专利名称：利用大豆属发酵提取物抑制15－脂肪氧合酶的制作方法
技术领域：
本发明将大豆属发酵提取物用于抑制15-脂肪氧合酶，预防和/或治疗由15-脂肪氧合酶而引发的疾病，如心血管疾病、免疫功能紊乱(如，哮喘和/或炎症)并有调节免疫系统功能的作用。本发明还包括采用大豆属发酵提取物预防和/或治疗微生物感染。
背景技术：
脂肪氧合酶(LOX)为含非血基质铁的酶，可以对某些多不饱和脂肪酸，如脂蛋白，的氧化起催化作用。已知的几种不同的脂肪氧合酶，例如LOX-5，LOX-12和LOX-15都具有其特有的氧化作用。LOX-15能催化花生四烯酸和亚油酸的氧化反应并参与低密度脂蛋白(LDL)的氧化变性(oxidative modification)。许多研究报道LOX-15与冠状动脉病变和动脉硬化症(Shen等人，J.Clin.Invest.1996，Vol.98，No.10，pp.2201-2208；Timo等人，1995，Vol.92(11)，pp.3297-3303；Ravalli等人，1995，Arteriosclerosis，Thrombosis andVascular Biology，Vol.15，No.3，pp.340-348；及Kuhn等人，1997，J.Clin.Invest.，Vol.99，No.5，pp.888-893)，癌症和炎症疾病(USP6,001,866；Mogul等人，2001，Biochemistry，40，4391-4397；Walther等人，1999，Molecular Pharmacology，56196-203；及Kamitani等人，1998，the Journal of Biological Chemistry，Vol.273，No.34，pp.21569-21577)以及免疫响应(Kruisselbrink等人，2001，Clin ExpImmunol，1262-8)有关。因此，可以有效抑制LOX的物质将有助于预防和治疗与LOX相关的疾病。
大豆是人类饮食中异黄酮的高浓度摄取源。大豆中还含有其它化合物，包括皂角苷、植物甾醇、大豆肌醇六磷酸、蛋白酶抑制剂、酚酸、多糖、硼、卵磷脂、Ω-3脂肪酸和叶酸。这些都有益于健康。许多传统的东方食品，如天贝(tembe)和纳豆，都是由大豆发酵制得的。例如，天贝是将大豆接种根霉寡孢子、米根霉、少根根霉和匍枝根霉发酵得到的。纳豆是由大豆接种纳豆杆状菌发酵而得到。这些传统的发酵食品可以作为绝佳的蛋白质摄取源。但是，先前并没有报道揭示大豆发酵食品或大豆本身可以用来抑制15-脂肪氧合酶LOX-15。
发明内容
本发明采用大豆属发酵提取物抑制15-脂肪氧合酶(LOX-15)，大豆属发酵提取物是将大豆属提取物在水溶液中，与至少一种乳酸菌和至少一种酵母发酵制得的。具体点说，所用的大豆属植物为大豆或黑豆。更具体的说，本发明的大豆属发酵提取物包括大豆发酵提取物和黑豆发酵提取物。
本发明的大豆属发酵提取物可用来预防和/或治疗由15-脂肪氧合酶的抑制作用而引发的疾病，如心血管疾病、免疫功能紊乱(如，哮喘和炎症)，并有调节免疫系统功能的作用。
本发明的大豆属发酵提取物还可以用于预防和/或治疗微生物感染之类主题的疾病。
图1给出大豆发酵提取物对LOX-15的抑制作用。
图2给出黑豆发酵提取物浓度与LOX-15抑制率的关系。
