专利名称：Cc10蛋白的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及CC10蛋白的表达和制备方法，及其在治疗哺乳动物肺部相关疾病、哮喘、肿瘤以及肾脏疾病等方面的应用。
背景技术：
CC10(Clara cell 10kDa protein，Clara细胞10kDa蛋白)，又称为UGB(Uteroglobin，子宫球蛋白)、CCSP、CC16，主要由肺泡II型Clara细胞分泌，分基本型和类固醇诱导型两类，是分泌球蛋白家族(secretoglobins，SCGBs)成员。和其他家族成员类似，CC10通过链间的二硫键形成二聚体，蛋白中主要是α螺旋结构。
人CC10基因位于11号染色体q12.3-q13.1区，全长4.1kb，含有3个外显子，2个内含子。CC10蛋白前体共91个氨基酸，其中21个为信号肽，成熟蛋白70个氨基酸。其中3位的半胱氨酸与另一蛋白的69位形成二硫键，同时69位半胱氨酸与对应蛋白的3位形成二硫键，从而形成了由两个链间二硫键相连的二聚体。形成的二聚体比较稳定，对酸、酶都有很好的耐受性。CC10蛋白是良好的谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase，TG)的天然蛋白底物，体外试验中，TG能催化CC10蛋白通过相互交联形成高分子的聚合物。
CC10具有免疫调节、抗炎、抗纤维化和抗肿瘤等生物学活性。体外研究表明，CC10是分泌型磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)的强抑制剂(Am.J.Respir.Crit.Care Med.152290)，而PLA2与炎性介质的产生密切相关，PLA2可溶解肺泡表面卵磷脂，是感染性疾病诱发ARDS的关键因素；CC10还可抑制细胞释放花生四烯酸，花生四烯酸经脂氧化酶及环氧化酶作用，生成白三烯、血栓素、前列腺素等炎性介质，介导炎性细胞的趋化、激活以及细胞外基质浸润。
CC10可以抑制甲酸蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(Formyl methionine-leucine-phenylalanine，FMLP)诱导的中性粒细胞和单核细胞的趋化作用(Cell Mol.LifeSci.55771)；CC10还抑制在体外IL-2刺激的人外周血淋巴细胞释放TNF-α、IL-1β以及IL-8等炎性细胞因子(J.of Immunology 2001，1673025)；CC10还能够结合细菌的细胞膜，从而抑制毒素在肺部积累，减轻肺部损伤；疏缓肺部平滑肌和肺部血管，改善肺功能。
研究表明，CC10基因缺陷小鼠对多种损伤因素均敏感，如100％浓度的氧吸入、臭氧吸入、病毒或细菌感染等，并且更容易演变成急性呼吸窘迫综合症样的肺泡改变；进一步研究表明，当CC10基因缺陷小鼠气管内感染腺病毒或假单胞杆菌时，局部的中性粒细胞明显增加，在肺脏匀浆中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平表达也增高(Am.J.Respir.Cell Biol.17147)。
一些间接性的证据也提示CC10是肺脏炎症的重要保护性机制，如肺部出现炎症反应时，相应肺脏产生CC10增多；吸烟导致CC10的产生减少，血清中CC10含量相应降低；CC10基因定位于染色体11q13区，基因学研究表明该区与超敏和支气管超反应性相关，并且在哮喘患者中发现CC10不同的等位基因(Am.J.Respir.Crit.Care Med.160930)；在新生儿呼吸窘迫综合症和多种因素导致的急性呼吸窘迫综合症的情况下，局部或全身CC10水平异常。
目前，CC10蛋白在临床上的应用已经取得了很大的进展，CC10已经被美国FDA批准用于治疗新生儿呼吸窘迫综合症(Neonatal respiratory distresssyndrome，nRDS)，这些新生儿不能产生天然CC10，容易发展成严重肺部感染。在支气管-肺发育不良症(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)上也已完成II期临床。
在美国，CC10正在被尝试用于治疗成人呼吸窘迫综合症，其适应症范围还可扩大到特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺炎、哮喘等。此外，CC10在肾脏疾病及癌症治疗方面也有一定作用。天然CC10在保护肾脏功能方面至关重要。许多糖尿病及慢性高血压的患者逐渐丧失肾功能，最后需要透析或肾移植，实验室结果表明， 血液中的天然CC10可以抵制肾脏衰竭，重组CC10可能对肾脏疾病的减缓有一定作用。
