专利名称：一种治疗中风病的中药组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物，特别涉及用于治疗中风病的中药组合物，同时涉及该组合物的制备方法和质量控制方法。
缺血性中风的临床治疗，中医目前主要是应用平肝熄风、化痰通络、行气活血、开窍醒神等方药。由于给药途径等方面的限制，在急性期难以发挥治疗优势。即使有一些注射剂如脉络宁、清开灵等，但由于其成分复杂，作用机制尚未明确，临床应用的目的性较差；血栓通(血塞通)注射液等活血化瘀作用较好，但对于导致脑络瘀阻不通的因素影响甚微，临床疗效并未获得显著提高。西医根据近年来脑缺血损伤机理研究结果创制的药物与治疗方案，仍有许多难以解决的问题。例如，目前认为能够阻止局部缺血损伤过程的药物NMDA受体拮抗剂(MK-801)、钙离子通道拮抗剂(尼莫地平)等，能够减少缺血性病变的范围，但是不加区别地阻断EAA介导的神经传递、影响一些正常生理功能，包括修复所必须的神经可塑性，可能为预后康复带来了不利影响。急性期的缺血性脑水肿是中风病一个重要病理过程。由于细胞毒性和血管源性两类因素的混合，前者针对膜离子泵衰竭，治疗应采取逆转能量耗竭即提供氧合血以恢复泵功能，此时，高渗剂效果有限；缺血数小时后血脑屏障崩溃产生的血管源性水肿，按理高渗剂应该奏效，然而CT扫描观察到高渗剂对脑梗塞性肿胀效果并不显著，甘露醇有并发水肿反跳的副作用；试用地塞米松疗效尚难估价，类固醇激素即使大量应用似乎也无裨益，甚至可能对缺血神经元有害；甘油在脑血管病幸存者中有一定效果，但导致糖尿病控制困难。
因此，临床需要一种阻抑缺血级联反应损伤，改善脑缺血的微灌流状态，从而有效保护神经细胞，药效物质和作用机理相对清楚的现代中药复方注射制剂。
按药剂学方法，可以将上述本发明药物组合物制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。
本发明药物还可加入常规的药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。
B方案制成注射液的制备方法为取处方量的栀子，粉碎成粗粉，用7-9倍量的65-80％乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至55-70℃相对密度为1.00-1.20的清膏，加3-5倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏45-50小时，滤过，滤液减压浓缩为55-70℃相对密度为1.00-1.20的清膏，上活性炭柱，先用蒸馏水洗脱，至洗脱液无色，再用9-11倍量65-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品；取栀子半成品用适量注射用水溶解，滤过；另取处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，滤过，将三七药液与栀子药液混匀，调节pH值至5.5-7.5，0-4℃冷藏20-30小时，0.45μm滤膜滤过，滤液加注射用水至全量，用0.22μm滤膜滤过，滤液灌装成10ml安瓿注射液，110-120℃热压灭菌20-40分钟，即得。
本组合物制成注射剂的质量控制方法包括鉴别和/或含量测定和/或指纹图谱。
鉴别方法包括下列方法中的一种和/或两种a.取本品5ml，水浴蒸干，残渣加乙醇溶解并定量转溶于容量瓶5ml，另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2000年版附录VIB)试验；吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-11∶6-9∶1-3∶0.3-0.6醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；b.取本品10ml，加以水饱和的正丁醇振摇提取2-4次，每次10ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水液洗涤2-4次，每次100ml；取正丁醇层减压回收至干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每ml各含6mg的混合液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录IIB)试验，吸取上述两种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，在环境温度15-25℃以下，以11-15∶6-9∶1-3氯仿-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1→10硫酸乙醇液，于105-115℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；含量测定方法包括下列方法中的一种和/或两种a.栀子苷，照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；13-17∶80-90乙腈-水为流动相；检测波长为238nm理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于1500；对照品溶液的制备，精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇适量使溶解，制成每1ml含0.14-0.15mg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取本品1ml，水浴蒸干，残渣加无水乙醇溶解，乙醇液转移至另一坩埚，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得；本品含栀子苷(C17H24O10)每ml不得少于4.6-4.9mg；b.三七皂苷，照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水二元梯度为流动相(见表1)；检测波长为203nm；理论塔板数以人参皂苷Rg1峰计算应不低于2500；对照品溶液制备，精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1适量加甲醇溶解，制成每1ml含三七皂苷R11.5mg、人参皂苷Rg12.8mg、人参皂苷Rb14.1mg的混合对照品溶液；供试品溶液制备，精密吸取样品5ml，用水饱和正丁醇振摇提取三次，每次10ml；正丁醇层合并，用10ml正丁醇饱和水洗涤一次，弃水层，正丁醇层减压回收，至干，残渣用甲醇溶解至5ml，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，即得；测定法，精密吸取对照品溶液3μl，7μl、供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，用外标两点法计算，即得；本品每ml含三七皂苷R1不得少于0.18-1.25mg；人参皂苷Rg1不得少于0.75-0.85mg；人参皂苷Rb1不得少于1.8-2.5mg；表1乙腈-水二元梯度洗脱表时间(min) 流速(ml/min) A(水) B(乙腈)0 1.0 8020201.0 6040本发明注射液质量控制方法还可采用指纹图谱的方法，该方法包括以下方法中的一种和或两种