图3给出五倍子酸的抗氧化效果。在37℃下，加入H2O2作为过氧化剂(X)，五倍子酸作为抗氧化剂(Y)和/或乙醛作为自由基受体(Z)之后，测量化学荧光强度和CL数。图3(a)中，曲线A为同时加入X和Y之后的化学荧光强度，曲线B为同时加入Y和Z之后的化学荧光强度，曲线C为同时加入X和Z之后的化学荧光强度。图3(b)给出的是在200秒时刻，向X和Z的混合物中加入五倍子酸，化学荧光强度增加(也就是说，只有在X、Y和Z同时存在的情况下会产生化学荧光)。
图4给出茶和维生素C的抗氧化效果。测试温度37℃，以H2O2作为过氧化剂，在加入乙醛(Z)作自由基受体和不加入的情况下，在200秒时刻分别添加以下几种抗氧化剂之一，即EGC、茶和维生素C，测量化学荧光强度和CL数。图4(a)给出分别在使用与不使用乙醛的情况下，在200秒时刻加入EGC(表焙儿茶素，一种多酚物质)作为抗氧化剂时，化学荧光强度的变化。由图4(b)可知在200秒时刻加入茶作为抗氧化剂，无乙醛存在下的化学荧光强度为乙醛(+Z)存在下的5.79％。图4(c)表明，使用维生素C作为抗氧化剂，无乙醛存在下的化学荧光强度为乙醛存在下的64.13％。
图5给出不同浓度大豆发酵提取物，FSE的抗氧化作用。测量温度37℃，以H2O2为过氧化剂，分别在使用乙醛作为自由基受体(Z)与不使用的情况下，在200秒时刻加入大豆发酵提取物，测量不同浓度的提取物对应的化学荧光强度。图5(a)表明，FSE浓度为1∶1时，无乙醛存在下的化学荧光强度为乙醛存在下的44.13％。图5(b)表明，FSE浓度为1∶10时，无乙醛存在下的化学荧光强度为乙醛存在下的63.64％。图5(c)和(d)表明，FSE浓度为1∶100和1∶500时，无乙醛存在下的化学荧光强度至少为乙醛存在下的90％。
图6给出大豆发酵提取物对载脂蛋白E缺乏小鼠体内总体血浆胆固醇水平的影响。
图7给出大豆发酵提取物对载脂蛋白E缺乏小鼠伤口的影响。
图8为载脂蛋白E缺乏小鼠大动脉伤口着色照片。
具体实施例方式
本发明涉及大豆属发酵提取物在生产用于抑制15-脂肪氧合酶(LOX-15)以及与15-脂肪氧合酶相关的疾病之组合物中的新应用。所使用的大豆属发酵提取物是将大豆属提取物在水溶液中，与至少一种乳酸菌和至少一种酵母发酵制得的。意外的发现大豆属发酵提取物能有效地抑制低浓度下的15-脂肪氧合酶。
具体的说，含有本发明中的大豆属发酵提取物的组合物可用于预防和/或治疗与15-脂肪氧合酶相关的疾病，如心血管疾病、免疫功能紊乱(如，哮喘和炎症)并有调节免疫系统功能的作用。此外，该发明中的大豆属发酵提取物还能预防和/或治疗微生物感染。
该发明中的组合物可以为医药组合物或食品组合物。
大豆发酵提取物的制备方法大豆属发酵提取物是将大豆属提取物在水溶液中，与至少一种乳酸菌和至少一种酵母发酵制得，并(例如)通过加热对发酵液进行灭菌，过滤和浓缩为可选过程。
根据本发明，用于制备大豆属发酵提取物的大豆属植物包括大豆和黑豆。更具体的说，本发明中的大豆属发酵提取物为大豆发酵提取物或黑豆发酵提取物。
大豆属发酵提取物是将大豆属提取物与至少一种乳酸菌和至少一种酵母菌发酵制得的。使用的乳酸菌为一株或多株同类乳酸菌或几株不同种类的乳酸菌，酵母菌为一株或多株同类酵母菌或几株不同种类的酵母菌。大豆属提取物的与一种或多种乳酸菌及可选酵母菌的发酵过程，可能是按照任一次序进行也可能是同时进行的，不过其更倾向于同时进行。
