专利名称：重组人干扰素β－1b用于制备预防、治疗SARS药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人干扰素β-1b(rhIFN-β-1b)的一种药物用途，具体地，本发明涉及重组人干扰素β1b在制备预防、治疗SARS药物的用途及其制剂。
背景技术：
干扰素(interferon IFN)是一类具有抗病毒、抑制细胞增殖与调节机体免疫作用的细胞因子，按其来源不同，分为α、β、γ三种(Pestka S.，Arch.Biochem.Biophys.，1983，2211；Weissmann C.and Weber H.，Prog.Nucleic Acid Res.，1986，33251.)。目前，均已有基因工程产品在临床使用。IFN-β是成纤维细胞在病毒、双链DNA、其他多聚核苷、抗原及丝裂诱导下产生的糖蛋白。人IFN-β基因已被克隆并在不同启动子系统控制下表达于多种宿主系统中(Mark D.F.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，815662.；Itoh S.，et al.，DNA，1984，3(2)157.；Pestka S.，et al.，Annu.Rev.Biochem.，1987，56727.)。其中利用大肠(E.coli)生产的重组IFN-β称为rhIFN-β-1b。1993年美国FDA年批准了chiron公司的大肠杆菌表达的重组人β干扰素产品(rhIFN-β-1b，商品名为Betaseron)用于治疗复发型多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)，在临床治疗中具有很好的疗效，目前在欧美国家有很大的市场，成为治疗MS的主要药物。
IFN-β与其它类的干扰素一样，具有多种生物学功能。与细胞表面特异性结合，产生其生物学活性，具有抗病毒(Kerr I.M.，et al.，J.Interferon Res.，1992，12237.)，抑制细胞生长(Arabje Y.M.，et al.，J.Interferon Res.，1993，1325.)、抗感染(KirchnerH.，Antiviral Res.，1986，61.)与免疫调节(Reiter Z.，J.Interferon Res.，1993，13247.；MurrayH.W.，J.Interferon Res.，1992，12319)的功能。
天然IFN-β是一种由166个氨基酸组成的糖蛋白，分子量为23kD，分子中有一个糖基化。在结构上与IFN-α有30％的同源性，识别的受体与IFN-α相同而产生相似的生物学功能。天然人IFN-β含有三个半胱氨酸，分别位于17，31和141位，其中第31位与141位之间形成二硫键，它是IFN-β形成天然构象、维持生物学活性所必需的。大肠杆菌表达的无糖基化的IFN-β分子比天然糖基化的分子活性低，主要原因是自由的第17位半胱氨酸易使IFN-β形成分子间二硫键而形成较低活性的聚集体或沉淀失活。
目前大肠杆菌表达的人IFN-β多为改构的IFN-βser17，从而能够提高分子在体外的正确折叠率，增加稳定性，提高产量。无糖基化的大肠杆菌表达的rhIFN-β-1b的分子量为18.5kD左右，具有与天然IFN-β相信的生物学活性。
Utsumi等(Utsumi J.，et al.，J.Biochem.，1986，991533.；Boublik M.，et al.，J.InterferonRes.，1990，10213)采用圆二色光谱(CD)与H1核磁共振(NMR)研究了纤维母细胞来源的IFN-β(糖基化)与E.coli表达的重组IFN-β(无糖基化)的空间构象。结果表明，在酸性环境下(pH1.6-4.6)，两种IFN-β具有相似的二组结构，它们都具有大约70％的α-螺旋结构，说明重组IFN-β分子糖基并不影响蛋白质的二级结构，两种IFN-β都具有良好的溶解性和稳定性。
选择大肠杆菌作为IFN-β表达系统在药物生产工艺上有多种优点，比如菌株发酵条件比较简易，成本低，周期短，而且产量放大较为容易。
严重急性呼吸系统综合症(以下简称SARS)，又称非典型性肺炎，是由一种新的冠状病毒引起的一种新的传染病，最先爆发于中国广东，随后向周边国家和地区蔓延，截止到2003年5月17日，已经扩散到32个国家和地区，共报道了超出7000例的SARS病例。其发病特征为高烧、全身不适、头疼、干咳、呼吸困难、血氧过少、肺部出现空洞，能够发现全身性间隙浸润液，严重的需要采用插管法或呼吸机帮助病人进行呼吸，死亡率高达15％左右(Kanchan Anand，John Ziebuhr，Parvesh Wadhwani and et al.，Science，2003，Science 3001763-1767；)。SARS临床诊断表现为淋巴细胞减少、白细胞减少、天冬氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶水平升高。