a.供试品溶液的制备精密吸取注射液5ml，用水饱和的正丁醇振摇提取两次，第一次10ml；第二次5ml，合并正丁醇提取液；用正丁醇饱和的水10ml反洗一次，弃去水层，正丁醇提取液减压回收至干，残渣用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，摇匀，0.45um滤膜滤过，即得；对照品溶液的制备取栀子苷对照品，用甲醇制成0.5mg/ml的溶液作为对照品溶液；测定方法检测波长238nm，乙腈-水梯度洗脱，见表2；理论塔板数计算，应不低30000；设定供试品溶液进样量为101，记录60分钟的色谱图，即得；以栀子苷的色谱峰(S峰)的保留时间和峰的面积为1计算相对保留时间和峰面积比值；指纹图谱及技术参数；记录时间为60分钟；共有指纹峰的标定(相对保留时间)根据10批次供试品的检测结果标定共有指纹峰如下1(0.404)2(0.462)3(0.510)4(0.589)5(0.618)6(0.666)7(0.722)8(0.798)S(1.000)9(1.085)10(1.110)11(1.197)12(1.238)13(1.277)；共有指纹峰面积的比值1∶S＝1∶(0.060-0.113)；部分峰形描述分离不好时，峰4呈峰5的肩峰；非共有峰面积供试品图谱与对照指纹图谱比较；非共有峰总面积不得大于峰面积的5％；仪器试剂 高效液相色谱仪Waters2695泵；Waters 2996紫外检测器；Millcnnium32色谱工作站；Diamonsil C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；乙腈为色谱纯(美国J.T.Baker)；娃哈哈纯净水；甲醇为色谱纯(北京昌化精细化工厂)；表2流动相梯度洗脱表时间(min)流速(ml/min)水％ 乙腈％00.8 95580.8 92821 0.8 881235 0.8 881240 0.8 703045 0.8 406050 0.8 0 10060 0.8 0 100
b.供试品溶液的制备精密吸取注射液10ml，用水饱和的正丁醇20ml分二次振摇提取，合并正丁醇提取液；用正丁醇饱和的水300ml分三次反洗，弃去水层，正丁醇层减压回收至干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml量瓶中，摇匀，0.45um滤膜滤过，即得；照物的制备取人参皂苷Rg1对照品(购自中国药品生物制品检定所)，用甲醇制成2mg/ml的溶液作为对照品溶液；测定方法检测波长210nm，灵敏度0.1AUFS乙腈-水梯度洗脱，(见表3)；理论塔板数按人参皂苷Rg1计算，应不低30000；精密吸取供试品溶液25μl，注入高效液相色谱仪，记录70分钟的色谱图，即得；以人参皂苷Rg1的色谱峰(S峰)的保留时间和峰的面积为1计算相对保留时间和峰面积比值；指纹图谱及技术参数；记录时间为70分钟；共有指纹峰的标定(相对保留时间)根据10批次供试品的检测结果标定共有指纹峰如下1(0.877)S(1.000)2(1.027)3(1.555)4(1.592)5(1.652)6(1.675)7(1.708)8(1.744)9(1.799)10(2.005)11(2.042)12(2.074)13(2.111)14(2.150)15(2.212)16(2.235)17(2.364)18(2.391)19(2.420)20(2.440)21(2.771)；共有指纹峰面积的比值S∶3∶8∶21＝1∶(0.222-0.412)∶(0.405-0.735)∶(1.428-2.380)；非共有峰面积供试品图谱与对照指纹图谱比较；非共有峰总面积不得大于总面积的5％；仪器试剂Waters 2695 Waters 2996紫外检测器Millcnnium32色谱工作站SymmetryshildTMRP18(5μm，4.6mm×250mm)；Fisher乙腈(美国色谱纯)Fisher甲醇(美国色谱纯)娃哈哈纯净水其它为分析纯表3 流动相梯度洗脱表时间(min) 流速(ml/min) A-水 B-乙腈0 1.0 83 1720 1.0 76 2440 1.0 60 4050 1.0 50 5055 1.0 0 10060 1.0 0 10070 1.0 0 100
本发明组合物制剂(通络救脑注射液)临床主治急性缺血性脑中风的注射剂，具有凉血解毒、化瘀通络之功效，通过阻抑脑中风的缺血级联反应，改善脑微灌流，达到抗神经元损害的治疗目的；与通络救脑注射液解毒功效有关的药效学试验研究，采用三氯化铁致大鼠大脑中动脉血栓形成的脑缺血损伤模型，研究了通络救脑注射液对此模型的大鼠神经症状、脑含水量、梗塞脑组织形态学、脑组织SOD和MDA含量、脑梗塞灶Glu和NMDA表达、延迟整流钾电流(IN)的作用机理；实验结果显示通络救脑注射液能明显降低MCAT大鼠脑组织MDA的含量，升高SOD含量，降低梗塞脑组织Glu和NMDA的表达，增大延迟整流钾电流(IN)，降低大鼠手术侧脑含水量，改善神经症状；与通络救脑注射液通络功效有关的药效学试验研究，采用三氯化铁致大鼠大脑中动脉血栓形成的脑缺血损伤模型，研究了通络救脑注射液对此模型大鼠脑血流、麻醉犬脑血流、血瘀大鼠血液流变学、鸡胚尿囊膜血管生成的作用；结果显示通络救脑注射液能促进新血管的生成、明显降低血瘀症大鼠全血粘度和血浆粘度，使红细胞变形性增强，聚集性下降，改善麻醉犬、MCAT大鼠脑血流，从而实现其通络功能；通络救脑注射液的药效作用与血栓通比较，在对MCAT大鼠脑组织含水量的测定实验中，通络救脑注射液小剂量组(与模型组比较P＜0.01)明显由于血栓通组(与模型组比较无统计学意义)；通络救脑注射液中剂量组SOD明显升高，与血栓通组比较P＜0.05)；通络救脑注射液小剂量组红细胞变性显著增加(与模型组比较P＜0.05，P＜0.01)，血栓通对红细胞变形无明显作用；通络救脑注射液大剂量组血管增生显著(与模型组比较P＜0.05，P＜0.01)，而血栓通作用较弱；血栓通能增大延迟整流钾电流(IN)，而通络救脑注射液作用不明显，目前研究证实，延迟整流钾电流(IN)的增强可促进缺血导致的神经细胞凋亡；其它药效实验中通络救脑注射液的作用均优于血栓通；通络救脑注射液明显具有促进麻醉犬脑血流的作用；总之，通络救脑注射液与血栓通比较，有降低用药剂量，从而达到减毒增效的目的；实验结果摘要如下1.通络救脑注射液对MCAT大鼠神经症状的影响实验采用了三氯化铁致大脑中动脉血栓形成的大鼠脑缺血模型，造模后MCAT大鼠神经症状评定的结果显示通络救脑注射液83.2、41.6、20.8mg/kg组(分别相当临床人用量的20、10、5倍)的大鼠在术后12h，24h，48h其神经症状均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)；2.通络救脑注射液对MCAT大鼠脑组织含水量的影响造模后48h，通络救脑注射液83.2、41.6、20.8mg/kg组的大鼠手术侧脑含水量明显低于模型组，与模型组相比较差异具有显著性(P＜0.01，p＜0.05)；3.通络救脑注射液对MCAT大鼠脑组织形态学的影响脑组织病理形态学HE、Nissl染色显示，模型组大鼠脑皮质缺血灶细胞数量明显减少，胞体萎缩，变性，着色浅；通络救脑注射液三个剂量组大鼠脑缺血灶细胞数量较模型组明显增多，细胞萎缩变性较模型组明显减轻；图像分析表明通络救脑注射液组阳性细胞面密度与模型组比较具有统计学意义(P＜0.01)，提示通络救脑注射液具有减轻脑缺血所至的神经细胞损害的作用；4.