培养物上清并从所说的上清和细胞裂解物中分离并纯化所需的复合多肽。例如，包涵体溶出物经彻底透析后，可以使用SP-Sepharose阳离子柱(9HiTrapSP-Sepharose HP，Amersham Biosciences公司)，层析纯化HiTrap SP-SepharoseHP 5ml预装柱，该柱经20mmol/L、pH9.0Tris.CL缓冲平衡液，将透析液上SP柱，用20mmol/L、缓冲液及含1mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液(pH9.0)进行梯度洗脱并分步收集洗脱峰。如此得到的蛋白质纯度可达到93％。SDS-PAGE结果表明如此得到的蛋白质为分子量约75KD的蛋白的碱性蛋白质。进一步的Western印迹分析显示，抗HBV患者血清可特异识别本发明的复合蛋白，而不可识别载体pWR450-1所表达的β-半乳糖酐酶蛋白，表明该复合蛋白具有较理想的免疫原性(图5)。
实施例4包含HBV抗原表位的复合多肽的生物学活性分析本实施例中使用的所有检测方法均为本领域已知的常规方法。
(1)被免疫小鼠的抗体水平检测将平均体重为15-20g的Balb/c小鼠随机分为三组重组复合多肽免疫组(P/BPT)(实验组)、β-半乳糖酐酶载体蛋白免疫组(P)(阳性对照组)和生理盐水空白对照组。实验组和阳性对照组每只动物每次接种0.1mg(0.5ml)蛋白质，空白对照组动物接受等体积的生理盐水。按常规辅以弗氏佐剂皮下多点免疫Balb/C小鼠，两周一次，共三次。每周小鼠眼底动脉采血，分离血清并用于抗体水平检测。
用本发明的融合多肽免疫小鼠后，以间接免疫ELISA方法检测被免疫动物的血清抗体水平。结果，免疫接种后第二周动物体内即有特异性IgG抗体产生，第九周抗体达到最高水平，且明显高于阴性和阳性对照组(P值分别小于0.05和0.01)(图6)。
(2)被免疫小鼠的CTL杀伤活性检测以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测被免疫小鼠CTL细胞的细胞毒活性。结果表明，当效应细胞∶靶细胞比例约为100∶1时，接受本发明融合多肽的实验组小鼠的特异性CTL活性可高达40.5％，并明显高于载体蛋白组和PBS对照组(P＜0.05)(图7)。
(3)被免疫小鼠的淋巴细胞增殖实验免疫后第8周，以MTT法检测被免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖能力，结果以培养物上清的470nm吸光率和由之计算的刺激指数SI表示。实验结果可见，接受本发明融合多肽的免疫组小鼠的脾细胞刺激指数SI值高于载体蛋白免疫组(P＝0.03)，亦明显高于PBS空白对照组(P＝0.003)，但载体蛋白免疫组的SI值和空白对照组的SI值无显著差别(P＝0.081)。说明本发明的多肽确实激活了动物的免疫系统，并促进了动物淋巴细胞的增生。结果如下列表1所示。
表1被免疫小鼠的淋巴细胞增殖活性测定组别 动物数 实验组(A470 对照组A470 SI0.548±0.015 0.371±0.0131.477融合蛋白 3 0.536±0.028 0.309±0.0161.7310.403±0.021 0.235±0.0061.7150.524±0.025 0.433±0.0641.210载体蛋白 3 0.465±0.022 0.309±0.0161.3680.243±0.005 0.210±0.0061.4700.219±0.006 0.212±0.0071.033空白对照 3 0.322±0.006 0.286±0.0081.1250.378±0.09 0.318±0.0291.189(4)被免疫小鼠的淋巴细胞亚群分析免疫接种后第8周，以流式细胞分选法分析被免疫动物的脾淋巴细胞亚群及其比例。结果可见，融合多肽免疫组小鼠的CD4/CD8平均比值为2.69±0.302，载体蛋白免疫组的平均值为1.89±0.090，二者相比P＜0.05。空白对照组动物的CD4/CD8平均比值为1.96±0.147，与载体蛋白组相比P＝0.03＜0.05。这些结果表明，本发明的融合多肽可促进CD4+T淋巴细胞的增殖(图8)。另外，比较不同淋巴细胞亚群的比例显示，CD4+T淋巴细胞亚群比例显著高于空白对照组(P＝0.04＜0.05)，但三组间的CD8+T淋巴细胞亚群比例则无明显差异(P＞0.05)。