世界卫生组织负责传染病的执行干事戴维·海曼于2003年4月16日宣布，经过全球科研人员的通力合作，正式确认冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体，科学家将其命名为“SARS病毒”。引起SARS的冠状病毒是一种正义、单链RNA病毒，是RNA病毒中基因组最大的病毒，它本身没有细胞结构，不能自主复制，但一旦进入人体细胞，就能利用细胞中的各种资源在宿主细胞中不断进行复制(QIN E’de，ZHU Qingyu，YU Man and et al.，A completesequence and comparative analysis of a SARS-associated virus(IsolateBT01)，Chinese Science Bulletin，2003，48(10)941-948；Marco A.Marra，Steven J.M.Jones，Caroline R.Astell and et al.，The Genome Sequenceof the SARS-Associated Coronavirus，2003，Science 3001399-1404；Christian Drosten，Stephan Gunther，Wolfgang Preiser and et al.，Identification of a novel coronaviral in patients with severe acuterespiratory syndrome，the New England Journal of Medicine，April 10，2003)。引起SARS的冠状病毒主要通过呼吸道传播，由于病毒的寄生特性，很难找到合适的药物，因为药物在杀死病毒的同时，往往也会误伤健康细胞(PaulA.Rota，M.Steven Oberste，Stephan S.Monroe and et al.，Characterizationof a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome，2003，Science 3001394-1399；)。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种含有重组人干扰素β-1b和稳定剂或赋形剂的药物组合物。
本发明的目的之二是提供重组人干扰素β-1b在制备预防、治疗严重急性呼吸系统综合症(SARS)药物中的用途。
本发明的目的之三是提供上述预防或治疗SARS药物的剂型。
本发明利用常规重组DNA技术克隆人IFN-β的基因，构建表达质粒pET23a-IFN-β，然后将其转化到大肠杆菌菌株BL21中，诱导表达，筛选出高效表达rhIFN-β-1b的重组大肠杆菌表达菌株。进行发酵后，经纯化后获得可以得到高纯度、高活性的rhIFN-β-1b样品。然后加入一定里的保护剂或赋形剂形成药物组合物，其中重组人干扰素β1b的有效剂量为1×105国际单位/毫升-5×106国际单位/毫升。
该药物可以做成多种剂型，如加入一定的保护剂与赋形剂，冻干，过滤除菌，分装，放入冻干机真空冷冻，最后通入氮气，进行容器封口，做成注射剂型。或者加入一定的保护剂或赋形剂，放入一定的喷雾或气雾装置中，做成喷雾剂或气雾剂。
将上述药物组合物送生物安全三级实验室进行抗引起SARS冠状病毒的实验。其中所用的细胞为非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供；病毒为SARS病毒，BJ-01株，由军事科学院微生物流行病研究所病毒室提供。
经过用CPE法测定含rhIFN-β-1b的药物组合物抗病毒的活性，结果表明rhIFN-β-1b对于引起SARS的冠状病毒具有封闭作用。
具体实施例方式
在下面的具体实施方式
将进一步说明本发明，但并不限制本发明范围。
实施例1rhIFN-β-1b工程菌株的构建、发酵及纯化运用常规分子生物学实验方法，克隆人IFN-β的基因，构建表达质粒pET23a-IFN-β；为提高表达效率，对IFN-β基因片段中的惰性密码子进行了改造；同时为提高表达蛋白质的稳定性，采用基因定点突变技术将Cys17改造为Ser17；然后将其转化到大肠杆菌菌株BL21中，诱导表达，筛选出高效表达rhIFN-β-1b的重组大肠杆菌表达菌株。进行发酵、纯化后，得到高纯度、高活性的rhIFN-β-1b样品。
实施例2注射用重组人干扰素β-1b我们在成品中采用2％的人血白蛋白(HSA)作为保护剂与赋形剂。冻干时，过滤除菌，分装，放入冻干机真空冷冻，最后通入氮气，进行容器封口。其中，每支含有200μg的重组人干扰素β-1b，4.82×106IU/支，20mg的HAS。