通络救脑注射液对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响通络救脑注射液83.2、41.6mg/kg组可明显降低MCAT大鼠脑组织MDA的含量，升高SOD含量(P＜0.01)；提示通络救脑注射液具有抗自由基损伤，保护脑组织的作用；5.通络救脑注射液对MCAT大鼠梗塞脑组织Glu和NMDA表达的影响采用三氯化铁致大脑中动脉血栓形成的大鼠脑缺血模型和免疫组织化学方法，结果显示通络救脑注射液能明显降低Glu、NMDA在梗塞灶的表达；6.通络救脑注射液对延迟整流钾电流的影响应用膜片钳电生理技术，检测了通络救脑注射液对心肌细胞延迟整流钾电流的影响，结果表明，通络救脑注射液对延迟整流钾电流(IN)的影响不明显；7.通络救脑注射液对MCAT大鼠脑血流量的影响MCAT大鼠脑组织血流量明显减少，通络救脑注射液83.2、41.6mg/kg组造模48h的脑组织血流量均明显高于模型组(P＜0.01)，说明本药对缺血后脑组织血流有明显改善作用；通络救脑注射液对急性应激造成的大鼠血瘀症有明显的改善作用，小剂量的作用最为明显；8.通络救脑注射液对麻醉犬脑血流量的影响实验在33只健康杂种犬进行，试验表明通络救脑注射液可以显著提高麻醉犬脑血流量(P＜0.05或P＜0.01)；其作用于注射药物后10分钟开始起效，药效维持到给药后50分钟；通络救脑注射液83.2、41.6mg/kg组与阳性药血栓通比较没有显著性差异；通络救脑注射液低剂量组与阳性药血栓通比较，在注射药物后45分钟和50分钟有显著性差异(P＜0.05)；9.通络救脑注射液对急性血瘀大鼠血液流变学的影响通络救脑注射液中剂量(41.6mg/kg)与小剂量(20.8mg/kg)可明显降低血瘀症大鼠全血粘度(与模型组比较P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001)，血浆粘度呈下降趋势(但未见统计学差异)，小剂量组明显降低红细胞压积(与模型组比较P＜0.0001)；小剂量组可使红细胞变形性增强，聚集性下降(P＜0.01，P＜0.001)；10.通络救脑注射液对鸡胚尿囊膜血管生成的影响通络救脑注射液83.2、41.6、20.8mg/kg组均具有促进鸡胚尿囊膜血管生成的作用；以下对上述部分实验进行详述实验例一 通络救脑注射液对MCAT大鼠神经症状的影响实验材料1.药品与试剂受试药通络救脑注射液由内蒙古康源药业有限公司提供，颜色外观呈淡黄色，含量10.39mg/ml，具有凉血解毒，化瘀通络之功能，主治急性缺血性脑中风；批号2001042322；临床拟用量4.16mg/kg，静脉注射；阳性对照药血栓通注射液由内蒙古康源药业有限公司提供，颜色白色，含量50mg/ml，具有活血祛瘀之功能，主治急性缺血性脑中风；批号内卫药准字(1996)第001945号；临床拟用量10mg/kg，静脉注射1～2次/日，1次5ml；试剂与药品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工厂产品，用1mol/L盐酸配制；2.动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号；3.仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；SHZ-22型恒温水浴振荡器，江苏太仓医疗器械厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品；方法与结果1.分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、通络救脑注射液83.2mg/kg组、通络救脑注射液41.6mg/kg组、通络救脑注射液20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/Kg组(相当人用量的5倍)，每组10只；造模后尾静脉给药，一日剂量分两次给予，共给药五次；2.造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉；按Tamura[4]等的方法，稍加改进；大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)；置一小片中空塑料薄膜保护血管周围组织；将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上(6)，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养；假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组；3.MCAT大鼠神经症状的评定在术后不同时间(12h，24h，48h)，按Bederson等(7)的方法并加以改进，对动物进行行为评分；1.提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况；如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘的屈曲又有内旋者，记为1、2、3和4分；2.将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力；如双侧阻力对等且有力者记为0分；如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重3度，分别记为1、2、3分；3.将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力；双侧肌张力对等且有力者为0分；同样根据手术对侧前肢肌张力下降程度不同记为1、2、3分；4.提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分；根据以上标准评分，满分为11分，分数越高，动物的行为障碍越严重；对行为检测打分值进行组间比较，t检验；结果见表1；表1通络救脑注射液对MCAT大鼠神经症状的影响(X±SD)精神症状评分组别 剂量mg/kg N12h 24h48h假手术组 - 10 0 0 0MCAT模型组- 10 5.5±0.55 4.67±0.52 4±0.63通络救脑组83.2 10 4.33±0.82**3.83±0.41** 3.17±0.75*41.6 10 4.4±0.55** 3.83±0.75** 3.33±0.82*20.8 10 4.67±0.55 4±0.63* 3.33±1.03血栓通组 5010 3.67±0.52**4±0.63* 3.33±0.52*注各组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；结果显示，除假手术组未见行为异常改变，MCAT模型组大鼠在术后12h，24h，48h均出现偏瘫样症状，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降；通络救脑注射液20.8mg/kg组在术后48h神经症状改善不明显外，通络救脑注射液各剂量组与血栓通组的大鼠在术后12h，24h，48h其神经症状均有不同程度的改善(P＜0.01，P＜0.05)；实验例二 通络救脑注射液对MCAT大鼠脑组织含水量的影响实验材料1.药品与试剂受试药、阳性对照药同试验20.1；2.动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，71只，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号；3.