CC10通过TG交联到细胞膜上，从而保护了胚泡、精子等细胞上的抗原位点，防止引起不必要的免疫反应。在体外试验中(Proc.Natl.Acad.Sci.USA932915)，CC10能通过特异性受体，抑制人滋养层细胞和NIH 3T3细胞穿透人工基底膜，证明它在正常怀孕过程中防止绒膜癌的产生有重要作用。最新研究表明，CC10可以抑制肿瘤细胞的生长和代谢，有鉴于此，重组CC10可以和其他化疗药物联合使用，用于癌症治疗。
发明内容
本发明的一个目的在于提供用大肠杆菌或甲醇酵母表达CC10蛋白并分离纯化制备CC10蛋白的生产方法。
本发明的另一个目的是提供含有所获得的CC10蛋白的药物制剂。
本发明还提供上述CC10蛋白在制备预防和治疗哺乳动物肺部相关疾病、哮喘、肿瘤以及肾脏疾病的药物中的用途。
本发明生产CC10蛋白的方法包括(a)将编码CC10蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌或酵母表达载体，得到CC10蛋白重组表达载体；(b)将步骤(a)中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达CC10蛋白的工程菌；(c)在适合CC10蛋白表达的条件下发酵培养步骤(b)中的工程菌；(d)从步骤(c)的发酵培养产物中纯化分离出所述CC10蛋白。
通常，在进行上述步骤(a)之前，根据文献报道，按照大肠杆菌偏爱密码子设计CC10的基因片段，同时设计引物，并引入适当的内切酶位点，然后采用PCR方法将基因拼接全长，从而获得CC10蛋白的核苷酸序列。
本发明所述的CC10蛋白包括其变体，所述变体有1-5个添加、缺失或置换。本发明CC10蛋白或其变体可选自(a)SEQ ID NO1所示的CC10蛋白序列；(b)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met的序列；(c)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met-Ala-Ala的序列。
本发明所述的CC10蛋白还包括CC10蛋白本身与免疫球蛋白Fc或白蛋白融合产生的蛋白。众所周知，与免疫球蛋白或白蛋白融合可以延长蛋白的半衰期，从而提高蛋白的活性。
本发明提供一种编码CC10蛋白的核酸序列。众所周知，一种氨基酸可以有多种密码子编码，本发明分别提供了一种编码CC10蛋白的核酸序列(SEQ IDNO2)，但在某些实施方案中，可以根据实际需要对核酸密码子进行突变，特别是选用宿主菌偏爱密码子，但所产生的CC10蛋白的氨基酸序列不变。
本发明中所指的大肠杆菌可以是各种菌株如DH5α、BL21(DE3)、K802等，本发明宿主菌优选BL21(DE3)。而选用的表达载体可以是pBV220、pET11a、pET32a(+)等本领域已知的载体。本发明优选大肠杆菌pET表达载体，最佳为pET32a(+)。
本发明中所指的甲醇酵母包括巴德氏毕赤酵母(pichia pastoris)、pichiamathonolica等能够利用甲醇作为唯一碳源的酵母。本发明中使用的表达载体可以选用各种已知的载体，如商业化的载体pHIL-D2、pPIC9、pPICZα、pPIC3.5K等。将重组表达载体通过化学转化、电转化或原生质体转化等方法转入宿主细胞，利用合适的条件筛选重组子，可以诱导表达重组蛋白。
本发明中，当工程菌为大肠杆菌时，发酵培养包括以下步骤经筛选的工程菌株活化后接入培养液(如LB)中制备种子液，培养过夜后接种至发酵罐中，发酵用培养基为基础培养基(例如M9+LB)，发酵条件控制为pH4.0-8.0，优选pH7.0，温度28℃-37℃，优选为30.0，溶氧控制在30％以上。培养3-6小时后开始补料，加入甘油或葡萄糖等，当菌体OD值达到高密度(OD600为3-200)，加入诱导剂〔如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或甲醇〕诱导表达，控制pH5.0-7.0，优选pH6.0，诱导2-8小时结束。
在本发明一个优选实施例中，工程菌为大肠杆菌，发酵pH较佳为6.0-8.0，更佳为7.0；当菌体OD600为3-20、优选3-15时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
在本发明另一优选实施例中，工程菌为甲醇酵母，发酵时的pH控制为5.0-8.0，优选为7.0，当菌体OD600达到15-200时，加入诱导剂甲醇进行诱导。
