专利名称：姜黄油提取物滴丸及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有活性成分的姜黄油提取物的滴丸。本发明还涉及滴丸的制备方法和用途。
背景技术：
近年来，在抗癌天然药物研究领域中的许多研究人员都致力于研究紫杉醇、榄香烯各种异构体、姜黄油提取物、温郁金提取物等的抗癌活性和这些药物的各种制剂形式。
上述植物温郁金与另外两种可作为天然药物使用的植物莪术和姜黄同属于姜科植物类群，产于中国的广东、四川、福建、广西、浙江等省。
在中国专利公开CN1247756A中公开了用于治疗恶性肿瘤的姜郁注射液，其中姜黄与郁金的重量比为50-60∶50-40，该注射液是一种简单的混合物。
发明内容
本发明的目的本发明的目的是从姜黄挥发油获得含有芳姜黄酮、姜黄酮和/或芳姜黄酮衍生物的姜黄油提取物，据此提供姜黄油提取物滴丸。本发明的另一个目的是提供滴丸的制备方法。
本发明的再一个目的是提供滴丸用于制备治疗癌症或缺血性中风的用途，滴丸用于缓解肿瘤疼痛的用途，滴丸用于抑制和/或治疗肿瘤的用途，和滴丸用于增加胆汁分泌的用途。
图1是在姜黄油提取物的制备之后立即测定的指纹谱。
图2是在姜黄油提取物制备后放置3个月之后测定的指纹谱。
本发明的详细说明现有技术领域中已经知道榄香烯某些异构体、姜黄油提取物、温郁金提取物具备抑制肿瘤的作用，一些文献公开了这些天然药物的各种制剂形式(或剂型)，例如脂质体、乳剂、脂肪乳等制剂。但是，对于特定的倍半萜酮类的抑制肿瘤的作用，人们了解得不多，文献中有关这方面的报道很少。
本发明人对姜黄油提取物乳剂剂型的抑癌作用进行了多年的研究，已经发现姜黄油中的倍半萜烯化合物(C15H24)姜烯、姜黄烯、芳姜黄烯象榄香烯一样有相近的抑癌活性。我们又发现姜黄油中属于倍半萜酮类的化合物芳姜黄酮、姜黄酮等制备成滴丸经药理试验，证实其抑癌活性比榄香烯乳提高15％～25％，十分有开发价值。我们已对姜黄油提取物中芳姜黄酮、姜黄酮，含氧抑癌活性成分开发出滴丸。
本发明所使用的姜黄油提取物是从姜黄获取的精油(或称作挥发油或姜黄油)中提取的含有芳姜黄酮、姜黄酮和芳姜黄酮衍生物的提取物，其中芳姜黄酮的含量是在大约25wt％以上。
本发明人利用长(25米或25米以上)的高效色谱柱，采用色质联用仪成功地拆解了姜黄油的特定几种的倍半萜酮类，发现它们的抑制肿瘤作用比倍半萜烯类更好，并从该姜黄油提取物制取了滴丸。该滴丸通常具有1-4mm，更优选1.5-3.5mm的平均粒径。
本发明提供姜黄油提取物滴丸，它包括含活性成分的姜黄油提取物和滴丸基质，姜黄油提取物与滴丸基质两者的重量比是1∶12-1∶4，该含活性成分的姜黄油提取物是从姜黄油分离得到的并且包括至少约25wt％的作为活性成分的芳姜黄酮。在正常情况下，如果在色谱分离中对三种主要成分不进行截分，该含活性成分的姜黄油提取物包括作为活性成分的至少约25wt％的芳姜黄酮，约2-28wt％和更优选5-30wt％的姜黄酮和约1-20wt％和更优选3-20wt％的芳姜黄酮衍生物。更理想地，该含活性成分的姜黄油提取物包括作为活性成分的至少约25wt％的芳姜黄酮，约10-26wt％的姜黄酮和6-18wt％的芳姜黄酮衍生物。
如果进行拆分，甚至可以获取含有95wt％以上芳姜黄酮的姜黄油提取物。其中芳姜黄酮衍生物含有以下通式I的异构体
本发明还提供姜黄油提取物滴丸的制备方法，它包括首先将滴丸基质熔化，添加含活性成分的姜黄油提取物和任选的其它辅料，混合，然后利用滴管滴入冷却液中而冷凝成丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物是从姜黄油分离得到的并且包括至少约25wt％的作为活性成分的芳姜黄酮，和其中辅料包括表面活性剂，维生素E，C2-C4二醇、三醇或四醇，和C16-C24脂肪酸当中的一种或多种。
对于这些姜黄油提取物，要求它包括作为活性成分的约至少25wt％的芳姜黄酮，其它是姜黄酮和姜黄酮衍生物，还有倍半萜烯类和少量即低于5wt％的其它天然成分(包括单萜烯、二萜烯、姜黄素等天然成分)。理想地，该姜黄油提取物包括作为活性成分的至少30wt％、更优选至少45wt％、甚至更优选60wt％、再更优选至少70wt％、进一步更优选至少80wt％、特别优选至少85wt％、最优选至少95wt％的芳姜黄酮。其它天然成分的含量是低于4wt％，优选低于3.5wt％，更优选低于3wt％，再更优选低于2.5wt％，甚至更优选低于2wt％和特别优选低于1.5wt％，更特别优选低于0.5wt％和最优选低于0.01wt％。由于采用了较长的高效色谱柱，使得能够以高纯度分别地分离出芳姜黄酮，姜黄酮，和芳姜黄酮衍生物，三者作为三个主峰依次在附图中给出的指纹谱图中按照从左到右的顺序出现，这从附图中可以看出，这三种物质的三个峰都可以分开，分别截取这三种成分是可能的。当然，对所截分的芳姜黄酮进一步进行色谱分离，得到更高的纯度(浓度)的样品。由于姜黄酮，芳姜黄酮衍生物也具有不错的功效，所以，将芳姜黄酮、姜黄酮和芳姜黄酮衍生物三者进一步分离有时候显得没有必要，即不必加以拆分。