仪器XTT解剖显微镜，北京电光科学仪器厂产品；AEG-220型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品；Df-206型鼓风干燥箱，北京西城医疗器械厂产品；方法与结果分组、给药及手术同试验20.1；术后48小时断头取脑，切取大脑中间部分(前后各去除3毫米)，左右分开，用滤纸吸干表面水分，分别称量左右脑片湿重；再置于烘箱中，105℃烘烤48小时至恒重，精确称量干重，计算含水量[8]，与同组对照侧比较，和组间比较，进行t检验；结果见表2； 表2通络救脑注射液对MCAT大鼠脑组织含水量的影响(X±SD)剂量 含水量(％)组别 N(mg/kg) 左脑含水量 右脑含水量假手术组 - 1077.30±0.79 77.09±0.57△△MCAT模型组- 1077.04±0.48** 78.90±0.96通络救脑组83.2 1076.55±1.33** 78.09±1.0341.6 1076.77±0.78** 77.96±0.9120.8 1077.51±2.16** 75.11±2.03△△血栓通组 50 1077.04±0.48** 78.90±0.96注与模型组相比△△P＜0.01；与同组对侧脑组织含水量相比**P＜0.01；结果显示，术后48h，假手术组未见左右两侧大脑含水量异常改变，模型组大鼠手术侧脑组织含水量明显增加，通络救脑注射液各剂量组、血栓通组的大鼠手术侧脑含水量明显少于模型组，与模型组相比具有显著差异(P＜0.01)，但各给药组手术侧脑组织含水量与左脑相比却明显增加(P＜0.01)；实验例3 通络救脑注射液对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响实验材料1、药品与试剂受试药血栓通注射液、通络救脑注射液同实验20.1；MDA、SOD试剂合购自南京建成生物工程研究所；批号20011031；
2、动物Wistar大鼠，雄性，体重190～210g，60只，为中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号；3、仪器721型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品；方法与结果分组、给药、造模方法同实验20.1；造模、给药24小时断头取脑，去小脑、嗅球及脑干，加9倍生理盐水制备成10％脑匀浆，备用；1、SOD的测定按SOD试剂合说明测定SOD活力，结果见表3；2、MDA的测定按MDA试剂合说明测定MDA含量，结果见表3；表3通络救脑注射液对MCAT大鼠脑组织SOD及MDA的影响(X±SD)组别 剂量mg/kg N MDAmmol/g脑组织 SODnu/mg脑组织假手术组 - 10 0.54±0.11**144±20.20**模型组 - 10 0.87±0.21 92.17±21.5483.2 10 0.56±0.1** 127.67±20.55**通络救脑组 41.6 10 0.59±0.12**138.33±27.27**20.8 10 0.79±0.21 98.5±29.04血栓通组 5010 0.57±0.07**114.5±21.86**注各组与模型组相比，**P＜0.01；结果显示，大鼠经凝闭大脑中动脉后，其超氧化歧化酶(SOD)、MDA均有明显变化，模型组大鼠MDA含量明显高于假手术组，SOD明显低于假手术组，通络救脑注射液可明显降低MDA含量，升高SOD活力(P＜0.01)；提示本药具有抗自由基损伤保护脑组织的作用；实验例四 通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu和NMD表达的影响实验材料1、药品与试剂受试药通络救脑注射液由内蒙古康源药业有限公司提供，主治急性缺血性脑中风；阳性对照药血栓通注射液由内蒙古康源药业有限公司提供，主治急性缺血性脑中风，静脉注射，2次/日，1次5ml；批号2000091112；试剂与药品FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工厂产品，用1mol/L盐酸配制；免疫组织化学试剂兔抗Glu、NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物(1∶200，Histostatn-sp试剂盒，ZYMED公司)；2、动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，由中国医学科学院动物中心繁育场提供，合格证号医动字第01-3008号；3、仪器POLYVAR万能显微镜，美国产品；C8真彩病理图像分析仪，北京航空航天大学产品；试验方法1.分组及给药将60只大鼠随机分为六组，即假手术组、MCAT模型组、通络救脑注射液83.2mg/kg组、通络救脑注射液41.6mg/kg组、通络救脑注射液20.8mg/kg组(分别相当于临床人用量的20、10、5倍)、血栓通50mg/kg组(相当人用量的5倍)，每组10只；造模后尾静脉给药，一日剂量分两次给予，共给药五次；2.造模方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉；按Tamura[3]等的方法，稍加改进；大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)；置一小片中空塑料薄膜保护血管周围组织；将吸有50％氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上(4)，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养；假手术组，除不滴加氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组；3.动物处理末次给药后一小时(即术后48小时)，断头取脑，分别以10％中性甲醛固定，石蜡包埋，切片(取视交叉前后脑片)，作免疫组织化学染色，显微观测组织形态变化，并做图像分析；4.免疫组化染色方法采用ABC法，步骤如下①.切片入1％甲醇H2O2掖，室温30min②.蛋白酶K消化，37℃30min③.正常羊血清，室温30min④.兔抗Glu，NMDA(1∶200，Santa cruz公司)，4℃过夜⑤.生物素化羊抗兔IgG和ABC复合物(1∶200，Histostatn-sp试剂盒，ZYMED公司)，37℃2h⑥.0.05％DAB-0.1％H2O2液显色；在①、②、③、⑤、⑥步骤之前都用0.01MPBS洗3次，每次洗5min；阴性对照，省去一抗或用正常羊血清代替一抗；5.图像分析及统计学处理对Glu、NMDA免疫组化结果，用CMIAS8真彩病理图像分析系统(中国航空航天大学图像分析中心)进行分析，统计每个场的面密度；组间资料统计用t检验；实验结果1.通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶Glu表达的影响正常大鼠脑皮质Glu表达在细胞的胞质内，核区呈阴性，细胞形态多呈锥体形，且带有突起，细胞层次清楚；模型组大鼠脑皮质梗塞灶内Glu细胞数量比正常大鼠明显增多，Glu表达也明显增强，细胞形态呈萎缩变性的锥体形；阳性药组、大剂量组、中剂量组大鼠脑内Glu表达比模型组明显减弱，其中中剂量组Glu表达最弱，且细胞数量最少；小剂量组Glu的表达同模型组；图像分析统计结果见表4；