本发明中，从发酵产物中纯化分离出CC10蛋白或CC10融合蛋白包括以下要点收集发酵产物，目标蛋白表达产物存在于培养液或菌体中；如表达产物在菌体中，则需破菌；经多步纯化获得产物(包括亲和柱层析、离子柱层析、反向层析、透析、超滤或凝胶过滤等)；用SDS-PAGE和RP-HPLC检验，获得纯度大于95％的目标蛋白。
本发明提供的CC10蛋白生产方法可以使CC10蛋白表达量占到全菌蛋白的15％左右，纯化得率超过30％。比文献报道的5％左右的表达量要高3倍。
本发明首次提出CC10可以有效地治疗严重急性呼吸道综合症(SARS)，根据有关报道，10％的SARS患者病情进行性恶化，发展为急性呼吸窘迫综合症，需要呼吸机的维持治疗，急性呼吸窘迫综合症的死亡率极高，约80％。SARS的另一致命原因是因为感染诱发了过激的免疫反应，以致身体对肺组织出现自我排斥现象所致，故利用CC10抑制细胞免疫反应，抑制炎症反应和过敏性反应以及组织纤维化。可以减轻SARS感染症状，减少肺部纤维化，提高疾病的治愈率。
CC10治疗SARS的依据在于(1)SARS患者并发ARDS时，需高浓度氧的正压通气治疗，有可能引起氧中毒而进一步影响肺功能。在给新生小猪100％氧浓度正压通气造成的氧中毒和气压性损伤的模型中，rhCC10可使肺顺应性恢复至正常水平，对肺功能具有明显的保护作用。(2)在SARS相关ARDS病人肺泡灌洗液中，白细胞尤其是中性粒细胞计数显著偏高。在新生兔子和羊羔的的呼吸窘迫综合征模型中，rhCC10可抑制单核细胞和中性粒细胞的浸润，同时降低肺组织和循环中IL-8的浓度，后者是引起ARDS发生的最直接的细胞因子。(3)CC10抑制磷酸酯酶A2的活性，而PLA2与炎性介质的产生密切相关，PLA2还溶解肺泡表面卵磷脂，导致ARDS的产生。(4)在内毒素诱导离体灌注大鼠肺脏气道收缩的模型中，CC10对抗内毒素所引起的气道阻力增加，同时降低了体液中炎性细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6的水平。(5)在呼吸道合胞病毒感染导致的小鼠肺炎模型中，rhCC10除表现出有效的抗炎作用外，它还可以促进病毒颗粒的清除，选择性地抑制Th2细胞因子反应，而对Th1无影响，因此对机体的抗病毒免疫无抑制。
已确证，CC10蛋白在临床应用上是安全有效的。因此，该蛋白是安全的并适宜于药物使用。
本发明的药物制剂，是含有本发明蛋白的药物制剂，或者是以本发明蛋白为活性成分、与传统的辅剂和添加物一起组成的药物制剂，包括注射针剂、口服制剂、含服制剂及肺部、气道、鼻腔给药制剂及其他非肠道给药组合物。
注射针剂含有本发明活性蛋白，优选以无菌冻干物储存。在给药前与合适的等渗溶液混合，等渗溶液包括传统的适于注射或注入的等渗水系统，其中含有用于注射液的普通添加物如稳定剂和促溶剂，优选生理盐水或通过缓冲液调成的等渗溶液。
口服制剂含有本发明活性蛋白，包括按知方法制备的固体组合物、液体组合物及喷雾组合物。该组合物为含有本发明活性蛋白与至少一种常用的惰性稀释剂混合。该组合物在实际一般情况下，也可加入惰性稀释剂之外的其他添加物如润滑剂(例如硬脂酸镁)、悬浮剂、崩解剂(如甘醇酸纤维素钙)、稳剂(例如乳糖)、助溶剂(例如谷氨酸、天冬氨酸)、甜味剂、芳香剂以及防腐剂等。
含服制剂及肺部、气道、鼻腔给药制剂及其他非肠道给药组合物含有本发明活性多肽，包括本发明活性蛋白与普通添加物如惰性稀释剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂等混合，并用已知方法制备的喷剂、搽剂、栓剂、药膏等。
CC10蛋白可以用于治疗SARS，还可用于防治其他肺部急性感染(病毒或者细菌性)、成人呼吸窘迫综合症、肺纤维化、慢性阻塞性肺炎、哮喘、肿瘤以及肾脏疾病等。
图1重组质粒1的构建示意图。
图2为重组质粒2的构建示意图。
图3为CC10融合表达电泳图。
图4为重组质粒3的构建示意图。
图5为重组质粒4示意图。图中，“Ampicillin”为氨苄抗性基因。
图6为重组质粒5示意图。
图7表示CC10抑制猪胰腺磷脂酶A2的剂量图。
图8表示内毒素对离体灌注通气肺组织的气道阻力影响。
图9表示CC10对内毒素诱导气道阻力增加的百分率。
图10表示支气管肺泡灌洗液中TNFα的含量，单位为pg/ml。
图11表示支气管肺泡灌洗液中IL-6的含量，单位为pg/ml。
图12表示肺循环灌注液中IL-1β的含量，单位为pg/ml。
具体实施例方式
实施例1表达载体为pET11a的CC10工程菌的构建本例利用Novagen公司的pET表达系统表达CC10蛋白。