另外，用三氯化铁(FeCl3)进行显色分析，表明芳姜黄酮衍生物存在酚羟基或烯醇式结构。
需要指出的是，在本发明中作为本发明的起始原料来制备滴丸的姜黄油提取物可以使用商购的产品，如含所述芳姜黄酮，姜黄酮和/或芳姜黄酮衍生物的姜黄油提取物商购产品，以及按照现有技术中描述的方法或在这里所述的方法从姜黄植物(优选它的根茎)的挥发油(或精油或姜黄油)中提取的姜黄油提取物产品。如果在本申请中需要自己制备这些提取物，用于制备这些提取物的各种挥发油(或精油)可以使用商购产品，也可以使用通过普通的水蒸汽蒸馏法或CO2超临界提取法从植物(例如植物的根茎)中获得的挥发油。每一种提取物能够用作本发明的起始原料，而且温郁金的挥发油可以用作获得提取物的原料。还需要指出的是，在本申请中活性成分特定地包括芳姜黄酮、姜黄酮和芳姜黄酮衍生物中的一种、两种或三种酮类，但芳姜黄酮是必须有的。
原则上，从植物中提取的含有≥25wt％，优选≥30wt％，更优选≥45wt％，再更优选≥60wt％、甚至更优选≥65wt％、最优选≥70wt％的活性成分的所有提取物都可作为原料用于制备本发明的滴丸。在一些情况下，姜黄油提取物含有≥60wt％，更理想≥65wt％，优选≥70wt％，特别优选≥75wt％，非常特别优选≥80wt％，进一步特别优选≥85wt％，最优选≥95wt％的活性成分，即选自芳姜黄酮，姜黄酮和芳姜黄酮衍生物中的一种、两种或三种酮类。姜黄油提取物中的其它成分是倍半萜烯类和少量即低于5wt％的其它天然成分(包括单萜烯、二萜烯、姜黄素等)。理想地，其它天然成分的含量是低于4wt％，优选低于3.5wt％，更优选低于3wt％，再更优选低于2.5wt％，甚至更优选低于2wt％和特别优选低于1.5wt％，更特别优选低于0.5wt％和最优选低于0.01wt％。在非常理想的情况下，其它天然成分含量应该低于0.0001wt％。各种成分的含量是用毛细管柱气相色谱-质谱联用仪来测量，即在本申请中色谱分析所使用的气相色谱-质谱联用仪是Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)是DB1(固定液是聚二甲基硅氧烷)，BP-5或DB5(固定液是聚(5％苯基)二甲基硅氧烷。作为滴丸制备用的原料，含有70wt％、优选75wt％、更优选80wt％以上的活性成分的姜黄油提取物是理想的，含有85wt％以上活性成分的提取物是优选的，含有90wt％以上活性成分的提取物是更优选的，含有95wt％以上活性成分的提取物是特别优选的。
用于提取芳姜黄酮、姜黄酮、芳姜黄酮衍生物的姜黄属植物包括中国南方各省出产的姜黄，尤其是广东产的姜黄，主要从根茎中获取姜黄油，再从姜黄油制备姜黄油提取物。有关这些植物和所含的成分倍半萜酮类的描述参见《药学学报(ACTAPHARMACEUTICA SINICA)》，“我国姜黄属植物的研究”，Vol.XVII，No.6(第17卷第6期)，1982年6月。在该文章中详细介绍了姜黄属五种植物根茎挥发油的成分和含量，该文献以全部内容引入本文供参考。
术语的解释在本申请中，姜黄油提取物指从姜黄植物中，尤其从姜黄植物的根茎中获取的挥发油(或精油或姜黄油)经真空填料式精馏装置精馏出的组分或经分子蒸馏仪精制出的组分。经GC-MS(气相色谱-质谱联用仪)检测含量。
在本申请中纯度是指按重量计的百分纯度，除非另有说明。
本申请中所使用的原料即姜黄油提取物没有特别的限制，只要该提取物是从天然植物中提取并且包括≥25wt％的芳姜黄酮，其它是姜黄酮和芳姜黄酮衍生物，少量即低于16wt％和更优选低于10wt％的倍半萜烯类和少量即低于8wt％和更优选低于5wt％的其它天然成分(包括单萜烯、二萜烯、姜黄素等)，而芳姜黄酮、姜黄酮和芳姜黄酮衍生物在这里被认为是活性成分，则该提取物就可在本发明中使用，更理想的是，该纯度≥30wt％，更理想≥45wt％，优选≥60wt％，特别优选≥65wt％，非常特别优选≥70wt％。当然，更高活性成分纯度的提取物是理想的，因为纯度高，在制备滴丸时提取物用量相应减少。所以，在有些时候能够采用活性成分(芳姜黄酮、姜黄酮和/或芳姜黄酮衍生物)纯度≥70wt％，更理想≥75wt％，优选≥80wt％，特别优选≥85wt％，非常特别优选≥88wt％，更特别优选≥95wt％的姜黄油提取物。所述活性成分指，选自芳姜黄酮，姜黄酮和芳姜黄酮衍生物中的一种、两种或三种酮类，但芳姜黄酮是必须有的。其中芳姜黄酮、姜黄酮还应该包括各自全部的异构体，如果有的话。此外，姜黄油提取物可含有90wt％以上、或95wt％以上的芳姜黄酮，此时可以认为它是单一组分。
在本发明中使用其它辅料，该辅料包括表面活性剂(例如吐温-80)，维生素E，C2-C4二醇、三醇或四醇(例如丙二醇、甘油、季戊四醇)，和C16-C24脂肪酸(例如硬脂酸、棕榈酸)当中的一种或多种，要求它们一般要求符合国家药用标准。
除非另有说明，否则在本申请中色谱分析所使用的气相色谱-质谱联用仪是Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)是DB1(固定液是聚二甲基硅氧烷)，BP-5或DB5(固定液是聚(5％苯基)二甲基硅氧烷。
