专利名称：活化的hla半相合异基因混合性造血干细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及到一种干细胞及其制备方法，具体来说，本发明提供了一种活化的HLA半相合异基因混合性造血干细胞及其制备方法，该干细胞得自母体，与其后代中的干细胞微嵌合，具有抗肿瘤作用。将该细胞回输到体内后，能提高免疫力，从而杀死肿瘤和抗击目前正流行的SARS病毒。
背景技术：
研究成果表明，可以利用各种来源的干细胞，来治疗衰老、外伤、遗传性及代谢性疾病，具有良好的临床应用前景。干细胞通过体外克隆培养和定向诱导，可以成为1)合适的细胞移植材料，用于修复受损伤器官；2)干细胞作为转基因载体，用于转基因治疗；3)利用干细胞移植治疗人类顽症如骨髓干细胞或脐带血干细胞移植治疗白血病等。干细胞系的建立必需满足两个条件在细胞周期内复制可得到大量子代细胞，即具有永生化特性；细胞系必需保持原始细胞的世系遗传显型特征。目前研究首先要解决的问题是如何获得可用于临床应用的干细胞系，并能够在体外扩增。
国外已有多种技术路线建立干细胞系1)来自神经管和神经嵴派生的祖先细胞建立细胞系。2)从自然发生肿瘤细胞中分离细胞系，如由Augusti-Tocco和Sato，Schubert等(1969)建立的小鼠神经母细胞瘤(mouse neuroblastomaC1300)，人类大脑皮质瘤也建立了具有神经元特性的细胞系(Ronnett等，1990)。3)利用X-rays或化学诱导剂诱导肿瘤细胞，建立分离神经细胞系，如被广泛应用的PC12细胞系是由X-rays诱导建立(Greene和Tischler，1976)。4)用逆转病毒载体或腺病毒载体携带原癌基因特异转染神经前体细胞(neuralprecusor)建立细胞克隆。5)建立携带含神经肿瘤细胞系杂交，建立永生化神经细胞系(Greene等，1975；Choi等，1991)。7)采用原代中枢神经无血清培养，表皮生长因子(EGF)刺激，获得永生化细胞克隆(Reynolds和Weiss，1992；Ray等，1993)。8)利用胚胎干细胞定向诱导建立神经干细胞系，如Gottlieb(华盛顿大学)用Retinoic酸诱导神经元样细胞。9)目前最新研究动态关注，与调控细胞寿命有关的染色体目短DNA重复序列，即端粒。少数细胞每一次分裂增殖后，由端粒酶重建端粒，保持细胞永生化。上述技术尽管可获得干细胞，但有些技术涉及胚胎干细胞的有关伦理问题，有些细胞系与癌变细胞不易区分，利用病毒载体转染目的基因获得的干细胞有临床使用安全性问题等，人们期望一项技术可获得临床能应用的干细胞系。
在国内，干细胞领域的研究逐渐受到多个学科的重视。国内研究已涉及皮肤、软骨及神经系统损伤的人体组织工程的研究。造血干细胞的移植已经拯救许多患白血病患者的生命。目前国内研究的状况为以上海市转基因研究所和上海市第二医科大学的成国祥博士、盛惠珍教授和曹谊林教授为代表的利用人胚胎干细胞的技术路线，分化人类特定的组织器官，如皮肤、软骨心脏、肝脏等，但该方法存在伦理问题。北京中科院系统以陈大元教授为代表的克隆国宝大熊猫为国家重大课题。昆明中科院系统以灵长类克隆为主要特色。西北农业科技大学农业部开放实验室以畜牧业为主要研究方向。目前全国许多有实力的或地方特色的实验室，都在积极开展该项研究。
已经证明，微移植的干细胞进行可以杀死白血病细胞(参见Champlin.R等，Reinventing bone marrow transplantationreducing toxicity usingnonmyeloablative，preparative regimens and induction of graft-versus-malignancy，Curr Opin Oncol，1999，1187-91)。Artlertt.CM等已经报道，在怀孕多年后母体与其后代的细胞仍是嵌合的(参见Artlertt.CM等，Identification of fetalDNA and cells in skin lesions from women with systemic sclerosis，N Engl JMed，1998，3381186-91)，因此，母体可能可以耐受其后代的细胞并允许注入的细胞存在而产生一种具有抗肿瘤效果的移植。