如果发酵过程中使用了多于一种微生物，发酵可能按顺序进行也可能同时进行。经过筛选的非转基因有机大豆属提取液更适宜作为起始原料。而且更适宜采用乳酸菌异种培养物，例如5、10、15、20、25或30株乳酸菌的培养物进行发酵且加入至少一种酵母菌到该乳酸菌异种培养物中。可选用的乳酸菌株包括，(例如)嗜酸乳杆菌CCRC 10695、14026、14064、14065和/或14079，戴耳布吕克保加利亚乳杆菌CCRC 10696、14007、14009、14010、14069、14071、14098和/或16054，乳酸乳杆菌CCRC 10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、14015和/或14117，开菲乳杆菌CCRC 14011和/或kefiranofaciens乳杆菌CCRC 16059。可以选用的酵母菌包括，(例如)啤酒酵母菌CCRC 20577、20578、20581、21494、21550、21797、21805、22138、22234、22337、22731和/或22728，和/或开菲假丝酵母CCRC 21269、21742和/或22057。经过发酵后，对发酵液进行灭菌(例如通过加热或辐射，最好是加热)，以得到无菌液。无菌液最好再经过过滤或离心(离心法较优)，除去大多数或全部死亡微生物，以得到大豆属发酵提取物。对滤出液进行再过滤去除部分水份以达到对发酵液的浓缩目的，由此得到的大豆发酵提取物效果更佳。除非另作说明，此应用中有关实验涉及到的均为经过浓缩后的大豆发酵提取物。视需要也可以(例如)通过干冻法将大豆属发酵提取物干燥，以得到粉末状大豆属发酵提取物。
制备方法为，将大豆属有机物(去脂后)与蒸馏水按照1∶10的比例混合。将混合物加热到100℃，并保持30分钟，然后过滤得到大豆属提取物。将牛肉和海藻在蒸馏水中保持沸腾状态30分钟，以得到肉汤培养基。加入盐、糖和琼脂以得到特殊的琼脂培养基。向特制的琼脂培养基中加入乳酸菌和酵母菌株。培养基中的乳酸菌和可选的酵母菌转移到大豆属提取物中，在36-43℃培养45-50小时。由于不同种类的微生物根据其相似的生长特性而成群生长，因此最好在培养前将这些微生物群分开加入到大豆属提取物中。这些生长特性为(例如)独特营养培养基的任何要求，微生物菌株发酵后是否能产生较好的气味，该类微生物是否能在此独特的条件下存活。这样做的目的是减少不同种菌株间的负面作用。不同的微生物菌株群最好在培养前以等比例加入到大豆属发酵提取物中，得到的提取物在40℃下培养45-47小时。该培养过程结束后，再将异种培养物引入大豆属提取物中，在36-43℃下培养100-150小时。将最终的发酵提取物加热灭菌过滤。在浓缩器中去除95％的水份，得到浓缩或凝聚状态的大豆属发酵提取物。最上层经过瓷器过滤，分放在容器中密封保存。
本发明涉及到的是一种中草药的发酵提取物，以中草药代替大豆，制备方法与上述方法相似。中草药的发酵提取物可为甘草、枸杞、薏苡(Coix lacryma-jobi Lvar.)、川谷(ma-yune Stapf)、越南槐、桂皮、黄芩、茵陈蒿、黄连、龙胆、红碗莲、菊花、水栀子、大麦、肉桂、食用萝卜(Raph)、anus sativus L.、山药、当归、川芎、羌活、芍药、蒜、五味子素、地黄叶粉、细柱五加、马科动物驴、女贞、绿豆、小麦、扁豆、白术、防风、金银花、肉桂、姜、天麻、天门冬、环草石斛和芝麻。