本发明滴丸一般具有1-4mm的平均粒径。该滴丸能够口服方式用于治疗目的。
本发明的优选实施方案本发明的优选实施方案高度概括为如下
1.姜黄油提取物滴丸，它包括含活性成分的姜黄油提取物和滴丸基质，姜黄油提取物与滴丸基质两者的重量比是1∶12-1∶4，更优选是1∶8-1∶5，该含活性成分的姜黄油提取物是从姜黄油分离得到的并且包括至少约25wt％，优选至少约30wt％，更优选至少约45wt％的作为活性成分的芳姜黄酮。
2.根据1项的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物进一步包括作为活性成分的约2-28wt％的姜黄酮。
3.根据2项的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物还进一步包括作为活性成分的约1-20wt％的芳姜黄酮衍生物。
4.根据1或3项的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括作为活性成分的至少约25wt％的芳姜黄酮，约5-30wt％的姜黄酮和3-20wt％的芳姜黄酮衍生物。
5.根据6项的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括作为活性成分的至少约25wt％的芳姜黄酮，约10-26wt％的姜黄酮和6-18wt％的芳姜黄酮衍生物。
6.根据1项的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括至少约95wt％的作为活性成分的芳姜黄酮。
7.根据1项的滴丸，其中滴丸基质是选自聚醚，聚氧乙烯硬脂酸酯，聚酯，和它们的共聚物，明胶，多糖，以及这些物质的共混物当中的一种或多种，这些物质的分子量是在3000-60,000之间并且它们在50℃或50℃以上是可以熔化的和在40℃或40℃以下是固体。
8.根据1项的滴丸，它进一步包括表面活性剂，维生素E，C2-C4二醇、三醇或四醇，和C16-C24脂肪酸当中的一种或多种。
9.根据8项的滴丸，其中，各自独立地，表面活性剂的含量是滴丸总重量的0.5wt％-4wt％，维生素E的含量是滴丸总重量的0.01-1.0wt％，C2-C4二醇、三醇或四醇的含量是0.01-7wt％，和C16-C24脂肪酸的含量是0.01-6wt％。
10.根据8项的滴丸，其中，各自独立地，表面活性剂的含量是滴丸总重量的0.8wt％-3wt％，维生素E的含量是滴丸总重量的0.1-1.0wt％，C2-C4二醇、三醇或四醇的含量是0.05-5wt％，和C16-C24脂肪酸的含量是0.05-4wt％。
11.根据1项的滴丸，其中滴丸的平均粒径是1-4mm，优选是1.5-3.5mm。
12.姜黄油提取物滴丸的制备方法，它包括首先将滴丸基质熔化，添加含活性成分的姜黄油提取物和任选的其它辅料，混合，然后利用滴管滴入冷却液中而冷凝成丸，随后任选地用纸吸去冷却液或进行离心甩干或用石油醚或乙醇洗涤和空气吹干，其中该含活性成分的姜黄油提取物是从姜黄油分离得到的并且包括至少约25wt％的作为活性成分的芳姜黄酮，和其中辅料包括表面活性剂，维生素E，C2-C4二醇、三醇或四醇，和C16-C24脂肪酸当中的一种或多种。
13.以上12项的制备方法，其中冷却液选自液体石蜡，和二甲基硅油。
14.以上12项的制备方法，其中滴管的滴口直径是1-4mm，滴管口与冷却液的垂直距离是1-5cm。
15.以上1-11中任何一项的滴丸用于抑制和/或治疗肿瘤，用于抑制癌细胞转移，用于缓解肿瘤疼痛，用于预防或治疗缺血性中风，或用于增加胆汁分泌的用途。
16.以上1-11中任何一项的滴丸用于制备抑制或治疗癌症的药物或用于制备增加胆汁分泌的药物的用途。
17.由12-14中任何一项的方法制备的滴丸，其中滴丸平均粒径是1-4mm，优选是1.5-3.5mm。
下面的制备例和实施例用于举例说明本发明，但不应认为限制本发明的范围。本发明的保护范围由权利要求来定义。
按普通的水蒸汽蒸馏或CO2超临界方法从姜黄的根茎获取挥发油。下面的制备例采用这些挥发油。
制备例1姜黄油提取物(倍半萜酮类)的制备方法以1000ml姜黄挥发油(芳姜黄酮、姜黄酮和芳姜黄酮衍生物三者的含量≥15wt％)为原料，经广州汉维机电公司MD-S80型分子蒸馏仪精制，其工艺条件蒸馏温度35～45℃，蒸馏压力70～90Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，物料流速15～30毫升/小时，得到馏出物，仅收集馏余物，积累到足够量(约450ml)，继续进行分子蒸馏。蒸馏温度45～60℃，蒸馏压力30～70Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，分别收集150ml馏出物与约300ml馏余物，将得到的二次馏余物积累到足够量(750ml)，继续进行分子蒸馏。蒸馏温度30～70℃，蒸馏压力10～50Pa，刮膜速度300-320转/分，冷凝面温度20～25℃，系统保温20～25℃，该馏分流速15～30毫升/小时，收集馏出物(320ml)，放掉馏余物，将溜出物再添加到分子蒸馏仪中继续重复蒸馏一直到用气相色谱仪(即大约25米长毛细管气相色谱-质谱联用仪Bio-RadFTS-65A，HP5890II，色谱柱BP-5)检测时总活性成分含量≥75wt％为止，获得150ml姜黄油提取物。该提取物经上述气相色谱仪检测，含有75.5wt％的活性成分，即芳姜黄酮，姜黄酮和芳姜黄酮衍生物。用气相色谱法制定供检测用指纹图谱。DB1，BP5或DB5毛细管色谱柱检测是含羰基为主的馏份，固定液为聚(5％苯基)二甲基硅氧烷时毛细管柱色谱有有三个主要峰，从左到右分别对应于芳姜黄酮，姜黄酮和芳姜黄酮衍生物。该提取物用于下面的实施例中。