表4通络救脑注射液对MCAT大鼠大脑皮层梗塞灶Glu表达的影响(X±SD)剂量组别 N阳性细胞面密度(mg/kg)假手术组 - 90.09±0.02**MCAT模型组 - 90.13±0.02通络救脑注射液组 83.2 90.09±0.02**41.6 90.07±0.02**20.8 90.06±0.02**血栓通组 5090.10±0.10**注与模型组相比**P＜0.012.通络救脑注射液对脑缺血大鼠脑皮质梗塞灶NMDA表达的影响正常大鼠脑皮质NMDA表达在细胞的胞质内，核区呈阴性，细胞形态多呈锥体形和圆形，细胞层次清楚；模型大鼠脑皮质梗塞灶内NMDA的表达明显比正常大鼠强，细胞形态呈肿胀和萎缩变形形态；阳性药组和大剂量组、中剂量组、小剂量组大鼠NMDA表达比模型组减弱，其中大剂量组、中剂量组NMDA的表达最弱，大剂量组NMDA细胞呈锥体形，且萎缩变性；中剂量组NMDA阳性细胞多呈小圆形；统计结果见表5；表5 通络救脑注射液对MCAT大鼠大脑皮层NMDA表达的影响(X±SD)组别 剂量(mg/kg)N 阳性细胞面密度假手术组 - 9 0.08±0.02*MCAT模型 - 9 0.11±0.02通络救脑注射液组 83.2 9 0.09±0.02**41.6 9 0.07±0.02**20.8 9 0.05±0.01**血栓通组 50 9 0.07±0.01*注与模型组相比*P＜0.05，料P＜0.01结论通络救脑注射液通过降低Glu、NMDA在梗塞灶的表达，逆转细胞的肿胀、变性，从而达到治疗目的；实验例五 通络救脑注射液对麻醉犬脑血流量的影响实验材料
1.动物健康杂种犬33只，雌雄兼用，体重12～15kg，由北京市海淀区通利实验动物养殖场提供，动物合格证编号第024-069号；2.药物通络救脑注射液内蒙古康源药业有限公司(内蒙古甘旗卡药厂)出品；批号2001042322；规格20ml/只；263mg人参皂甙/20ml；空白对照药生理盐水；血栓通注射液(阳性药)内蒙古康源药业有限公司(内蒙古甘旗卡药厂)出品；批号2000091112；规格250mg/5ml药物原液置于4℃冷藏保存；3.药物配制在每次实验开始时，根据动物体重进行药物配制血栓通注射液0.5ml原液/kg；(25mg/kg)通络救脑注射液低剂量组0.394ml原液/kg(5.18mg人参皂甙/kg)；通络救脑注射液中剂量组0.788ml原液/kg(10.4mg人参皂甙/kg)；通络救脑注射液高剂量组1.577ml原液/kg(20.7mg人参皂甙/kg)；吸取相应毫升数的原液，与适量的生理盐水混合成总体积为100ml的静脉滴注用液，水浴加热至37℃后进行静脉滴注；4.实验仪器和器械TA-4000多道生理记录仪(美国GouldInc公司产品)，MF-27电磁流量计(日本光电公司产品)，动物手术器械一套；5.实验步骤实验动物手术动物称重后腹腔注射5％戊巴比妥钠30mg/kg，麻醉后背位固定，分离左侧股静脉备用；颈部切口，分离右颈总动脉，插管(肝素溶液管内抗凝)直接记录颈动脉血压；分离左颈总动脉，分离结扎颈外动脉，将颈总动脉嵌入电磁流量计探头(φ＝2mm)，垂直于颈总动脉固定，备测颈内动脉血流量用；为防止探头干燥，滴加生理盐水保持湿润；安放心电图电极，记录标准肢体II导联心电图；将呼吸探头置于鼻孔处记录呼吸频率和呼吸深度；6.实验动物给药手术后稳定30分钟，记录各项指标，作为给药前对照；实验开始时，按照前述方法进行药液的配制；犬经左侧股静脉匀速滴注相应的研究药物，记录滴注开始时间，控制药物在20分钟内匀速滴完；7.观察指标滴注开始时立即进行测定(0分钟)，每隔5分钟记录一次，每次记录15～30秒，记录时走纸速度为10mm/s，记录间期走纸速度为50mm/h，多道生理记录仪监视器同步进行监测；观察记录药物作用至滴注开始后60分钟结束；同步记录以下生理指标1)颈内动脉血流量2)动脉血压实验结果TA-4000多道生理记录仪将实验数据记录在专用的记录纸上，通过人工计数，将记录的图形转换为数字，以表格的形式附在每次实验记录后面；实验结果使用SAS统计软件，就各组间的各项指标进行t检验以确定是否有显著性差异；1.通络救脑注射液对麻醉犬脑血流量的影响参见表6；表6通络救脑注射液对麻醉犬脑血流量的影响(ml/min)给药后时 通络救脑 通络救脑 通络救脑血栓通(n＝6) 生理盐水(n＝7)间(分)高剂量(n＝7) 中剂量(n＝7) 低剂量(n＝6)0 110.7±2.2109.1±2.6106.6±6.1110.8±3.4 111.9±2.05 117.5±6.6116.7±5.0112.0±7.3116.7±5.2 111.8±2.910 124.2±8.8**121.7±7.3**119.4±9.4*120.8±8.6*110.3±5.915 126.7±10.8**128.3±16.7**122.7±11.3**122.2±7.1**110.3±4.520 128.3±13.7**131.4±16.0**125.4±12.7**123.8±8.6**111.3±6.625 130.8±16.6**130.7±12.1**127.6±11.7**124.0±7.9**110.9±6.630 115.3±53.5 131.4±8.9**126.9±10.9**125.5±7.4**110.6±5.635 132.2±14.5**130.4±8.1**122.9±15.5 123.8±6.0**111.3±8.340 129.2±10.2**126.9±6.9**126.1±8.5**120.2±2.6 113.3±8.745 130.0±8.4**126.1±8.7**126.7±6.9**115.8±4.9△113.0±7.950 130.2±7.8**126.1±12.8**125.6±6.8**115.3±11.9△110.9±7.955 122.5±13.6 119.3±13.7 122.3±10.2 112.8±7.5**110.3±6.160 119.2±17.4 118.4±14.6 106.4±39.7 108.7±11.9 110.9±7.2
*与对照组比较P＜0.05；**与对照组比较P＜0.01；△与血栓通比较P＜0.05；实验表明通络救脑注射液可以显著提高麻醉犬脑血流量(P＜0.05或P＜0.01)；其作用于注射药物后10分钟开始起效，药效维持到给药后50分钟；通络救脑注射液高剂量组和中剂量组与阳性药血栓通比较没有显著性差异；通络救脑注射液低剂量组与阳性药血栓通比较，在注射药物后45分钟和50分钟有显著性差异(P＜0.05)；2.通络救脑注射液对麻醉犬血压的影响通络救脑注射液对麻醉犬收缩压的影响参见表7；表7通络救脑注射液对麻醉犬收缩压的影响(mmHg)给药后时间通络救脑 通络救脑 通络救脑 生理盐水血栓通(n＝6)(分) 高剂量(n＝7) 中剂量(n＝7) 低剂量(n＝6) (n＝7)0 148.3±12.5 149.6±12.5 140.6±16.8 146.8±19.6 137.2±17.05 146.3±13.6 152.1±11.8 138.0±11.7 147.9±18.9 138.0±18.410 149.8±16.7 153.0±13.3 139.0±11.7 149.3±18.1 137.4±17.315 148.7±15.2 154.7±13.5 140.0±10.8 149.3±18.8 136.9±16.620 147.7±16.5 152.7±12.6 140.6±10.7 149.3±19.5 137.1±15.925 148.2±16.0 151.0±13.1 139.1±10.9 149.5±18.3 136.7±18.330 144.3±11.2 151.9±12.4 139.1±10.4 148.8±18.6 137.9±.16.635 144.3±11.5 150.4±13.1 139.9±9.5150.3±19.3 138.1±17.640 147.2±12.6 147.6±12.6 140.0±13.7 148.2±19.1 138.4±16.645 146.7±13.8 147.4±13.0 141.7±10.7 144.6±22.3 138.7±16.350 144.0±10.4 146.7±14.7 141.4±12.2 147.3±19.9 138.8±17.055 146.7±16.9 145.4±16.3 140.6±12.9 143.5±17.2 137.8±17.060 148.2±12.1 146.8±14.9 141.1±13.2 145.4±18.6 138.2±17.1实验表明通络救脑注射液对麻醉犬收缩压的影响没有显著性差异(P＞0.05)