1.1基因的全合成与重组质粒1的构建(图1)设计并合成基因片段P1、P2、P3、P4、P5、P6(SEQ ID NO3，4，5，6，7，8)，其中P1引物引入NdeI位点，同时在Met后引入两个Ala以增加表达量，P6引物引入了BamHI、HindIII、NotI位点。首先以P3、P4为模板，P2、P5为引物，进行第一次PCR反应，然后以此产物为模板，以P1、P6为引物进行第二次PCR，得到250bp左右的PCR产物。用胶回收方法回收PCR产物，用NdeI和BamHI位点将基因片段克隆到pET11a载体中，获得重组质粒1，经测序证实序列正确。
1.2质粒的转化与工程菌的筛选将重组质粒1转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen公司)，用氨苄青霉素抗性筛选，得阳性克隆，为CC10的表达工程菌〔pET11a-CC10/BL21(DE3)〕。
将经筛选的CC10工程菌划线在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于LB培养液(含Amp 100μg/ml)，37℃培养过夜。将过夜菌以1∶20接种于LB培养液(含Amp 100μg/ml)，37℃振荡培养。当OD600达0.6～0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导6小时。菌液经5000rpm，5min离心。去培养基上清，沉淀菌体加入上样缓冲液，100℃水浴3min，离心后上SDS-PAGE电泳(浓缩胶5％，分离胶15％)，染色、脱色、扫描分析。因CC10基因长219bp，蛋白含73个氨基酸，理论分子量约为8.1KD。
实施例2表达载体为pET32a(+)的CC10融合表达工程菌的构建2.1重组质粒2的构建(图2)设计并合成引物7(SEQ ID NO9)，引物7引入肠激酶识别位点相应DNA序列，同时引入KpnI酶切位点。以pET11a-CC10为模板，以P7、P6为引物，PCR扩增CC10基因，电泳回收基因片段，用KpnI和HindIII处理，电泳回收得到KpnI和HindIII处理后的基因片段。
用KpnI和HindIII切开表达质粒pET32a(+)，然后与KpnI和HindIII处理后的基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司)，涂布在带氨苄青霉素的LB平板上。筛选转化子得到重组质粒2。
2.2CC10在大肠杆菌中的融合表达将重组质粒2转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen公司)，用氨苄青霉素抗性筛选，得阳性克隆，为CC10的表达工程菌(pET32a(+)-CC10/BL21(DE3))。
将经筛选的CC10工程菌划线在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养16小时。挑选生长良好的单菌落，接种于LB培养液(含Amp 100μg/ml)，37℃培养过夜。将过夜菌以1∶20接种于LB培养液(含Amp 100μg/ml)，37℃振荡培养。当OD600达0.6～0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导6小时。菌液经5000rpm，5min离心。去培养基上清，沉淀菌体加入上样缓冲液，100℃水浴3min，离心后上SDS-PAGE电泳(浓缩胶5％，分离胶15％)，染色、脱色、扫描分析。因Trx-CC10融合基因长714bp，融合蛋白含228个氨基酸，理论分子量约为25KD。SDS-PAGE结果表明在20KD和31KD之间有明显表达条带(图3)，与预期相符，融合蛋白占菌体总蛋白25％左右。筛选高表达的菌株为工程菌株。
实施例3表达载体为pPIC9的CC10工程菌的构建本例使用Invitrogen公司Pichia pastoris表达系统表达CC10蛋白。
3.1重组质粒3的构建(图4)设计并合成引物P8(SEQ ID NO10)，引物P8中引入XhoI酶切位点和酵母α信号肽切割位点(KEX2酶识别位点)。以pET11a-CC10为模板，以P8、P6为引物，PCR扩增CC10基因，电泳回收基因片段，用XhoI和NotI酶切处理并回收。同时用XhoI和NotI酶切pPIC9质粒，电泳回收后与XhoI和NotI处理后的CC10基因片段连接，然后转化大肠杆菌DH5α(购自Invitrogen公司)，筛选转化子得重组质粒3(pPIC9-CC10)。DNA序列分析证明基因序列正确。
3.2重组质粒3转化宿主菌GS115大量抽提重组质粒3，用SalI线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的GS115宿主菌，涂布在MD筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