制备例2使用与制备例中相同的原料即姜黄挥发油，按照制备例1中的相同方法，只是仅仅针对芳姜黄酮的峰进行截分，得到了含有约95.5wt％芳姜黄酮的姜黄油提取物。为了制备西药滴丸，可以使用制备例2的姜黄油提取物，西药滴丸的制备方法与下列的实施例中完全相同。
在附图1中给出了制备例1的姜黄油提取物的指纹谱。在附图2中给出了制备例1的姜黄油提取物在有空气存在下存放3个月后的指纹谱。其中毛细管色谱固定液名称聚二甲基硅氧烷或聚(5％苯基)二甲基硅氧烷，商品柱名称DB1，DB-5或BP5等。两指纹谱中的峰高度的变化反映了姜黄酮部分地转化成更稳定的芳姜黄酮。而且，调节PH值至酸性或碱性，会加速这一转化。
在本申请中色谱分析所使用的气相色谱-质谱联用仪是Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，毛细管色谱柱(30×0.25mm×0.25μm)是DB1(固定液是聚二甲基硅氧烷)，BP-5或DB5(固定液是聚(5％苯基)二甲基硅氧烷。
GC/MC参数(GC)Col.DB-1MS(30m×0.25mm×0.25μm)；Col.Temp.100℃(2min)--8℃/min--200℃(2min)Inj.Temp.230℃；Inj.Modesplit(10∶1)；Inj.Volume10μl；Carrier gasHe；Column flow1ml/min(EIMS)70eVMass Range33-500 Scan Rate1000amu/s
Interface Temp.230℃ SolventCHCl3Solvent Cut Time4.0minStart time4.2minDetector1.00Kv对其指纹谱构成中的色谱峰经气质联用解析，发现有芳姜黄酮 姜黄酮 和含有烯醇或酚羟基结构的芳姜黄酮衍生物。
值得指出的是，从附图中可以看出，三个峰已明显分开，基本上有可能分别截取每一种主要成分，或截取其中的两种主要成分。由于在本发明中发现它们三者都具有很好的抑制肿瘤的作用，故没有将三者拆分，对于大规模工业生产来说三种成分的同时分离操作显得简单、容易一些。
姜黄油提取物滴丸的制备在这里只选用了三种基质，分别是聚乙二醇-6000(BASF公司的产品)、聚醚(poloxamer，BASF公司的产品，聚氧乙烯-氧丙烯嵌段共聚物)和聚氧乙烯单硬脂酸酯(S40)，但本发明并不限于它们。
实施方案1-姜黄油提取物滴丸的制备方法1一种姜黄油提取物滴丸的配方其组分为姜黄油提取物9～18wt％，棕榈酸或硬脂酸1.5～4.5wt％，吐温-80 0.6～2.8wt％，维生素E 0.1～0.5wt％，聚乙二醇-6000 75～83wt％。其制备方法是按配方中的重量百分比，先将聚乙二醇-6000在85～95℃的温度下熔化后，缓慢地加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后再依次加入棕榈酸(或硬脂酸)、吐温-80、维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴丸机(型号DWJ-2000，烟台康达尔药业有限公司制造，下同)的滴管滴入液体石蜡或二甲基硅油冷却液中，冷凝成丸后，用吸蜡性好的纸例如毛边纸吸去粘附的液体石蜡或二甲基硅油，或进行离心甩干，或用乙醇或石油醚洗涤和然后吹干即可，滴丸的重量为每滴丸0.03～0.05克。滴管的口径为0.1～0.4厘米，滴管口与石蜡冷却液之间的距离为1～5厘米。
实施方案2-姜黄油提取物滴丸的制备方法2一种姜黄油提取物滴丸的配方其组分为姜黄油提取物10～15wt％，丙二醇2～5wt％，聚乙二醇-4000 5～10wt％，维生素E 0.1～0.5wt％，聚乙二醇-6000 70～80wt％。其制备方法是按配方中的重量百分比，先将聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000在85～95℃的温度下熔化后，缓慢的加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后再依次加入丙二醇、维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴管滴入液体石蜡或二甲基硅油冷却液中，冷凝成丸后，用吸蜡性好的纸吸去粘附的液体石蜡或二甲基硅油，或进行离心甩干，或用乙醇或石油醚洗涤和然后吹干即可，滴丸的重量为每滴丸0.03～0.05克。滴管的口径为0.1～0.4厘米，滴管口与石蜡冷却液之间的距离为1～5厘米。