抑制15-脂肪氧合酶的功用15-脂肪氧合酶是含非血基质铁的酶，可以催化某些多不饱和脂肪酸(如脂蛋白)的氧化。已知这种化合物可以抑制15-脂肪氧合酶的作用，有益于治疗、缓和哺乳动物(包括人类)的炎症、过敏症状、心血管疾病合免疫功能紊乱。
本发明的研究表明，本发明的大豆属发酵提取物比已知的大豆发酵食品和未发酵大豆具有更强的15-脂肪氧合酶抑制能力。
用作抗氧化剂大豆属发酵提取物具有显著的抗氧化性能和自由基清除活性。大豆属发酵提取物能够清除过氧化自由基，如O2、H2O2与ROO，可作为不饱和脂肪酸与脂肪的抗氧化剂。大豆属发酵提取物具有显著的消除超氧(hyper oxygen)阴离子的能力，以使细胞免于氧化损害，并可将自由基的能量降低使其成为无害物质。
用作治疗心血管疾病的药物许多研究给出了LOX-15抑制剂用于治疗和预防炎症和动脉硬化症的例子(Cornicelli等人，USP 6,001,866；Bocan等人，Atherosclerosis，136，203-216，1998及Timo等人，Circulation，col.92(1)，1995年12月1日，pp.3297-3303)。认为大豆属发酵提取物可用于预防和/或治疗心血管疾病，如动脉硬化。
用于提高免疫机能体外研究表明，本发明中的大豆属发酵提取物可以提高免疫机能。分别在添加和不添加分裂素(包括脂多糖、双环醇对刀豆蛋白A和植物血球凝集素)的情况下，考察大豆属发酵提取物调节动物体(Bala/c小鼠)免疫机能的作用。脾细胞增生化验表明大豆属发酵提取物与免疫系统调节过程中的T&B细胞交互作用有关。大豆属发酵提取物还与消炎作用有关。大豆属发酵提取物能够提高巨噬细胞71％的噬菌能力。小鼠的体外实验也得到类似的结果。实验还证明，大豆属发酵提取物的抗肿瘤作用是通过调控细胞分裂素而实现的。受到大豆属发酵提取物调节的培养基刺激了45-56％的周边血液单核细胞，白介素-1b，白介素-b和肿瘤坏死因子-a的水平比未处理的对照实验高很多。由于未处理的巨噬细胞和T淋巴细胞产生少量或不产生细胞分裂素，而且正常的单核细胞不能抑制白细胞的成长，抗肿瘤的作用可能是因为细胞分裂素的增加而实现的。
大豆属发酵提取物可用于哮喘病儿童的治疗。例如，研究结果显示，一群患哮喘病的儿童每天服用3ml大豆发酵提取物，持续4个月，体重会有明显上升。血液实验表明，服用大豆属发酵提取物可以增加这些哮喘儿童的RBC和Hb水平。
用作抗炎药本发明还可用于治疗和/或预防炎症，患者需要时可服用有效剂量的大豆属发酵提取物。服用的大豆属发酵提取物是大豆属提取溶液接种至少一种乳酸菌和至少一种酵母菌发酵制备得到的。
已证明，用药量为10ml/kg时，大豆属发酵提取物可减缓由角叉菜胶引起的老鼠后爪瘤病患；辅助关节炎实验表明，其对急性和慢性关节炎具有消炎作用。
用于预防或治疗感染实验证明，大豆属发酵提取物在体内和体外都具有抗菌能力。它可以抑制幽门螺杆菌、耐氨卡青霉素和甲氧西林金黄色葡萄球菌、沙门氏菌属、枯草杆菌，大肠杆菌，变形杆菌以及耐万古霉素肠球菌的成长。耐万古霉素肠球菌由鸟肠球菌、酪黄肠球、坚忍肠球菌、粪肠球菌和屎肠球菌中选择效果较好。耐万古霉素肠球菌由鸟肠球菌、酪黄肠球菌、坚忍肠球菌和粪肠球菌中选择效果更好。耐万古霉素肠球菌由坚忍肠球菌、粪肠球菌和屎肠球菌中选择效果会更好。耐万古霉素肠球菌由粪肠球菌和屎肠球菌中选择效果会更好。耐万古霉素肠球菌为粪肠球菌时效果最好。