3.3表达筛选从MD平板上选20个单克隆分别接种到3ml MGY培养基中，30℃培养48小时后加入27ml MM培养基进行诱导，表达72小时，取样进行SDS-PAGE检测，筛选高表达的菌株为工程菌株。
实施例4表达载体为pMETαA的CC10蛋白工程菌的构建本例使用Invitrogen公司Pichia mathonolica表达系统表达CC10蛋白。
4.1重组质粒4的构建用XhoI和NotI双酶切实施例3中的重组质粒3，回收CC10蛋白基因片段，与XhoI和NotI酶切处理的pMETαA质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有100ug/ml的氨苄青霉素的LB平板上，筛选转化子得重组质粒4(图5)。
4.2重组质粒4转化宿主菌PMAD11大量抽提重组质粒4，用ApaI线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的PMAD11宿主菌，涂布在MD筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
4.3表达筛选从MD平板上挑选20个单克隆分别接种到50ml的BMGY培养基中，30℃培养到OD600为6.0，离心收集菌体，重新悬浮到5ml的BMMY培养基中诱导表达，每24小时补加50ul的甲醇，诱导表达72小时，取样SDS-PAGE，筛选高表达菌株为工程菌。
实施例5表达载体为pGAPZαA的CC10蛋白工程菌的构建本例使用Invitrogen公司的连续表达载体pGAPZα载体表达CC10蛋白。
5.1重组质粒5的构建用XhoI和NotI双酶切实施例4中的重组质粒4，回收CC10蛋白基因片段，与XhoI和NotI酶切处理的pGAPZαA质粒连接，转化大肠杆菌TOP10F′，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低盐LB平板上，筛选转化子得到重组质粒5(图6)。
5.2重组质粒5转化宿主菌X-33大量抽提重组质粒5，用AvrII线性化，然后用无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后晾干，溶于适量的TE溶液中(浓度约为1μg/μL)。然后电转化制备好的X-33宿主菌，涂布含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS筛选培养基上，30℃培养3天，得到酵母转化子。
5.3表达筛选从转化子中挑选20个单克隆，分别接种到50ml的YPD培养基中，30℃培养表达72小时，取样SDS-PAGE，筛选高表达菌株为工程菌。
实施例6在大肠杆菌中的发酵将实施例1获得的工程菌株斜面上取一环菌种接入LB培养液中，30℃200rpm摇瓶培养12-16小时后按10％接种量接入M9+LB培养液中，30℃250rpm摇瓶培养6小时。将种子液按1∶20接入量加入装有m9+LB培养基的发酵罐中，30℃，400rpm培养，通气量0.2vvm，控制pH值7.0，溶解氧(DO)30％以上，培养至4-6小时，DO值开始上升时开始补加葡萄糖，至OD600约为5时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导3.5小时停止发酵。
实施例7酵母工程菌的发酵将实施例3中获得的工程菌株接种于BMGY培养基中，30℃培养24小时后，作为种子液接种于发酵罐中，发酵培养基为加了微量元素的基础培养基溶液，发酵温度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％，菌体生长24小时后开始补加甘油，同时将pH下调到3.0。菌体OD600达到200时开始加入甲醇诱导表达。起始甲醇添加量控制为每升每小时1-2ml，随后逐渐增大每升每小时至15-20ml，通过调节搅拌速度和通气量保持溶氧值大于30％，必要时通入纯氧。连续诱导培养72小时后收获培养液，离心收集上清，4.0℃保存。
实施例8CC10蛋白的纯化8.1发酵产物的预处理将实施例6中得到的发酵产物(8000g)离心10min收集菌体，把菌体按1∶5(g∶ml)的比例重悬于破菌缓冲液(20mM PB，1mM EDTA，pH7.5)中，用高压匀浆法破菌，破菌后10000rpm(18000g)离心30min，收集上清液备用。
将实施例7中得到的发酵上清液用磷酸盐缓冲液调节pH至7.5，通过分子量为3000的超滤膜浓缩体积至原先的1/5。