实施方案3-姜黄油提取物滴丸的制备方法3一种姜黄油提取物滴丸的配方其组分为姜黄油提取物9～18wt％，维生素E 0.1～0.5wt％，聚醚(poloxamer)75～87wt％。其制备方法是按配方中的重量百分比，先将聚醚(poloxamer)在60～75℃的温度下熔化后，缓慢地加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后加入维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴管滴入液体石蜡或二甲基硅油冷却液中，冷凝成丸后，用吸蜡性好的纸吸去粘附的液体石蜡或二甲基硅油，或进行离心甩干，或用乙醇或石油醚洗涤和然后吹干即可，滴丸的重量为每滴丸0.03～0.05克。滴管的口径为0.1～0.4厘米，滴管口与石蜡冷却液之间的距离为1～5厘米。
实施方案4-姜黄油提取物滴丸的制备方法4一种姜黄油提取物滴丸的配方其组分为姜黄油提取物10～15wt％，维生素E 0.1～0.5wt％，聚氧乙烯单硬脂酸酯(S40)70～87wt％。其制备方法是按配方中的重量百分比，先将聚氧乙烯单硬脂酸酯(S40)在60～75℃的温度下熔化后，缓慢的加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后加入维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴管滴入液体石蜡或二甲基硅油冷却液中，冷凝成丸后，用吸蜡性好的纸吸去粘附的液体石蜡或二甲基硅油，或进行离心甩干，或用乙醇或石油醚洗涤和然后吹干即可，滴丸的重量为每滴丸0.03～0.05克。滴管的口径为0.1～0.4厘米，滴管口与石蜡冷却液之间的距离为1～5厘米。
具体实施例方式采用表I中的配方，利用以上制备方法，来制备滴丸。
实施例1采用实施方案1。姜黄油提取物滴丸的配方是其组分为姜黄油提取物180g(18％)，硬脂酸22g(2.2％)，吐温-8012g(1.2％)，维生素E 2.5g(0.25％)，聚乙二醇-6000783.5g(78.35％)。其制备方法是按配方中的重量份数，先将聚乙二醇-6000在85～95℃的温度下熔化后，缓慢地加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后再依次加入硬脂酸、吐温-80、维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴管滴入液体石蜡冷却液中，冷凝成丸后，用毛边纸吸去粘附的液体石蜡即可，滴丸的重量为每滴丸平均0.03～0.05克。滴管的口直径为0.3厘米，滴管口与液体石蜡冷却液之间的距离为1.5厘米。
实施例2采用表I中给出的配方，按照与实施例1中相同的程序，制备滴丸，只是液体石蜡冷却液改变为二甲基硅油，滴管口与液体石蜡冷却液之间的距离为3.5厘米。
实施例3采用表I中给出的配方，按照与实施例1中相同的程序，制备滴丸，只是在冷凝成丸后，不用毛边纸吸去粘附的液体石蜡，而是进行离心甩干。
实施例4采用表I中给出的配方，按照与实施例1中相同的程序，制备滴丸，只是在冷凝成丸后，不用毛边纸吸去粘附的液体石蜡，而是滴丸用乙醇洗涤和然后空气吹干。
实施例5采用表I中给出的配方，按照与实施例4中相同的程序，制备滴丸，只是在冷凝成丸后，滴丸用石油醚(而不是乙醇)洗涤和然后空气吹干。
实施例6和7按照与实施例4中相同的程序，采用表I中给出的配方，制备滴丸。
实施例8
采用实施方案2。姜黄油提取物滴丸的配方是其组分为姜黄油提取物145g(14.5％)，丙二醇23g(2.3％)，聚乙二醇-400080g(8.0％)维生素E 2g(0.2％)，聚乙二醇-6000 750g(75％)。其制备方法是按配方中的重量比，先将聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000在85～95℃的温度下熔化后，缓慢的加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后再依次加入丙二醇、维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴管滴入液体石蜡冷却液中，冷凝成丸后，用毛边纸吸去粘附的液体石蜡即可，滴丸的重量为每滴丸平均0.03～0.05克。滴管的口直径为0.3厘米，滴管口与石蜡冷却液之间的距离为1.5厘米。
实施例9采用表I中给出的配方，按照与实施例8中相同的程序，制备滴丸，只是液体石蜡冷却液改变为二甲基硅油，滴管口与液体石蜡冷却液之间的距离为3.5厘米。
实施例10采用表I中给出的配方，按照与实施例8中相同的程序，制备滴丸，只是在冷凝成丸后，不用毛边纸吸去粘附的液体石蜡，而是进行离心甩干。