大豆属发酵提取物的有效浓度通常为1-10％。一些病人因并发的肿瘤化疗而极有可能染上嗜中性白血球减少症，大豆属发酵提取物的有选择的抗菌净化作用可预防这些病人发生细菌感染，这一点已经在100个病人中得到验证。耐万古霉素肠球菌由鸟肠球菌、酪黄肠球、坚忍肠球菌、粪肠球菌和屎肠球菌中选择效果较好。耐万古霉素肠球菌由鸟肠球菌、酪黄肠球菌、坚忍肠球菌和粪肠球菌中选择效果更好。耐万古霉素肠球菌由坚忍肠球菌、粪肠球菌和屎肠球菌中选择效果会更好。耐万古霉素肠球菌由粪肠球菌和屎肠球菌中选择效果会更好。耐万古霉素肠球菌为粪肠球菌效果最好。
大豆属发酵提取物的给药本发明中，大豆属发酵提取物可以单独给药，也可以用包含大豆属发酵提取物与医药可接受载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物的形式给药。大豆属发酵提取物最好为大豆发酵提取物或黑豆发酵提取物。大豆属发酵提取物的用药剂量可为0.001-40ml/Kg体重，每次用药剂量不要超过2000ml每人。大豆属发酵提取物的适宜用量为0.01-20ml/Kg体重，更佳用量为0.1-5ml/Kg体重。这些剂量是以浓缩后的发酵提取物为准。可以据此计算未经浓缩的或干燥粉末状大豆属发酵提取物的适当用量。具体剂量可根据患者的健康状况和预防治疗的疾病类型调整。
对啮齿动物进行六个月长期的慢性毒性研究表明，每天服用1-10ml大豆属发酵提取物是绝对安全的。对服用剂量分别为10ml/Kg和1ml/Kg的小鼠进行28天亚急性口服毒性试验，并没有显示出任何明显差异和异常症状。在对啮齿动物急性口服毒性试验中，两组实验动物用药剂量分别为20ml/Kg和1ml/Kg，没有观察到总体中毒或致命现象。艾姆斯氏试验表明，大豆属发酵提取物为非诱导物质，体外不会造成哺乳动物染色体损害，ICR小鼠试验中也没有造成骨髓细胞产生微核。
怀孕妇女服用大豆属发酵提取物，大豆属发酵提取物的用量在怀孕期间可以增加，直到每日用量达到12ml。可以在怀孕早期和中期服用，也可以在分娩时期服用。结果表明，服用大豆属发酵提取物能够改善怀孕期间通常出现的症状，如便秘、恶心、呕吐和肠胃不适。此外，服用大豆属发酵提取物还能减少怀孕和分娩期间异常情况的发生。大豆属发酵提取物不仅有利于改善怀孕期间的健康状况，而且作为长期日常饮食的补充服用也不会产生负面作用。让新生儿和婴儿每日服用大豆属发酵提取物会有助于其增加体重。同样，如果长期服用大豆属发酵提取物的哺乳母亲，其婴儿的体重也会增长较快。
做手术的妇女从入院开始到手术当天和术后几天，坚持每天服用1ml大豆属发酵提取物和其他种类的治疗产品，结果表明大豆属发酵提取物能够提高术后的造血组织和肝的功能。
参考如下实例以描述本发明。
实施例1LOX-15是花生四烯酸(AA)代谢的主要代谢产物。AA的一个代谢途径涉及到15-脂肪氧合酶，即LOX-15，生成了HETE(氢过氧化物)。据报道，HETE对癌细胞转移起重要作用。HEPE能诱发蛋白质激酶C活性，导致癌细胞转移。HEPE还是造成有丝分裂的一个因素，能引发血管产生癌变。从兔子红血球中分离出LOX-15。分别在大豆发酵提取物存在和不存在的情况下，采用亚油酸作为LOX-15的基质。产生的HETE量用分光光度法分析。数据表明，大豆发酵提取物对LOX-15具有抑制作用(见图1)。结果显示，大豆发酵提取物能抑制血管癌变和癌细胞转移，并能诱发癌细胞死亡。