通络救脑注射液对麻醉犬舒张压的影响参见表8；表8通络救脑注射液对麻醉犬舒张压的影响(mmHg)给药后时间 通络救脑 通络救脑 通络救脑 生理盐水血栓通(n＝6)(分) 高剂量(n＝7) 中剂量(n＝7) 低剂量(n＝6) (n＝7)0116.3±10.2 121.3±10.5 112.9±14.2119.7±13.2 109.6±13.15115.0±8.6119.7±11.6 111.2±10.4120.0±12.9 110.8±14.710 119.5±14.4 120.0±10.9 112.1±10.6121.3±13.5 110.3±13.515 116.0±7.9119.4±13.9 112.4±10.0120.5±12.7 110.3±13.520 116.8±10.6 118.1±12.3 112.8±10.6119.7±13.1 109.9±13.125 117.7±9.8117.0±12.8 112.0±10.7120.8±12.4 110.7±14.130 116.0±8.0117.6±13.0 112.1±10.6119.7±13.0 110.3±14.035 115.7±8.0118.4±12.6 113.0±9.4 122.8±11.9 110.4±14.740 116.7±8.4115.6±12.8 112.1±12.1121.8±12.8 110.9±13.245 117.2±9.2117.0±12.2 113.7±10.5117.8±16.7 111.1±12.250 114.8±8.5116.0±14.9 113.0±12.1118.7±17.0 111.1±13.555 118.7±13.3 115.5±16.0 112.6±13.5117.7±15.5 110.7±13.760 117.3±10.1 117.0±13.9 112.9±13.4116.3±15.8 110.7±13.7实验表明通络救脑注射液高、中、低剂量组对麻醉犬舒张压的影响没有显著性差异(P＞0.05)实验例六通络救脑注射液对鸡胚尿囊膜血管生成的影响实验材料与方法1.药物针剂中药血栓通、通络救脑由牛欣教授提供，浓度为50mg三七总皂甙/ml溶液；将此药液分为大(50mg三七总皂甙/ml)、中(25mg三七总皂甙/ml)、小(12.5mg三七总皂甙/ml)三个浓度；2.孵育新鲜白皮种蛋购自昌平种禽公司，挑选无破损裂纹、大小近似有气室的种蛋，用75％的乙醇将其表面擦拭消毒后，大头朝上，倾斜放入已消毒的37.8℃孵育箱中，孵育箱中放置水盘以保持箱内一定的湿度；为防止胚胎粘连，促进羊膜运动，每天转蛋4-5次[3]；3.开窗参照付生法等方法[4]并加以改进；种蛋孵育至第5天时取出，在照蛋器上检查血管发育情况；挑选血管清晰、发育良好的种蛋，在胚头的右下方两条大血管之间画定一1cm×1cm的窗口位置，并在气室处也画一标记；移入超净台内，将画好位置处种蛋外壳用75％的乙醇擦拭消毒后，先用牙科钻在种蛋气室处钻一小孔以用于减压，再用牙科钻小心磨切画定窗口位置的外壳，用眼科镊轻轻揭除开窗处卵壳，露出白色壳膜，滴少许生理盐水后再小心揭除卵壳膜暴露尿囊膜；4.加药根据张树成等研究结果[5]，我们采用明胶海绵作为加药载体；将无菌明胶海绵(购自中日友好医院)剪成5mm×2mm×2mm的小块，加入35μl用0.22μm无菌滤器滤过的药液后，置于窗口中央位置的尿囊膜上，用无菌透明胶带封住窗口及气室处的小孔后，放回孵育箱中继续孵育48小时；并设置对照组(无菌生理盐水，35μl/一个鸡胚)、血栓通阳性组，通络救脑注射液83.2mg/kg、41.6mg/kg、20.8mg/kg组；每组均做20个鸡胚；5.取膜揭开鸡胚小窗上的透明胶带，在种蛋下部钻一小孔，待流出1ml左右的蛋清后，向窗内滴加固定液(甲醇∶丙酮＝1∶1)，在室温下固定15-20min；之后，将蛋壳向两侧掰开，内容物全部倒入一培养皿中，用眼科剪及眼科镊小心地将尿囊膜取下，放入盛有清水的平皿内展开，并敷贴在滤纸上，阴干保存；6.计数在解剖镜下观察尿囊膜上血管的生长情况并计数；计数范围以给药为中心在直径1.5cm的范围内，根据血管的直径分为大、中、小血管并进行计数；7.计学处理我们将计数结果同生理盐水组用t检验进行统计学处理；实验结果数据统计结果如表9所示表9通络救脑注射液对鸡胚尿囊膜血管形成的影响剂量尿囊膜血管数/胚(x±s)组别mg/kg大血管中血管 小血管对照组2.33±1.5311.00±1.0043.67±6.35通络救脑组 83.2 2.00±0.828.86±2.27 35.43±6.6041.6 1.71±0.767.86±2.12*36.14±2.34**20.8 2.29±1.119.43±2.30 36.71±3.86*血栓通组 50 2.01±0.556.80±3.11*30.60±6.77**注n＝20， 与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01结果表明通络救脑注射液各剂量组，特别是大剂量组与血栓通比较，具有促进血管新生的作用；下述实施例均能实现上述实验例的效果。实施例1注射剂栀子 175g三七总皂苷5.5g取处方量的栀子，粉碎成粗粉，照流浸膏剂项下的渗漉法(《中国药典》2000年版一部附录IO)，用8倍量的70％乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，滤液减压浓缩为相对密度为1.10(60℃测定)的清膏，上活性炭柱，先用蒸馏水洗脱，至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品；取栀子半成品用适量注射用水溶解，滤过；另取处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，滤过，将三七药液与栀子药液混匀，调节pH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小时，0.45μm滤膜滤过，滤液加注射用水至全量，用0.22μm滤膜滤过，滤液灌装成10ml安瓿注射液，110℃热压灭菌30分钟，即得。功能与主治凉血解毒、化瘀通络。主治缺血性中风病。用于中风病半身不遂，偏身麻木，眩晕头痛，舌强言蹇或不语，口舌歪斜，神志昏蒙；甚者突然仆倒，神志昏愦，鼻鼾谈名痰鸣，舌质暗红，脉弦滑等风火上扰、瘀阻脉络之证。
用法与用量一日一次，一次154mg，一个疗程两周。