实施例11采用表I中给出的配方，按照与实施例8中相同的程序，制备滴丸，只是在冷凝成丸后，不用毛边纸吸去粘附的液体石蜡，而是滴丸用乙醇洗涤和然后空气吹干。
实施例12采用实施方案3。姜黄油提取物滴丸的配方是其组分为姜黄油提取物135g(13.5％)，维生素E 3g(0.3％)，聚醚(poloxamer)862g(86.2％)。其制备方法是按配方中的重量比，先将聚醚(poloxamer)在60～75℃的温度下熔化后，缓慢地加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后加入维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴管滴入液体石蜡冷却液中，冷凝成丸后，用吸蜡性好的纸吸去粘附的液体石蜡即可，滴丸的重量为每滴丸0.03～0.05克。滴管的口径为0.3厘米，滴管口与石蜡冷却液之间的距离为1.5厘米。
实施例13采用表I中给出的配方，按照与实施例12中相同的程序，制备滴丸，只是液体石蜡冷却液改变为二甲基硅油，滴管口与液体石蜡冷却液之间的距离为3.5厘米。
实施例14采用实施方案4。姜黄油提取物滴丸的配方是其组分为姜黄油提取物135g(13.5％)，维生素E 3g(0.3％)，聚氧乙烯单硬脂酸酯(S40)862g(86.2％)。其制备方法是按配方中的重量比，先将聚氧乙烯单硬脂酸酯(S40)在60～75℃的温度下熔化后，缓慢的加入姜黄油提取物(油状物)并搅拌，然后加入维生素E，并充分搅拌均匀后，将混合物在75～85℃的恒温条件下，用滴管滴入液体石蜡冷却液中，冷凝成丸后，用石油醚洗涤和然后吹干即可，滴丸的重量为每滴丸0.03～0.05克。滴管的口径为0.3厘米，滴管口与石蜡冷却液之间的距离为1.5厘米。
实施例15采用表I中给出的配方，按照与实施例14中相同的程序，制备滴丸，只是液体石蜡冷却液改变为二甲基硅油，滴管口与液体石蜡冷却液之间的距离为3.5厘米。
表I具体配方(重量百分比，按滴丸重量计)
表II姜黄油提取物滴丸(实施例1)对试验大鼠胆汁分泌的影响样品 剂量给药方案 动物数 胆汁分泌增mg/kg 始/终(只) 加率％姜黄提取物滴丸 4510 6/6 30.16姜黄提取物滴丸 3510 6/6 24.32姜黄提取物滴丸 2510 6/6 12.18对照组(去氢胆酸 10 12/1231.23钠)姜黄油提取物滴丸抑制肿瘤试验报告1、材料和方法1.1、试验动物18～22g昆明种雄性小鼠，每个剂量组10只(动物移植性肿瘤试验的小鼠每组平均体重相差不超过1g)，由中国医科大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号辽实动字第521号。
1.2、试验瘤株小鼠肉瘤180(S-180)、肝癌(H22)均有中国医学科学院药物研究所提供。
1.3、试验仪器全自动酶标仪、无菌器械、恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、分析天平(感量0.0001g)、电子天平(感量0.01g)、显微镜。
1.4、试验方法1.4.1、剂量分组为160mg/kg、120mg/kg、80mg/kg三个实验组和蒸馏水对照组。每日灌胃一次，连续30天后，分别测定各项指标。
1.4.2、动物移植性肿瘤试验(做重复试验)1.4.2.1、小鼠肉瘤180(S-180)动物移植性肿瘤试验采用小鼠肉瘤180(S-180)瘤株，小鼠连续给受试物二周后，抽取健康腹水型S180小鼠腹水，经台盼蓝染色，计数活细胞数，用生理盐水稀释至活细胞数为107个/ml，每只小鼠腋部皮下接种0.2ml。接种后继续给予受试物，接种二周后，在停止给予受试物之次日处死小鼠，先称体重，后解剖皮下瘤块，称重，如对照组小鼠肿瘤平均重量小于1g或20％鼠的瘤重小于400mg，表示肿瘤生长不良。在试验期间给受试物组鼠死亡超过20％，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15％者，表示受试物的毒性反应，应当减少剂量重新试验。
1.4.2.2、小鼠肝癌(H22)动物移植性肿瘤试验采用小鼠肝癌(H22)瘤株，方法同1.4.2.1。
1.4.3、免疫调节试验1.4.3.1、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)每鼠腹腔注射20％(v/v)鸡红细胞悬液1ml。间隔30分钟，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1分钟。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移植37±1℃孵箱温育30分钟。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Gimsa-磷酸缓冲液染色3分钟，再用蒸馏水漂洗晾干。镜检，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数。计算吞噬百分率和吞噬指数。