有关LOX-15的进一步抑制实验是根据上述的方法完成的。考察了未发酵大豆和发酵大豆对LOX-15的抑制效果的差异。结果表明，经过发酵的大豆的抑制效果是未发酵大豆的四倍。
实施例2在兔子红血球中测试黑豆发酵提取物对LOX-15的抑制作用。测试方法采用Analytical Biochemistry 1992，201，375-380中描述的方法。在4℃下使用1％、0.5％、0.1％、0.05％与0.01％(v/v)的黑豆提取物培养兔子红血球10分钟。培养用的缓冲溶液为0.05M磷酸钾缓冲液(pH5.9)。用分光光度计测量得到的13-HPODE的量。
图2中给出了黑豆的浓度和其对LOX-15的抑制率之间的关系。
有关LOX-15的进一步抑制实验是根据上述的方法完成的。考察了未发酵黑豆和发酵黑豆对LOX-15的抑制效果的差异。未发酵黑豆的LOX-15抑制率列于表1表1
经过发酵的黑豆提取物对LOX-15的抑制率在表2中列出表2
上表的结果表明，黑豆发酵提取物对于抑制LOX-15具有意想不到的出众效果。
实施例3大豆发酵提取物可作为抗氧化剂使用并可去除自由基。利用先前发表的几个模型来研究大豆发酵提取物的抗氧化能力，使用维生素C和水溶性维他命E作为正参照。采用以下方法确定抗氧化能力(1)NBT法(2)H2O2还原法(3)DPPH还原法(4)TRAP还原法(5)共轭二烯烃法(6)脂过氧化法(7)在活性氧存在下使用化学荧光法(见图3，4和5)。所有结果显示，大豆发酵提取物与维生素C和水溶性维他命E相比对不饱和脂肪酸和过氧化反应具有最高的抗氧化能力。
在活性氧的存在下，化学发光受体的Okubo试验系统中的试验表明，大豆发酵提取物既具有抗氧化能力又可作为自由基受体。试验分别在有、无乙醛加入的情况下，测量双氧水的化学荧光强度。已知的抗氧化剂，如五倍子酸(见图3(b))、EGC、茶和维生素C(见图4(a)-(c))或大豆发酵提取物(见图5)，分别在200秒时刻加入。有关数据分别在图3-5给出。图3(b)表明，在200秒时刻当五倍子酸加入到双氧水和乙醛混合液中时，化学荧光强度增加。图4表明，在乙醛存在的情况下，在200秒时刻加入EGC，茶或维生素C，化学荧光强度增加。然而，在无乙醛存在下，当200秒时刻加入维生素C也会增加(见图4(c))，表明维生素C的抗氧化机理可能与EGC、茶不同。图5表明，在200秒时刻加入大豆发酵提取物后，化学荧光强度增加，证明大豆发酵提取物是一种强大的抗氧化剂。大豆发酵提取物的抗氧化能力意味着大豆发酵提取物可用于去除自由基。大豆发酵提取物具有抗氧化性和清除自由基的能力使其可以用于改善个人总体健康状况，或促进急需提高健康水平的一类人的身体素质，因为我们已知氧化压力，如活性氧和脂过氧化物的过量存在对人体有害。
实施例4采用体外实验方法证明大豆发酵提取物具有抗微生物能力。第一个试验中，在营养肉汤培养基或BHI培养基中培养沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、三株幽门螺杆菌(TMU-C74，TMU-D16与TMU-E86)和耐万古霉素肠球菌，并转移到Mueller Hinton琼脂板或巧克力琼脂板上。将大豆发酵提取物置于琼脂板上的纸盘中，在37℃下培养，测量抑制区域的大小。数据列于下表3中。