(5)被免疫小鼠的血清内细胞因子水平融合多肽免疫小鼠后，以RT-PCR法半定量检测小鼠脾细胞特异性细胞因子mRNA的水平。结果显示，接种载体蛋白的对照组动物IL-6、IL-12m RNA水平未见显著升高(P值分别为0.817和0.254)。而与载体蛋白组相比，接种本发明的融合多肽的实验组动物的IFN-r水平则明显升高(P＝0.038＜0.05)。表明本发明的融合多肽可刺激细胞因子IFN-r的生成与分泌(图9)。
(6)安全性试验小鼠经疫苗接种后，注射部位无明显红肿。观察期间动物正常进食，未见明显的异常行为，并且各组动物体重亦无明显改变。接种10倍于有效剂量的本发明的复合蛋白10周后，大体解剖除发现复合蛋白免疫组小鼠的脾脏轻微有肿大外，未见小鼠肝及淋巴结等其它器官发生明显的改变。肌肉免疫组织化学检查亦无异常发现。
序列表<110>热带病研究所<120>乙型肝炎疫苗及其制备方法<140>
<141>
<160>9<210>1<211>176<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的带有5′端附加酶切位点的HBV前S2区抗原表位编码序列。
<400>1AGCTTGGATC CATGCAGTGG AACTCCACTA CCTTCCACCAGACTCTGCAG GACCCGCGTG TTCGTGGCCT GTACTTCCCGGCTGGTGGCT CTTCCTCTGG TACTGTTAAC CCGGTACCGACCACTGTTTC CCCGATCTCT CTGATCTTCT CCAAAATCGGCGACCTGGCA CTGAAC<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>带有N末端甘氨酸接头的合成的辅助性T淋巴细胞表位的编码序列.
<400>2GGTGCTAAAT TCGTTGCTGC ATGGACTCTG AAGGCTGCAG CG<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>带有N末端甘氨酸接头的合成的HBV核心抗原表位的编码序列。
<400>3GGTTTCCTGC CGTCTGACTT TTTCCCGTCT GTG<210>4
<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>带有N末端甘氨酸接头的合成的HBV核心抗原表位的编码序列。
<400>4GGTTCCACT CTGCCGGAAA CTACCGTTGT ACGTCGC<210>5<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>带有N末端甘氨酸接头的合成的CpG核心的编码序列。
<400>5GGTAACGTT<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>带有N末端甘氨酸接头的合成的HBV表面抗原表位的编码序列。
<400>6GGTTTCCTGC TGACTCGTAT CCTGACCATC<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>带有N末端甘氨酸接头的合成的HBV核心抗原表位的编码序列。
<400>7GGTATCCGTC AGCTGCTGTG GTTCCACATC<210>8<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>带有3′末端酶切位点的乙型肝炎病毒DNA聚合酶表位的编码序列。
<400>8
GGTGGCCTGTCCCGTTACGTAGCTCGTCTGGGTTGAGTCGACGAATT<210>9<211>399<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>复合多肽基因序列(正链)。
<400>9AGCTTGGATC CATGCAGTGG AACTCCACTA CCTTCCACCA GACTCTGCAG GACCCGCGTG TTCGTGGCCTGTACTTCCCG GCTGGTGGCT CTTCCTCTGG TACTGTTAAC CCGGTACCGA CCACTGTTTC CCCGATCTCTCTGATCTTCT CCAAAATCGG CGACCTGGCA CTGAACGGTG CTAAATTCGT TGCTGCATGG ACTCTGAAGGCTGCAGCGGG TTTCCTGCCG TCTGACTTTT TCCCGTCTGT GGGTTCCACT CTGCCGGAAA CTACCGTTGTACGTCGCGGT AACGTTGGTT TCCTGCTGAC TCGTATCCTG ACCATCGGTA TCCGTCAGCT GCTGTGGTTCCACATCGGTG GCCTGTCCCG TTACGTAGCT CGTCTGGGTT GAGTCCTGC