规格10ml/支，154mg(以栀子苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷R1含量之和计)。实施例2注射剂栀子190g三七总皂苷7g取处方量的栀子，粉碎成粗粉，用7倍量的75％乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至65℃相对密度为1.10的清膏，加5倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏49小时，滤过，滤液减压浓缩为60℃相对密度为1.10的清膏，上活性炭柱，先用蒸馏水洗脱，至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品；取栀子半成品用适量注射用水溶解，滤过；另取处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，滤过，将三七药液与栀子药液混匀，调节pH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小时，0.45μm滤膜滤过，滤液加注射用水至全量，用0.22μm滤膜滤过，滤液灌装成10ml安瓿注射液，115℃热压灭菌30分钟，即得注射剂。用法与用量一日一次，一次154mg，一个疗程两周。规格10ml/支，154mg(以栀子苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷R1含量之和计)。实施例3片剂栀子175g三七90g。
取处方量的栀子、三七，粉碎成粗粉，用7倍量的75％乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至65℃相对密度为1.10的清膏，加5倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏49小时，滤过，滤液减压浓缩为60℃相对密度为1.10的清膏，经常规制粒，制成颗粒100克，加入赋形剂，压片(制粒压片机一次完成)。每片重0.5克。实施例4胶囊剂栀子苷70g 三七总皂苷60g经常规制成胶囊剂。实施例5本发明组合物注射剂的质量控制方法鉴别方法a.取本品5ml，水浴蒸干，残渣加乙醇溶解并定量转溶于容量瓶5ml，另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2000年版附录VIB)试验；吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10∶7∶2∶0.5醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；b.取本品10ml，加以水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水液洗涤3次，每次100ml；取正丁醇层减压回收至干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每ml各含6mg的混合液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录IIB)试验，吸取上述两种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，在环境温度20℃以下，以13∶7∶2氯仿-甲醇-水10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1→10硫酸乙醇液，于110℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；含量测定方法a.栀子苷，照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；15∶85乙腈-水为流动相；检测波长为238nm；理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于1500；对照品溶液的制备精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇适量使溶解，制成每1ml含0.144mg的溶液，即得；供试品溶液的制备，精密吸取本品1ml，水浴蒸干，残渣加无水乙醇溶解，乙醇液转移至另一坩埚，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得；本品含栀子苷(C17H24O10)每ml不得少于4.7mg；b.三七皂苷，照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水二元梯度为流动相(见表1)；检测波长为203nm；理论塔板数以人参皂苷Rg1峰计算应不低于2500；对照品溶液制备，精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1适量加甲醇溶解，制成每1ml含三七皂苷R11.5mg、人参皂苷Rg12.8mg、人参皂苷Rb14.1mg的混合对照品溶液；供试品溶液制备，精密吸取样品5ml，用水饱和正丁醇振摇提取三次，每次10ml；正丁醇层合并，用10ml正丁醇饱和水洗涤一次，弃水层，正丁醇层减压回收，至干，残渣用甲醇溶解至5ml，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，即得；测定法，精密吸取对照品溶液3μl，7μl、供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，用外标两点法计算，即得；本品每ml含三七皂苷R1不得少于0.2mg；人参皂苷Rg1不得少于0.8mg；人参皂苷Rb1不得少于2.0mg；表1乙腈-水二元梯度洗脱表时间(min) 流速(ml/min)A(水)B(乙腈)0 1.0 80 20201.0 60 40本发明注射液质量控制方法还可采用指纹图谱的方法a.供试品溶液的制备精密吸取注射液5ml，用水饱和的正丁醇振摇提取两次，第一次10ml；第二次5nl，合并正丁醇提取液；用正丁醇饱和的水10ml反洗一次，弃去水层，正丁醇提取液减压回收至干，残渣用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，摇匀，0.45um滤膜滤过，即得；对照品溶液的制备取栀子苷对照品，用甲醇制成0.5mg/ml的溶液作为对照品溶液；测定方法检测波长238nm，乙腈-水梯度洗脱，见表2；理论塔板数计算，应不低30000；设定供试品溶液进样量为101，记录60分钟的色谱图，即得；以栀子苷的色谱峰(S峰)的保留时间和峰的面积为1计算相对保留时间和峰面积比值；指纹图谱及技术参数；记录时间为60分钟；共有指纹峰的标定(相对保留时间)根据10批次供试品的检测结果标定共有指纹峰如下1(0.404)2(0.462)3(0.510)4(0.589)5(0.618)6(0.666)7(0.722)8(0.798)S(1.000)9(1.085)10(1.110)11(1.197)12(1.238)13(1.277)；共有指纹峰面积的比值1∶S＝1∶(0.060-0.113)；部分峰形描述分离不好时，峰4呈峰5的肩峰；非共有峰面积供试品图谱与对照指纹图谱比较；非共有峰总面积不得大于峰面积的5％；仪器试剂高效液相色谱仪Waters2695泵；Waters 2996紫外检测器；Millcnnium32色谱工作站；Diamonsil C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；乙腈为色谱纯(美国J.T.Baker)；娃哈哈纯净水；甲醇为色谱纯(北京昌化精细化工厂)；表2流动相梯度洗脱表时间(min) 流速(ml/min) 水％乙腈％0 0.895 58 0.892 8210.888 12350.888 12400.870 30450.840 60500.80 100600.80 100b.