8.2Sephacryl S-100柱层析Sephacryl S-100柱(Phamacia)用平衡缓冲液(50mM Gly-HCl，pH3.5)充分平衡，把上述离心上清液过柱，流速为3ml/min。用平衡缓冲液洗脱，分步收集洗脱峰(5ml/管)，用SDS-PAGE分析洗脱峰成分，把含CC10蛋白的组分合并收集备用。
8.3SP-Sepharose HP柱层析SP-Sepharose HP柱(Phamacia)用平衡缓冲液(50mM Gly-HCl，pH3.5)充分平衡，把上述离心收集液过柱，并用平衡缓冲液洗至基线平稳，然后用线性的盐梯度(B液50mM Gly-HCl，0.5M NaCl，pH3.5)洗脱(0-80％B，40ml，40min)。分步收集洗脱峰，用SDS-PAGE分析洗脱峰成分，把含CC10蛋白的组分合并收集备用。
8.4Superdex 75柱层析Superdex 75柱(Phamacia)用平衡缓冲液(50mM乙酸铵，pH6.0)充分平衡，把上述收集液过柱，流速1.5ml/min。用平衡缓冲液洗脱，分步收集洗脱峰，用SDS-PAGE分析洗脱峰成分，把纯的CC10蛋白组分合并收集。用RP-HPLC分析(C-18柱)纯度大于95％。
实施例9CC10抑制磷脂酶A2的活性测定采用Cayman化学公司提供的PhospholipaseA2 Assay Kit检测，其原理是底物二庚酰基磷脂酰胆碱(diheptanoyphosphatidylcholdine，一种磷脂)的1，2-二硫代类似物被PLA2水解后产生硫醇，与显色剂DNTB结合而显色。在检测板的各滴定孔内加入5ul检测缓冲液，10ul显色剂DNTB，阳性对照孔内加入标准品10ul PLA2，将实施例8获得的CC10溶于0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，取不同的摩尔浓度，与猪胰腺来源的2nM的磷脂酶A2(购自Sigma)在37℃共孵育25分钟，混合液中取10ul样品加入测定孔中，每孔加入200ul底物溶液启动反应，记录开始加入的精确时间。用封板胶覆盖反应孔，小心振动板子混匀，于405nm测定至少5个时间点的OD值。选取OD值在1.2内(反应呈线性)的两个时间点计算酶活性，结果表明纯化的重组CC10蛋白可以明显地抑制PLA2活性(见图7)。
实施例10CC10抑制内毒素诱导离体灌注大鼠肺脏气道收缩的研究10.1离体灌注通气的大鼠肺脏准备将雄性Sprague-Dawley大鼠(210-320g)麻醉，然后后分离肺脏，经肺动脉用含有12.5mM HEPES、5.0mM葡萄糖和2％牛血清白蛋白组份V的Krebs-Ringer缓冲液持续维持10cmH2O静水压。首次输入50ml缓冲液替换原有的血液，用蠕动泵将流入和流出连接起来，肺脏实现用总体积100ml的可再循环缓冲液进行体外灌注，通过调节泵压，使静水压维持在10cmH2O，肺动脉压由血压传感器测量并纪录到示波器上，调整流出端高度使左侧动脉压为0cmH2O。灌注液的pH值由CO2控制在7.32到7.45之间，温度保持37℃。
将离体的肺脏悬挂在气管上，置于37℃、潮湿的人工胸腔中，施行负压通气，每分钟80次。呼吸机和真空泵连接人工胸腔，产生相对于外周的浮动性负压(-1到-10cmH2O)。用压差传感器测量胸腔压力，用连接在一个压差传感器上的呼吸速度描记管测量空气流速。用温暖的室内气体进行通气，每5分钟通过将吸气末压力降到-14cmH2O，激活一次深呼吸。胸腔压力(P)和空气流速(F)可用以计算任何时间(t)的气道阻力(R)，计算公式为Rt＝Pt/Ft。
10.2 CC10对内毒素诱导增加气道阻力的影响实验分三组LPS，CC10+LPS，CC10。内毒素LPS(20mg/kg)溶于1ml仅仅不含有牛血清白蛋白的Krebs-Ringer缓冲液中，输注到流入肺动脉的管中，继续灌注120min，记录压力和流速，分析内毒素是否增加气道阻力，结果见图8，发现随着时间的延长，内毒素组的气道阻力逐渐增加。为了判断CC10的作用，在LPS输注前，输注溶于0.8ml生理盐水中的实施例8的CC10(20mg/kg)的溶液，并循环30min以保证内循环状态稳定，然后如前所述，灌注LPS，记录压力和流速，计算气道阻力，结果表明CC10对抗内毒素所引起的气道阻力增加(图9)。