发明内容
于是，本发明的目的就在于提供一种活化的HLA半相合异基因混合性造血干细胞，该干细胞得自供体，与其受体中的淋巴细胞微嵌合，具有抗肿瘤作用。其中的受体可以是女儿、儿子，供体是父亲、母亲或者供体是女儿、儿子，受体是父亲、母亲。
本发明的另一个目的是提供一种获得上述干细胞的方法，该方法包括采集癌症患者及其家属的外周血，对于血型相同的患者及家属，采集外周血干细胞前对患者及其家属进行合血，将采集到的外周血干细胞倒入特定的培养基中培养；如果患者与其家属血型不合，先将采集到的外周血分别分离成单个核细胞，然后再用与上述相同的培养基共同培养。其中的家属包括儿子和女儿。
将培养的外周血干细胞收集，洗涤，回输给患者，回输后发现病人食欲增加，睡眠改善，体力状况指标提高，个别病理有水肿，进一步治疗后明显好转。这表明将该细胞回输到体内后，能提高免疫力，从而杀死肿瘤，因此，可以预见该干细胞对于抗击目前正流行的SARS(severe acute respiratory syndrome，急性呼吸窘迫综合症)病毒也具有一定的作用。
上述培养方法中所用的培养基命名为X-VIV020(CAMBREX)，含有Iscove改良的Dulbecco基本培养基(IMDM)、100-5000U/ml的IL-2、0.1-10ug/ml的脂肪酸、1.5ug/ml的胆固醇、5-20ug/ml的甘油酯、100-5000U/ml的γ-干扰素、300ug/ml的转铁蛋白。缓冲溶液是碳酸氢纳或HEPES，培养基的pH值为7.0。
图1HLA分型PCR电泳图，阳性产物大小约为500bp。
图2用X-VIV020培养基培养得到的细胞集落。
具体实施例方式
本发明用下面的实施例作进一步的说明，但对本发明的范围不起限制作用。
实施例1培养干细胞的培养基X-VIV020(CAMBREX)在IMDM中加入亚油酸8ug/ml、胆固醇1.5ug/ml、甘油二酯15ug/ml、Tween80 5ug/ml、γ-干扰素1000U/ml、转铁蛋白300ug/ml，2600ug/mlHEPES缓冲液(pH 7.0)、2500ug/ml碳酸氢钠。在使用培养基之前，向培养基中加入1000U/ml的IL-2。
实施例2干细胞的来源干细胞来源于一名癌症患者的外周血，该患者是一名52岁的亚洲妇女，患有严重分化性上皮胸腺癌。她严重地呼吸短促并具有晚期的静脉腔综合症，在计算机上进行CT扫描发现一个大地纵隔肿瘤、一个包心块、越来越多的左上和右中脑脑节肿瘤块、右肝块。她的总Karnofsky得分是30-40，Ca19-9是70U/ml(正常是35)。她的体重下降了60Kg，预期的生命非常短。其女儿正常。
实施例3干细胞的分离与培养用粒性白细胞巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)处理女儿5天后从患者女儿的外周血中取出血样，如果该患者与其女儿的血型相合，则进行合血，用美国Baxter公司CS-3000plus血细胞分离机分离合血后的外周血样中的单个核细胞。外周血干细胞采集后将收集袋中的干细胞倒入到50ml离心管中，用生理盐水洗3次，同时将IL-2加入到培养基X-VIV020(CAMBREX)中，浓度为5×103/ml，共1000ml，将洗涤的干细胞加入到培养基中放入5％CO2培养箱中培养3小时，期间每隔半小时将培养箱瓶摇动一次，防止其贴壁。
如果患者与其女儿的血型不合，则采集外周血细胞洗涤后，分别用Ficoll淋巴细胞分离液1800rpm，18min分离淋巴细胞收集单个核细胞，用生理盐水洗涤2次后，按上述方法共同培养。参见图1的细胞集落图。