权利要求
1.乙型肝炎病毒免疫原性复合多肽，特征在于所说的免疫原性多肽包括至少部分HBV前S2区的氨基酸序列，和分别来自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、HBV DNA聚合酶的其他四个连续的HLA限制性抗原表位的氨基酸序列及由之形成的空间结构。
2.据权利要求1的复合多肽，其中所说的乙型肝炎病毒抗原表位分别是相当于乙型肝炎表面抗原前S2区第1-55位氨基酸的肽片段MetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnThrLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuThrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrValSerProIleSerLeuIlePheSerLysIleGlyAspLeuAlaLeuAsn(SEQ ID NO1)；相当于乙型肝炎核心抗原第18-27位氨基酸的肽片段PheLeuProSerAspPhePheProSerVal(SEQ ID NO2)；相当于乙型肝炎核心抗原第141-151位氨基酸的肽片段SerThrLeuProGluThrThrValValArgArg(SEQ ID NO3)；相当于乙型肝炎表面抗原第183-191位氨基酸并且N末端带有甘氨酸接头的肽片段PheLeuLeuThrArgIleLeuThrIle(SEQ ID NO4)；相当于乙型肝炎病毒核心抗原第98-106位氨基酸的肽片段IleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIle(SEQ IDNO5)，以及相当于乙型肝炎病毒DNA聚合酶第455-463位氨基酸的肽片段GlyLeuSerArgTyrValAlaArgLeu(SEQ ID NO6)。
3.据权利要求1的复合多肽，所说的免疫原性肽还可包括具有氨基酸序列AlaLysPheValAlaAlaTrpThrLeuLysAlaAlaAla(SEQ ID NO7)的辅助性T细胞表位PADRE和具有氨基酸序列AsnVal(SEQ ID NO8)的CpG岛核心序列。
4.根据权利要求1的复合多肽，构成所说的乙型肝炎病毒免疫原性肽是由权利要求2肽片段以任何排列方式串联连接的。
5.根据权利要求1的复合多肽，其中构成所说的乙型肝炎病毒免疫原性肽的每两个独立的序列之间均有由一个或多个甘氨酸构成的接头。
6.制备如权利要求1限定的乙型肝炎病毒免疫原性多肽的方法，该方法包括以下步骤(1)分别分段合成编码如上限定的氨基酸序列的核苷酸小片段；(2)分步退火连接步骤(1)的核苷酸小片段，得到长度约399bp的全复合基因序列；(3)将步骤(2)的多核苷酸连接到适当的载体中；(4)用步骤(3)的重组载体转化适当的宿主细胞；(5)培养步骤(4)的重组体细胞，并从培养物上清和细胞内分离所需的乙型肝炎病毒免疫原性多肽。
7.根据权利要求6的方法，其中所说的全复合基因序列也可以是以一次连续方法合成的。
8.根据权利要求6的方法，其中所说的小片段长度约为10-30个碱基。
9.根据权利要求1的乙型肝炎病毒免疫原性多肽作为治疗/预防性乙型肝炎疫苗的应用。
10.具有预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染作用的疫苗，特征在于所说的疫苗含有作为基本活性成分的权利要求1的免疫原性复合多肽。
全文摘要
本发明涉及衍生于乙型肝炎病毒衣壳蛋白质的免疫原性多肽，特别是涉及包括乙型肝炎抗原的多个HLA限制性表位的复合多肽，其制备方法及其作为预防/治疗性乙型肝炎疫苗的应用。
文档编号A61P1/16GK1594359SQ0314043
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月8日 优先权日2003年9月8日
发明者李明, 骆利敏, 王萍 申请人:热带病研究所