1.4.3.2、NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)以新鲜传代的TAC-1细胞为靶细胞，以无菌新鲜制备的脾细胞悬液为效应细胞。取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50∶1)，加入0.5ml塑料离心管中；靶细胞自然释放管加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放管加靶细胞和1％NP40各100μl；上述各项均设三个复管，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，1500r/min离心5min，每管吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCL30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。计算NK细胞活性。
1.4.4、数据处理方差分析、最小显著差法和t检验，用Excel97 for Window95软件统计分析。
2、检验结果2.1、小鼠肉瘤180(S-180)动物移植性肿瘤试验姜黄油提取物滴丸对荷瘤鼠的影响(实施例1)剂量 动物数瘤重 (g) 抑制率mg/kg (只) X SD (％)160101.82(1) 0.52 41.69120101.94(1) 0.51 37.4780 102.10(1) 0.43 32.65蒸馏水对照10 3.11 0.88组(1)P(可信度)＜0.05姜黄油提取物滴丸对荷瘤鼠的影响(实施例4)剂量 动物数瘤重 (g) 抑制率mg/kg (只) XSD (％)160 101.89(1) 0.50 41.43120 102.01(1) 0.45 37.5780102.19(1) 0.80 32.14蒸馏水对照103.22 0.85组(1)P(可信度)＜0.05二次试验蒸馏水对照组小鼠皮下肿瘤生长良好，蒸馏水对照组小鼠平均瘤重大于1g，小鼠对送检样品无明显毒性反应，试验期间未发生死亡。各实验组的瘤重与蒸馏水对照组比较，差异显著；160mg/kg、120mg/kg二个实验组的抑制率均大于35％。
2.2小鼠肝癌(H22)动物移植性肿瘤试验姜黄油提取物滴丸对荷瘤鼠的影响(实施例8)
剂量动物数 瘤重 (g)抑制率mg/kg (只) XSD (％)160 10 2.38(1) 0.56 41.77120 10 2.43(1) 1.29 37.9680 10 2.66(1) 0.67 32.23蒸馏水对照 10 3.92 1.43组(1)P(可信度)＜0.05姜黄油提取物滴丸对荷瘤鼠的影响(实施例2)剂量 动物数瘤重 (g)抑制率mg/kg (只) X SD (％)160101.68(1)0.88 42.1680 102.10(1)0.55 31.68蒸馏水对照 103.08 0.57组(1)P(可信度)＜0.05二次试验蒸馏水对照组小鼠皮下肿瘤生长良好，蒸馏水对照组小鼠平均瘤重大于1g，小鼠对送检样品无明显毒性反应，试验期间未发生死亡。各实验组的瘤重与蒸馏水对照组比较，差异显著；160mg/kg、120mg/kg二个实验组的抑制率均大于35％。
2.3、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)姜黄油提取物滴丸对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞影响(实施例1)
剂量 动物数 吞噬百分率(％) 吞噬指数(％)mg/kg (只) X SD XSD160 10 38.30(1) 1.64 0.386(1) 0.02120 10 31.70(1) 2.91 0.320(1) 0.038010 25.20 5.03 0.25 60.05蒸馏水对照组 10 25.70 1.94 0.2520.02(1)P＜0.05160mg/kg、120mg/kg实验组吞噬百分率和吞噬指数与蒸馏水对照组比较，差异显著，说明对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力无抑制作用。
2.4、NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)试验结果姜黄油提取物滴丸对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞影响(实施例8)剂量 动物数 NK细胞 活性(％)mg/kg (只)X SD160 10 63.68(1)18.70120 10 62.25(1)14.768010 60.88 15.88蒸馏水对照组 10 45.25 17.75(1)P＜0.05160mg/kg、120mg/kg实验组NK细胞活性与蒸馏水对照组比较，差异显著，说明对小鼠NK细胞活性无抑制作用。