实施例4所获得的干细胞的鉴定1.所获得的干细胞的DNA提取取3ml上述干细胞，1500rpm离心5min，弃上清。取20ul蛋白裂解液加入1.5ml离心管中，加入200ul外周血离心沉淀，再加入200ul的AL缓冲液，震荡15s。56℃孵育10min，短暂离心，加入200ul无水乙醇，将样本转入QLAampspin column，12000rpm离心1min，依次加入500ulAW1、AW2缓冲液洗涤2遍，用50ulmili-Q水将滤膜上的DNA溶出，收集到另一离心管中备用。
2.DNA质量检测将上述提取的DNA检测OD260、OD280的吸光度，样品OD260/OD280＞1.8，并计算DNA浓度。
1.PCR检测HLA分型PCR体系PCR mix 7.1ulTaq酶 0.1ulDNA(75-125ng/ul) 1ulPCR条件循环步骤温度(℃)时间(Sec)1 1 96 605 1 96 252 70 503 72 4521 1 96 252 65 503 72 454 1 96 252 55 603 72 120保持1 42.电泳配置2％TBE琼脂糖凝胶，120V电泳15min，观察判定结果，阳性产物500bp(见图1)。
本实验中采用的是“序列特异性引物”扩增技术，简称SSP(sequence spesificprimer)。从患者外周血有核细胞中提取DNA进行HLA 型的鉴定及筛选。它是基于DNA序列的HLA配型试剂盒，应用PCR扩增的方法进行HLA-A2位点低分辨率基因的分型，设计的引物用于扩增WHO国际委员会定义的等位基因。本实验中采用此方法共检测41名患者外周血，其中19名为HLA-A2阳性，阳性率为46.34％。
实施例5培养所得的HLA半相合异基因混合性造血干细胞的治疗肿瘤活性将培养得到的干细胞回输给患者，回输3天后，病人的咳嗽减弱，食量增加，其Karnofsky值增加到70，晚期地静脉腔综合症得到改善。到第25天，Karnofsky值增加到90，CT扫描发现左上和右中脑脑节肿瘤块显著减少，Ca19-9降低到32U/ml。到第210天，她的体重增加了66Kg，重新过上了正常、有活力的生活。治疗1年后，CT扫描表明左上和右中脑脑节肿瘤块完全消失，肝块也消失。
权利要求
1.一种获得活化的半相合HLA异基因混合性造血干细胞的方法，该方法包括采集癌症患者及其家属的外周血，对于血型相同的患者及家属，采集外周血干细胞前对患者及其家属进行HLA合血，将采集到的外周血干细胞在特定的培养基中培养；如果患者与其家属血型不合，先将采集到的外周血分别分离成单个核细胞，然后再用与上述相同的培养基共同培养。
2.权利要求1的方法，其中的癌症包括恶性胸腺瘤、消化道瘤、呼吸道瘤、泌尿系统肿瘤和卵巢癌及乳腺癌。
3.权利要求1的方法，其中的家属包括父亲、母亲、儿子和/或女儿。
4.权利要求1的方法，其中的培养基是X-VIV015(CAMBREX)培养基，含有Iscove改良的Dulbecco基本培养基(IMDM)、100-5000U/ml的IL-2、0.1-10ug/ml的脂肪酸、1.5ug/ml的胆固醇、5-20ug/ml的甘油酯、100-5000U/ml的γ-干扰素、300ug/ml的转铁蛋白，缓冲溶液是碳酸氢纳或HEPES，pH值为7.0。
5.用权利要求1的方法所获得的半相合异基因混合性造血干细胞。
6.权利要求5的干细胞用于制备治疗肿瘤疾病的药物的用途。
7.权利要求5的干细胞用于制备治疗SARS的药物的用途。
全文摘要
本发明提供了一种活化的半相合异基因混合性造血干细胞及其制备方法。采集癌症患者及其家属的外周血，对于血型相同的患者及家属，采集外周血干细胞前对患者及其家属进行合血，将采集到的外周血干细胞倒入特定的培养基中培养；如果患者与其家属血型不合，先将采集到的外周血分别分离成单个核细胞，然后再用与上述相同的培养基共同培养。该干细胞得自供体，与其受体体内的淋巴细胞微嵌合，具有抗肿瘤作用。将该细胞回输到体内后，能提高免疫力，从而杀死肿瘤和抗击目前正流行的SARS病毒。
文档编号A61P11/00GK1566330SQ0314787
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者任秀宝 申请人:任秀宝