供试品溶液的制备精密吸取注射液10ml，用水饱和的正丁醇20m1分二次振摇提取，合并正丁醇提取液；用正丁醇饱和的水300ml分三次反洗，弃去水层，正丁醇层减压回收至干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml量瓶中，摇匀，0.45um滤膜滤过，即得；照物的制备取人参皂苷Rg1对照品(购自中国药品生物制品检定所)，用甲醇制成2mg/ml的溶液作为对照品溶液；测定方法检测波长210nm，灵敏度0.1AUFS乙腈-水梯度洗脱，见表3；理论塔板数按人参皂苷Rg1计算，应不低30000；精密吸取供试品溶液25μl，注入高效液相色谱仪，记录70分钟的色谱图，即得；以人参皂苷Rg1的色谱峰(S峰)的保留时间和峰的面积为1计算相对保留时间和峰面积比值；指纹图谱及技术参数；记录时间为70分钟；共有指纹峰的标定(相对保留时间)根据10批次供试品的检测结果标定共有指纹峰如下1(0.877)S(1.000)2(1.027)3(1.555)4(1.592)5(1.652)6(1.675)7(1.708)8(1.744)9(1.799)10(2.005)11(2.042)12(2.074)13(2.111)14(2.150)15(2.212)16(2.235)17(2.364)18(2.391)19(2.420)20(2.440)21(2.771)；共有指纹峰面积的比值S∶3∶8∶21＝1∶(0.222-0.412)∶(0.405-0.735)∶(1.428-2.380)；非共有峰面积供试品图谱与对照指纹图谱比较；非共有峰总面积不得大于总面积的5％；仪器试剂Waters 2695 Waters 2996紫外检测器Millcnnium32色谱工作站SymmetryshildTMRP18(5μm，4.6mm×250mm)；Fisher 乙腈(美国色谱纯)Fisher甲醇(美国色谱纯)娃哈哈纯净水其它为分析纯表3 流动相梯度洗脱表时间(min) 流速(ml/min) A-水 B-乙腈0 1.0 831720 1.0 762440 1.0 604050 1.0 505055 1.0 0 10060 1.0 0 10070 1.0 0 100
权利要求
1.一种治疗中风病的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的栀子150-220重量份三七70-110重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的栀子170-200重量份三七80-100重量份。
3.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的栀子150-220重量份三七总皂苷3-9重量份
4.如权利要求3所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的栀子170-200重量份三七总皂苷5-7重量份。
5.如权利要求4所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的栀子175重量份三七总皂苷5.5重量份。
6.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的栀子苷3.8-11.5重量份三七总皂苷3-9重量份。
7.如权利要求6所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由下述原料药制成的栀子苷6.3-8.9重量份 三七总皂苷5-7重量份。
8.如权利要求3-5所述的中药组合物注射剂的制备方法，其特征在于该方法为取处方量的栀子，粉碎成粗粉，用7-9倍量的65-80％乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至55-70℃相对密度为1.00-1.20的清膏，加3-5倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏45-50小时，滤过，滤液减压浓缩为55-70℃相对密度为1.00-1.20的清膏，上活性炭柱，先用蒸馏水洗脱，至洗脱液无色，再用9-11倍量65-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品；取栀子半成品用适量注射用水溶解，滤过；另取处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，滤过，将三七药液与栀子药液混匀，调节pH值至5.5-7.5，0-4℃冷藏20-30小时，0.45μm滤膜滤过，滤液加注射用水至全量，用0.22μm滤膜滤过，滤液灌装成10ml安瓿注射液，110-120℃热压灭菌20-40分钟，即得。
9.如权利要求8所述的中药组合物注射剂的制备方法，其特征在于该方法为取处方量的栀子，粉碎成粗粉，用8倍量的70％乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加4倍量水稀释，搅匀，0-4℃冷藏48小时，滤过，滤液减压浓缩为60℃相对密度为1.10的清膏，上活性炭柱，先用蒸馏水洗脱，至洗脱液无色，再用10倍量70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇并浓缩，干燥，得栀子半成品；取栀子半成品用适量注射用水溶解，滤过；另取处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，滤过，将三七药液与栀子药液混匀，调节pH值至6.0-7.0，0-4℃冷藏24小时，0.45μm滤膜滤过，滤液加注射用水至全量，用0.22μm滤膜滤过，滤液灌装成10ml安瓿注射液，110℃热压灭菌30分钟，即得。
10.如权利要求1-7所述的中药组合物在制备治疗中风病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种治疗中风病的中药组合物及其制备方法和质量控制方法。该组合物主要由栀子150－220重量份、三七总皂苷3－9重量份组成。该中药组合物制备时将栀子用乙醇渗漉，浓缩至清膏，上活性炭柱，得栀子半成品；取栀子半成品用适量注射用水溶解，另取处方量的三七总皂苷，加适量注射用水溶解，滤过，将三七药液与栀子药液混匀，调节pH值，滤膜滤过，热压灭菌制得注射剂。同时本发明还提供了对该组合物进行成分鉴别、含量测定、指纹图谱的质量控制方法。
文档编号A61K31/7048GK1476891SQ0314952
公开日2004年2月25日 申请日期2003年7月15日 优先权日2003年6月19日
发明者牛欣, 印永贵, 李澎涛, 尹洪林, 王玥琦, 司银楚, 李继东, 庞鹤, 孙建宁, 宋晓雯, 蔡大勇, 徐元景, 孙伟, 牛 欣 申请人:北京中医药大学, 内蒙古康源药业有限公司