10.3测量细胞因子和CC10含量在实验开始后，灌注液每60min取样一次，实验最终进行支气管肺泡灌洗，得到灌洗液，用夹心ELISA法(试剂盒购自R&D Systems)检测灌注液和支气管肺泡灌洗液中的细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6以及IFNγ，用MultiskanMk3(Thermo Labsystems)读数、定量，发现CC10降低了体液中炎性细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6的水平，而IFNγ的含量无明显的抑制，结果见图10、11、12。
采用竞争ELISA方法进行CC10的定量，用兔多克隆的抗CC10抗体(购自DAKO)以1∶2500倍稀释，包被ELISA条板，室温过夜，弃去上清，PBS洗板3次后加入溶于PBS的5％蔗糖和1％BSA，封闭3小时，然后弃去封闭液，室温干燥至少3小时。用活化的辣根过氧化物酶标记CC10分子，取110μl不同稀释度的CC10标准液、样本或者对照与110μl CC10-HRP混合，复孔每100ul加到抗体包被板中，PBS洗板3次后加入OPD显色液，然后加入1N H2SO4终止反应，490nm处检测每孔光密度值，根据标准曲线计算样本或对照的CC10含量。
序列表<110>上海富纯中南生物技术有限公司<120>CC10蛋白的制备及应用<130>034168<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>70<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(70)<223>CC10蛋白的氨基酸序列<400>1Glu Ile Cys Pro Ser Phe Gln Arg Val Ile Glu Thr Leu Leu Met Asp1 5 10 15Thr Pro Ser Ser Tyr Glu Ala Ala Met Glu Leu Phe Ser Pro Asp Gln20 25 30Asp Met Arg Glu Ala Gly Ala Gln Leu Lys Lys Leu Val Asp Thr Leu35 40 45Pro Gln Lys Pro Arg Glu Ser Ile Ile Lys Leu Met Glu Lys Ile Ala50 55 60Gln Ser Ser Leu Cys Asn65 70<210>2<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>CC10蛋白的核苷酸序列<400>2gaaatctgcc cgtctttcca gcgtgttatc gaaaccctgc tgatggacac cccgtccagc 60ctttagacgg gcagaaaggt cgcacaatag ctttgggacg actacctgtg gggcaggtcg120tacgaagcag ctatggaact gttctctccg gaccaggaca tgcgtgaagc aggtgctcag180atgcttcgtc gataccttga caagagaggc ctggtcctgt acgcacttcg tccacgagtc240ctgaagaaac tggttgacac cctgccgcag aaaccgcgtg aatccatcat caaactgatg300gacttctttg accaactgtg ggacggcgtc tttggcgcac ttaggtagta gtttgactac360
gagaagatcg ctcagtctag cctgtgcaac taactcttct agcgagtcag atcggacacg420ttgatt 426<210>3<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3atacatatgg ctgctgaaat ctgcccgtct ttccagcgtg ttatcgaaac cctgctg 57<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gttatcgaaa ccctgctgat ggacaccccg tccagctacg aagcagctat ggaactgttc60<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5acgaagcagc tatggaactg ttctctccgg accaggacat gcgtgaagca ggtgctcagc60<210>6<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ggattcacgc ggtttctgcg gcagggtgtc aaccagtttc ttcagctgag cacctgcttc60