表3微生物大豆发酵提取物抑制区域(mm)沙门氏菌 未稀释11枯草芽孢杆菌 未稀释14幽门螺杆菌TMU-C74 未稀释15幽门螺杆菌TMU-D16 未稀释16幽门螺杆菌TMU-E86 未稀释15耐万古霉素肠球菌 未稀释25耐万古霉素肠球菌 稀释50％ 15另一试验中，分别测定了大豆发酵提取物对沙门氏菌(ATCC14028)、枯草芽孢杆菌(CRCC 10447)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和耐万古霉素肠球菌的最小抑制浓度(MIC)。这些菌体的悬浮液浓度调整到3×105CFU/ml。将调整后的菌体悬浮液与浓度为10％、5％、2.5％、1.25％、0.65％或0.32％的大豆发酵提取物(浓度可以相同也可以不同)加入到96孔菌盘中。菌盘在37℃下培养15小时。测定的MIC列在下表4中表4微生物大豆发酵提取物的MIC沙门氏菌 2.5％枯草芽孢杆菌 2.5％金黄色葡萄球菌 2.5％耐万古霉素肠球菌 1.25％黑豆发酵提取物也用来测试抗菌能力。得到的MIC列于下表5
表5微生物黑豆发酵提取物的MIC绿脓假单胞菌 3.125％KP(克雷白氏肺炎杆菌) 3.125％金黄色葡萄球菌 1.563％实施例5大豆发酵提取物对免疫系统调节作用的研究。
(A)体外研究脾细胞增生分析(MTT法)由老鼠体内分离出脾细胞置于培养瓶中，细胞浓度为2×106细胞/ml，培养培养基为RPMI，使用或不使用以下几种分裂素中的一种，即脂多糖(LPS)，Concavalin A(Con A)和植物血球凝集素(PHA)。脾细胞培养物经过一夜的培养后被用于MTT测试。
次优浓度为5ug/ml的LPS与浓度为1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的大豆发酵提取物，对脾细胞(尤其是B细胞)的增生没有影响。5ug/ml的PHA加上0.05％的大豆发酵提取物可以使脾细胞数增加，尤其是T细胞，是单独使用PHA所获得的细胞数的2.32倍。由此可知，在对免疫系统的调节中，大豆发酵提取物影响T和B细胞的交互作用。5ug/ml的Con A与0.05％的大豆发酵提取物得到的脾细胞数比仅用Con A的细胞数量少20％。可见，大豆发酵提取物能起到消炎作用。
巨噬细胞活性分析给Balb/c小鼠注射thiogllate。注射后3-4天，从小鼠的腹膜腔分离出巨噬细胞，然后在添加和不添加大豆发酵提取物的情况下培养30分钟，保持温度37℃。大肠杆菌与荧光探针配合加入到巨噬细胞悬浮液中，在37℃下培养2小时。通过测量流动血细胞数量对噬菌作用进行检测。数据表明，加入0.05％的大豆发酵提取物比未经大豆发酵提取物处理的巨噬细胞的噬菌能力高71％。
(B)体内研究分别给每只ICR白化公鼠进行腹膜内注射赋形剂、0.8毫升1％的大豆发酵提取物、0.8毫升0.1％的大豆发酵提取物、30mg/kg的左咪唑或100mg/kg的azimexone。在腹膜注射1小时后，给每只小鼠静脉注射1.5-2×107CFU的白色念珠菌(ATCC 10231)。每天确定一次(连续10天)小鼠的死亡率(见表6)。
如表6所示，大豆发酵提取物降低了白色念珠菌对小鼠的致死率。大豆发酵提取物降低死亡率的效果要优于左旋咪唑。