实施例3重组人干扰素β-1b喷雾剂原液中加入适量稳定剂和防腐剂，制成地喷雾剂。其中每毫升含3×106IU的重组人干扰素β-1b，20mg的HAS。
实施例4重组人干扰素β-1b气雾剂原液中加入适量稳定剂和防腐剂，装入气雾装置中，制成气雾剂。其中每毫升含3×106IU的重组人干扰素β-1b，20mg的HAS。
实施例5重组人干扰素β-1b体外抗SARS病毒试验1、实验材料药品注射用重组人干扰素β-1b，4.82×106IU/支；
细胞非洲绿猴肾细胞(Vero E6)，由军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室提供；病毒SARS病毒，BJ-01株，由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室提供；细胞培养液含10％胎牛血清的DMEM培养液。
实验室生物安全三级实验室(P3实验室)2、实验方法1)CPA法测定病毒对Vero-E6细胞半数毒性浓度(TCID50)Vero-E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2*104个/孔，37℃培养24小时，细胞长成单层，加入10倍稀释9个浓度的病毒液，每浓度孔，37℃，5％CO2温箱培养。每天用显微镜观察细胞病变(CPE)。细胞病变在25％以下为+，26-50％病变为++，51-75％病变为+++，76-100％病变为++++。记录细胞病变程度(CPE)。用Reed-Muench法计算病毒半数感染剂量(TCID50)。
2)干扰素β-1b对细胞毒性的测定Vero-E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2*104个/孔，37℃培养24小时，细胞长成单层。药物设5个浓度，即106、105、104、103、102IU/ml(终浓度)。每浓度4孔。设正常细胞对照。每天观察给药组细胞病变，观察到5天。确定药物的无毒浓度。
3)CPE法测定药物抗病毒活性；Vero-E6细胞接种于96孔板，每孔100μl，含细胞2*104个/孔，37℃培养24小时，细胞长成单层。将最大无毒浓度以下的药物10倍稀释5个浓度，分别加入细胞板中，每孔100μl，37℃培，5％CO2温箱培养24小时后，再分别加入不同稀释度的病毒(10-3、10-4、10-3)，共同培养48-72小时，观察细胞病变CPE(细胞病变在25％以下为+，26-50％病变为++，51-75％病变为+++，76-100％病变为++++，正常细胞为一)。每个稀释度设4个孔，并设正常细胞对照、药物对照和不同稀释度(10-3、10-4、10-3)的病毒对照，每天观察，待病毒对照出现细胞明显病变时，判定干扰素抗病毒的效应。试验重复1次。用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度IC50。
3、实验结果药物的抗病毒作用表1 重组人干扰素β-1b对SARS病毒的作用
结论重组人干扰素β-1b对细胞的无毒浓度为105IU/ml。当病毒浓度为10-5(1000TCID50)时，干扰素对引起SARS的冠状病毒有封闭作用，其半数抑制病毒浓度(IC50)为21IU/ml。
权利要求
1.含有重组人干扰素β1b和稳定剂或赋形剂的药物组合物。
2.重组人干扰素β1b(rhIFN-β-1b)在制备预防、治疗严重急性呼吸系统综合症(SARS)药物中的用途。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中重组人干扰素β1b的有效剂量为1×105国际单位/毫升-5×106国际单位/毫升.
4.如权利要求1所述的药物组合物，其剂型为注射剂。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其剂型为喷雾剂。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其剂型为气雾剂。
全文摘要
本发明涉及一种重组人干扰素β－1b(rhIFN－β－1b)在制备预防、治疗SARS药物中的用途及药物制剂。
文档编号A61P31/00GK1579545SQ0315327
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月13日 优先权日2003年8月13日
发明者胡前进, 王京燕, 赵艳红, 纪晓光, 李晓萸, 张敏, 赵京花, 张永详 申请人:北京金赛狮生物制药技术开发有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所