<210>7<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7agactgagcg atcttctcca tcagtttgat gatggattca cgcggtttct gc 52<210>8<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8gccggatcct ctagaagctt agttgcacag gctagactga gcgatcttct ccatc 55<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9ctgggtaccg acgacgacga caaggaaatc tgcccgtctt tccag 45<210>10<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10tctctcgaga aaagagaaat ctgcccgtct ttccag 3权利要求
1.一种产生CC10蛋白的方法，该方法包括(a)将编码CC10蛋白的核苷酸序列可操作地连于大肠杆菌或酵母表达载体，得到CC10蛋白重组表达载体；(b)将步骤(a)中的重组表达载体转入宿主菌，筛选获得表达CC10蛋白的工程菌；(c)在适合CC10蛋白表达的条件下发酵培养步骤(b)中的工程菌；(d)从步骤(c)的发酵培养产物中纯化分离出所述CC10蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述步骤(a)之前，根据大肠杆菌偏爱密码子设计CC10基因片段，采用PCR将基因片段拼接成全长CC10基因。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CC10蛋白包括其变体，所述变体有1-5个添加、缺失或置换。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CC10蛋白、其变体选自以下(a)SEQ ID NO1所示的CC10蛋白序列；(b)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met的序列；(c)在SEQ ID NO1的氨基端增加Met-Ala-Ala的序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为大肠杆菌pET表达载体，宿主菌为BL21(DE3)；所述发酵步骤包括用基础培养基，在pH 4.0-8.0、温度28℃-37℃、溶氧控制在30％以上的条件下发酵，培养4-8小时后开始补料，加入甘油或葡萄糖，当菌体OD600为3-20时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，此时控制pH5.0-7.0，诱导2-8小时；所述纯化步骤包括用亲和层析收集融合蛋白，然后用肠激酶酶切去除前导蛋白，再通过离子交换层析、分子筛层析得到纯CC10蛋白。
6.权利要求1所产生的CC10蛋白的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肺部相关疾病、哮喘、肿瘤以及肾脏疾病的药物。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肺部相关疾病包括病毒性或细菌性肺部急性感染、新生儿呼吸窘迫综合症、成人呼吸窘迫综合症、支气管-肺发育不良症、肺纤维化、慢性阻塞性肺炎。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肺部急性感染为SARS。
全文摘要
本发明涉及用基因工程方法在大肠杆菌或甲醇酵母中表达CC10蛋白，经过发酵和分离纯化，得到重组CC10蛋白的生产方法。本发明还涉及将CC10蛋白用于治疗严重急性呼吸道综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)。此外，CC10蛋白还可用于治疗成人呼吸窘迫综合症、婴幼儿呼吸窘迫综合症及慢性支气管－肺发育不良、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺炎、哮喘、多种肿瘤以及肾脏疾病等。
文档编号A61P11/06GK1580261SQ0314207
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月6日 优先权日2003年8月6日
发明者倪健, 张婷婷, 杨武剑, 罗鹏, 刘定燮 申请人:上海富纯中南生物技术有限公司