3、小结姜黄油提取物滴丸在本实验室条件下，以18～22g昆明种雄性小鼠为试验动物，分160mg/kg、120mg/kg、80mg/kg三个实验组和蒸馏水对照组，每日灌胃一次，连续30天后，选做动物移植性肿瘤试验采用小鼠肉瘤180(S-180)、肝癌(H22)瘤株；免疫功能试验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)、NK细胞活性测定乳酸脱氢酶(LDH)测定法。试验结果表明送检样品能明显抑制小鼠S180、H22肿瘤的生长；对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力无抑制作用，对小鼠NK细胞活性无抑制作用。
权利要求
1.姜黄油提取物滴丸，它包括含活性成分的姜黄油提取物和滴丸基质，姜黄油提取物与滴丸基质两者的重量比是1∶12-1∶4，该含活性成分的姜黄油提取物是从姜黄油分离得到的并且包括至少约25wt％的作为活性成分的芳姜黄酮。
2.根据权利要求1的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括至少约30wt％的作为活性成分的芳姜黄酮。
3.根据权利要求1的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括至少约45wt％的作为活性成分的芳姜黄酮。
4.根据权利要求1的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物进一步包括作为活性成分的约2-28wt％的姜黄酮。
5.根据权利要求4的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物还进一步包括作为活性成分的约1-20wt％的芳姜黄酮衍生物。
6.根据权利要求1或4的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括作为活性成分的至少约25wt％的芳姜黄酮，约5-30wt％的姜黄酮和3-20wt％的芳姜黄酮衍生物。
7.根据权利要求6的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括作为活性成分的至少约25wt％的芳姜黄酮，约10-26wt％的姜黄酮和6-18wt％的芳姜黄酮衍生物。
8.根据权利要求1的滴丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物包括至少约95wt％的作为活性成分的芳姜黄酮。
9.根据权利要求1的滴丸，其中滴丸基质是选自聚醚，聚氧乙烯硬脂酸酯，聚酯，和它们的共聚物，明胶，多糖，以及这些物质的共混物当中的一种或多种，这些物质的分子量是在3000-60,000之间并且它们在50℃或50℃以上是可以熔化的和在40℃或40℃以下是固体。
10.根据权利要求1的滴丸，它进一步包括表面活性剂，维生素E，C2-C4二醇、三醇或四醇，和C16-C24脂肪酸当中的一种或多种。
11.根据权利要求10的滴丸，其中，各自独立地，表面活性剂的含量是滴丸总重量的0.5wt％-4wt％，维生素E的含量是滴丸总重量的0.01-1.0wt％，C2-C4二醇、三醇或四醇的含量是0.01-7wt％，和C16-C24脂肪酸的含量是0.01-6wt％。
12.根据权利要求8的滴丸，其中，各自独立地，表面活性剂的含量是滴丸总重量的0.8wt％-3wt％，维生素E的含量是滴丸总重量的0.1-1.0wt％，C2-C4二醇、三醇或四醇的含量是0.05-5wt％，和C16-C24脂肪酸的含量是0.05-4wt％。
13.根据权利要求1的滴丸，其中滴丸的平均粒径是1-4mm。
14.根据权利要求1的滴丸，姜黄油提取物与滴丸基质两者的重量比是1∶8-1∶5，
15.姜黄油提取物滴丸的制备方法，它包括首先将滴丸基质熔化，添加含活性成分的姜黄油提取物和任选的其它辅料，混合，然后利用滴管滴入冷却液中而冷凝成丸，其中该含活性成分的姜黄油提取物是从姜黄油分离得到的并且包括至少约25wt％的作为活性成分的芳姜黄酮，和其中辅料包括表面活性剂，维生素E，C2-C4二醇、三醇或四醇，和C16-C24脂肪酸当中的一种或多种。
16.权利要求15的制备方法，其中冷却液选自液体石蜡，和二甲基硅油。
17.权利要求15的制备方法，其中滴管的滴口直径是1-4mm，滴管口与冷却液的垂直距离是1-5cm。
18.权利要求1-14中任何一项的滴丸用于抑制和/或治疗肿瘤，用于抑制癌细胞转移，用于缓解肿瘤疼痛，用于预防或治疗缺血性中风，或用于增加胆汁分泌的用途。
19.权利要求1-14中任何一项的滴丸用于制备抑制或治疗癌症的药物或用于制备增加胆汁分泌的药物的用途。
20.由权利要求15-17中任何一项的方法制备的滴丸，其中滴丸平均粒径是1-4mm。
全文摘要
本发明涉及含有芳姜黄酮的姜黄提出物的滴丸及其制备方法，以及姜黄提取物滴丸的用于抑制肿瘤的用途。
文档编号A61K9/20GK1515310SQ0315747
公开日2004年7月28日 申请日期2003年9月23日 优先权日2003年8月27日
发明者李德山, 陈泽平, 庄熹 申请人:李德山, 陈泽平, 庄熹