在其静脉注射白色念珠菌5、3及1天前用环磷酰胺，按照30mg/kg的用量对ICR白化公鼠进行预处理。在静脉注射白色念珠菌6、4及2天前，分别用赋形剂、0.1％的大豆发酵提取物、1％的大豆发酵提取物或100mg/kg的用量的azimexone进行处理。连续10天确定小鼠的死亡率(见表7)。如表7所示，经过环磷酰胺预处理后，大豆发酵提取物能减小白色念珠菌对小鼠的致死率。大豆发酵提取物对死亡率的降低程度与azimexone的相当。
表6
每只小鼠在腹膜注射试验样品1小时后静脉注射1.5～2×107CFU的白色念珠菌(ATCC 10231)。利用Fisher的准确性试验确定统计显著性*P＜0.05，**P＜0.01注意每只小鼠0.8ml浓度为1％的大豆发酵提取物相当于0.4ml/kg原始大豆发酵提取物(100％)每只小鼠0.8ml浓度为0.1％的大豆发酵提取物相当于0.04ml/kg原始大豆发酵提取物(100％)表7
a赋形剂PBS(pH＝7.4)未经环磷酰胺预处理bCY在感染前5、3、1天，按照30mg/kg，的剂量，用环磷酰胺预处理。感染前6、4、2天，注射0.8ml大豆发酵提取物或azimexoue。
每只小鼠在第零天静脉注射6～8×106CFU的白色念珠菌(ATCC 10231)。
利用Fisher的准确性试验确定统计显著性*P＜0.05，**P＜0.01
实施例6测试了大豆发酵提取物对载脂蛋白E缺乏小鼠(具有与人类相似的高血胆固醇，动脉硬化损伤)的影响，以考察其治疗心血管疾病的功效。给载脂蛋白E缺乏小鼠服用10μl/g大豆发酵提取产品(浓度为15％)3个月，然后测量血浆胆固醇水平和动脉硬化程度。试验发现，采用本发明的大豆发酵提取产品治疗后，血浆胆固醇水平没有明显变化，但服用本发明的大豆发酵提取产品的小鼠的动脉硬化损伤与对照试验相比有了明显改善(见图6、7和8)。由试验结果可知，本发明的大豆发酵提取物对心血管疾病，如动脉硬化有治疗效果，是因为其对15-脂肪氧合酶的抑制作用，而不是降低血浆胆固醇。
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权利要求
1.一种关于大豆属发酵提取物在生产一种用于抑制15-脂肪氧合酶的组合物中的应用，其中大豆属发酵提取物是大豆属提取物在水溶液中，与至少一种乳酸菌和至少一种酵母发酵制得的，其对15-脂肪氧合酶的抑制作用可用来治疗或减少心血管疾病带来的危险性。
2.根据权利要求1所述的应用，其中该大豆属植物为黑豆。
3.根据权利要求1所述的应用，其中该乳酸菌为乳酸杆菌。
4.根据权利要求1所述的应用，其中该酵母菌为酵母杆菌。
5.根据权利要求1所述的应用，其中该心血管疾病为动脉粥样硬化。
6.根据权利要求1所述的应用，其中该组合物为医药组合物或食品组合物。
全文摘要
本发明涉及大豆属发酵提取物在抑制15－脂肪氧合酶中的应用，此处的大豆属发酵提取物是大豆属提取物在水溶液中，与至少一种乳酸菌和至少一种酵母发酵制得的。具体的说，大豆属发酵提取物可用于预防和/或治疗由15－脂肪氧合酶而引发的心血管疾病，免疫功能紊乱(如，哮喘和炎症)并有调节免疫系统功能的作用。本发明还涉及大豆属发酵提取物在预防和/或治疗微生物感染中的应用。
文档编号A61K35/66GK1589869SQ0315799
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月4日 优先权日2003年9月4日
发明者路孔明 申请人:中天生物科技股份有限公司